パルプ生産に適した植林木Eucalyptus globulusは、挿し木による増殖が非常に困難な樹種であり、通常、種子から生産された実生苗で植林される。実生苗は各々異なる遺伝的バックグランドを持つため、成長や材の性質に差が見られる。これまでに、E.globulusの不定根の形成過程において、高濃度CO2（1000 ppm）を供給することで、発根率が上昇し、根系も発達することを見出している。高濃度CO2条件下にすることで、rbcSの発現量は増加した。また、オーキシン極性輸送阻害剤である1-N-naphthylphthalamic acidを加えることによって、濃度依存的に不定根形成を阻害した。不定根形成には、光合成活性の促進とオーキシンの極性輸送が重要と考えられた。
今回、酸化型グルタチオンの不定根形成に対する効果を調査した。酸化型グルタチオンはカルビン回路のフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を制御することが報告されている。E.globulusで酸化型グルタチオンを施用した結果、約3倍発根率が増加した。また、DR5-GUSが導入された発芽後7日のシロイヌナズナに対して、酸化型グルタチオンを施用した結果、施用していない対照と比較して、強いGUS活性が見られた。以上のことから、GSSGを施用することで、内生のオーキシン量が上昇する可能性が示された。

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これまでの研究により、シロイヌナズナの細胞死制御因子LSD1が複数のAux/IAA転写抑制因子と相互作用することから、LSD1の機能は細胞死の制御だけでなく、Aux/IAAとの相互作用を介してオーキシン応答の転写制御にも関わる可能性が示唆された、そこでまず植物のオーキシン応答におけるLSD1の機能を明らかにするために、LSD1の過剰発現体(LSD1-ox)と欠損変異体(lsd1-2)についてオーキシン関連の表現型を調べた。根のオーキシン関連の表現型を調べた結果、野生型と比較して重力屈性応答や側根数については差が無いが、主根の長さがLSD1-oxでは野生型より長くなり、lsd1-2では野生型より短くなることを明らかにした。さらに、これらの植物の根の内生IAA量をLC-MS/MSを用いた定量分析により調べたところ、LSD1-oxではIAA量が低下し、lsd1-2では増加していることが分かった。また、オーキシン転写制御系におけるLSD1の機能を調べるためにマイクロアレイ解析を行なったところ、lsd1-2において数多くのオーキシン応答性遺伝子の発現量が増加していることを明らかにした。これらの結果から、オーキシン応答におけるLSD1の機能は、Aux/IAAとの相互作用を介した転写制御系による根のオーキシン量の調節にも関与していると示唆された。

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植物の矮小化形質の誘導は、「植物工場」等の限られたスペースにおける物質生産に有用な技術として期待されている。本研究では、矮小化に関わる転写因子およびその機能を明らかにし、物質生産における基盤植物の開発を行うことを目的とした。独自に開発した遺伝子サイレンシング技術（CRES-T法）を用いて、矮小化に関わるシロイヌナズナ転写因子の同定を行った。CRES-T法とは、任意の転写因子に転写抑制ペプチドを融合したキメラリプレッサーを植物体内で発現させることにより、目的の転写因子だけでなく機能重複する内在性の転写因子も効率的に抑制することができる技術である。同定した転写因子（HR0444）のCRES-T適用シロイヌナズナでは、ブラシノステロイド誘導性遺伝子発現が抑制されており、細胞伸長の顕著な抑制がみられた。また、HR0444は、転写抑制活性を持っており、過剰発現株もCRES-T適用株と同様に矮小化形質を示した。CRES-T適用HR0444形質転換タバコを作出し、基盤植物としての物質生産能の評価を行った。その結果、形質転換タバコは、栽培スペースあたりの葉の質量、総タンパク質量が野生株よりも増加した。また、導入した外来遺伝子(GUS)由来タンパク質量生産量も野生株より増加した。HR0444遺伝子の導入は、省スペース栽培に適した植物の作出に有力な手法であることが示唆された。

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最も多く存在する天然型オーキシンはインドール-3-酢酸(IAA)である。シロイヌナズナではこれまでトリプトファンからIAAにいたる複数の生合成経路が研究され、経路上に存在する中間体としてインドール誘導体が提唱されてきた。オーキシン生合成の全容解明には至っておらず、中間体と推定される化合物がIAA前駆体としてオーキシン作用に関わっているかはこれまでのところよくわかっていない。我々は、IAA生合成阻害剤として新たに見いだされたL-amino-oxyphenylpropionicacid (L-AOPP) を用いることで、これまで中間体として推測されてきた化合物がIAAの前駆体かどうか検証を試みた。L-AOPPを含んだ培地で生育させたシロイヌナズナめばえの主根は伸長が抑制され、同一方向に斜行する形態を示す。IAA添加によりこの形態は回復することから、我々はこの形態回復を指標とすることで、IAA前駆体となる化合物を予想した。次に、オーキシン応答性遺伝子の発現を指標とし、L-AOPPで発現が減少したオーキシン応答性遺伝子が中間体と推定される化合物で増加するかを調べた。これらの結果、インドールピルビン酸を含むいくつかのインドール誘導体がIAA前駆体であることが示唆された。我々はさらに、新規阻害剤の候補物質として数種類の化合物を合成し、阻害剤としての有効性を検証したのであわせて報告する。

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ストリゴラクトンは根圏における根寄生植物とアーバスキュラー菌根菌の宿主認識シグナルである。また、宿主植物では自身の枝分れを制御する植物ホルモンとして働いている。変異体の解析からストリゴラクトンはカロテノイドから生合成されることが示されているが、その経路の全貌は明らかにされていない。遺伝学的手法だけでは明らかにできない生合成経路の解明には、懸濁培養細胞による標識ストリゴラクトンの取り込み・代謝実験が威力を発揮すると考えた。そこで、ストリゴラクトンを産出している培養細胞を理化学研究所バイオリソースセンターが維持している細胞株から探して、代謝実験に利用することにした。まず、シロイヌナズナおよびイネの培養細胞を選び、LC-MS/MS分析を行った結果、両細胞においてストリゴラクトンの生産が確認された。次いで、それらの培養細胞に重水素標識5-deoxystrigolを加えて培養したところ、orobancholへの変換が確認された。これらの培養細胞はストリゴラクトンの生合成および代謝経路の解明のための取り込み・代謝実験に有効な材料として利用できると考えられる。

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オーキシンは植物の生長や胚発生を制御する植物ホルモンの一種である。植物の体内で合成される主要な内性オーキシンにはインドール-3-酢酸（IAA）とインドール-3-酪酸（IBA）が存在し、これまでの研究によりIBAはIAAと同じ経路で植物の成長を制御すると考えられてきた。しかし、近年、IBAは他のオーキシンに比べて胚軸の伸長や側根の形成を促す働きが強いことが判明し、さらに、IBAの植物体内での輸送はIAA取り込みタンパク質やIAA排出タンパク質を介していないことが報告された。これは、IBAの輸送やシグナル伝達の経路が従来知られていたIAAのものとは異なるという可能性を示している。本研究では、IBA特異的な経路の解明を目的として、シロイヌナズナのEMS変異体群から新規IBA耐性変異体をスクリーニングし、その変異体を解析することによりIBA特異的な経路の解明を行なった。このスクリーニングにより、我々は根の生長阻害と側根形成においてはIBAによる抑制を示すが、他の植物ホルモンや生長抑制剤に対しては野生型と同じ反応を見せる三種類のIBA特異的な変異体を獲得した。また、これらの変異体は、三種類ともに根におけるIBAの輸送量が減少していた。このことから、これらの変異体の原因遺伝子がIBA特異的な輸送経路を制御している可能性が示唆された。

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本研究では、ブラシノステロイド（BR）情報伝達機構の解明を目指し、BR生合成阻害剤Brz存在下での形態変化を指標として、Arabidopsisアクティベーションタギング変異ラインからBR情報伝達変異体bil 3 (Brz-insensitive-long hypocotyl 3)を選抜し、原因遺伝子の単離を行った。
bil3は暗所Brz存在下で野生株の約1.5倍の胚軸徒長が見られる半優性変異体である。明所下ではロゼット葉の細小化と花茎の短化を伴う細矮性Slender Dwarf様の形質を示し、成熟個体においては、野生株と比較して主花茎数が約1.3倍、枝数が約2.2倍、鞘数が約2.2倍に増加していた。BR受容体BRI1の欠損変異体であるbri1-5変異体にbil3変異体を掛け合わせた二重変異体においては、BR欠損による矮性形態から野生型形態に類した形態への回復が観察された為、BIL3タンパク質はBRI1の下流で機能していると考察した。BIL3promoter::GUS解析により、明所10日目の個体において葉脈、茎頂分裂組織、根で、成熟個体において維管束で発現が見られた。BRは細胞分化や維管束形成に関わる可能性が示唆されており、BRの機能発現にBIL3が関与する可能性について、現在更に詳細な解析を進めている。

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アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）由来の植物腫瘍遺伝子群の一つに6b遺伝子(AK-6b)があり、AK-6b遺伝子を発現するタバコではオーキシンの極性移動が低下し、形態が変化する。AK-6b-タバコでは葉が上偏成長し、葉の裏から突起が生長し、根は短くなり、数が増え、太くなる。オーキシンの極性移動の影響をさらに調べるために、オーキシン流入阻害剤であるナフトキシ酢酸(NOA)を投与したところ、地下部では根の数が減少した。野生型タバコ+NOAでも同様に根の数は減少した。オーキシンの動態を調べるために、オーキシン応答性のレポーター遺伝子DR5：GUSを導入し、GUS活性を調べたところ、AK-6b-タバコ+NOAおよび野生型タバコ+NOAいずれも染色が弱かったことから根部分ではオーキシンの再分配の可能性は明かではない。一方、地上部ではAK-6b-タバコ+NOAでは葉の裏の腫瘍組織は縮小し、下胚軸に新たな突起が形成され、DR5：GUS染色ではAK-6bの腫瘍組織、新たに生じた組織のいずれにも顕著なGUS活性が見られた。一方、野生型タバコ+NOAでは茎葉部の形態には変化が見られなかった。以上のことから茎葉ではAK-6bによるオーキシンの排出阻害とNOAによる流入阻害によりオーキシンの再分配が起きていることが示唆される。

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ブラシノステロイドは細胞伸長や分裂、光形態形成に関与している植物ホルモンである。我々はブラシノステロイド情報伝達機構の解明を目指し、暗所、ブラシノステロイド生合成阻害剤Brz存在下での胚軸徒長を指標として、アラビドプシスのアクティベーションタグラインからbil2(Brz-insensitive-long hypocotyl 2)を選抜した。明所で生育したbil2は、ロゼッタ葉の上偏成長、葉柄伸長の形態を示す。bil2高発現株ではBR応答性遺伝子の発現が上昇していることが明らかとなった。bil2変異体のアクティベーションタグ近傍の遺伝子の中で、発現の上昇した3つの遺伝子について高発現株を作製したところ、一種の遺伝子について暗所Brz存在下で胚軸伸長するbil2変異体の形質が再現されたためbil2変異原因遺伝子と考察した。このbil2変異候補遺伝子は、細胞核に局在が予測される新規なタンパク質をコードしてあり、現在、この遺伝子機能の解析を進めている。
また葉緑体制御に関わるブラシノステロイド情報伝達突然変異体の探索を目標として、Brz存在下においても緑化が促進されず低緑化を示す形質をbpg (Brz-insensitive pale green)変異としてアラビドプシス完全長cDNA高発現変異性であるFOXラインから新しいbpg変異体の探索を開始した。現在、次世代解析を進めている。

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世界中から集められたシロイヌナズナ・アクセッション（野生型純系統）には、ゲノムDNA配列において一塩基多型や塩基欠損などの遺伝的バリエーションが存在する。これらの遺伝的変化は種子休眠性や開花時期など様々な表現型の違いに関係している。本研究では、シロイヌナズナ・アクセッションにおける種子休眠性とホルモン内生量のバリエーションに注目しており、これまでに168アクセッションについて、酸性ホルモン類の一斉分析をおこなった。その結果、それぞれのホルモンにはかなりの程度のバリエーションが存在した。例えば、アブシジン酸内生量には47.0～506.3 ng/g生重量の間で違いが存在した。一方、各ホルモン内生量と種子休眠性の程度に明確な相関性は無かった。次に本研究では、このようなナチュラルバリエーションの遺伝的要因を研究するため、アブシジン酸過剰蓄積と超休眠性を同時に示すアクセッションによるQTL解析をおこなった。MQM（Multiple-QTL Mapping）モデルによる計算の結果、各ホルモン内生量と種子休眠性に関して、それぞれのQTLを検出した。今回はこれらの解析結果を発表する。

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アブシジン酸(ABA)は、高等植物の種子休眠や気孔の開閉、凍結・乾燥ストレス耐性の発現に関わるホルモンとして知られている。ABAはシダ植物や、苔植物などの非維管束植物においてもストレス耐性の発現に関わることが示唆されている。しかし、陸上植物の進化の初期に生じたグループである、苔類に対するABAの作用は明確に明らかにされていない。本研究ではモデル植物である苔類ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)を用いて、苔類のABA応答の分子機構を解析することを目的とした。ABA応答性のコムギEmプロモーターに結合したGUSレポーター遺伝子(Em-GUS)をゼニゴケ培養細胞や植物体に導入したところ、外因性のABAはEm-GUSの発現を増大させた。ABA応答性のEm-GUSの発現は、Emプロモーター内のABA応答配列(ABRE)とRY配列に依存していた。苔類でABAと同様の働きを示すと考えられているルヌラリン酸(LA)は、Em-GUSの発現には関与しなかった。これらの結果は、苔類にLAの影響を受けないABA応答性遺伝子発現の分子機構が存在することを示唆する。

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シロイヌナズナの細胞周期停止因子群Kip-related proteinsであるAtKRP1～7はモチーフの構成から大きく2つのグループに分類できると考えられる. モチーフを7個以上もつ大サイズ・グループ（AtKRP3, 4, 5）と4～5個の小サイズ・グループ(AtKRP1, 2,k 6, 7) である. C末端側のCDK-cyclin 結合ドメインを構成する2つのモチーフ以外の機能は不明である. これらモチーフの機能の一つとして他タンパク質との相互作用があるのではないかと考え, 結合タンパク質の探索を行うこととした.
対象 KRPには大サイズ・グループに属するAtKRP3に注目した. 同遺伝子は他のKRPと比べ, 培養細胞で高い発現をみせる等, 特異的な発現が観察されている.方法には酵母 two hybrid 法を用い, preyにAtKRP3-cDNAを,bait にシロイヌナズナ芽生え由来のcDNA-poolを用いた.その結果, 約3万個のクローンより15個の候補タンパク質を選抜した.これらにはCDKA, 機能未知タンパク質, Rubisco 小サブユニット等の葉緑体関連遺伝子等が含まれていた.現在,これら候補タンパク質とAtKRP3とのin vitroでの結合能について検証を進めている.

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ギンリョウソウ（Monotropastrum humile）はツツジ科シャクジョウソウ亜科ギンリョウソウ属の植物で、葉緑素をもたない白色の無葉緑植物である。また光合成能をもたず、共生する菌類から供給される炭素化合物に完全に依存している絶対的菌従属栄養植物でもある。ギンリョウソウでは原色素体が葉緑体へと分化していないと考えられるが、無葉緑植物の無葉緑化の分子機構は全く明らかになっていない。本研究では色素体の分化に注目した研究を行うことで、ギンリョウソウにおける無葉緑化の分子機構を明らかにすることを目的とした。DAPIを用いた蛍光染色、及び透過型電子顕微鏡を用いた解析により、ギンリョウソウは未分化の原色素体様のオルガネラをもつことを明らかにした。ウエスタンブロット解析により、ギンリョウソウはRuBisCoの両サブユニットタンパク質（rbcS,rbcL）をもたないことを明らかにした。ギンリョウソウのゲノムDNA の解析、及びRT-PCR法を用いた発現解析により、rbcSは転写されているが、rbcLは転写されていないことを明らかにした。葉緑体への分化に関わる遺伝子群の転写調節に関わるバクテリア型RNAポリメラーゼ（PEP）によりrbcLが転写されることから、PEPによる転写調節機構が機能しないことによりギンリョウソウでは原色素体が葉緑体に分化していない可能性が示唆された。

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Although mesophyll chloroplasts have generally been used for studies on plastid replication, recent studies have suggested that there is tissue-dependent regulation of plastid replication, and that stromule formation may be involved in this process. Here, we report the detailed morphology of immature chloroplasts and their stromules in the leaf epidermis, the intraplastidic localization of chloroplast division regulators AtMinE1 and AtFtsZ1-1, and their associations with plastid replication and development in Arabidopsis. Using a functional AtMinE1-YFP fusion, we demonstrate that AtMinE1 concentrates at the constricting plane of the dividing plastids, and simultaneously diffuses throughout the stroma, in the epidermis of leaves and petals. We also show that the localization of AtMinE1-YFP is highly dependent on its expression level. In the knockdown atminE1 mutant expressing the plastid-targeted CFP, the size of epidermal chloroplasts varied widely, and chloroplasts emanated many stromules. Further examination of plastid morphology and visualization of AtFtsZ1-1 showed that stromule fission mediated by the FtsZ1 ring contributed to plastid heterogeneity in the atminE1 epidermis.

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植物細胞において、核DNA複製(nuclear DNA replication: NDR)とオルガネラDNA複製(organelle DNA replication: ODR)を協調させる機構については殆ど明らかにされていなかった。近年、我々は単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeおよびタバコ培養細胞BY2においてNDRがODRによって制御されていること、そしてオルガネラからNDRの開始を伝えるシグナルとしてテトラピロールの一種であるMg-ProtoIXが働いていることを明らかにした。NDRはMg-ProtoIXの蓄積によってCDKAが活性化される事によって行われる¹。しかし、Mg-ProtoIXによるCDKAの活性化がどのような分子機構によって行われているかは不明であった。前年会で我々はCDKAの活性化は、F-boxタンパク-Fbx3 によるCyclin 1のユビキチン化がMg-ProtoIXによって阻害されるために起こる事をin vitro実験系により明らかにした。今回、in vivoの実験系を用いて更なる検証を行ったので報告する。これらの実験結果をふまえたMg-ProtoIXによるNDRの開始機構のモデルを提示する。
1 Kobayashi, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 803 (2009).

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葉緑体には、原始シアノバクテリアの細胞内共生に由来する独自のゲノムとその遺伝子発現系が残されている。しかし、共生後の長い進化の過程で多くの遺伝子が葉緑体から失われ、それと並行して環境応答などの制御系は核による支配を強く受けるようになった。本研究で用いた単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）は、そのゲノム構造や転写制御系の解析から多くの原始的な特徴を保持していることが示されており、より自律的な環境応答・転写制御系が葉緑体に残されているものと予想される。我々はこれまでに、シゾンに唯一残されているヒスチジンキナーゼ（HIK）と葉緑体ゲノムに残されたレスポンスレギュレーターの1つであるYcf27が、光に自律応答した葉緑体の転写制御に関わることを明らかにしてきた。本研究ではHIKの機能解析を目的とし、まずHIKタンパク質の発現量を調べたところ、光条件に関係なく一定であることが示されたため、光依存的に活性が変化するセンサーとしての役割が予想された。そこで、光センシングに関わると考えられるN末端側のドメインをシアノバクテリアの系を用いて発現・精製した。このタンパク質を用いてZinc-blot解析を行った結果、明確なシグナルは得られなかったことから、フィコシアノビリンなどの開環テトラピロール化合物とは異なる別の分子が発色団として結合している可能性が示唆された。

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細胞質雄性不稔性（cytoplasmic male sterility；CMS）は細胞質の異常により正常な花粉を作れない形質で、F1種子の作出等に利用されている。CMSの多くはミトコンドリアゲノムの異常ORF発現により引き起こされる。コセナ型細胞質をもつダイコンでは、ミトコンドリア異常ORF（orf125）由来の蛋白質が蓄積し不稔性を示すが、稔性回復因子（Raphanus sativus restorer of fertility；rsRf）が核に存在すると、異常ORFの発現が抑制され花粉形成能が回復する。多くのRfと同様に、rsRfはオルガネラ遺伝子の発現をRNA段階で制御するpentatricopeptide repeat（PPR）蛋白質をコードしており、orf125の発現をRNA段階で抑制すると予想される。
本研究ではこの分子機構を明らかにするために、組換えrsRf 蛋白質とorf125 mRNA との結合をin vitroで解析した。その結果、rsRf蛋白質がorf125 開始コドン下流領域に結合することが示された。また、様々なダイコン品種のrsRf様遺伝子には数残基のアミノ酸多型が見られ、これら多型が稔性回復能に影響すると示唆されている。現在、rsRf様蛋白質のRNA結合能を解析中である。得られた結果を基にrsRfのRNA結合能と稔性回復能との相関関係を考察したい。

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約4億7千万年前に起きた植物の陸上進出は、生物進化の過程において極めて重要なイベントの一つであり、現在の地球環境の形成にも大きな影響を与えたと考えられる。植物の陸上化過程の解析は、古生物学や現生生物の解析のみならず、地質学や気候学など様々な分野からのアプローチが進行している。そのような状況の中、我々は車軸藻綱クレブソルミディウムの解析から植物の陸上進出要因の解明を目指している。
車軸藻綱の細胞分裂過程や分子系統学による解析により、陸上植物は車軸藻綱から派生したことが支持されている。車軸藻綱中でもクレブソルミディウムは単純な体制を持ち、水中および陸上の乾燥、貧栄養環境でも生育が可能であり、陸上植物の起源を明らかにするために重要な生物と考えられる。
我々は、物質生産およびエネルギー生産に中心的な役割を果たす葉緑体およびミトコンドリアの機能は陸上のストレスに適応するために重要であると考え、クレブソルミディウムの葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNAの配列解析を行った。本発表では、クレブソルミディウムの葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNAの特徴および、さまざまな植物・藻類の葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNAと比較した結果を報告する。さらにそれらの結果から車軸藻綱から陸上に適応した植物が誕生した一要因を考察する。

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液胞は、植物細胞の体積の90％を占め、タンパク質の貯蔵や分解だけでなく、細胞の伸長や形態保持などの形態形成に重要な働きを担っている。液胞は、ゴルジ体や小胞体の一部が分化して形成されると言われているが、その形成の仕組みは未だ明らかになっていない。我々は、高圧（加圧）凍結技法(High-pressure freezing; HPF)により、植物培養細胞および植物組織に適した固定法や包埋法、免疫電顕法の検討を行ってきた。その中で、液胞膜タンパク質のひとつである液胞型プロトンピロフォスファターゼ（V-PPase）を認識する抗体を用いてシロイヌナズナおよびタバコ根端分裂組織の免疫電顕を行った際、液胞膜の他に、V-PPaseが局在するリング状の新奇な構造体を見出した。このリング状構造体は、直径0.3～2 μmで扁平膜構造と二重膜構造が存在し、細胞質を取り囲むように存在していた。このリングが互いに融合して小さい液胞に変化している複雑な構造体もあり、特に中心柱付近の、液胞が未発達な細胞で観察された。またリング状構造体が大きな液胞に融合しつつある様子も見られた。一部の構造体では、内部に分解途中の細胞内物質を含んでいた。このことから新奇構造体は、形成途中の液胞であると推測される。現在、連続切片に対する免疫電顕法により、リング状構造体の立体構築を進めている。

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高等植物のペルオキシソームは組織や成長段階によって機能や名称が異なる。脂肪性種子植物の黄化子葉に存在するペルオキシソームはグリオキシソームと呼ばれ，β酸化系やグリオキシル酸回路の酵素を有し，種子中の貯蔵脂肪を代謝する中心的な役割を担う。緑化器官に存在するペルオキシソームは緑葉ペルオキシソームと呼ばれ，グリコール酸代謝を担う酵素が局在し，葉緑体やミトコンドリアと共に光呼吸を行う。ペルオキシソームに局在するリンゴ酸脱水素酵素PMDH（peroxisomal malate dehydrogenase）にはPMDH1とPMDH2の二つのアイソフォームが存在する。これまでに行った遺伝子発現解析やPMDH遺伝子の単一欠損および二重欠損変異体の解析から，PMDH1は主にグリオキシソームに局在して脂肪酸代謝に，PMDH2は緑葉ペルオキシソームに局在して光呼吸に関与すると推定されている。我々はシロイヌナズナにおけるPMDHの発現をさらに詳細に調べるため，PMDH1およびPMDH2とGFPとの融合タンパク質をそれぞれのプロモーターの制御下で発現させた形質転換シロイヌナズナを作製し，蛍光顕微鏡による観察を行った。本研究では，形質転換植物の解析から得られたPMDH1およびPMDH2の発現パターンの特徴について考察するとともに，PMDH欠損変異体に新たに見出された多面的な表現型について報告する。

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レタス芽生えでは液体培地のpHを6から4に低下させると根毛形成が誘導される。将来根毛を形成する細胞では、細胞長軸に垂直な表層微小管（CMT）配向が根毛原基形成に先立ちランダムになる必要があり、これはエチレンとオーキシンにより誘導される。近年、アブシジン酸も根毛形成を誘導することが明らかになったので、本研究ではアブシジン酸がCMTランダム化に与える影響と、CMTランダム化時のアブシジン酸とエチレン・オーキシンの相互作用について調べた。
アブシジン酸をpH 6の培地に添加してレタス芽生えを培養したところ、CMTはランダム化し、根毛形成が誘導されるようになった。しかし、pH 6の培地にアブシジン酸と同時にエチレン阻害剤やオーキシン阻害剤を添加すると、CMTのランダム化は起こらず、根毛も形成されなかった。逆に、アブシジン酸合成阻害剤のアバミンをpH 4の培地に添加すると、CMTのランダム化も根毛形成も阻害されるようになった。これらの結果から、根毛形成に必要なCMT配向のランダム化にはアブシジン酸は必要であるが、単独では十分な効果を持たず、エチレン・オーキシンと協調してCMTのランダム化に関与していることが示唆された。これらのホルモン間の関係をより明確にするために、現在、pH 4の培地にアバミンと同時にエチレンもしくはオーキシンを添加した場合のCMTを観察中であるので、併せて報告する。

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植物細胞の伸長方向は、細胞周期間期の表層微小管や細胞壁最内層のセルロース微繊維によって制御されている。微小管の重合・脱重合の調節が表層微小管の配向に影響し、細胞の伸長方向に関わることが示唆されている。我々は表層微小管の構築や維持に関与する因子を単離するため、微小管重合阻害剤プロピザミドに対して細胞伸長に影響を与える変異体を多数単離した。シロイヌナズナpropyzamide hypersensitive2（phs2）は単一劣性変異体であり、通常の培地条件では根がわずかに左方向に伸長する。低濃度薬剤存在下では、phs2変異体の根は野生型に比べ伸長阻害や細胞肥大を示した。地上部においては鞘のねじれが見られた。phs2変異体は、新規の遺伝子に欠損があり、5'、3'領域を含むゲノム領域がの薬剤高感受性を相補したことから、この遺伝子をPHS2と同定した。PHS2は11個のTPRリピートをもち、高等植物において遺伝子ファミリーを形成している。PHS2のN末端にGPFを融合した形質転換植物体はphs2表現型を相補し、表層微小管上に蛍光が観察された。以上のことから、PHS2が新規の微小管制御遺伝子として、植物細胞の表層微小管の配向制御等に関与することが強く示唆された。

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Boron is an essential micronutrient required for plant growth and development. A mutant with inhibited root elongation under boron deficient and normal conditions was isolated from EMS treated Arabidopsis M2 populations. Map-based cloning revealed it is a new allele of mur1 mutants, mur1-9. Arabidopsis mur1-1 is a dwarf mutant with altered cell wall structures, in which L-fucose is partially substituted by L-galactose. In boron deficient condition, root elongation of mur1-9 was inhibited to ~70% and rhamnogalacturonan II (RG-II) borate diester cross-links decreased to ~50% that of wild-type. Interestingly, inhibited root elongation of mur1-9 was recovered by supply the excess boron, but the ratio of cross-liked RG-II did not change significantly. Furthermore, application of L-fucose was also induced root elongation of mur1-9 under low boron condition. These results imply that boron performs important roles in Arabidopsis root elongation through an RGII-independent pathway.

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木部を構成する道管細胞や繊維細胞などは肥厚した二次細胞壁を形成する。膜タンパク質をコードするTED6、TED7遺伝子は、道管細胞分化過程で発現する遺伝子として単離された。これらの遺伝子の発現を抑制することで二次細胞壁形成に異常が起こること、またTED6タンパク質は、セルロース合成酵素サブユニットの一つと複合体を形成することから、TED6、TED7タンパク質はセルロース合成酵素などとタンパク質複合体を形成することで、二次細胞壁形成に重要な役割を果たすと推測された。
そこで本研究では、二次細胞壁形成における分子機構を解明するために、TED6タンパク質と結合しているタンパク質複合体を精製し、その構成因子の同定を行った。TED6pro:TED6の下流にタグ（HA、MYC、またはYFP）を付加させたコンストラクトを作製し、道管分化のマスター因子VND7の過剰発現により異所的な道管分化を誘導できるシロイヌナズナ形質転換体に導入した。作出した形質転換体から、膜画分のタンパク質を抽出し、タグを認識する抗体を用いてタンパク質複合体を精製した。質量分析解析を行ったところ、様々なタンパク質が同定された。現在、複合体に含まれるタンパク質の候補について、BiFC解析によりTED6タンパク質との結合の確認を行なっており、これらの結果についても報告したい。

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Fistulifera sp. JPCC DA0580株は高いオイル生産性を有する海洋性ケイ藻であり、我々は現在、本藻を利用したバイオディーゼル生産を目指して研究開発に取り組んでいる。その一環として、本研究では本藻の増殖特性について1リッター程度の培養規模で調べた。まず培地成分について検討を行い、先行研究に比べて10倍以上の生産性が得られる組成を見出した。また、本藻の生育至適温度は25～30℃であり、35℃までの高温にも耐性を示した。培地pHについては7以上9までのアルカリ側に耐性であった。さらに、培地の塩濃度については、2～8倍に希釈した海水においても通常海水とほぼ同等の生育を示した。通気CO₂濃度については0.5 %が至適であった。これら培養条件を至的化した場合の生産性は6.6 g dry weight/liter/weekであり、ラボスケールにおいてはプロジェクト目標値4 g dry weight/literを達成した。また、本研究の結果から、水資源問題への対応策として無尽蔵な海水とアルカリ排水の混合利用可能性や、屋外培養において問題となる高温への耐性能、さらに、通気CO₂コストの削減なども期待できる株であることが示唆された。[本研究はJST-CREST「二酸化炭素排出抑制に資する革新的技術の創出」研究領域（2010年度）の助成によるものである]

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私達はこれまで、効率的に新しい花の形質を創ることを目的に、花器官の発達および分化に重要な機能を有するシロイヌナズナの転写因子に転写抑制ドメイン（SRDX）を付加し、これをトレニアに導入してきた（CRES-T法）。この手法により、多種多様な組換えトレニアが作出可能であることが明らかとなった。一方で、得られた組換えトレニアの中には、開花に至らなかったり葉に形質変化が起こるなど、期待しない形質も観察された。CRES-T法で用いてきた35Sプロモーターを花器官プロモーターに換えることで、これらの問題を回避するのみならず、35Sプロモーターでは見られなかった形質の付与が可能になることが期待された。本研究では、シロイヌナズナ由来MYB24およびTCP3のキメラリプレッサーを花器官プロモーターで発現させることで、トレニアで新しい花の形質の創出に至ったことから、ここに報告する。MYB24-SRDX遺伝子は、35Sプロモーターでは花が咲かずに葉で形質変化が見られたが、花器官プロモーターにより葉での形質変化を回避するのみならず新しい形質を付与するに至った。さらに、TCP3-SRDX遺伝子を5種類の花器官プロモーターで発現することで、それぞれの花器官プロモーターに特徴的な多様な花の形質の作出に成功した。
本研究は、生研センターイノベーション創出事業によるものである。

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レタスの抽台（花芽分化及び花茎伸長）は一般に高温によって誘起される。高温条件下でのレタス栽培における抽台は、変形球の発生もともない、品質や収量の低下を招くことから、農業上重要な課題となっている。この栄養成長から生殖成長への移行のメカニズムについては、シロイヌナズナを主として明らかになりつつあるが、花成制御遺伝子のひとつであるFLOWERING LOCUS T (FT) 遺伝子は、多くの植物で花成を誘導するのに重要な役割を持つと考えられている。我々はレタスの花成誘導機構解明のため、Degenerate PCR法及び RACE法により、レタスからFT相同遺伝子(LsFT)を単離した。塩基配列解析及び系統樹解析の結果は、既報のFT相同遺伝子と高いホモロジーを示し、CaMV 35SプロモーターによりLsFTを過剰発現させたシロイヌナズナは抽台が早まったことから、LsFT遺伝子はレタスにおけるFTの相同遺伝子であると考えられた。リアルタイムPCRによりLsFTのレタスにおける発現解析を行ったところ、その発現量は茎長・花芽の発達段階とよく一致しており、経時的な解析により日周変動を示すことが明らかとなった。

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前回の生理学会（10年熊本）で、シロイヌナズナFT(AtFT)をrolCプロモーターで発現させた組み換えリンゴは、3～5ヶ月でin vitro開花することを報告した。今回シロイヌナズナのTWIN SISTER OF FT(TSF)を35SプロモーターまたはrolCプロモーターで発現させた組み換えリンゴを作出した。35S::AtFT組み換えリンゴは、in vitroでシュート頂に5mm程の蕾をつくり、開花することなく枯死した。一方、35S::TSF、rolC::TSF組み換えリンゴはそれぞれin vitroで開花した。花成への効果は、AtFT>TSF>MdFTの順となった。プロモーターの効果は35S>rolCとなり、FTの種類および発現場所により花成が大きく影響されることが示された。また、AtFTにGFPを連結した場合、35S::AtFT/GFP、rolC::AtFT/GFP導入組み換えリンゴは、GFPの蛍光の確認、また融合タンパクの確認が出来たが、どちらもin vitro開花を示さなかった。以上のことは、各種FT分子のリンゴの花成促進に働く作用は、その配列や構造の解明によって明らかにされることを示唆している。そこで、MdFT1、MdFT2、AtFT、TSF、Hd3aのアミノ酸配列を比較し、花成に影響を及ぼす部位の解析を行ったので報告する。

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遺伝子組換えによるスギの花成制御技術を開発するには、花成制御に関わる遺伝子を特定し、その役割を明らかにする必要がある。我々はスギ雄花に由来する完全長cDNAライブラリーから、12個のMADS-box遺伝子を単離し、6つのクレードに分類できることを明らかにした。6つのクレードに属する代表的なスギMADS-box遺伝子について、35Sプロモーター下流にcDNAを連結し、シロイヌナズナに導入し、6種類の遺伝子の機能を解析した。その結果、野生型より花成の促進が確認されたシロイヌナズナ組換え体は2系統あった。一つはAGL6クレードに属する遺伝子（CjAGL6）、もう一つはSOC1クレードに属する遺伝子（CjSOC1）を導入した組換え体であった。花成促進を示した組換えシロイヌナズナでは、導入したCjSOC1もしくはCjAGL6の発現量は極めて高かった。一方、導入遺伝子の発現量が低い組換え体では、花成の促進は観察されなかった。次に、スギ苗木にジベレリンによる花成誘導をおこない、そのときの遺伝子発現の経時変化を測定した。CjSOC1の発現はジベレリン処理の1週間、CjAGL6の発現はジベレリン処理後1ヶ月後にそれぞれ上昇した。以上の結果から、2種類の遺伝子がスギの花成に大きく関与していることが示唆された。

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高等植物における単一細胞レベルでのプロモータ活性の測定は難しく、活性の細胞間のばらつきや時間変動の解析は大きな困難をともなう。我々はルシフェラーゼ発光イメージングにより、個体内の単一細胞レベルのプロモータ活性を測定することにウキクサ科の植物を用いて成功した。ウキクサ科の植物は無菌培養でき、小さく平坦であることから個体全体イメージングに向いている。我々の開発した測定系では標的プロモータ下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだルシフェラーゼレポータをパーティクルボンバーメント法により個体表面の細胞にまばらに導入し、高感度CCDカメラを用いて各導入細胞の生物発光量を測定する。この系では自動連続測定による時系列データの取得や測定時の光条件操作も可能である。本発表では恒常発現や概日発現が予想されるプロモータをLemna属とSpirodela属のウキクサ科植物及びシロイヌナズナに導入し、連続明、連続暗、明暗条件下で測定した結果を報告する。今回開発した、単一細胞レベルでの発現解析技術の新たな活用法についても広く議論する。

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生物は一日の周期的環境変動を予測して適切に応答するための概日リズムを持っている。ウキクサ (Lemnaceae) は単子葉植物に属し、Lemna 属の L. gibba と L. paucicostata がそれぞれ長日植物と短日植物であることから、概日リズムやその光周性機構への関わりについて生理学的知見が蓄積している。我々のグループはパーティクルガンによる一過的遺伝子導入系とルシフェラーゼを用いた生物発光レポーター系を組み合わせたシステムにより、ウキクサの概日リズムの分子メカニズムを調べ、モデル生物におけるシステムとの相似性あるいは差異について明らかにしてきた。
さらに詳細な分子機構を解析するため、安定な形質転換体の作製を試みている。ウキクサに由来するカルスを用いて、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入を試みたところ、カルスの細胞内での遺伝子発現が確認された。また、生物発光レポーター系を用いた解析から、カルスの概日リズムが個体とは異なることが示唆された。カルスへの遺伝子導入系の開発の現状と、その過程で明らかになってきたカルスのプロモーター活性特性および概日リズム特性について議論する。

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シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC7942の概日時計は試験管内でKaiA，KaiB，KaiC蛋白質をATPと共に混合するだけでKaiCのリン酸化リズムとして再構成できる。KaiCはATPaseであり，その活性は非常に低く，2つの重要な性質を持つ．第1に，広い範囲の温度条件でもATPase活性は一定であり，第2に， ATPase活性と概日リズムの周期の逆数は比例し， その活性が周期を規定する。KaiCにはこれら2つの性質を満たす分子内フィードバック機構が内在し，ATPを分解して発生したエネルギーを自身の分子内に蓄積することによって生じた分子内の歪みがKaiC自身のATPase活性を強く抑えるのではないかと我々は考えた。KaiCがこの機構を保持するのであれば，温度によってATPase活性が急激に上昇しても同時にブレーキも強まるため，その活性は一定に保たれる。また，周期の変異型KaiCは一定のATPase活性に戻すための復元力の強弱が異なるため，温度のような外乱によってATPase活性が上昇してもその活性の戻る速度は変異体固有の周期に依存する。このフィードバック機構を検討する上では温度を変化させた瞬間のATPase活性の変動を測定する必要がある。そこで，本研究では分解能の高いATPase活性の測定法を開発し，分子内フィードバックモデルについて検討した。

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Anabaena sp. PCC 7120は、窒素飢餓条件下で窒素固定細胞ヘテロシストを等間隔に分化する多細胞性シアノバクテリアであり，単細胞性のSynechococcusで従来解析されてきた時計遺伝子kaiABCのホモログを持つため，概日リズムと空間パターン形成を備えた最も単純なモデル生物と考えられる。私たちは？？) kai遺伝子制御機構や概日出力系に関するSynechococcusとの相違、？？)細胞間同調機構の有無、？？)光合成細胞とヘテロシストの概日制御の違い、？？)概日時計による分化・パターン形成の制御に注目してきた。今回は，殆ど解析されていないAnabaenaの概日機構の基本特性に関する興味深い知見を報告したい。SynechococcusのkaiBCの発現は最も高振幅な振動を示すが、Anabaena kai遺伝子群はほとんど発現振動を示さなかった。それにも関わらず、ゲノムワイドな発現解析から多くの概日発現遺伝子の存在が明らかになり，少なくともkai遺伝子発現制御とその出力伝達機構に何らかの重大な違いが示唆された。一方，高振幅な遺伝子発現振動をモニターする発光レポーターを開発し，概日リズム特有の周期の温度補償性を確認したほか，暗パルスに関してSynechococcus同様の位相応答曲線を得た。現在，Kai蛋白質の発現パターンやリン酸化についても検討を行っており，併せて報告したい。

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約24時間の生理的活性のリズムは概日リズムと呼ばれている。このリズムは栄養条件などの細胞外の条件が変わっても周期がそれほど変わらないという意味で”安定性”を有している。特に温度に関しては、この安定性は”温度補償性”と呼ばれている。概日リズムが生化学反応の組み合わせから発生している事と、多くの生化学反応の速度は10℃上がると2倍になるという事実は、矛盾しているように見え、古くから温度補償性の起源に関して関心を持たれてきた。
温度補償性に関して、一つの経験的事実が知られている。温度補償性が成立する範囲が生理学的温度に限定されおり、この温度範囲の外では直ちにリズムは停止する。古くから様々な生物においてこの現象に関して報告はあるが、温度が直接リズムを生み出す振動子に作用を及ぼしているのか、他の外部環境の影響及ぼすことによる間接的な影響なのかはあまりよくわかっていない。
我々は概日リズムを持つ最も単純な生物であるシアノバクテリアを用いてリズムが低温で停止する理由を明らかにしようと試みた。この生物においては、概日リズムを生み出す生化学反応(KaiCリン酸化リズム)は特定されており、試験管内で再構成することも可能である。この生化学反応を利用して、概日リズムが低温で停止する理由を様々な温度で観察した結果と力学系の分岐理論の知識を援用して議論する。

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シロイヌナズナENHANCER OF SHOOT REGENERATION (ESR) 1/ESR2はシュート再生において重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、ESR1::GFP、ESR2::CFP形質転換体を用いてシュート再生過程におけるESR1/ESR2の発現とシュート形成との関係を調べた。ESR1はシュート誘導培地で培養後1日目から発現し始めた一方で、ESR2は4日目から発現した。ESR1の発現はシュート形成に先立って始まり、シュート形成初期の間、発現し続けた。また、ESR1とESR2はSAM様構造で発現していた。このことはESR1がシュート分化のスイッチとして働き、ESR1とESR2がシュート形成初期のイベントに関わる可能性を示唆している。
また、ESR1の核移行を誘導したときのESR2の発現量を調べた。ESR1の核移行誘導は、ESR2の発現を約2.9倍上昇させた。しかしながら、ESR1によるESR2の発現誘導はシクロヘキシミドにより阻害された。このことから、ESR1はESR2の発現を制御しているが、それは間接的であることが示唆された。
また、ESR1/ESR2のタンパク質としての活性を調べるために、esr2変異体ではシュート再生効率が低下することから、その変異体においてESR2プロモーター制御下でESR1を発現させた。その結果についても報告する。

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イネ種子貯蔵タンパク質分解に関与するプロテアーゼREP-1の遺伝子Rep1の発現は、ジベレリン(GA)により制御されている。我々は、そのプロモーターのシス配列(CARE)に結合するMyb型転写因子が同一遺伝子にコードされた長さの異なる2種類の新規タンパク質であることを見いだし、CTMyb1L (長鎖型)、CTMyb1S (短鎖型)と名づけた。CTMyb1SはGA応答性転写因子OsGAMybと協調的にRep1の転写活性化に働く（2007年度年会）。本研究では、GA応答に関与するDOF型転写因子RPBFとCTMyb1との相互作用を蛍光タンパク質再構成法で調べた。その結果、単独のCTMyb1S/LとRPBF:CTMyb1S複合体は核に局在したが、RPBF:CTMyb1L複合体は細胞質に局在した。さらに一過的発現系により、RPBFとCTMyb1Sを同時に過剰発現させてもRep1プロモーターの転写活性レベルはCTMyb1S単独時とほとんど変わらなかったが、CTMyb1LとRPBFを同時に過剰発現させると転写活性の増加がみられた。これらの結果は、RPBF:CTMyb1L複合体が核外へ移行すると、Rep1が活性化されることを示している。したがって，CTMyb1LはGAに応答したRPBFと複合体を形成して他の転写抑制因子を核外へ移動することで転写抑制を解除すると考えられた。

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イネの貯蔵デンプンや貯蔵タンパク質は種子登熟期の短時間で生合成され蓄積される。イネのflo2変異体は乳白で小粒の胚乳を生じる。この変異体では、登熟期に強く発現する貯蔵デンプンや貯蔵タンパク質生合成に関わる遺伝子の発現量が顕著に低下するため、この変異の原因遺伝子は貯蔵物質の生合成に関わる制御因子であることが示唆された。flo2変異の原因遺伝子をマップベース・クローニングしたところ、第4染色体の1つの遺伝子に終止コドンが生じる変異が起こっていることがわかった。野生型イネよりこの遺伝子を単離し、flo2変異体に導入したところ、得られた形質転換体は野生型の表現型を示したことから、この遺伝子がflo2変異の原因遺伝子であることが同定された。そこで、この遺伝子をFLO2 (FLOURY ENDOSPERM 2) と命名した。FLO2遺伝子は緑葉および未熟種子で強く発現していた。また、この遺伝子の発現量は登熟の進行とともに増加した。FLO2遺伝子はTPRドメインを有する新規なタンパク質をコードしていた。また、FLO2と相互作用する因子として、bHLHタンパク質とLEAタンパク質が検出された。このことからFLO2はこれらの因子と協調的に種子貯蔵物質の生合成系遺伝子群の発現を制御しており、種子の大きさや品質に関わる重要な因子であることが示唆された。

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2010年度までの研究において、我々は12アミノ酸からなるペプチドシグナルをコードしているCLE1-7遺伝子の機能を解析してきた。その結果、低硝酸条件においてCLE1-7遺伝子が根で発現し、同じく根で発現する受容体タンパクであるCLV1と共に側根の伸長を制御していることを明らかにした。したがって、根でのCLE-CLV1カスケードの下流には側根の伸長を直接制御している因子が存在する可能性が高い。しかし、カスケードの全体像は不明である。本研究では、CLE-CLV1カスケードの全体像を明らかにすることを目的として、下流因子の探索と機能解析を行っている。
我々は、まずCLE3過剰発現株とclv1変異体を用いたトランスクリプトーム解析を行い、野生型株の遺伝子発現プロファイルと比較解析した。根から抽出したmRNAを用いてATH-1アレイによる解析を行った結果、CLE3過剰発現株とclv1変異体で逆の発現応答を示す候補遺伝子が9個見つかった。これら下流因子の候補遺伝子のうち、野生型株と比較して特にmRNA量の変化が大きかった3つの遺伝子についてさらに解析を進めている。これら3つの遺伝子はそれぞれ、Heat-shock protein、転写因子、トランスポーターをコードしていた。現在、これらの遺伝子の過剰発現株、プロモーターGFP発現株を作成し、その表現型と遺伝子発現の局在について解析している。

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ホスファチジルセリン（PS）は、動物細胞で様々な生理学的役割が解明されているが、植物細胞での役割は存在量が少ないためほとんど明らかになっていない。我々は、PSがシロイヌナズナの花に豊富に含まれることや、PS合成酵素をコードする遺伝子PSS1が葯や花粉で高く発現していることを明らかにしている。また、逆遺伝学的解析から、pss1ヌルアリルは劣性胚性致死を示し、まれに単離されるホモ変異株も形態異常および不棯を呈すること、へテロ変異株は一部の雄性配偶子の発達に異常があることを明らかにしている。
本研究では、相反交雑による変異アリルの伝搬率およびqrt1-1を導入したヘテロ変異体の花粉死亡率から、雄性配偶子の細胞死の原因は、ヘテロ植物体の葯の配偶体および胞子体組織の両方にあることを明らかにした。さらに、PSと結合する蛍光バイオセンサーGFP-LactC2を用いた花粉母細胞およびテトラド期から小胞子発達期における花粉細胞内の PSの動態観察から、 PSは小胞様構造と核膜でその表在性を動的に変化させ、特に核消失の見られる小胞子発達初期に核膜に表在することを明らかにした。以上の結果は、PSが小胞輸送や核膜における膜成分あるいは脂質標識分子として機能し、花粉小胞子発達に重要であることを示唆している。

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春植物は温帯から亜寒帯にかけての落葉樹林の林床に生息する。雪解けから頭上の木々の林冠閉鎖までの8週間程の短期間に発芽・開花・結実を終え、地上部は枯死し、地下部の貯蔵期間は翌年の春まで休眠する。畑で育成した場合でも、林内と同様な時期に地上部の老化・枯死が生ずることから、林冠閉鎖前に生ずる同調的な老化・枯死は光量の不足により受動的に生ずるものではなく、何らかの内生的なシグナル物質が積極的に関与しているものと思われる。
春植物の一つであるキバナノアマナのシュートの抽出物中には強い老化促進活性が認められた。この活性は老化開始直前にピークに達したことから、その本体が老化を制御しているものと思われた。老化促進活性を指標として純化を進めた結果、遊離のリノレン酸が単離された。開花以前の植物体のリノレン酸含量は低かったが、生育に伴い増加を続け、開花1週目で最大値に達し、地上部の老化はその後顕著となった。リノレン酸の最大値はキバナノアマナの葉の老化を引き起こすには十分であった。以上の結果はキバナノアマナはリノレン酸を蓄積し、それにより老化が生ずることを示唆している。林冠閉鎖後の暗い林内で個体を維持するには貯蔵物質の消費が必要がある。キバナノアマナのような春植物はそのコストを軽減させるために積極的な老化を獲得し、それにより狭いニッチを埋めることができたものと思われる。

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植物の根と地上部の先端に存在するメリステムでは細胞分裂を繰り返し、一定の細胞数に達すると、細胞の体積が劇的に増加して急激な細胞伸長を示す。この劇的な細胞機能の転換を制御する分子メカニズムには、多数の遺伝子の発現変動を伴う転写のカスケードとネットワークがこのプロセスに関与していると考えられる。遺伝子の発現を上位で制御する転写因子を同定し、その機能を解明することで、細胞分裂活性を抑制して細胞伸長へと転換させる分子機構、植物器官の形作りの制御機構を分子レベルで明らかにすることができ、植物バイオマスの効率的な増加に貢献できる。
我々の研究室で構築した詳細な根の遺伝子発現地図を用い、UPBEAT1(UPB1)と名付けたbHLH転写因子が根のメリステムサイズ決定に重要な役割を果たすことを見いだした。
UPB1変異株や過剰発現株を用いたマイクロアレイ解析、更にはChIP-chipを用いたゲノムワイドなUPB1標的遺伝子の探索により、UPB1はペルオキシデースを介した活性酸素種（ROS）シグナルを制御していることが分かった。ROSの染色実験から超酸化物はメリステム領域、過酸化水素は伸長領域に蓄積し、upb1変異株ではこの分布バランスが乱れていた。少なくとも2種類の異なるROSの根端における空間的分布が細胞の分裂から伸長への転換、ひいてはメリステムサイズの決定に重要であることが示唆された。

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MCA1はシロイヌナズナのCa²⁺透過性機械受容チャネル候補として単離された遺伝子で、MCA2はMCA1の唯一の相同遺伝子である。シロイヌナズナの根において、mca1では変異によるCa²⁺取り込み量への影響がわずかであるのに対し、mca2では取り込みが大幅に低下する。また、MCA1が根の全域で発現しているのに対し、MCA2は細胞伸長域でのみ発現しており、根端において異なった発現パターンを示す。
今回、MCA1とMCA2がシロイヌナズナの根端成長に及ぼす影響を細胞レベルで定量的に明らかにするため、その変異体の根端成長について動力学的解析を行った。mca1とmca2の解析を行った結果、mca1では変異による根端成長への影響がほとんどなかった。一方で、mca2では野生型に比べて細胞伸長域における体積増大速度と細胞体積に顕著な低下が見られた。この低下が生じた領域はMCA2の発現域と一致した。さらに二重変異体mca1mca2についての解析を行ったところ、mca2と同じ領域で体積増大速度と細胞体積に低下が見られたが、その低下の幅はmca2より小さかった。これらの結果から、MCA2によるCa²⁺取り込みが根端成長に直接的な影響を与える一方で、おそらくMCA1による微量のCa²⁺取り込みが何らかのシグナルとしての役割を果たし、二重変異体の根端ではその影響が顕在化している可能性が示唆される。

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オートファジーは生物に広く存在する細胞内成分の分解経路である。植物におけるオートファジーでは、その過程で生じたオートファゴソームあるいはオートリソソームと呼ばれる膜小胞が最終的に液胞と融合すると考えられている。これにより液胞膜面積が増大し液胞の拡大が起こると予想される。そこで我々は液胞の拡大が細胞の伸長を引き起こすと仮定しこれを検証した。
シロイヌナズナ芽生えの根端5 mmを切り取り、液体培地で2~3日間培養して1日毎にその長さを測定した。ショ糖を含む培地で培養すると根は伸長成長したが、培地からショ糖を抜くと根の伸長はほとんど見られなかった。このことは、この実験系における根の伸長成長が培地のショ糖に依存して起こっていることを示している。このショ糖依存の成長は、オートファジー阻害剤の3-メチルアデニンや、プロテアーゼ阻害剤のE-64d により阻害された。また、オートファジー関連遺伝子破壊株(atg5)は野生株と比べ根の伸長速度が遅かった。以上の結果はオートファジーが細胞伸長に寄与しているということを示している。

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細胞膜H⁺-ATPaseは植物の膜輸送において主要な働きを持つ酵素であり，細胞伸長や気孔の開口など，さまざまな生理現象に関与している．多くの植物において，同酵素は5つのサブファミリーを形成する10前後のアイソフォームとして存在し，生理現象ごとに異なるアイソフォームが機能していることが示唆されている．ハナスベリヒユ（Portulaca hybrid）はマツバボタン (Portulaca grandiflora) とスベリヒユ (Portulaca oleracea) の交雑種であり，その開花は光強度と温度の上昇によって誘導される．本研究室では30℃一定の培養条件において，同植物の花弁の粗ミクロゾーム画分におけるVanadate-sensitive ATPase活性が，開花直前の暗期中，さらには光照射による花弁の急激な展開の過程で顕著に上昇し，これらの活性上昇の主要因が細胞膜H⁺-ATPase量の増加であること等を明らかにしてきた．今回，開花時の花弁で発現している4種類の細胞膜H⁺-ATPase遺伝子を取得し，その配列を調べたところ，アミノ酸配列として79.6～91.2%の相同性を示し，すべてサブファミリーIIに属した．また，花弁における経時的な発現パターンや，発現の器官特異性は各遺伝子間で違いがみられた．現在，これらの遺伝子の発現に対する光や温度の影響等について検討を行っている

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Zrt/Irt-like protein (ZIP)は細胞内への金属取り込みを担う重要なトランスポーターファミリーの一つである。これまでに重金属集積植物の重金属耐性・集積性において重要な役割を担っていることが示唆されているが、その詳細は明らかにされていない。今回我々はNi集積性植物であるタカネグンバイから単離したZIPトランスポーターTjZNT1のNi耐性能における役割について報告する。TjZNT1はその塩基配列および酵母発現系を用いた機能解析の結果から、シロイヌナズナのZn/Cuトランスポーター遺伝子であるAtZIP4のオーソログであることが示された。また、タカネグンバイにおいてTjZNT1プロモーターGUS解析を行った結果、根の中心柱および葉脈にGUSシグナルが観察され、AtZIP4と同様にZn/Cuの根から地上部への輸送に機能していることが示唆された。定量的RT-PCRの結果からタカネグンバイにおけるTjZNT1の相対発現量はシロイヌナズナにおけるAtZIP4のおよそ1000倍であることが示され、タカネグンバイはTjZNT1を恒常的に高発現していることが示された。さらに、TjZNT1を高発現した酵母細胞は高いNi耐性を示し、これはZn/Cuを細胞内へ供給することがNi耐性へ貢献しうることを示唆している。現在、TjZNT1導入シロイヌナズナのNi耐性能を検討している。

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シロイヌナズナのmetal tolerance protein 1(MTP1)は液胞膜に局在し、細胞質の過剰な亜鉛を液胞へ能動輸送するZn²⁺/H⁺ exchangerである。MTP1は6回膜貫通型タンパク質で、4番目と5番目の膜貫通領域の間の細胞質側にHis残基25個をもつHis-rich loopが存在する。このHis-rich loopの大部分を欠失させると亜鉛輸送活性が上昇し亜鉛への親和性が低くなり、亜鉛に加えてCo輸送能を獲得する（JBC 2008, 283:8374）。
本研究ではMTP1のHis-rich loopの個々のHis残基の役割を明らかにするために、Hisを5個ずつAlaに置換した変異MTP1を作製し、Saccharomyces cerevisiae の亜鉛感受性株Δzrc1cot1に異種発現させた。それらの酵母を、亜鉛を添加した寒天培地・液体培地での機能相補実験を行い、置換変異を加えたMTP1の亜鉛輸送能を解析した。結果、置換した部位毎に亜鉛過剰条件での酵母の生育が異なった。これはHis-rich loopの25個のHisはそれぞれ亜鉛輸送能への関わり方が異なることを示唆している。さらにCo、Ni、Cd、Mnを含む寒天培地でも変異MTP1導入酵母の耐性を調べ、置換部位、金属毎に生育の上昇あるいは下降が見られたのでその結果についても報告する。

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イネの籾は開花後約40日で完熟するが、その間デンプンや貯蔵タンパク質が蓄積し、水分含有率にも大きな変動が見られる。これらのプロセスに関わるアクアポリンを調査するため、イネアクアポリン全33種の内、30種を対象にmRNAの発現量をリアルタイムPCR法を用いてステージ別に調べた。その結果、登熟開始時には多くの分子種が発現していたが、登熟中期になると発現しているアクアポリンの全mRNA量の大部分はOsPIP2;1とOsTIP3;1であることが分かった。Western blotting の結果、この2種のアクアポリンのタンパク質量は登熟中期以降に急激に増加することが分かった。また、免疫組織染色の結果、OsPIP2;1は籾の組織全体に存在しているが、OsTIP3;1は糊粉層に局在していた。以上の結果より、OsPIP2;1とOsTIP3;1は登熟中期に見られる水分含有率の急激な減少と高い相関があることが分かった。また、OsTIP3;1は籾以外の器官では発現がほとんど認められないことからも、糊粉層に特有な機能に関連している可能性が示唆された。

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Cold acclimation process plays a vital role in plants survival to cold temperature stress. To elucidate the cold acclimation process, we analyzed the osmotic root hydraulic conductivity under cold stress for prolonged time and showed that chilling sensitive rice roots respond to the cold stress by a gradual increase in its osmotic hydraulic conductivity. Compared to 25C control plants, low root temperature treatment (LRT) at 10C dramatically reduced the hydraulic conductivity. However it gradually increased during the 5 day treatment and reached 10 fold higher at day 5 compared to the plants whose LRT treatment was just started. The gradual increase of the root hydraulic conductivity was found to be linked with a gradual increase in the expression of root aquaporins, specifically the OsPIP2;5. Further, the contrasting expression pattern of aquaporins under LRT and whole plant chilling techniques suggests that shoot signal is a prerequisite for triggering the root aquaporin signal. Collectively, these results demonstrate that cold acclimation process is also functional in chilling sensitive plants and regulated by inter-cellular signaling of aquaporin expressions.

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オジギソウは熱や接触に応答し、屈曲運動を行う。この運動には水の移動が関与しており、主葉枕下部から急激に水が放出され膨圧が低下することで屈曲運動が起こると考えられている。このような素早い水の移動にはアクアポリンの関与が考えられた。当研究室では計7種のPIPアイソフォームが単離されており、それぞれの水透過性が測定されている。運動細胞で発現、機能しているPIP遺伝子を特定するために実生オジギソウの各部位からcDNAプールを作製し、real-time PCR及び半定量的PCRによって発現量の解析を行った。その結果、主葉枕にはPIP2;2、PIP2;3遺伝子が発現していることが示唆された。さらに、主葉枕を下部と上部に分割して解析した結果、PIP2;2遺伝子が下部に多く発現していた。屈曲運動は接触して数秒で反応することから、PIPのリン酸化及び脱リン酸化による活性制御が考えられ、本研究ではこれらの阻害剤を用いて機能解析を行った。結果、PIP2;2は脱リン酸化阻害剤により水透過性が向上した。リン酸化される個所として、他の植物同様PIP2;2 にはC末端にPKCリン酸化モチーフが保存されている。そのため、PKCによる活性への影響を観察するために変異体を作製した。その結果PIP2;2の3つのリン酸化モチーフは全てPKCのリン酸化による活性調節を受けていることが示唆された。

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アマモ（Zostera marina）は、生活の場を陸上から海水中へと移した単子葉植物である。海水中での生活に適応するため、アマモには独自の水分調節メカニズムが存在すると考えられる。そこで、アマモでの原形質膜アクアポリンに着目し、その遺伝子の単離と発現解析を行った。アマモの葉からは、2種類のアクアポリン遺伝子のcDNAが単離された。予想されるアミノ酸配列から、それぞれPIP1（ZoPIP1）とPIP2（ZoPIP2）と推定された。アクアポリンに特徴的な機能ドメイン（膜貫通領域、NPA モチーフ）が保存されていたことから、ZoPIP1とZoPIP2は水チャネルとして機能すると考えられる。ZoPIP1とZoPIP2の発現は、葉、花序軸、根、地下茎、雌花、雄花、種子・果実、発芽体で検出された。ZoPIP1とZoPIP2とも、葉や発芽体での発現は高く、対照的に雄花での発現は低かった。葉では、乾燥処理によって両遺伝子とも発現が増加した。また、種子では、ZoPIP1とZoPIP2の発現は成熟時よりも発芽時において高かった。これらのことから、ZoPIP1とZoPIP2は、干出によって草体が乾燥にさらされた場合の水分調節や、種子発芽時の水の吸水に関与していると考えられた。

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