植物は重力方向に根を伸長させるとき、障害物に当たるとそれを避けるように伸長方向を変化させる。この現象をシロイヌナズナでは45°に傾けた寒天培地表面に根を這わせることで観察できる。適切な寒天濃度条件下では根は重力方向へ成長することと寒天面への接触を避けることの繰り返しで波状の成長パターンを示す。我々は接触刺激によって根端の成長方向を変化させる分子機構を明らかにするため、波状成長パターンが異常になったシロイヌナズナの突然変異体を6つ単離し、wav1～wav6 とそれぞれ名付けた¹⁾。
　これらのwav突然変異体のうち、今回報告するwav2は野生型に比べて根の波状成長の波長が詰まっている突然変異体である。この変異体では波の屈曲の角度は野生型の約2倍、波のピッチは野生型の約2分の1の値を示した。また、WAV2遺伝子はマップベースクローニングから機能未知でN末端に膜貫通ドメインを持つ309アミノ酸残基の蛋白質をコードする遺伝子であることが明らかになった。現在、我々はWAV2の発現および蛋白質の機能解析を進めている。本発表では波状成長異常突然変異体の表現型とWAV2蛋白質の機能についてこれまで得られた最新のデータを報告する。
1) Okada & Shimura (1990) Science vol.250, pp. 274-276

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一般的に高濃度(100 mM以上)の無機塩類は植物の成長を阻害する。このような塩ストレスの機構は、水ポテンシャルや代謝に対する影響の側面から多くの研究がなされてきている。しかしながら、低濃度無機塩類の影響はほとんど明らかにされていない。そこで、黄化レタス芽生えを対象に、低濃度無機塩類の植物の成長に対する影響を調べた。レタス(Lactuca sativa L. cv. Grand rapids)発芽種子を、暗所、25 ^oC下において、4日間、種々の濃度のNaClやKCl溶液で生育させたところ、50 mM以下の濃度で著しい胚軸伸長促進が認められた。NaClおよびKCl（いずれも20 mM）を処理し、経時的に胚軸伸長を調べた結果、処理後約4日目までは、いずれも水対照を上回る速度で同程度に伸長したが、その後、NaCl処理芽生えの成長速度は次第に低下し、5日目以降、KCl処理がNaCl処理を上回る伸長を示した。細胞の吸水成長を規定しているパラメータの一つである細胞液浸透濃度は、KClおよびNaCl処理により、実効の浸透濃度を上回って上昇し、その上昇はそれぞれKとNaの増加に基づいていた。他方、細胞壁力学的性質を測定した結果、少なくとも5日齢芽生えにおいてはKCl処理はNaCl処理に比べ細胞壁伸展性を増大させた。以上の結果から、低濃度無機塩による黄化レタス芽生えの胚軸伸長促進は、細胞液浸透濃度の上昇に依存する側面に加え、塩類の種類に応じた細胞壁力学的性質の変化によることが明らかとなった。

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Cyanamide has been utilized as a synthetic agrochemical. Recently, cyanamide was isolated and identified as a natural plant growth inhibitor of hairy vetch (Vicia villosa Roth), a legume. Cyanamide may also play an important role in vetch-associated disease of cattle as a toxic substance. In this study, we developed the advantageous method to identify cyanamide, and reported the distribution of cyanamide in some leguminous plants, such as Vicia, Astragalus and Trifolium. It became clear that Vicia contained large amount of cyanamide but other genus hardly contain cyanamide.

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Hairy vetch (Vicia villosa Roth) a leguminous plant mainly utilized as forage, green manure or cover crop in many countries. It has been reported that this plant effectively suppresses weed growth. Recently, natural occurrence of cyanamide has been confirmed and isolated from hairy vetch and are reported to be involved in allelopathic phenomenon. Many plant species including hairy vetch has been reported for their allelopathic potentiality, however, detail studies related to the function and mechanism of allelopathic substances on plant growth has not yet been carried out. As to our first approach, here we investigated the effects of cyanamide on the germination and growth of Arabidopsis and hairy vetch. We found that different concentration of cyanamide completely inhibited seed germination of Arabidopsis, while in hairy vetch it was not. Detail studies on the interaction mechanisms are underway and will be discussed.

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　トリコテセンは植物病原菌であるFusarium属などが生産するマイコトキシンの一種であり、植物への感染過程で病原性因子として働くことが分かっているが、植物におけるその作用機構についてはほとんど分かっていない。我々は、トリコテセンの1つであるT-2 toxinを含むMS培地でシロイヌナズナを生育させると感受性に個体差があるものの、矮化や葉柄が短くなり、また葉がカールするなど特徴的な形態異常が起こることを見出した。またT-2 toxinによって葉肉細胞等が小さくなることから、細胞の伸張成長が抑制されていることが示唆された。このようなT-2 toxinによる矮化やその感受性の違いにおける遺伝子発現の変化についてGeneChipを用いて網羅的な解析を行った。その結果、発現が誘導される遺伝子には防御遺伝子が多く含まれ、恒常的な防御応答が矮化を引き起こしている可能性が示唆された。また、T-2 toxinにより発現が誘導される遺伝子の中には、ブラシノステロイドの不活性化に関与しているB.napusのsteroid sulfotransferaseをコードするBNST3遺伝子のホモログが含まれていた。さらに、発現が抑制されている遺伝子には活性型ジベレリンの合成に関わるGA4遺伝子が含まれており、これらの二つの遺伝子がT-2 toxinによって誘導される矮化に関与している可能性が示唆された。

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　同化型硝酸還元酵素（Nitrate Reductase; NR）は植物の硝酸代謝経路における律速酵素として知られているが、植物体中で量が少なく精製の困難な酵素である。近年のNR活性調節機構解析やNRによるNO産生などの研究にはNRタンパク質が必要である。そこで酵母Pichia pastorisを宿主としたホウレンソウNRタンパク質発現系の構築を行った。
　ホウレンソウNRcDNAからNRタンパク質中のFADドメイン、Cyt bドメインおよびHinge-1領域のリン酸化セリン残基をコードする領域（CcR+）を発現ベクターに導入し、形質転換酵母を得た。CcR+タンパク質発現量は約0.9mg/L cultureで、以前作製したFADドメイン、Cyt bドメインをコードする領域（CcR-）を導入した酵母と比較して1/100の発現量であった。そこでCcR-をコードする遺伝子の翻訳開始点直前の塩基配列を導入した新たなCcR+ベクターを作製した。これを用いた結果CcR+タンパク質発現量は約56mg/L cultureに増加した。次にホロNRをコードするcDNAに上記改変を加えたベクターを作製しNRタンパク質発現量を調べた結果、改変を加えない場合と比較して約10倍の約0.7mg/L cultureの活性を有するNR タンパク質の発現が見られた。

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硝酸同化において、硝酸イオンは、硝酸イオン能動輸送体（NRT）によって細胞内に輸送され、硝酸還元酵素（NR）と亜硝酸還元酵素（NiR）によってアンモニアに還元される。NRT、NRおよびNiRの発現は窒素によって正負両面の制御を受けており、一般に硝酸イオンまたは亜硝酸イオンによって活性化され、アンモニア、グルタミンまたはその代謝産物によって抑制される。我々は植物の硝酸還元系の発現制御の機構を、相同組み換えによる遺伝子操作が可能なヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を用いて研究するため、まずNR遺伝子のcDNAをクローン化した。RT-PCRにより、2つのcDNA断片が得られ、RACE法によってほぼ完全長のcDNAを得ることができた。それら相互の推定アミノ酸配列の相同性は80％であった。また、ヒメツリガネゴケのNRのアミノ酸配列は、高等植物のものと約56％、緑藻のものと約47％一致しており、系統樹では緑藻と高等植物の間に位置していた。培地の窒素条件をかえて、mRNAの蓄積量の変化をノーザン解析で調べたところ、NRの転写はNiRと共に硝酸イオン存在下で活性化され、アンモニア存在下で抑制されることが分かった。これらの結果は本質的には植物において報告されている結果と同じであり、ヒメツリガネゴケが硝酸同化の研究においても高等植物のモデルとなり得ることが示唆された。

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Nitrate-independent activity of nitrate reductase (NR) is generally found in legume root nodules. Therefore, effects of nitrate on the levels of plant NR activity and mRNA were investigated in root nodules of Lotus japonicus. NR activity and mRNA were enhanced by the addition of nitrate in roots and root nodules. They were also detected in root nodules without nitrate while they were undetectable in roots. Southern blot analysis indicated that NR was a single gene. These results indicate that inducible-type NR could be expressed in root nodules without nitrate. The activation state of the nitrate-independent activity of NR was as high as that of nitrate-induced activity of NR. mRNA expressed independently of nitrate in root nodules was localized in the infected region of root nodules. Thus the expression could be related to specific structure and environment of root nodules.

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　高等植物における窒素代謝の律速酵素である硝酸還元酵素 (NR)は遺伝子レベルで活性が制御されると共に、環境条件に応じてタンパク質レベルで活性が制御される。NRタンパク質は、NRリン酸化酵素 (NR kinase)によりリン酸化され、そのリン酸化したNRに、14-3-3タンパク質が結合することで不活性化する。本研究では、コマツナのカルシウム非依存型NR kinaseについて研究を行った。
　緑葉を明条件から暗条件に移すと、NRは急激に不活性化し、同時にNR kinaseの活性が上昇した。このNR kinaseは、10 mM Glucose 6-phosphate (G6P)およびFructose 6-phosphate (F6P)により活性が約40 %阻害された。明、暗処理葉各々から調製した粗酵素抽出液をResource Qクロマトグラフィーにより分画し比較したところ、暗処理葉のみで活性が上昇するNR kinase画分が確認された。このNR kinase画分は、10mM G6P、F6Pにより活性がそれぞれ約40 %、20 %阻害された。以上の結果からNR kinase によるNR活性制御機構において、G6PおよびF6Pが機能している可能性が示唆された。

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Nitrite reductase (NiR), an enzyme containing a single siroheme and an [4Fe-4S] cluster, catalyzes the six-electron reduction of nitrite to ammonia in cyanobacteria and higher plants. Ferredoxin is the typical electron donor for NiR, and donates six electrons by an intermolecular transfer to the [4Fe-4S] cluster through the siroheme active-site. Plectonema boryanum NiR (FL-NiR) contains a redox-active ferredoxin-domain at the C-terminal region of its polypeptide. FL-NiR is homologous to many known assimilatory nitrite reductases. The P. boryanum NiR gene has been cloned from the genomic DNA, and over-expressed in Escherichia coli. A truncated FL-NiR containing only the NiR domain, or only the ferredoxin domain, and an authentic Synechocystis sp. 6803 NiR were also expressed. Physiological and enzymatic properties of these authentic NiRs and the truncated versions will be presented.

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高等植物において、NH4+の有機化反応はGS/GOGATサイクルを介して行われる。シロイヌナズナのゲノムには複数のGS、GOGAT分子種がコードされている(GS1;Gln1;1-1;5, GS2; Gln2, Fd-GOGAT; Glu1, Glu2, NADH-GOGAT; Glt1)。これらの分子種は、固有の発現特異性を示し、互いに共役しNH₄⁺の同化を担うことが推測されている。
本研究では、シロイヌナズナにおけるGS及びGOGATの生理機能の解明を目的とし、第一段階として、根で吸収されたNH₄⁺の同化に関わるGS及びGOGAT分子種の同定を行った。定量的real-time PCRを行った結果、NH₄⁺の供給後、GS1分子種であるGln1;2 及びNADH-GOGATであるglt1 mRNAの蓄積量が特異的に増加することが明らかとなった。特に、Gln1;2 mRNAの蓄積量は、他のGS分子種mRNAより10倍以上も高い値を示した。さらに、プロモーターGFP解析の結果より、Gln1;2及びGlt1遺伝子が、NH₄⁺の吸収に重要とされる表皮または皮層細胞において発現していることが示された。これらの結果は、Gln1;2とGlt1にコードされるGS1/NADH-GOGATが共役し、根にけるNH₄⁺の同化を担っていることを示している。

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イネのサイトゾル型グルタミン合成酵素(GS1)は、免疫組織化学的解析などにより、篩管を介して老化葉身から転流されるグルタミンの生合成に主として関与していることが示唆されている。本研究では、この生理機能についてGS1欠損変異体を用いて証明することを目的とした。
　イネの内在性レトロトランスポゾンTos17を転移させて作製されたイネ「日本晴」遺伝子破壊系統群 ［RGP、ミュータントパネル（廣近、宮尾）］より、GS1遺伝子第8 exonにTos17が挿入された遺伝子がホモ接合体となった変異体osgs1が得られた。この変異体は、葉身におけるGS1タンパク質含量が著しく減少しており、活性も大幅に低下していることが明らかになった。免疫組織化学的解析により、通常GS1が多く蓄積している細胞群には、シグナルは検出されなかった。主に根で発現するGSrへのTos17の挿入はないことを確認している。生育の遅延や、不稔などの表現型は、後代においても確認された。PCR法による三次元スクリーニングにより、GS1遺伝子にTos17が挿入されている新たな系統を4系統獲得した。このうち、第8 exon、第10 exonにTos17が挿入されている2系統を栽培したところ、挿入された遺伝子がホモ接合体となった変異体において、osgs1と同様の表現型が確認された。

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　グルタミン酸脱炭酸酵素 (GAD) はグルタミン酸からγ-アミノ酪酸(GABA) への反応を触媒する酵素であり、大腸菌から高等植物まで広く存在する。我々は一昨年の本大会で、イネは少なくとも二つの異なるアイソフォーム (OsGAD1とOsGAD2)を持ち、前者は双子葉植物のGADのC末端側に見られるカルモジュリン結合ドメイン(CaMBD)を持つのに対して、OsGAD2はCaMBDを持たない新規なGADであることを報告した。これら二種のイネGADの細胞内での活性制御機構を明らかにするために、野生型GAD遺伝子及びC末端側の30アミノ酸残基を欠失させた変異GAD遺伝子をアグロバクテリウムを介した形質転換法によりイネカルス細胞に導入した。ハイグロマイシン耐性カルスから遊離アミノ酸を抽出して、GABA含量を調べた所、野生型の遺伝子を過剰発現させたものでは2～5倍の増加が見られた。驚いたことに,変異OsGAD1の過剰発現株は野生型に比べてわずかな上昇にすぎなかったのに対して、変異OsGAD2を過剰に発現させたものでは100～200倍もの蓄積が観察された。また再生植物体はペール色、葉のカール、矮化などの表現型が見られ、根、茎、葉のいずれの器官でも高いレベルのGABAを検出した。以上の結果から、OsGAD2のC末端側を欠失したことにより、その細胞内での酵素活性が飛躍的に上昇したものと考えられる。このことから、OsGAD2のC末端側は強力な自己阻害ドメインとして働いていると予想される。

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動物や酵母で知られているカルモジュリン依存性プロテインホスファターゼ (PP2B)は、植物では知られておらず、植物におけるカルシウムによるタンパク質脱リン酸化の調節は不明である。ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）のDNAライブラリーを³⁵Sラベルしたカルモジュリンでスクリーニングすることによりカルモジュリン結合タンパク質をコードする遺伝子の探索を行ったところ、得られたクローンのひとつ（PCaMPP）がプロテインホスファターゼ2Cと相同性を示した。大腸菌で発現させた組み換えGST-PCaMPPタンパク質は、カルモジュリンセファロースと結合した。GST-PCaMPPはリン酸化ミエリン塩基性タンパク質に対して脱リン酸化活性を示し、この活性はマンガンイオン添加により増大した。また、オカダ酸による活性阻害は受けなかった。GST-PCaMPPは、C末端付近にある塩基性両親媒性アミノ酸配列を含む領域を欠失させることで、カルモジュリン結合能を失うとともに活性が低下した。また、この領域のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドは、カルモジュリンとカルシウム依存的に結合した。PCaMPPと相同性の高いはシロイヌナズナゲノムにも存在することから、陸上植物に広く保存されるプロテインホスファターゼであることが推察された。

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　ジベレリン生合成系遺伝子の発現調節に関与する転写因子RSGの核-細胞質間輸送に14-3-3タンパク質が重要な働きをしていることを前回の学会で報告した（2002年度日本植物生理学会年会）。今回、in-gel プロテインキナーゼアッセイにより、タバコ細胞破砕液細胞分画にあるRSGのSer-114残基をリン酸化するプロテインキナーゼ活性を検索した。N末端にGSTをつけた融合タンパク質としてRSGを大腸菌において大量発現、精製を行い、これをタンパク質リン酸化基質とした。タバコ緑葉マイクロソーム画分にある分子量50-60kDaのプロテインキナーゼにより、Ca²⁺依存的にRSGのSer-114残基がリン酸化され、膜結合性CDPKがRSGのリン酸化をリン酸化することが示唆された。タバコcDNAライブラリーからCDPK1をクローニングし、N末端にGSTを融合させたCDPK1を大腸菌で大量発現、精製した。組み換え体CDPKはRSGのSer-114残基を特異的にリン酸化することが示された。CDPK1によりリン酸化されたRSGは14-3-3タンパク質と結合することがpull-down アッセイにより示された。さらにCDPK1自身も14-3-3タンパク質と結合することが明らかとなった。これらの結果はCDPKがRSGのSer-114残基のリン酸化を介してRSGと14-3-3の結合、ひいてはRSGの細胞内局在を制御する事を示唆している。

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植物（イネ）のカルシウムシグナル伝達系の特徴を解明する目的で、イネ完全長cDNA配列データ（約2万8千）について、BLAST　searchを用いて、動植物の既存の遺伝子との相同遺伝子を検索し、類似した遺伝子制御系による生命現象の調節機構の有無を調べた。
第1にカルシウムイオン流入調節系の膜タンパクを比較したところ，動植物間ではカルシウムシグナルの細胞間での電気的伝達系（膜電位依存性チャネル，リアノジン及びIP3受容体等）が著しく異なることが示唆された．その一方で，個々の細胞内への化学的カルシウムシグナル伝達系（リガンド結合性膜チャネル，Ca2＋ATPase，ion-exchanger）は植物では構造が簡略化されているものはあるが，高い相同性で保持されていることが示された．
第2に細胞質内に流入したCa2＋に対するシグナル伝達機構についても動植物の比較を行ったところ，植物では動物よりもCa2＋に直接作用するリン酸化及び脱リン酸化機構が発達していることが解明された．植物ではカルモジュリン系タンパクを介した系も存在するが，Ca2＋結合領域(EF-hand）に加えてCAMKIIタイプのカイネース領域も保持しているCDPKが独自に多く存在している．そして，Ca2＋／リン脂質結合タンパク質やカルシニューリンも多く保持していることが示された．

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タバコ培養細胞BY-2は、植物病原菌由来のタンパク質性エリシター（cryptogein）を認識してプログラム細胞死(PCD)を誘導する。エリシター処理直後に、一過性で二相性の[Ca²⁺]_cyt変化、持続的なCl^- efflux、早い一過的な変化と持続的な変化の二相性のpH変化、さらに活性酸素生成が誘導されることが明らかとなり、特徴的なパターンを示すイオンの動員や活性酸素生成がPCDの制御に関与していると考えられた（2002年度本大会）。このイオンチャネルカスケードの因果関係を明らかにするために各種特異的阻害剤を用いた解析を行ったところ、Cl^- effluxに伴う膜電位脱分極が[Ca²⁺]_cyt変化に関与すること、陰イオンチャネルを介したCl^- effluxの誘導に[Ca²⁺]_cyt変化が必要であることが示唆された。また、エリシター誘導性の活性酸素生成に[Ca²⁺]_cyt変化が必要だが、逆に活性酸素生成を阻害しても[Ca²⁺]_cyt変化に顕著な変化は見られなかった。これらの結果をもとに、PCD誘導過程における細胞膜上での初期応答反応の分子機構について議論する。一方、エリシター誘導性の[Ca²⁺]_cyt変化は、酸素の供給や培地成分などの環境要因によって大きく影響された。これらの環境要因が[Ca²⁺]_cyt変化に影響を与える機構についてもあわせて報告する。

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　我々は、樹木の成長・分化や環境適応において、細胞外からの情報の認識に関与すると推定される受容体型プロテインキナーゼに関する研究を行っている。今回、新たにポプラ（Populus nigra var. italica）シュート由来のcDNAライブラリーから、受容体型プロテインキナーゼをコードする約2.7kbpのcDNAをクローニングした。
　コードされる予想タンパク質 PnLRK1 (P. nigra leucine-rich repeat receptor kinase 1) は856アミノ酸残基からなり、推定分子量は95kDaである。N末端から、シグナル配列、14個のロイシンリッチリピートを含むドメイン、疎水性の膜貫通ドメイン、C末端側には12のサブドメインからなるプロテインキナーゼ触媒ドメインが存在することから、典型的な受容体型プロテインキナーゼの構造を持つと考えられる。ノーザン解析により、PnLRK1遺伝子は、ポプラの茎、葉、芽で発現していることが確認されたが、根での遺伝子発現は微弱であった。

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アブラナ科植物の自家不和合性は、1遺伝子座のS複対立遺伝子によって支配され、花粉と柱頭のS遺伝子の表現型が一致したときに不和合となる。S遺伝子座には、SP11 (塩基性低分子量蛋白質)、SRK (受容体型キナーゼ)、SLG (分泌型糖蛋白質)という3つの多型を示す遺伝子が存在する。これまでに、花粉表層に存在するSP11が柱頭細胞膜上に存在する（同一S遺伝子型の）SRKのリガンドとして機能していること、SRKが約60 kDaのSLG様蛋白質と共にSP11に対する受容体複合体を形成していることを明らかにしてきた。しかし、SLG様蛋白質の実体および受容体複合体の構造は未解明である。
今回、まずSRKおよびSLGによりSP11受容体複合体が再構成されるかを確認するために、異種細胞系（酵母およびCOS-7細胞）を用いSRK及びSRK/SLGを共発現させた。しかし、何れの細胞においても活性型のSP11受容体を得ることは出来なかった。そこで、柱頭細胞膜上のSP11受容体複合体の構成要素を再検討することにした。Biotin標識化SP11を用いて、受容体複合体のアフィニティー精製を行い、SRKおよびSLG様蛋白質が回収されることを確認した。しかし、得られたSLG様蛋白質の分子量は柱頭中に大量に存在する可溶性SLGより大きいことが判明した。現在、このSLG様蛋白質の構造を解析中である。

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　自家不和合性は自家受粉を抑制する機構の1つである。アブラナ科植物の自家不和合性反応は、レセプターである柱頭側因子のSRKと、そのリガンド物質である花粉側因子のSP11が関わっていることが知られている。SRKに自己と同系統のSP11が結合すると、SRKはリン酸化し、自家不和合反応を誘起する。しかし、SP11によってSRKに伝えられたシグナルが、その後どのように伝達され、自家不和合反応を誘起するのかについてはほとんどわかっていない。
　そこで、本研究では二次元電気泳動法を用い、自家不和合反応に関わるタンパク質、特にリン酸化タンパク質を見いだすことを目的とし、研究を行った。Brassica rapaの雌しべをアイソトープラベルし、自家受粉後0分、60分、他家受粉後60分の柱頭からタンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行い、それぞれ比較した。その結果、自家受粉時に特異的にリン酸化されるタンパク質を1個、他家受粉時に特異的にリン酸化されるタンパク質を2個、見いだした。これらのタンパク質は、アブラナ科植物の自家不和合反応あるいは受粉・受精の過程に関わる重要なタンパク質であることが期待される。また、今回見つかった自家受粉時特異的にリン酸化されるタンパク質は、自家受粉後30分という早期にリン酸化されることも明らかとなった。

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アブラナ科植物では、柱頭の乳頭細胞に他家（和合）の花粉が受粉すると花粉は吸水し、花粉管を発芽・伸張させ、乳頭細胞に侵入する。花粉管はさらに伸張して子房に達し受精に至る。このような一連の生殖過程において、雌蕊と花粉管の間では情報交換が行われ、花粉管の発芽・伸長が制御されていると考えられているが、その実体は明らかではない。一般に、動物および植物細胞では、外部からの刺激に対して細胞内Caイオン濃度の変動がおこり、情報が伝達されることが知られており、in vitroでの花粉管伸長過程でも、花粉管伸長に伴い花粉管内のCaイオン濃度の変動が生じることが報告されている。従って、受粉・受精過程における雌蕊細胞と花粉管のCaイオンの動態を明らかにすることは、生殖過程を理解する上で重要である。本研究では、最初に、走査電顕に装着したX線分析装置を用いて、受粉過程における花粉と乳頭細胞のCaの変動を明らかにした。さらに、細胞内のCaイオンの動態を明らかにするために、Caセンサータンパク質であるイエローカメレオンの遺伝子をシロイヌナズナに導入した植物を作製し、in vivoでのCaイオンの濃度変化を明らかにする系の構築を試みた。現在、花粉でyellow cameleonを強く発現する個体を得ており、この花粉を用いて、受粉時における花粉管の発芽・伸長とCa2+変動の関係を解析中である。

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Prant heterotrimeric G proteins have been proposed to be involved in the transduction of several extracellular signals such as plant hormones, elicitor and light. In the plant G proteins, the precise intracellular localization of the subunits have not yet been analyzed. In the present work, we analyzed the localization of the subunits of the rice G protein.
1. Western blot analysis showed that the α, β, γ1, and γ2 subunits were localized in rice plasma membrane fractions.
2. Membrane-proteins solubilized with cholate were fractionated by gel filtration (Superdex 200 PC3.2/30, SMART System, Pharmacia). Two fractions of the G protein were obtained; one seemed to be a heterotrimer(s) (αβγ1 and/or αβγ2), and the other, a βγ dimmer(s) (βγ1 and/or βγ2). We propose that, in rice plants, a large amount of βγ dimmer is present in the plasma membrane in a form without the α subunit.

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GH3はオーキシンによって急速に誘導される遺伝子として、ダイズより単離された遺伝子である。シロイヌナズナのゲノムには20のGH3ホモログが存在しており、その中のいくつかはオーキシンや光によって制御されていることが確認されている。最近になって、いくつかのシロイヌナズナのGH3タンパク質は植物ホルモンのアデニル化活性を示すことが報告されている。このことからシロイヌナズナのGH3遺伝子ファミリーのうちいくつかについてはホルモンの活性を調節することで、ホルモンによって引き起こされる応答制御を行っていると考えられている。
　今回、われわれはアクティベーションタギングラインから単離した新奇GH3遺伝子ファミリーメンバーの一つの優性変異体について報告する。dwl1-D(dwaf in light 1-like 1-D)と名付けたこの変異体は矮性の表現型を示し頂芽優性が乱れていた。また、その実生は光条件に関係なく短胚軸になり、地下部においては側根の数が減少する。この遺伝子の過剰発現体は、アクティベーションタギングラインで確認された表現型を再現した。DWL1の発現を調べたところ、この遺伝子はオーキシンによる誘導が観察され、その誘導はmsg1では抑えられていた。これらの結果から、DWL1はさまざまな発達段階に応じてオーキシンによって制御されている応答に関わっていることが示された。

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Previous experiments have established that the MYC-like sequence CATGTG plays an important role for induction of dehydration-dependent expression of the ERD1 gene that encodes a putative protein similar to the ATP binding subunit of the Clp protease. Three cDNA clones encoding NAC proteins that bind to the 63-bp fragment of the ERD1 promoter containing the CATGTG motif were isolated using yeast one-hybrid system. The cDNA clones were named NAC2, NAC3 and NAC4. The three encoded proteins formed a subgroup of the NAC transcription factor. All three proteins bound specifically to the CATGTG motif either in vitro or in vivo, and activated the transcription of the GUS reporter gene driven by the 63-bp fragment in Arabidopsis protoplasts. Expression of the three genes was induced mainly by drought, high salinity stress and ABA treatment, but not by low temperature. Using yeast one-hybrid system we determined the complete NAC recognition sequence (NACRS).

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　円石藻は細胞表面にCaCO₃を主成分とする円石と呼ばれる構造体を持つ単細胞藻類である。そのバイオマス量と炭素固定能の大きさから，海洋でのブルーム発生などその増殖要因の解明が期待されている。我々は円石藻が生育の必須元素としてセレン（Se）を要求することを既に明らかにした。本研究では，円石藻によるセレンの利用機構を明らかにするために, 放射性亜セレン酸（⁷⁵Se）を用いたSe取り込みの速度論的解析を行い，円石藻Emiliania huxleyiによるSe蓄積能について解析した。
　E. huxleyiは海水濃度（3.2-nM）の亜セレン酸濃度では2400倍にSeを濃縮した。細胞成分を分画し，各画分の放射活性を測定したところ，吸収されたSeのうち50%は低分子画分，20%はタンパク質画分に取り込まれた。総Se吸収の経時変化パターンを解析したところ,速度の異なる2種の成分が含まれていることを見出した。セレン吸収は，⁷⁵Se添加後30秒以内で定常状態に達する高速のセレン吸収成分と，それ以降に見られるアミノ酸やタンパク質への合成に至る低速の成分が融合したものであった。さらに，セレン吸収に対するATP合成系の阻害実験および速度論的解析の結果などを合わせ，細胞内へのセレン蓄積は能動および受動輸送系による速やかな亜セレン酸の取り込みと，それに続く有機セレン化合物の合成により行われることを明らかにした。

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Rice is a typical Si-accumulating plant and a specific uptake system for silicic acid in rice roots has been suggested. We characterized this specific system in rice roots. Si uptake increased linearly with time, but pre-treatment with Si did not affect the Si uptake, suggesting that the uptake system for Si constantly exists in rice roots. Kinetic study indicated that Si uptake is mediated by a kind of proteinaceous transporter. The Km was estimated to be 0.32 mM, suggesting that the transporter has a low affinity for silicic acid. Mercury chloride, phloretin significantly inhibited the Si uptake, but DIDS hardly affect the Si uptake. Si uptake was also not affected by the presence of 10 times more of boric acid. Taken together, the Si uptake by rice roots is a transporter-mediated process and this transporter contains Cys residues but not Lys residues.

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　植物の硝酸イオン吸収は、根細胞膜上の硝酸トランスポーター(NRT)によって行われていると考えられている。本研究では、オオムギの高親和性NRT(NRT2)の抗体を作製し、オオムギ根におけるNRTタンパク質の発現解析を行ったので報告する。
　方法：大腸菌にNRT2のC末端部分を大量発現させ、これをウサギに免疫し抗体を得た。播種後無窒素で1週間育てたオオムギ幼植物に、10mMのKNO₃を供与し、24時間後に根を採取した。根を摩砕抽出後超遠心でミクロソーム画分、さらに二層分配法で細胞膜(PM)画分を得た。ミクロソーム画分とPM画分から可溶化したタンパク質を免疫ブロッティングに供した。また、指標酵素によりオルガネラの純度検定を行った。
次に、オオムギ幼植物に1mM及び10mMのKNO₃を供与し、経時的に根を採取した。摩砕抽出後ミクロソーム画分を調製し、免疫ブロッティングに供した。また、同様にKNO₃供与した植物に100mM¹⁵NO₃^-を一定時間与え、¹⁵N吸収量を測定した。
　結果・考察：ミクロソーム画分、PM画分の免疫ブロッティングとオルガネラの検定から、NRTタンパク質が細胞膜に存在することが確認できた。経時的に採取したミクロソームの免疫ブロッティングでは、NRTタンパク質は各時間とも10mM KNO₃を供与したオオムギ根に強く発現していたのに対し、¹⁵NO₃^-吸収活性は1mM KNO₃供与のオオムギにおいて高かった。以上より、NRT2は翻訳後のレベルで制御されていることが示唆された。

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青色光は孔辺細胞の細胞膜H⁺-ATPaseを活性化し、気孔開口の直接の原因となるK⁺取り込みの駆動力を形成する。青色光によるH⁺-ATPaseの活性化はC末端のリン酸化とリン酸化C末端への14-3-3蛋白質の結合により引き起こされる。本研究では活性調節に重要な役割を果たすH⁺-ATPaseのC末端領域と相互作用する新規蛋白質の単離を目的として、VHA1のC末端領域（846-951 aa）を用いたソラマメ孔辺細胞cDNAライブラリーの酵母Two-hybridスクリーニングを行なった。4.2 x 10⁷クローンのスクリーニングの結果、8個の陽性クローンを得た。このうち5クローンは未知の蛋白質であり、3クローンはソラマメの14-3-3蛋白質のvf14-3-3aとvf14-3-3dであった。以前の研究で孔辺細胞にはvf14-3-3a、b、c、dの少なくとも4つのアイソフォームが発現しており、vf14-3-3aが細胞内でH⁺-ATPaseと結合することが示されている。本研究の結果はvf14-3-3dも細胞内でC末端と結合することを示唆するものである。また、vf14-3-3aはvf14-3-3dよりC末端との結合強度が4倍程度高く、アイソフォーム間で親和性が異なることも明らかとなった。C末端と14-3-3蛋白質の結合はC末端から2番目のThr₉₅₀のリン酸化が必須であることが示されている。そこで、Thr₉₅₀をAlaに置換したところ、vf14-3-3a、dともにC末端と結合しなかった。よって、Thr₉₅₀は酵母内でリン酸化されvf14-3-3と結合していると考えられる。

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　水耕栽培したライムギの根からマイクロソ－ム膜小胞を調整し、これをフルクト－スを含むmediumに入れ、膜小胞内にフルクト－スを飽和まで取り込ませた。このmediumにMg²⁺あるいはATPを付加し、一定時間後、mediumをゲルろ過し、ろ液に含まれる膜小胞内のフルクト－ス量を測定した。Mg²⁺とATPのみの付加は、膜小胞内のフルクト－ス量にほとんど影響を与えなかった。一方、Mg²⁺とATP両方の付加は膜小胞内のフルクト－ス量を低下させた。膜小胞内のフルクト－ス量に及ぼす種々のヌクレオチドの付加の影響を調べた結果、ATPが最も膜小胞内のフルクト－ス量を低下させることが示された。Mg²⁺とATPに依存したこの膜小胞内から膜小胞外へのフルクト－スの輸送は、プロトノフォア－によってほとんど影響を受けなかった。一方、この輸送は、ヴァナジン酸によって阻害された。このフルクト－スの輸送活性を、種々の濃度のフルクト－スで平衡化した膜小胞を用いて測定した結果、ミカエリス-メンテンタイプのkineticsが示された。実験に使用したmediumの中には、プロトンポンプによるプロトンの輸送を促進するアニオンは含まれていない。これらの結果は、この膜小胞に、プロトンの濃度勾配に依存しない、Mg²⁺とATPに依存したフルクト－ス輸送機構が存在することを示唆する。

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　我々は、イネ培養細胞（Oryza sativa L. japonica cv. Nipponbare）にエリシターまたは電気的刺激（30V, 30sec）を作用させることで、細胞外から細胞内へのCa²⁺流入により細胞内Ca²⁺濃度が一過的に上昇し、これがトリガーとなってキチナーゼ遺伝子が発現することを明らかにしている。また、このCa²⁺流入には、阻害剤などを用いた実験から電位依存性Ca²⁺チャンネルが関与していることも明らかにしている。そこで本研究では、イネCa²⁺チャンネル遺伝子をクローニングし、その機能を解析することを目的とした。
　Arabidopsis thaliana由来電位依存性Ca²⁺チャンネルAtTPC1の配列をもとに、RT-PCRによるクローニングを行った結果、新規のイネCa²⁺チャンネル遺伝子（OsCC1：2791bp）が得られた。このOsCC1は、AtTPC1とアミノ酸レベルで高い相同性（70%）を示している。そこでOsCC1タンパクの機能を解析するために、OsCC1を酵母のCa²⁺チャンネル欠損株に導入し、⁴⁵Ca²⁺の取り込み能を測定した。その結果、コントロールと比べて有意にCa²⁺の取り込みが認められ、OsCC1がCa²⁺チャンネルであることが示唆された。

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　エクオリンは細胞のカルシウムシグナリングを解析するのに広く利用されている。演者らは、Baubetらの報告を元にGFPとエクオリンから成るキメラタンパク質を作製した。Ca²⁺結合によるエクオリンの発光エネルギーがGFPへ転移してGFPが発光するこのタンパク質には、様々な利点があり、動植物体での利用が期待される。本研究では、このキメラタンパク質と当研究室で単離されたシロイヌナズナのカルシウムイオン透過性チャネルAtTPC1を出芽酵母のカルシウムチャネルcch1 変異体に導入し、AtTPC1の機能解析を行った。
　AtTPC1は、糖欠乏させた酵母で起こるグルコース誘導性サイトゾルカルシウム濃度（[Ca²⁺]_cyt）上昇レベルを増大させた。また、この[Ca²⁺]_cyt上昇は、カルシウムキレート剤のBAPTA、カルシウムチャネルブロッカーのLa³⁺で阻害されたことから、Ca²⁺は細胞外からAtTPC1を通して取り込まれたことが分かった。また、このグルコース誘導性[Ca²⁺]_cyt上昇はK⁺特異的に阻害された。加えて、AtTPC1は代替放射性核種⁸⁶Rb⁺の酵母への取り込みを促進したことから、Ca²⁺、K⁺選択性イオンチャネルであることが示唆された。

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Ca²⁺シグナリング系は植物のシグナル伝達の中枢を占めると考えられている。その初発反応を担うのはCa²⁺チャネルの開孔である。植物の形質膜や細胞内Ca²⁺貯蔵オルガネラにはCa²⁺チャネルが存在し、様々なシグナルに応答して活性化され[Ca²⁺]_cyt上昇を引き起こす。動物のL-タイプCa²⁺チャネルのα-サブユニットは、6つのTM領域と5、6番目のTM領域に挟まれた一つのイオン透過孔形成部位(p-ループ)からなる6TM1Pドメインが4つ集合し、4つのp-ループを中央に配置してイオンチャネルを形成する。演者らはこれと二次構造において高い相似性を示す蛋白質をコードするcDNA・ AtTPC1をシロイヌナズナから単離し、昨年の年会において報告した。ゲノムブロット及びデータベース解析の結果AtTPC1ホモログは広く植物種全体に保存されていた。AtTPC1は二つのドメインからなる蛋白質をコードしており、二量体として機能すると考えられる。また、両ドメインを繋ぐリンカー領域には二つのEF-ハンドモチーフ(EF-1,2)と、動物のK⁺-チャネルの4量体形成に関わる配列が含まれている。EF-1を点変異導入により破壊した蛋白質は酵母において野生型よりも強いチャネル活性を示した。

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シャジクモ類では細胞質の急速水和により、細胞内貯蔵庫からの Ca²⁺ 放出が起こる。これは貯蔵庫膜の浸透的膨潤によって Ca²⁺ チャンネルが活性化されるからである（機械刺激感受性 Ca²⁺ チャンネル）。
新免によれば、シャジクモ細胞は機械刺激によって“受容器電位”を発生する。我々は、この“受容器電位”発生への機械刺激感受性 Ca²⁺ チャンネルの関与の有無を検討した。機械刺激は、節間細胞を“たたく”ことによって行った。
細胞外液から Ca²⁺ を取り除くことは、“受容器電位”を可逆的に阻害した。機械刺激は“受容器電位”の発生と同時に細胞内 Ca²⁺ レベルの一過性の上昇を引き起こした。さらにこれらの強度は共に機械刺激の強度に依存して大きくなった。これらのことから、シャジクモ細胞における機械刺激の受容には、機械刺激感受性 Ca²⁺ チャンネルが関わっていると結論した。

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By taking advantage of Characeae, I have studied the mechanism of electrical perception of *eath message Specimens composed of two internodal cells were prepared. When one cell (victim cell) was killed, another cell (receptor cell) generated depolarizing responses. A possibility was suggested that the depolarization was induced by loss of the turgor pressure of the victim cell. To examine this possibility, I decreased the turgor pressure of the victim cell by adding sorbitol to the bathing medium of the victim cell. Upon decrease in the turgor pressure of the victim cell, transient depolarization was induced by the receptor cell. However, duration of the depolarization induced by the osmotic stimulation was much shorter than that induced by killing the victim cell (Shimmen (2001) Plant Cell Physiol 42: 366-373). In the present study, the mechanism of membrane depolarization induced by osmotic stimulation was analyzed.

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　車軸藻節間細胞が淡水中に有るとき、通常7気圧以上の膨圧φを維持している。これは細胞内外の浸透圧差Δπによる外向きの力、又は細胞壁の応力に対応する。細胞外液を高張にすると、Δπが減少するので細胞膜を介した水の流出が起こり細胞は収縮をする。しかし、細胞壁の力学的性質により、収縮率は極めて僅かであるため（0.4%）、細胞壁の張力の減少として観察される。細胞壁の張力の時間変化は、細胞に比較的ゆっくりした一定の振動数と振幅の正弦波振動(10Hz)を与え、振動の細胞による吸収率の時間的変化を歪み計によって測定した。ここで、細胞を適当な浸透圧π(150mM　mannitol)の外液に順応させた後、Δπを増大又は減少（±100mM）させることで、細部膜の張力の時間的変化（水の出入りの速度変化）を求めることができる。その時間的変化は、細胞膜を介した水の流入または流出の相対速度に対応すると考えられるので、細胞膜にかかる力（浸透圧差Δπ）とその時の水の相対流速から、細胞膜の水透過性の時間的変化が算出できる（時間分解能＝100msec）。その結果、細胞膜の水透過性には方向性（整流性）は見られなかった。先人の観察による整流性は、細胞膜表面に、接近した外液と外液の熱力学的性質に起因すると思われる（non-intrinsic）。

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我々は6年前より、ポストシーケンシング時代において、遺伝子の機能解析において完全長cDNAが重要になると考え、シロイヌナズナ完全長cDNAの単離を進めてきた。これまでに、種々のストレス・ホルモン処理した植物体や種々の発生段階の植物体などを出発材料する19種類のシロイヌナズナ完全長cDNAライブラリーを作製し、約15万個のcDNAクローンを単離した。それらをクラスタリングすると約15,000個の独立したcDNAグループに分類された。 　
我々は、また、これまでに単離したシロイヌナズナ完全長cDNAを用いてマイクロアレイを作製し、種々のストレス応答性遺伝子や転写因子のTarget遺伝子の同定に関する研究を進め、完全長cDNAマイクロアレイ解析は、1)種々のストレス誘導性遺伝子やストレス耐性に関与する転写因子のTarget遺伝子を調べる有効な方法であること、また、2) マイクロアレイの発現Dataをゲノム配列Dataと組み合わせることにより、マイクロアレイ解析で同定した遺伝子のプロモーター中に存在するシス配列を検索する有効な方法であることを示した。
さらに、無細胞タンパク質合成系を用いて完全長cDNAからタンパク質を合成し、植物特異的な転写因子やシグナル伝達に関わる因子などのタンパク質機能や3次元構造の解析も進めている。
今回の発表では、我々の進めているシロイヌナズナ完全長を用いた遺伝子の機能解析の現状と今後の予定について説明する。

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　塩ストレスは植物にとって重要な環境ストレスのひとつである。近年塩ストレス高感受性(sos)変異体 (sos1, sos2, sos3)がシロイヌナズナで単離された (Zhu, 2000)。本研究では、sos2-1およびsos3-1変異体のマイクロアレイ解析を行った。
　シグナル比が3倍以上のものを塩ストレス誘導性遺伝子とした場合、野生株では347個、sos2-1では157個、sos3-1では125個の塩ストレス誘導性遺伝子を検出した。その中で、乾燥・塩ストレス誘導型転写因子のDREB2A、その下流のターゲット因子であるRD29A、RD17遺伝子は、sos2-1およびsos3-1変異体において野生株と同様に塩ストレスにより発現が誘導された。したがって、SOS pathwayはDREB pathwayとは独立したシグナル伝達経路であることが明らかになった。一方、野生株では発現誘導が確認されたSOS1遺伝子、転写因子、機能未知の遺伝子がsos2-1、sos3-1変異体では塩ストレス誘導性遺伝子として検出されなかった。この結果は、これらの遺伝子がSOS pathwayの発現制御を受けていることを示唆している。マイクロアレイで得られたSOS pathwayの下流の候補遺伝子についてノーザン解析による確認と合わせて報告する。
Jian-Kang Zhu (2000) Plant Physiology 124:941-948

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Plants respond and adapt to drought stress to survive under stress conditions. Several genes that respond to drought at the transcriptional level have been described,*but there are few reports on genes involved in the recovery process from dehydration. Analysis of*rehydration-inducible genes should help not only to understand the molecular mechanisms of stress responses of higher plants, but also to improve the stress tolerance of crops by gene manipulation. We used a full-length cDNA microarray with ca. 7000 Arabidopsis full-length cDNAs and identified 154 rehydration-inducible genes. Among them, 59 genes contained the ACTCAT sequence involved in proline- and hypoosmolarity-inducible gene expression in their promoter regions. Venn diagram analysis showed relationship of the rehydration-inducible genes to proline-inducible genes and water-treatment-inducible genes. Functional analysis of rehydration-inducible genes and rehydration-repressed genes revealed their functions not only in the release from a stressed status but also recovery for growth of plants.

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　中国東部沿岸の塩性土壌で成育する塩性植物のThellungiella halophilaが報告されている。T. halophilaはArabidopsisの近似種で、外観の類似以外にも、植物体が小さい、生活環が短い、自家受粉をする、多くの種子をつけるという、これまでの塩性植物にはない、非常に遺伝学的にも優れた性質を有する。さらに塩基配列レベルでArabidopsisの遺伝子と90％以上の相同性を有し、かつArabidopsisと同様の形質転換方法を応用出来ることから、ゲノム科学的、遺伝学的な手法を用いることが可能である。
　T. halophilaとArabidopsisの土植え植物を500mM NaCl下で生育させたところ、Arabidopsisは完全に枯死するものの、T. halophilaはほとんど影響を受けないほど、顕著な耐塩性が観察された。本研究では、T. halophilaの耐塩性のメカニズムを解析するためにArabidopsisのcDNAマイクロアレイを用いてArabidopsisとT. halophilaの発現プロファイルの違いを調べた。遺伝子発現プロファイルの特徴と共に適合溶質の蓄積などT. halophilaの耐塩性に関わる分子生理学的な解析結果についても報告する。

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ポリアミンは微生物から動植物に至るまで広く生体内に存在する生理活性物質である。ポリアミンは古くから、様々な細胞内のプロセスに関与していると考えられてきたが、我々は環境ストレス応答におけるポリアミンの機能について解析を行っている。Arabidopsis
植物中に存在する主なポリアミンはプトレスシン、スペルミジン、スペルミンの3種である。シロイヌナズナゲノム上には10個のポリアミン合成関連遺伝子が存在し、これらのストレス下での発現パターンはストレス誘導性、恒常性、抑制性の3つのパターンに分かれた。これらの遺伝子の中で我々は、自分自身もポリアミンとして働き、また基質としても重要なプトレスシンの合成に関わる律速酵素遺伝子arginine decarboxylase(ADC)に注目し、ADCの組織特異性並びに細胞内局在を解析した。現在adc2ノックアウトミュータントを用いて各種ストレスに対する表現型を観察しており、その進行状況も報告する。

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植物は環境ストレス下におかれると，プロリンやベタインなどの適合溶質を合成することで耐性を獲得すると考えられている．プロリンは多くの植物種でその蓄積が認められており，ストレス下では主に浸透圧調節物質として機能する．我々はこれまでにオオムギの根からプロリンの輸送体であるプロリントランスポーター（HvProT）遺伝子の単離と機能解析を行い，ストレス誘導性であることとその基質特異性について明らかにしてきた．HvProTのストレス耐性への寄与についてさらなる知見を得るために，HvProT遺伝子を過剰発現させた形質転換アラビドプシスを作出し，そのストレス耐性およびプロリン添加培地での表現型を調査した．その結果，形質転換体では明らかなストレス耐性の向上が確認された．特に，発芽後の初期生長における影響が顕著であった．また一方で，培地中の高濃度のL-プロリンは形質転換体の生長を著しく抑制することも明らかになった．同様にD-プロリンについても形質転換体では感受性となっており，これらの結果から生体内でのプロリン濃度の制御はストレス耐性の獲得のみならず，生長の抑制にも関与していることが示唆された．

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植物における水分ストレスのうち，湛水については，根の酸素不足に関連する研究は多いが，葉における応答の研究は少ない。水生シダ植物の一種であるリチャードミズワラビは，高水分条件下では，幅広い栄養葉を維持する傾向にあるが，乾燥状態になると細く巻いた胞子葉が多くなる。昨年の本大会において，栄養葉では，分子サイズ17kDaの蛋白が多いこと,その蛋白の全アミノ酸配列を明らかにしたこと，相同性検索では有意に相同性のある遺伝子は挙がってこないことを報告した。
　今回，ウエスタン解析を行った。成熟蛋白のN末端にHisタグを付けたものを大腸菌で発現させ，封入体から目的蛋白を精製し，ウサギでポリクローナル抗体を作成した。植物をSDS-PAGEの試料可溶化液で磨碎した遠心上清を分析試料として用いた。リチャードミズワラビの栄養葉の幅広い葉では，前駆体蛋白と成熟蛋白に対応する2本のバンドが出たが，根と茎においてはバンドは検出されなかった。完全に巻いた胞子葉では，バンドは検出されなかった。他の種類の植物については，日本産ミズワラビでは，リチャードミズワラビと似た分子サイズの位置にバンドが見られた。シロイヌナズナでは，全く検出されなかった。これは，相同性検索で全くヒットしないことと矛盾しない。コケ類でもバンドは見られなかった。他種のシダ植物では，異なる分子サイズのバンドが出現するものもあった。

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ユリの花弁からアクアポリン遺伝子、AqpL1、を分離し、その性質を調べた。塩基配列から細胞膜局在型のアクアポリンであった。In vitroタンパク質合成系で26Kdaのモノマーが合成される。cRNAをアフリカツメガエルの卵で発現させて、水透過性を測定したところ、Pf= 0.72×10-3 cm/sで、対照のcRNA無しに比べれば2-3倍高かった、しかし、ヒトのAQP2に比べると3-4倍低かった。AqpL1をタバコに導入したところ、幾分生長が早い傾向があったが、調査個体を増やして調べてみないとはっきりしたことは言えない。形質転換タバコでは明らかにアクアポリンの含量が増えていることがウエスタンブロットで調べると確認できる。形質転換タバコの水透過性は高まり、Pf=4.3×10-2 cm/sであった。また、タバコの葉細胞の水伝導性も高まった。これらの結果はAqpLが水の透過に重要な役割をなしていることを示している。さらに、ノーザンで調べたところ、AqpL1は蕾で強く発現し、花弁のしおれとともに発現がみられなくなった。　　

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　私達はこれまで陸生ラン藻（イシクラゲ）の乾燥耐性を調べ、本学会で発表してきたが、その特徴は以下の通りであった。
1）光合成色素タンパク質複合体（光化学系I、II反応中心複合体、フィコビリゾーム）が乾燥により、吸収した光エネルギーを熱に変換するよう構造変化を起こす。2）乾燥状態では光化学系I、IIともに反応中心の活性は失活しているが、活性回復にはほんの少量の水分で十分である。3）乾燥耐性のない種では光合成活性の低下に比例した光化学系II反応中心活性の低下がない。
　今回は上記ラン藻の結果と比較しながら、水環境の異なる場所で生育する7種類の蘚苔類（ギンゴケ、ハイゴケ、ゼニゴケ、カマサワゴケなど）を用い、水分含量変化に伴う光合成諸活性の変化について調べた結果について報告する。
1）光化学系IIの変化蛍光（Fv）の顕著な減少が見られたが、光化学系Iにおいては光エネルギーを熱に変える変化は見られなかった。光化学系IIの失活は光エネルギーが反応中心に到達できないためと考えられる。2）細胞内の水ポテンシャルの低下に対する活性の低下はラン藻に比較してより小さい。3）乾燥耐性のない種では、極度に水分を失った状態でも光化学系I、II反応中心活性が維持された。この点はラン藻の場合と同様で、乾燥耐性の有無との関連性が強いと考えられる。

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　根は，水分勾配刺激に応答して水分屈性を発現し，重力屈性等とともにその姿勢を制御している．近年，重力屈性については分子生物学的な解析が行われるようになってきた．しかし，水分屈性の発現機構については，根冠が刺激受容器官であること，オーキシン，アブシジン酸およびカルシウムイオンの関与することなどが知られているものの，その刺激受容やシグナル伝達に関する分子機構はほとんど解明されていない．そこで本研究では，モデル植物のシロイヌナズナを用いた根の水分屈性突然変異体スクリーニング法を開発し，EMS処理をしたM₂種子約2万個から，野生型に比較して水分屈性の低下した突然変異体の単離を試みた．その結果，これまでに12株の水分屈性突然変異体rhy (root hydrotropism) が見出された．それらのrhy突然変異体について水分屈性の経時的な発現，重力屈性，光屈性，波型成長等を解析した結果，水分屈性特異的な突然変異体（rhy1）や，水分屈性を含む複数の屈性に異常のある突然変異体（rhy2，rhy3，rhy4）が見出された．現在，Landsberg erectaと交配したF₂集団のDNAを用いて，変異遺伝子のマッピングを行っている．

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植物体内の水の動態は実験手法が未発達であるため未だによく解析されていない。本研究ではポジトロン放出核種¹⁵Oを用いて生きた植物体内の水動態を非破壊状態で測定することを試みた。¹⁵Oは、半減期が非常に短いため(2分)、約30分で検出不可能となる。よって、同じ植物体を用いて何度も実験できることが本手法の大きな利点である。
実験試料としてダイズとコムギを用いた。1-2GBqの¹⁵O標識水（H₂¹⁵O）を根に与え、イメージングプレート(IP)を用いて植物体内の水分布について解析する一方、BGO検出器を用いて、ダイズは胚軸下の茎、コムギは葉の下部において¹⁵O標識水を経時的に検出し、流量の算出を試みた。
　IPを用いた¹⁵Oの検出では、植物体内の¹⁵O標識水の分布像が得られた。しかし、植物体では試料の個所により厚さが異なるため、定量は困難であった。そこで、同一植物を用い、茎の同じ部位における測定値を比較した。その結果、水吸収量は光の強度に相関した。また、湿度が著しく高い場合では、水の吸収が著しく抑えられることがわかった。また、BGO検出器を用いて同じ条件で実験を繰り返したところ、IPでの実験と同様の結果が得られ、さらに経時的な水吸収を解析できた。しかし、BGO端子ではイメージが得られないため、IPとBGO検出器の両方を用いて、互いにデータを補完しながら実験を進めることが適当であると結論づけた。

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アルミニウム(Al)は根端伸長域において細胞伸長を阻害する。一方、細胞伸長は水ポテンシャルに依存することから、本研究では、タバコ培養細胞を用い、Alによる細胞増殖への影響を水ストレスから検討した。対数増殖期のタバコ培養細胞をカルシウムとショ糖のみを含む単純な培養液に懸濁し、Al (50 μM)を添加して18時間の培養を行った結果、Al処理細胞の水分含量はAlを添加していないコントロール細胞の70％程度に低下し、同時に増殖能も30％まで低下した。このようなAl処理細胞において原形質膜の透過性は、エバンスブルーの取り込みで見る限り、コントロール細胞と同程度であった。一方、Al処理細胞の浸透圧は、コントロール細胞の80％程度に低下していた。さらに、コントロール細胞とAl処理細胞から各々プロトプラストを調製し、低張液ならびに高張液に懸濁することにより水の透過速度について比較検討した結果、Al処理細胞では水の取り込み速度がコントロール細胞の1/4に低下し、水の排出速度が8倍に増加していた。以上の結果より、Al処理により細胞内の浸透圧が低下し、水の取り込みが抑制されて水分欠乏となり、細胞伸長が阻害さる可能性が示唆された。

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Tazawa and Okazaki (1997)は、カイワレダイコンの下胚軸表面からの水の蒸散をその重量の減少から求め、時間に対して直線になると報告した。この現象は当然のように見えるが、また奇妙でもある。なぜなら、下胚軸表面から水が蒸散すれば、それらの細胞内の細胞液の濃度は上昇し、濃度が上昇すれば、水は蒸発しにくくなるはずであるから、蒸散量は時間とともに減少するはずである。そこで、私はシャジク藻節間細胞からの水の蒸散速度を、25℃で相対湿度を制御した状態で測定するとともに、蒸留水、シャジク藻の細胞液とほぼ同じ濃度である300 mMマンニトール水溶液、およびその約二倍の濃度になる500 mMマンニトール水溶液と278 mM KCl水溶液表面からの水の蒸散速度を測定して比較した。得られた結果は次のようであった。(1)シャジク藻節間細胞表面からの水の蒸散は、時間に対して直線的で、(2)蒸留水、300 mM、及び500 mMマンニトール水溶液、278 mM KCl水溶液表面からの水の蒸発は、時間に対して直線的で、その蒸発速度は用いた水溶液の濃度範囲では、濃度依存性はなかった。したがって、カイワレダイコン下胚軸、およびシャジク藻節間細胞表面からの水の蒸散が、時間に対して直線的であることは、蒸留水及び、これらの濃度の水溶液からの蒸散速度に濃度依存性がないことで説明できる。これらの結果について、熱力学的に説明を試みて、ほぼ矛盾なく説明できた。

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　アラビノガラクタン-プロテイン（AGP）は高等植物の細胞間マトリックスや細胞膜に存在し、器官の分化・成長に伴い、その糖鎖構造が変化する。AGPの糖鎖の基本骨格はβ-3,6-ガラクタンで、側鎖を構成するβ-1,6-結合したGal残基にα-L-Arafやβ-GlcAあるいはβ-4-Me-GlcA等が結合した分岐構造を有している。AGPの糖鎖の生合成の解明を目的としてβ-グルクロン酸転移酵素（GlcATase）の諸性質について解析した。
　ダイコン一次根のミクロソーム画分を酵素源、UDP-[¹⁴C]-GlcAを供与体、β-1,3-ガラクタンを受容体として反応を行い酵素活性を求めた。GlcATaseの最適pHは6.0、0.75% Triton-X 100と30 mM MnCl₂で活性が促進された。[¹⁴C]GlcAの転移生成物をエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼで分解するとGlcA-Gal、GlcA-Gal-Galが生じ、それに続くAspergillus nigerのβ-グルクロニダーゼ[1]処理によりGlcAが検出された。ダイコン成根のAGPは本酵素の受容体としての効率は低いが、予めα-L-アラビノシダーゼとエンド-β-1,6-ガラクタナーゼ[2]で処理してAGPの側鎖を短くするとその受容体の効率が高まった。
[1] Carbohydr. Res., 333 (2001) 27-39
[2] Carbohydr. Res., in press

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気孔を構成する孔辺細胞は、光、特に青色光に反応して気孔を開口させ植物と大気間のガス交換を促進する。青色光は孔辺細胞の細胞膜H+ポンプを活性化し、気孔開口の直接の原因となるK⁺取り込みの駆動力を形成することが知られている。しかしながら、青色光受容体やH⁺ポンプの実体など青色光シグナル伝達の詳細は不明であった。私達はソラマメ孔辺細胞を用いて解析を進め、H⁺ポンプの実体が細胞膜H⁺-ATPaseであり、青色光によりH⁺-ATPaseが活性化されることを見出した。さらに、青色光による活性化にはH⁺-ATPaseのC末端から2番目のThr残基のリン酸化とリン酸化C末端への14-3-3 蛋白質の結合が必須であることを明らかにした。これは生理的シグナルによる細胞膜H⁺-ATPaseの活性調節機構を示した初めての例である。この研究過程において光屈性や葉緑体定位運動の青色光受容体フォトトロピン（phot）が孔辺細胞にも発現し、気孔開口の青色光受容体として機能していることを示す間接的証拠を得た。そこで、シロイヌナズナのphot変異体を用いて気孔の青色光反応を調べ、phot1とphot2が気孔開口の青色光受容体として重複して機能していることを実証した。
　本研究により、青色光はphotに受容され細胞膜H⁺-ATPaseを活性化し、気孔開口を引き起こしていることが明らかとなった。今後、photから細胞膜H⁺-ATPaseへのシグナル伝達に関わる未知の因子の同定が待たれる。

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