クロロフィル蛍光は光合成の状態をよく反映すると考えられており，古くから多くの光合成研究に用いられてきた．我々はクロロフィル蛍光を二次元画像として経時的に測定できるシステムを用い，シロイヌナズナT-DNAタグラインのスクリーニングを行った．主に強光応答に欠損を持つ変異体を単離することを目的として，2段階の強光条件を用いた．まず，短時間の強光応答を観察するため，通常の光条件下で7日間成育させたシロイヌナズナに短時間（12秒）の強光を照射し，非定常状態のクロロフィル蛍光挙動を観察した．さらに長時間の強光応答として，24時間強光にさらした後に蛍光挙動によるスクリーニングを行った．これまでに約8,000個体の蛍光挙動を観察し，9つの候補株が得られている．このうち6個体については短時間の強光照射で野生株と異なる蛍光挙動を示しており，残りの3個体については24時間の強光処理後に挙動の違いが認められた．単離した候補株について，パルス変調蛍光法を用いて700μ Eの励起光照射時における定常状態の光合成を調べたところ，qP，qN，ETR，Fv/Fmのパラメーターが野生株と異なる値を示したが、定常状態の光合成には影響が見られない個体も存在した．この結果は，本スクリーニングにより強光下における非光化学消光，光化学消光，光合成電子伝達に欠損のある変異体が単離できたことを示している．

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Excess light exposure leads to inhibition of photosynthetic electron transport and photooxidative stress in plants. In this study we characterised photooxidative stress response of the knockout mutant of A. thaliana in signal recognition particle (cpSRP43) named chaos, which has permanently reduced photosystem II antenna. Chlorophyll fluorescence parameter and oxygen evolution data indicated that photosynthesis was more strongly inhibited by excess light (2,000 μmol/m²/s) illumination in chaos compared to WT. However, when returned to low light conditions chaos recovered faster from photoinhibition. ATP/ADP ratio was higher in chaos than in WT in low light-acclimated condition. When plants were subjected to photooxidative stress conditions (650 μmol/m²/s, 4 °C), chaos exhibited better photosynthetic performance and survival compared to that observed for WT. It is concluded that a lack of functional cpSRP43 protein leads to a higher energy conservation and to constitutive tolerance to photooxidative stresses.

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　光励起エネルギーの移動の過程で生じる一重項酸素は、種々の生体分子を標的にする酸化力の強い活性酸素種である。従来、光化学系IIの光阻害のメカニズムとして、励起した三重項状態の反応中心クロロフィルが励起エネルギーを酸素分子に渡し、生じた一重項酸素がD1タンパク質等を攻撃して光化学系IIを失活に導く、という説が数多くのin vitro実験により提唱されてきた。しかし、このメカニズムが実際in vivoで起こっているかどうかは不明である。私たちは、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803を用いて一重項酸素の作用機構をin vivoで詳細に検証した結果、一重項酸素は光化学系IIに直接損傷を与えるのではなく、光によって損傷を受けた光化学系IIを修復するプロセスを阻害することを見い出した。さらに、それが光化学系IIの修復を担うD1タンパク質の新規合成の阻害に起因し、特に翻訳の過程が一重項酸素の最初の標的になっていることを明らかにした。光化学系IIの光損傷のメカニズムについても新たなモデルを挙げて議論する。

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グリシンベタイン（ベタイン）は適合溶質（compatible solute）の一つで、様々な生物種でストレス条件に応答して細胞内に蓄積される。これまでの形質転換株を用いた解析から、ベタインが様々なストレスに対する耐性を与えることが示されてきている。しかしながら、耐性獲得の詳細な分子機構については不明な点が多く残されている。
codA遺伝子は、ベタイン合成酵素の一つコリンオキシダーゼをコードしている。codAを導入したラン藻Synechococcus sp. PCC7942は、コリン存在下でベタインを合成し細胞内に蓄積することができ、塩と低温ストレスに対する耐性を獲得している。この株を用いた解析から、低温条件下（20^oC）ではベタインによって光化学系II（系II）の光損傷後の修復が促進されることが示された。しかしながら、通常の生育温度（34^oC）で強光照射を行ったところ、ベタインによる大きな効果は認められなかった。このことは、通常の生育温度では系IIの修復は十分に行われており、ベタインによるそれ以上の促進は起らないことを示している。低温や塩は系IIの修復を阻害するが、おそらくベタインはこの阻害を抑制する働きがあると考えられる。現在、塩ストレス条件下での光阻害について解析を行っているところである。

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　私達はこれまで陸生で高い乾燥耐性能を持つラン色細菌Nostoc communeを用いて研究を行ってきたが、Sorbitol溶液を用いて高浸透圧処理することにより乾燥過程と同様な状態を作る事が出来ることを報告した。その研究の中で細胞内の水分が減少する早い段階で本ラン色細菌は積極的に光化学系の活性を失うことがわかった。
　今回は乾燥途中の様々な段階でNostocの光化学反応中心複合体がどのような状態にあるかをさらに詳しく調べるため、種々の浸透圧条件下での光と温度の影響を調べた。その結果、Nostocは光によっても系II活性が低下せず、高温耐性も5℃ほど高温にシフトすることがわかった。一方、乾燥耐性のないSynechocystis sp. PCC6803では、水分が細胞から失われると共に光による活性の低下が見られ、乾燥状態でも高温感受性は変化しなかった。
　また、液体培養したNostoc communeの色々なの株について高浸透圧処理の光化学系II活性に対する影響を調べた。液体培養したNostocは水分減少の早い段階で光化学系を失活させることはなく、高浸透圧条件下においても活性を維持することがわかった。この結果から、常に液体中にされされているNostocは乾燥耐性を維持する機能が無くなってしまったことが考えられる。

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Freezing tolerance of cyanobacteria, Nostoc commune and Synechocystis sp. PCC6803, and the effects of alcohol were studied by measuring their photosynthetic activities. Because freezing stress usually causes water stress simultaneously, the effects of freezing stress were compared with those of drying stress. N. commune is terrestrial and is highly tolerant to drying stress, while Synechocystis is not. The following results were obtained. 1) N. Commune can survive freezing stress even at temperatures as low as -78^oC, while Synechocystis could not when it was frozen at -20^oC. 2) Decreases in fluorescence emission from photosystem (PS) II and photochemical activities of PSI and PSII showed that water loss from the N. commune cells was not so large as in the case of air drying. 3) Addition of 5% methanol to the Synechocystis solution protected the cyanobacterium from freezing damage. The effects of alcohol will be discussed.

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In the present study we investigated the effect of the Calvin cycle inhibition on photoinactivation of PSII. When Chlamydomonas reinhardtii (wild type) cells were exposed to light, glycolaldehyde (GA), which inhibits the Calvin cycle, stimulated the photoinactivation. The effect of GA on the photoinactivation was similar to that of chloramphenicol. The photoinactivation in a Rubisco missense mutant (10-6C) was faster than that in wild-type. However, it was not further accelerated by GA and chloramphenicol. After photoinactivation treatment, PSII activity in wild-type cells gradually recovered under low light. However, no significant recovery was observed when the Calvin cycle is inhibited. The inhibition of the Calvin cycle suppressed the synthesis of proteins, which are encoded in chloroplastic genome. These observations suggest that the level of photoinactivation is enhanced by the inhibition of the repair system when the Calvin cycle is inhibited by high temperature.

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酸化的ストレスにより発現誘導されるシロイヌナズナの新規酵素NADPH:2-alkenal α,β-hydrogenase (ALH) は，過酸化脂質から生ずる4-ヒドロキシノネナール（HNE）などの α,β-不飽和アルデヒドを還元し消去する。ALHの抗酸化機能を検証するために，ALH遺伝子をタバコに導入し，ALH過剰発現ホモ接合体3株を得た。HNEをタバコ葉に与えるとPSII活性が低下し，2日で組織が壊死した。ALH過剰発現株はいずれもHNEによる傷害が軽微であり，ALH が in vivo でHNE を消去・解毒することを示した。メチルビオローゲン（MV）による光酸素ストレスにもALH過剰発現株は耐性を示し，3つの過剰発現株のHNE耐性とMV耐性の強さは良い相関性を示した。過剰発現株のSOD，APXなどの活性酸素消去酵素の活性は野生株と同程度であり，過剰発現株のMV耐性はALHによるHNE解毒消去の効果と考えられた。すなわち，不飽和アルデヒドは光酸素ストレス傷害因子のひとつであり，ALHによる解毒作用はストレス耐性に寄与する。

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葉緑体NAD(P)H dehydrogenase (NDH)は、PS I周辺循環的電子伝達に機能する複合体である。我々はNDHの生理的意義を明らかにするため、NDH活性を欠くシロイヌナズナの核遺伝子変異株crr2(crr2-1, crr2-2)を単離した。光合成の主要複合体のウエスタン解析を行った結果、crr2では両光化学系及びCytb₆fのサブユニットの蓄積量に影響は見られなかったが、NdhHタンパク質量が著しく減少していた。Map-based cloningによりCRR2は9つのPPRモチーフを含む葉緑体タンパク質をコードする事を確認した。PPRタンパク質はオルガネラ遺伝子の転写後発現制御に関わるという報告から、CRR2はNDH遺伝子の発現に関与することが示唆される。そこで葉緑体ゲノムにコードされるNDHの11サブユニット遺伝子のノーザン解析を行ったところ、ndhBのRNAサイズに相違が認められた。詳細に調べた結果、crr2では成熟したndhB mRNAが見られず、上流のrps7と結合した前駆体RNAが蓄積していた。また野生株を用いたndhBの5'-RACE解析の結果、mRNAの成熟課程でCRR2により切断されると示唆されるmRNA切断部位を同定した。以上のことから、crr2においてrps7とndhB mRNAの転写後切断に異常が生じ、そのためにndhBが翻訳されずNDH活性を欠失した事が明らかとなった。

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PSI cyclic電子伝達は、PSIのアクセプターから電子をプラストキノンに戻すことでΔpHの形成に貢献している。高等植物のPSI cyclicには2つの経路、FQRとNDHが関わることが知られている。FQR活性に異常があるシロイヌナズナpgr5変異株の解析により、FQRは強光下でNPQを誘導するためのΔpH形成に必須であることが明らかになっている。一方NDHは、ストレス条件下でストロマの過還元を防ぐため補助的に機能していると考えられる。我々はpgr5変異株と、NDHを欠くシロイヌナズナcrr2変異株との二重変異株を作成することで、PSI cycle電子伝達を完全に欠く植物を得た。二重変異株は、弱光下でも電子伝達効率は低下しており、激しく生育阻害を受けた。また、PSIは電子受容体の欠乏によりpgr5よりも還元状態にあった。この結果は、二重変異株ではCO₂固定に必要なATPが足りておらず、ストロマが過還元状態に陥っていることを示している。植物の光合成において、PSI cyclic電子伝達によるΔpH形成は、ATP合成に必須であると考えられる。

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赤外光（FR）照射下のP700酸化還元レベルは、FRの光強度に依存する電荷分離の速度と、循環的電子伝達経路および光化学系I内の電荷再結合による電子の流入速度とにより決定される。昼間、太陽光を受けている植物葉を暗所に移動し、FRによるP700酸化レベルを測定したところ、夜間の測定に比べ、著しく酸化レベルが低くなっていることを見出した。暗適応した葉に、飽和光を照射することでも、同様なP700酸化レベルの低下が観察されたことから、昼間は太陽光照射により、ストロマが過還元状態となり、循環的電子伝達および電荷再結合が促進されたものと推定した。強光により、FR下のP700酸化レベルが著しく低下した葉を暗適応させることで、FR下の酸化レベルがゆっくり回復（半回復時間が5時間程度）した。すなわち、この変化は可逆的であり光化学系Iの光阻害ではないと推定された。強光照射した無傷葉緑体にDBMIBおよびメチルヴィオロゲンを添加する実験により、循環的電子伝達と電荷再結合の寄与の割合を見積もったところ、両者とも同レベルの寄与であった。また、強光照射後のP700のFR下の酸化レベルの低下は、プラストキノンの非光化学的還元およびNAD(P)H濃度の上昇と関連していた。現在、この現象が両光化学系の量子収率に与える影響について検討している。

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In order to reveal the molecular mechanisms of unusual pigmentation patterns of flowering peach, gene expression of pink-coloured flowers and variegated ones were investigated by RTPCR Southern-hybridization. The CHS gene was strongly expressed in both of pink-coloured flower buds and variegated ones. But the DFR gene and the AS gene were strongly expressed only in pink-coloured flower buds. Therefore variegation considered to be caused by a transcription factor regulating the expression of structural genes in the later part of anthocyanin synthesis. Complementation of pigment synthesis was attempted by introducing five genes encoding Antirrhinum transcription factors into variegated flowers by particle bombardment. Red spots were reverted in petals by Rosea1 one of MYB-like transcription factors. Two MYB-like clones expressed only in pink-coloured flower buds were obtained by RTPCR cloning as a candidate responsible for the variegation.

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　FWAはホメオドメインを持ったタンパク質をコードする。この遺伝子領域のDNAメチル化レベルの低下した突然変異体fwa-1 では、異所的遺伝子発現と開花時期遅延形質が観察される(Soppe W. et al. Molecular Cell 2000)。
　前回大会において、FWAは胚乳において発現する遺伝子であることを報告した。今大会では胚乳での遺伝子発現とFWA遺伝子のエピジェネティックな制御の相関を知る目的で、遺伝子発現のparent-of-origin 特異性を解析した結果について報告する。また、DNAメチル化酵素の突然変異体、met1 (Methyltransferase1), cmt3 (Chromomethylase3), drm1 drm2 (Domains Rearranged Methltransferase1, 2) を用いてFWA遺伝子のインプリンティングの制御機構を解析した。これらの結果と現在までに得られている知見をもとに、植物におけるインプリンティングのモデルを議論したい。

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接合藻ミカヅキモ（Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex）には、+型、−型と呼ばれる性が存在し、両者による接合子形成には、二種の性フェロモン（PR-IP及びPR-IP Inducer）が関わることが明らかになっている。これらに加え、接合過程初期の有性的細胞分裂（SCD）を誘導する性フェロモン（SCD-inducing pheromone, SCD-IP）の存在も確認されている。これらのうち、－型細胞から放出され＋型細胞の有性分裂を誘導するSCD-IP-minusは、＋型細胞からのPR-IP産生を誘導する PR-IP Inducerの生理・生化学的特徴と類似していることから、両者が極めて近い関係にあることが示唆された。酵母を用いて組換え型PR-IP Inducerを産生したところ、発現産物はPR-IP Inducerとしての活性のみならず、SCD-IP-minusとしての活性をも示した。またPR-IPの産生誘導に必要な時間よりも、極めて短い時間、組換え型PR-IP Inducerを処理することで、有性分裂の誘導が可能であった。以上のことから、1．有性生殖過程においてPR-IP InducerがSCD-IP-minusとしても機能する、2．これらの生理活性の発現は異なる機構による、ことが示唆された。

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ミカヅキモは、陸上植物ともっとも近縁な系統関係にある単細胞シャジクモ藻類である。中でもClosterium peracerosum-strigosum-littorale complexでは、性フェロモンを介した有性生殖機構について解析中であり、植物における有性生殖機構の進化を考える上で重要な材料といえる。本研究では、有性生殖過程の細胞のEST情報を取得し、さらにDNAマイクロアレイの作製を行った。これまでに、1190クローンの塩基配列を決定し、最終的に760のクラスターを得た。BlastX解析の結果、370種は既知のタンパク質との相同性を示さず、ミカヅキモに特徴的であることが示唆された。得られたクローンの中には既知の性フェロモンのホモログも含まれており、未知の性フェロモンをコードしている可能性も考えられた。これらに2304種の配列未決定のESTを加え、3072スポットからなるcDNAマイクロアレイを作製した。有性生殖誘導前と誘導初期（8時間）の細胞からmRNAを回収し、シグナルを比較した結果、有性生殖時には、性フェロモン及びそれらのホモログに加えて、ロイシンリッチリピートをもつもの、受容体型プロテインキナーゼをコードすると思われるものなど多数の遺伝子発現が顕著に高まることが明らかになった。今後、有性生殖の様々なステージを比較し、遺伝子発現プログラムの詳細を明らかにする予定である。

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　クラミドモナスは、窒素(N)飢餓条件下に置かれると、-Nストレスに対する適応プログラムだけでなく配偶子形成のプログラムも開き、栄養細胞から配偶子に分化する。私達は、クラミドモナスのcDNAマクロアレイを使って-N条件下で発現が顕著に上昇する約100クローンをスクリーニングし（Abeら、植物生理学会2002年度大会）、さらにその中から配偶子形成時に特異的に発現する19種類の新規Nsg（N-starved gametogenesis）遺伝子を単離した。本研究では、同調化した配偶子形成システムを用いて、これらのNsg遺伝子の発現プログラムを詳細に検討した。
　同調化したG₁初期の栄養細胞を-N培地に移すと、約2時間後から配偶子形成が急激におこり4-5時間目には95%以上の細胞が配偶子になった。-Nに移してから8時間目までの1時間毎にサンプリングした細胞から調製したRNAを用いてノザン解析を行った結果、Nsg遺伝子は、その発現時期を、初期（1-2時間目；1遺伝子）、中期（3-4時間目；15遺伝子）、後期（6-7時間目；3遺伝子）の3クラスに分類された。また、数種類の既知の性分化遺伝子における発現パターンとの比較により、初期および後期発現遺伝子は-Nストレスに対する適応プログラムに関連するものである可能性が高く、一方、中期発現遺伝子は配偶子形成プログラムに関与することが示唆された。

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　ヒロハノマンテマはXY型の巨大な性染色体をもつ雌雄異株植物である．染色体末端には特徴的なサテライトDNA（Sl-distal-satDNA）が存在する．Sl-distal-satDNAは，常染色体では8対の両腕と3対の片腕に局在し，性染色体ではX染色体の両碗，Y染色体の片腕に局在する．構築中のBACライブラリーからSl-distal-satDNAの繰り返し構造を含む11個のBACクローンを単離した．単離されたBACクローンをそれぞれ6種類の制限酵素で処理し，Sl-distal-satDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行うと，ラダー状のバンドを示す制限酵素がBACクローンごとに異なることを見出した．それらの最小単位である約310bpの塩基配列を決定し，近隣結合法を用いて無根系統樹を作成したところ，11個のBACクローンより得られた繰り返し単位は，4つのクラスター（SacI，KpnI，E, Fファミリー）を形成した．染色体上の分布を調べるため，KpnIファミリーとSacIファミリーの配列をプローブとしてマルチカラーFISHを行ったところ，KpnIファミリーは7番染色体に存在することを見出した．Sl-distal-satDNAを構成する繰り返し単位は，ファミリー間で多様性を持ち，それを用いてヒロハノマンテマの各染色体を識別することが可能であることを明らかにした．

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　我々は、陸上植物における性の決定・分化に必要な遺伝子群の解明を目指し、雌雄異株植物であるゼニゴケの性染色体について全遺伝情報の解読を行っている。ゼニゴケY染色体は約10 Mbと見積もられ、Y染色体特異的反復配列が蓄積している領域YR1（約4 Mb）と、その他の領域YR2（約6 Mb）に大別できる。YR1については、制限酵素切断パターンの異なる25個の代表PACクローン及び470-kbのコンティグ正味の配列情報を得た。YR2については、全長約5.94 Mbのコンティグ地図から、重なりが最小となる44個のPACクローンを選び、配列解析を行った。YR1より見出された遺伝子はY染色体に複数コピー蓄積しており、YR2より見出された遺伝子はY染色体にのみ存在する単一コピー遺伝子であることが分かり、YR1、YR2それぞれの領域で、遺伝子の存在様式に差異があることを示した。Y染色体とX染色体における遺伝子構造の違いと合わせて、ゼニゴケY染色体およびその遺伝子の進化について考察する。

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シロイヌナズナABI3は胚発生初期から発現する転写制御因子の一つであるが、この遺伝子の発現制御機構は未だ解明されていない。我々はこれまでにABI3相同遺伝子C-ABI3をニンジンより単離し、その発現がABI3と同様に胚発生初期から見られることを確認してきた。今回は、胚発生初期における遺伝子発現制御機構の解明を目的とし、ニンジン不定胚形成系を用いてC-ABI3の発現制御機構を解析した。まず、C-ABI3のプロモーター領域を単離し、胚特異的遺伝子発現に関与する新規のシス領域Carrot Embryonic Element 1（CEE1）を同定した。CEE1は形質転換ニンジン不定胚およびシロイヌナズナ種子胚においてGUS遺伝子の発現を誘導した。また、ゲルシフトアッセイの結果、CEE1には複数のニンジンEmbryogenic Cell核タンパク質が結合することが示唆された。そこで、イーストワンハイブリッド法を用いてCEE1結合因子の探索を行い、7種類の遺伝子を単離した。これらはすべてAP2/EREBP領域を持つ転写制御因子であった。各々のCEE1 結合因子について発現解析を行ったところ、いずれもニンジン不定胚・種子胚において発現する遺伝子であったが、これらの遺伝子の発現特性には差異が認められた。このことから、7種のCEE1 結合因子はそれぞれ特有の機能を持つ胚発生制御因子である可能性が示唆された。

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　シロイヌナズナにおいては、胚形成に関わる主要な転写制御因子としてABI3、LEC1、FUS3が知られており、その欠損変異株ではlate embryogenesis abundant(LEA)タンパク質を含む貯蔵タンパク質が減少している。我々は、ニンジンからLEAタンパク質に分類されるembryogenic cell proteins(ECPs)を同定し、その対応遺伝子(DcECP31、DcECP63)を単離してきた。これらはABI3のニンジンホモログであるC-ABI3によって発現制御されており、種子発達後期に発現していることが明らかとなっている。しかし、ニンジンにおいては、FUS3ホモログが単離されておらず、C-ABI3、C-LEC1遺伝子欠損変異株も得られていない。そこで、DcECP31およびDcECP63のシロイヌナズナホモログAtECP31、AtECP63を単離し、その発現解析を進めている。今回は、ABI3、LEC1、FUS3の欠損変異株や過剰発現体を用い、AtECP31およびAtECP63の関係の発現を制御している因子が各々異なることを明らかにしたので報告する。

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　体細胞から比較的容易に個体再生を行うことができるニンジン不定胚形成系を用いて、新規な不定胚形成制御遺伝子の単離を試みた。
　ニンジンではオーキシン存在下で不定胚形成能を有するEmbryogenic Cell (EC) を維持することができる。この状態においてはECからの不定胚形成は認められず、培地からのオーキシン除去により初めて不定胚が形成される。従ってこの誘導過程において、発現してくる遺伝子が不定胚形成に必要な遺伝子であると考えた。そこで、オーキシン除去前のECとオーキシン除去後のECから Total RNAを抽出して、サブトラクション法により、オーキシン除去後特異的に発現増加してくる遺伝子として18B-H10をを単離した。この18B-H10は全長1523bpであり、推定アミノ酸残基は443残基であった。ホモロジー解析の結果、ニンジンEP1と最も高い相同性があり、自家不和合性に関与しているS-locus-glycoproteinとも相同性があった。18B-H10はECをオーキシン除去処理することにより発現誘導され、オーキシン除去後8時間をピークに発現量は低下した。一方、実生や不定胚形成能を喪失したNon-Embryogenic Cellでの発現は認められなかった。
　以上のように今回単離した18B-H10は不定胚形成能を有する細胞において、オーキシン除去により一過的に発現することが明らかとなり、現在その生理的役割について解析を進めている。

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　ニンジンの胚軸切片を2,4-Dで処理し、次いで2,4-Dを含まない培地へ移して培養すると体細胞胚が形成される。2,4-Dがどのようにして分化している体細胞を胚形成可能な細胞に転換するのかは非常に興味がもたれる点である。我々は胚軸切片を2,4-D処理することで特異的に発現する遺伝子を検索することが体細胞から胚形成可能な細胞に転換する機構を解明する糸口になるのではないかとの認識で本実験を始めた。
　ニンジン胚軸切片を、（1）2,4-Dで48時間培養したもの、（2）2,4-Dで24時間培養し、次いで2,4-Dのない培地で24時間培養したもの、（3）対照実験として2,4-Dのない培地で48時間培養したもの、の3種を試料として、これらからそれぞれ全RNAを調製し、これら3つの試料をDifferential display法を用いて比較した。その結果2,4-Dで処理した試料にのみ存在するバンドをクローニングし、部分塩基配列を決定した後、定量RT-PCRによる解析結果から最終的に2,4-D処理によって特異的に発現する3つの遺伝子（No.130、No.151、No.209）が得られた。これら3つの遺伝子はいずれも体細胞胚形成の球状胚までの初期段階に発現し、それ以降の心臓型胚、魚雷型胚および幼植物体の段階では検出されなかった。現在はこれら3つの遺伝子についてさらに上流の塩基配列の解析を進め、その同定を試みている。

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　私達はニンジンにおいて体細胞から直接胚を形成する体細胞胚形成系を確立し、種々の研究を行ってきた。再生したニンジン植物体を2,4-Dで短時間処理し、次いで2,4-Dのない培地に移し培養すると細胞塊を経て、球状胚、心臓型胚、魚雷型胚を形成した後、植物体へと再生する。従来の体細胞胚形成系では細胞塊に2,4-Dを加えるとその後の形態形成が阻害的に働くことが知られている。今回は、2,4-Dが細胞塊からの胚の形成をどのように阻害するかを検討した。細胞塊を高濃度（1mg/l）の2,4-Dで処理すると、まったく胚が形成されない。その時の細胞塊の表層細胞をSEMで観察すると、表層の薄い膜のようなものが崩壊している様子が観察され、この崩壊が形態形成に深く関わっていると考えた。次に、2,4-Dで阻害された細胞塊と、2,4-Dを含まない培地で正常に胚形成が進行しているものとで差異的に発現する遺伝子をsubtraction法で検索した。その結果、胚形成が阻害された2,4-D を含む培地で培養した細胞塊において、特異的に発現している遺伝子をクローニングし、その全長配列を決定した。その遺伝子はトマトのpolygalacturonaseと高い相同性を持っていた。このことから、2,4-Dにより誘導されたpolygalacturonaseが細胞表層のペクチンを分解して、正常な形態形成を阻害しているのではないかと考えた。また、2,4-D によって阻害を受けた細胞塊の細胞壁画分に高いpolygalacturonase活性を確認した。

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　ロッカクヒルギBruguiera sexangulaの液体培養細胞は、マングローブ植物から誘導された唯一の培養細胞系で耐塩性を保持している。この細胞は、細胞質からの塩の排除や、適合溶質の生成のために、一般の細胞より多量のATPをつかうものと思われる。10日目の細胞を150 mM NaClを含む改変Thompsonのアミノ酸培地に移すと呼吸の増加が確認された。この時、解糖系中間産物の変動を調べた結果、フルクトース6リン酸(F6P) の減少とフルクトース1,6ビスリン酸(F1,6BP)以降の中間産物の増加が確認された。そこで、F6PからF1,6BPを触媒するATP依存ホスホフルクトキナーゼ(PFK)か、植物に特有な、この反応のバイパス経路であるピロリン酸:フルクトース-6-Pホスホトランスフェラーゼ(PFP)のステップでの活性化が示唆された。ロッカクヒルギ細胞から精製されたPFKとPFPの最大速度は、NaClにより大きくなり、PFKのF6Pに対するKm値はNaClにより低下し、PFKのVmax/Km値は150 mM NaClにより、2倍以上になった。高濃度のATPはPFKの活性を阻害したが、NaClによりこの阻害の回復が確認された。一方、ロッカクヒルギ細胞のPFPはF2,6BP依存性であり、1 μM F2,6BP存在下で、NaClにより活性化された。



　

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これまでに我々は、イネカルスが10％グルコースを含む培地では多くの澱粉を蓄積すること、また、その条件下ではAGPase large subunit（accession D50317　以下AGPL）の発現量が澱粉含量の増加と比例して上昇することを報告した。今回は澱粉蓄積のメカニズム、つまり何を契機として澱粉合成が開始されるのかを明らかにするためにまず、培地中への糖添加に対する澱粉合成および糖代謝関連遺伝子の発現応答について調べたので報告する。N6D培地を基本とした3種類の培地（糖を含まない、3％スクロースを含む、または10％グルコースを含む）を用いてイネカルスを培養し、継代後1日おきに3日間サンプリングし、全RNAを調製した。これらを鋳型とした定量的RT―PCRによって、9種類の糖代謝および9種類の澱粉合成関連遺伝子の発現を調べた。その結果、発現量が、（1）澱粉含量の増加と比例するもの、（2）反比例するもの、（3）糖の添加で誘導、（4）抑制されるもの、（5）ユビキタスなもの、さらに（6）極めて低いもの、の6様式に分類された。今回調べた遺伝子中でもやはりAGPLの発現だけが澱粉の蓄積と比例していた。今後はこの条件で誘導されるであろうAGPLの発現を制御している因子の探索を行う。

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　多くのラン藻種における貯蔵炭水化物はグリコーゲンであり、これは、植物デンプン（アミロペクチン）の原始的な形であると考えられる。植物におけるアミロペクチン構造の形成機構を明らかにすることを目的として、ラン藻 Synechococcus sp. PCC 7942 株のポリグルカン代謝酵素変異株を作成した。
　グリコーゲン合成酵素（GS）、分枝酵素（BE）、イソアミラーゼ（ISA）各遺伝子のコード領域内にクロラムフェニコール、スペクチノマイシン、カナマイシン耐性遺伝子がそれぞれ挿入した形質転換株を得た。BE および ISA 変異株については、野生型遺伝子が消失していることを確認した。単一遺伝子の変異株に加え、BE と ISA については二重変異株を作成した。
　野生株および変異株における貯蔵多糖の分枝構造について、α-1,6-結合切断後、キャピラリー電気泳動法により解析を行った。分解後の Synechococcus のグリコーゲンは、グルコース鎖重合度（DP） 6 の位置に分布極大を示した。BE 変異株では、DP 6 のピークが著しく減少し、逆に長鎖（DP ≥ 10）の割合が増大した。ISA 変異株では、短鎖（DP 2 から 3）の含量が増え、DP 8 前後の糖鎖が減少した。BE/ISA 二重変異株では、それぞれの変異株での影響が相加的に現れた。

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　高等植物であるシロイヌナズナからエタノール高感受性変異株geko1（gek1）を単離した。gek1は0.03%のエタノール存在下で発芽・生育共に阻害されるが、エタノール非存在下では正常に生育する。マッピングにより原因遺伝子を同定した結果、GEK1は新規な遺伝子で、機能を示唆する既存のドメインは認められなかった。相同性検索の結果、興味深いことに植物と古細菌にのみ存在が確認された。
　本研究では、GEK1の機能を明らかにする目的で、植物、大腸菌、酵母の系でGEK1の過剰発現を試みた。GEK1を過剰発現させたシロイヌナズナでは、エタノール高感受性の表現型が回復しただけではなく、エタノール耐性を獲得していた。反対にco-suppressionが起きたと思われる植物体は、エタノール高感受性を示し、植物体内のGEK1発現レベルとエタノール耐性に相関が見られた。一方、大腸菌や酵母でGEK1を過剰発現させたが、エタノール感受性に変化は見られなかった。以上の結果は、GEK1タンパク質が、植物（もしくは植物と古細菌）特異的なエタノール代謝経路に関与している可能性を示唆した。この機能未知であるGEK1の役割について考察したい。

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植物におけるリン酸代謝の全体像を明らかにするために，リン酸化合物の網羅的解析手法の確立を目指している。今回は，多成分の一斉分析法として有効であるイオンクロマトグラフィーを用いた糖リン酸の分析法の開発をおこなった。イオン交換分離－パルスドアンペロメトリー(酸化還元能の)検出（HPAE-PAD）法で糖リン酸を測定する方法はすでに報告されているが，高等植物に適用した例はほとんどない。そこで，シロイヌナズナに本法を適用し、含有糖リン酸の網羅的分析法を検討した。
クロマトグラフィーに適用するためには，糖リン酸の代謝状態を変化させないよう，試料採取直後に酵素を不活性化する必要がある。そこで，塩酸抽出，TCA抽出，マイクロウェーブ，限外ろ過，熱処理などの方法を試みた。塩酸やTCAによる抽出は，イオン交換カラムにおける交換容量超過を引き起こし定量的な測定が困難であった。限外ろ過および熱処理では，処理前に試料をホモジナイズする必要があり，その間に代謝状態が変わることがわかった。マイクロウェーブを適用した場合は，試料の含有水分量に対する処理時間などの微妙な調節が困難であった。そこで，試料を凍結乾燥して酵素活性を停止した状態で熱処理することによって問題を解決し，本法に適した条件を決めた。この手法を用いて培地のリン酸濃度を変えて生育させたシロイヌナズナの分析をおこなった。

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　グリセロール‐3‐リン酸アシルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.15; GPAT）は真正細菌および真核生物におけるグリセロ脂質生合成の初発反応を司る酵素である．真核生物はゲノム中に複数のGPAT遺伝子を持ち，それは細胞内共生によって獲得された遺伝子に由来すると考えられる．植物ではGPAT活性は3つの細胞内小器官（小胞体、色素体、ミトコンドリア）にみられるが，色素体のGPATに対する核コード遺伝子（ATS1）のみがこれまで報告されている．
　 ATS1遺伝子のコードするGPATは水溶性酵素であるのに対し，ラン藻のGPATは膜結合性の酵素であると予測されている．そのため，ATS1遺伝子の進化的起源およびラン藻GPAT遺伝子との関係について興味が持たれたが，これまでラン藻のGPAT遺伝子については全く報告がなかった．今回，我々は，種々のアシルトランスフェラーゼで保存されているアミノ酸配列モチーフ(Lewin et al. (1999) Biochemistry 38: 5764-5771)を，ラン藻Synechocystis sp. PCC6803のゲノムに対してProScanによる検索を行い，ATS1の祖先型である可能性の高い新規のアシルトランスフェラーゼ遺伝子（CyGPAT）を単離した．本遺伝子のGPAT活性および他のラン藻における分布についても報告する．

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　モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）は酸素発生型光合成生物に特徴的な糖脂質であり、高等植物葉緑体やラン藻のチラコイド膜では全脂質の半分以上を占めている。このことから、MGDGは光合成反応に重要な役割を果たしていると考えられているが、実際結晶構造解析からPSIの反応中心タンパク質と強く結合していることが報告されている。これまで高等植物葉緑体のMGDG合成については、その反応に関わる遺伝子が明らかにされ詳しく解析されている。しかし、全ゲノム配列が報告されたラン藻では、高等植物MGDG合成酵素のオルソログと考えられるような遺伝子は見つかっていなかった。
　我々は最近、2種のラン藻Synechocystis sp. PCC6803とAnabaena sp. PCC7120において、いずれも高等植物と異なるUDP-Glc依存のMGDG合成活性が存在すること、また両者にこれとは異なるUDP-Gal依存の活性も存在していることを見出した。そこで、これらの合成を担う遺伝子が両ラン藻間で高く保存されていると仮定し、比較ゲノム的な解析を行った結果、糖転移酵素モチーフを持つ機能未知遺伝子の中からUDP-Glc依存のMGDG合成酵素を同定することに成功した。本発表では遺伝子を同定した方法について紹介したい。また、この遺伝子のノックアウト株の解析結果についても合わせて報告する。

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　1,2-diacylglyceryl-3-O-hydroxymetylcholine (DGCC)はハプト藻に普遍的に存在するベタイン脂質のひとつである。我々は、ハプト藻におけるDGCCの生合成経路を明らかにすることを目的に研究を行っている。¹⁴C-標識化合物を用いたトレーサー実験により、DGCCの前駆体はエタノールアミンを介したコリンであり、極性基のトリメチルアンモニウム基はコリン経由であることが示唆された。シダやコケ、緑藻などに存在するベタイン脂質である1,2-diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N-trimethyl)homoserine (DGTS)の極性基はメチオニンから合成され、脂質に結合した状態で3段階のN-メチル化が進行してトリメチルアンモニウム基が形成されると報告されている。従って、DGCCの極性基はDGTSと全く異なる経路で合成されると考えられる。現在、¹³C-標識化合物の投与とNMRによる解析を行い、極性基に存在するカルボキシル基の生合成を検討している。

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植物には2つの糖脂質合成経路（原核型と真核型）が存在し、それぞれの経路で合成されるジアシルグリセロール(DG)の分子種に違いがあることが知られている。特に真核型経路はほとんど全ての植物に存在することから、植物の糖脂質合成に非常に重要であると考えられている。リン酸欠乏時にジガラクトシル-DG（DGDG）が蓄積することが知られているが、このDGDGは脂肪酸組成から真核型脂質のなかでも特徴的なものであることがわかっている。真核型の脂質は葉緑体外からホスファチジルコリン(PC)として葉緑体に輸送されると考えられているが、実際、葉緑体外包膜に存在するPCの脂肪酸組成はリン酸欠乏時に増加するDGDGの脂肪酸組成と非常に似ている。従って、リン酸欠乏時の糖脂質合成ではまずPCからDG、そしてDGDGへと合成されると考えられた。
そこで本研究では、PCに特異的なホスホリパーゼC(PC-PLC)に着目した。データベースを検索したところ、様々な植物にバクテリア型のPC-PLCホモログが存在し、他の真核生物では相同性のある遺伝子が検出されないことから、これらの遺伝子は高等生物においては植物に特異的に存在していると考えられた。つまり、植物特有の脂質代謝に関与していると期待される。シロイヌナズナには6つのアイソザイムが存在しており、リン酸欠乏時ではそのうちのPC-PLC3のみが発現誘導されることがわかった。

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The green microalga Botryococcus braunii produces large amounts of liquid hydrocarbons and is classified into three races, A, B, and L depending on the types of the hydrocarbons. The B race produces two types of triterpenoid hydrocarbons, methylated squalenes and botryococcens, which are promising as renewable fuels. In order to understand isoprenoid biosynthesis by the B race of B.braunii, the incorporation of ¹³C labelled glucose into tetramethylsqualene and C₃₀botryococcene was studied by quantitative ¹³C NMR spectroscopic analyses. The resulting labelling patterns showed that the isoprene units of those triterpenoids are derived from the methylerythritol phophate (MEP) pathway. We also isolated and characterized a gene for 1-deoxy-D-xylulose 5-phophate synthase (DXS) from this alga which catalyzes the first step in the MEP pathway.

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PnC401遺伝子は、短日植物アサガオ（Pharbitis nil cv. Violet）において花成誘導暗期中に特異的に発現する遺伝子として単離された。PnC401遺伝子および長日植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるホモログAtC401遺伝子のmRNAは、暗期増加型のサーカディアンリズム振動を示す。我々はC401遺伝子のサーカディアンリズム発現制御機構を明らかにするため、AtC401遺伝子プロモーター断片をホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc+）に連結した融合遺伝子を導入したシロイヌナズナ形質転換体を用いたレポーター解析を行っている。これまでに5’プロモーターデリーションによって転写開始点を含む146 bpの5’上流ゲノムDNA断片がAtC401のサーカディアンリズム発現に十分であることを報告した。今回、プライマー伸長法によりAtC401の転写開始点を決定し、この断片には転写開始点より73 bp下流の配列を含むことが分かった。また、転写開始点よって下流の配列を除いたプロモーター断片（-174/+2）ではレポーター発光が見られず、同じ断片にCaMV35S最小プロモーター断片（47 bp）を連結した断片でも、レポーター発光の周期性は回復しなかった。これらの結果から、5’非翻訳領域の配列がAtC401のリズム発現制御に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

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絶対的短日植物であるアサガオの品種紫（Pharbitis nil cv. Violet）は、光周性花成誘導研究のモデル植物であり、播種後7日目の子葉の段階でも16時間の暗期を一回与えることにより花成を誘導できる。我々は、蛍光ディファレンシャルディスプレイ（FDD）法を用い、アサガオ（品種紫）において誘導暗期特異的に発現が増加する遺伝子の単離を試み、cDNAを20クローン単離・同定した。この中でNo. G4-11はシロイヌナズナにおいて長日性花成誘導に対して促進的に機能する遺伝子として知られる青色光受容体Cryptochrome 1 (CRY1) と高い相同性があり、PnCRY1 (Pharbitis nil Cryptochrome 1)と名付けた。PnCRY1遺伝子は675アミノ酸、約76 kDのタンパク質をコードし、推定アミノ酸配列はトマトとシロイヌナズナのCRY1と比較して、それぞれ79%, 73% の相同性を示した。ノーザンハイブリダイゼーションによる発現解析の結果、短日および長日条件下で、暗期中に発現が増加し、明期で減少するような日周変動を示した。また、連続暗条件下において、約24時間周期のサーカディアン発現変動を維持したことから、概日時計の制御を受けていると考えられる。PnCRY1遺伝子のアサガオ品種間での発現様式の違いや、赤色光、青色光による光中断の花成抑制効果と遺伝子発現の関連についても報告する。

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シロイヌナズナの概日リズム因子、LHY、CCA1、TOC1、GIは、相互に発現を調節しあうネガティフィードバックループを形成していると考えられている。光周性による花芽形成誘導機構として、次のようなモデルが提唱されている。長日条件下では、夕方に発現のピークを迎えるGIにより、中心的な花成促進因子COの発現が明期中（暗期直前）に誘導され、活性化されたCOによってその下流のFT、SOC1の発現が誘導され、花成に至ると考えられる。一方、短日条件下では、COが明期中に発現しないためその機能が活性化されず、下流因子の発現上昇が見られず、花成が誘導されないと考えられる。我々は、短日条件下でlhy cca1二重機能欠損株に極端な花成期間の短縮が見られることを明らかにした。この形質は、上記のモデルに従うと、1）LHYとCCA1の二重欠損により通常夕方にピークを迎えるGIの発現の位相が朝方にまで大幅に前進し、2）それに伴いCOが明期中に高いレベルで発現し、3）下流因子FTとSOC1の発現が誘導されて花成早化に至るというモデルで説明することができる。そこで、多重変異体を用いた花成時期調査および発現解析によるこのモデルの検証を試みた。今回は、概日リズム因子LHY、CCA1と、花成促進因子FT、SOC1との関係についての研究結果を中心に報告する。

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多くの生物で多様な生体機能が約24時間周期の内因性リズム（概日リズム）により調節されている。二つのMyb関連遺伝子、LHY（LATE ELONGATED HYPOCOTYL）とCCA1（CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）がシロイヌナズナの概日リズム制御系において中心的な役割を果たすことが明らかにされている。LHYまたはCCA1の単独の機能欠損変異体では、連続明条件下で、概日リズムにより調節される遺伝子群の発現と、葉の上下運動のリズムが短周期になり、また短日条件下で野生型に比べて花芽形成期間が短縮される。LHYとCCA1の二重機能欠損変異体では、連続明条件下での概日リズムが消失し、短日条件下での花芽形成期間はさらに短縮される。このlhy cca1早咲き形質の特徴を活かし、花芽形成関連遺伝子との多重変異体を作成し、現在提唱されている花芽形成に関するモデルを検証した。特に、光周性依存型の花芽形成過程で重要な機能を有する2つの遺伝子、CO（CONSTANS）とFHA/CRY2と、概日リズム制御因子、LHYとCCA1との関係について解析した結果を報告する。

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概日リズムは約24時間周期の生命活動の変動で、個体における時間生成機構としてバクテリアから植物、ヒトに至るまで生物界に普遍的に存在する制御機構である。高等植物では、花芽形成、胚軸伸長、遺伝子発現、葉の上下運動などが概日リズムによる制御を受けていることが知られている。シロイヌナズナを用いた遺伝学的解析により、概日リズム制御に関わる因子が複数単離されてきた。少なくとも4つの遺伝子、LHY、CCA1、TOC1、GIが、概日リズム制御と光周性依存型の花芽形成過程に深く関わることが明らかにされてきた。我々は、LHYとCCA1を同時にノックアウトし、LHYとCCA1が1）概日リズム制御下にあるマーカー遺伝子の、恒明条件下での周期的な発現維持に必要であること、2）同じく概日リズム制御下にある葉の上下運動の、恒明条件下での周期的な発現維持に必要であること、3）光周性依存型の花芽形成制御系で重要な機能を有することを明らかにしてきた。今回我々は、シロイヌナズナの概日リズム制御に関わる新たな因子の単離同定を目指し、lhy単独機能欠損株の形質を増強させる変異体をスクリーニングした。変異体候補の一つ、70elf-1lhy-12はlhy-12 cca1-1と極めて類似した形質を持つが、遺伝学的な解析から、70ELF-1とCCA1は異なる遺伝子であることが予想された。現在までに得られた知見をもとに、概日リズム制御系と光周性依存型の花芽形成の関係について議論する。

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　シロイヌナズナのAPRR因子群は、それぞれN末端の擬似レギュレータードメインに加えてC末端にCCTモチーフを持ち、5種類のメンバーからなるファミリーを形成している。これらAPRRファミリー（APRR1=TOC1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9）の最も際だった特徴は、それらの転写発現が全て概日リズムを示し、APRR9→APRR7→APRR5→APRR3→APRR1の順に規則正しく転写が誘導される点である（APRR五重奏）。また初発のAPRR9は光誘導性である。今回は、APRRファミリーが計時機構と関連しているか否かを、APRR9に焦点をあてて検討した。具体的には、APRR9過剰発現植物体を作成し、これらの変異植物体におけるAPRRファミリーと他の時計関連遺伝子の発現様式を詳細に解析した。その結果、APRR9過剰発現植物体においては、APRRファミリーのみならず他の一連の時計関連遺伝子（CCA1やLHYなど）の自由継続リズム周期が全て短くなった。さらに、この過剰発現植物体は顕著な早咲きの表現型を示すことが明らかとなった。またAPRR9変異植物体の解析も行ったので合わせて報告する。これらの結果をもとに、APRR9の働きを中心に、APRRファミリーの時計機能や開花の光周性制御における重要性に関して考察する。

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