植物の生育にとって必要不可欠な元素であるリンは、今世紀半ばにも不足することが予測されているが、未だ植物のリン酸吸収機構は解明されていない。我々は、リンを有効に利用する植物改良あるいは栽培技術開発の手がかりを得る目的で研究を行っている。今回はESTクローンを利用したマクロアレイと、Agilentが提供するシロイヌナズナ22Kマイクロアレイを利用し、非重複な22,064個の遺伝子を対象とし、植物のリン酸飢餓応答性について解析を行った。液体回転培養を21日間行ったシロイヌナズナにリン酸飢餓条件を72時間与え、この過程に起こる遺伝子発現変化を詳細に解析した。この結果、リン酸トランスポーターAtPT2やRNase1、SQD1、SQD2など既に報告のあったリン酸飢餓誘導性遺伝子の発現に加え、発現比が各処理区のコントロールと比べ5倍以上となった遺伝子が70個同定された。また、解糖系においても、PEPからOAAを生合成する機能を持つ遺伝子が誘導されることが明らかとなった。これとは逆に、光合成反応に関与する遺伝子では、光化学反応系の構成パーツ、カルビン経路に関与する酵素群などが抑制されており、植物においてリン酸欠乏に動的に適応している様子が明らかとなった。

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一般に土壌中のリン濃度は低濃度であることから、植物は低リン適応戦略を発達させている。その一方で、リン欠乏状態の植物にリンを施与した場合（以下、P再施与）に急速にリンを吸収することから、P再施与時のリンの吸収に注目した。そこで、リン欠乏イネを用いてP再施与に応答して起きる遺伝子発現の変化をcDNAマイクロアレイによって網羅的に調査することを目的として実験を行った。水耕栽培によってリン処理（+P, -P, P再施与）を施したイネの根部または地上部から単離した全RNAを試料としてcDNAマイクロアレイによる遺伝子発現の解析を実施した。P再施与によって発現が有意に増減した遺伝子数は-P処理によって発現が有意に増減した遺伝子数の数倍であった。P再施与で最も発現が抑制された遺伝子は、-Pで最も発現が増加した新規遺伝子OsPI1であった。このようにP再施与で発現が減少した遺伝子の多くは-Pで増加した遺伝子であり、リンを十分に与えて栽培した+PとP再施与の間では差がなかったことから、-P条件に特異的に反応していることが明らかとなった。一方、P再施与で発現が増加した遺伝子の多くは、+PとP再施与を比べてもP再施与で発現量が多いことから、Pが欠乏している植物が、Pを再施与された際にPを獲得する場面において重要な役割を担う可能性が推察された。

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植物は低リン状態に陥ると、体内の代謝系を調節して細胞内のリンを効率的に利用するようになることが知られている。特に炭素代謝系において、リン酸化合物は様々な経路において関わっており、低リン条件下ではいくつかの経路においてはリン要求量がより少ない代謝系にバイパスすることが提案されている。さらには、無機リン酸の体内での再利用効率を高めるように代謝系が調節されていることが想定される。そこで、本研究では水耕栽培した栄養生長期のイネに低リン処理を施し葉からTotal RNAを抽出し、Real Time PCR法を用いて、Triose phosphote translocater, phosphoenolpyruvate/phosphate translocator, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate kinase, NAD dependent glyceraldehydes―3-phosphate dehydrogenase, NADP dependent glyceraldehydes―3-phosphate dehydrogenaseをコードする遺伝子の発現を調査した。低リン処理により無機リン酸が著しく減少した。これまでの報告では低リン栄養に対してPEPCはNAD-3G3PDHの活性が高まるとされていたが、遺伝子の発現レベルではそのようなバイパス機構はほとんどおこっていないことが想定された。その一方で、PPT/Pi translocatorの発現が低リン条件で著しく上昇していた。この事は細胞質からクロロプラストへのPEPに伴った炭素とリンの取り込みが低リン条件のイネの葉で進行している可能性を示唆している。

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Living organisms respond to phosphate limitation by expressing various genes whose products maintain an appropriate range of phosphate concentrations within each cell. We identified a two-component system, which consists of histidine kinase Hik7 and its cognate response regulator Rre29, that was the dominant sensory system that controled gene expression in response to phosphate limitation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.
The response regulators PhoB in E. coli and PhoP in B. subtilis bind specifically to conserved sequences, known as Pho boxes. In order to investigate the possibility that Synechocystis might also have a Pho box, we examined whether Rre29 can bind to the upstream flanking regions of the phosphate limitation-inducible genes. We found that Rre29 bound to the upstream flanking regions of several phosphate limitation-inducible genes at repetitive PyTTAAPyPy(T/A)-like sequences, suggesting that this repetitive sequence might be the Pho box in Synechocystis .

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　リン酸Alを唯一のリン酸給源として選抜されたニンジン培養細胞（LPT細胞）は、クエン酸を多量に放出することによりリン酸を獲得し、生育することができる。これまでに、この機構に関わる因子として分子生物学的にクエン酸合成酵素、NADP特異的イソクエン酸脱水素酵素を、生理学的にアニオンチャネル、PM H⁺-ATPaseを付きとめている。本研究では、PM H⁺-ATPaseに焦点を起き分子生物学的な解析を行った。
　クエン酸放出時には、PM H⁺-ATPaseを介してH⁺が放出されており、LPT細胞でその活性が高いことがわかっている。そこでde-generate PCRによりcDNAを単離し、6種類のisoformの存在を確認した。転写量解析の結果、DcPA1;1（Daucas carota proton ATPase）がLPT細胞で3倍転写量が高く、高活性に最も貢献していると考えられた。更にこのDcPA1;1をanti-senseによりLPT細胞で抑制したところ、活性の減少とクエン酸放出の減少に高い相関が認められ、PM H⁺-ATPaseの必須性がうかがえた。

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硫黄欠乏下でGFP蛍光を増す形質転換シロイヌナズナNOBをEMS処理したM2植物から、nbm2(NOB mutant 2) -1, 2を単離した。nbm2は、硫黄通常条件でNOBよりもGFP蛍光が強かった。マッピングを行ったところ、nbm2は第三染色体上腕の55kbの範囲に存在していた。この領域の10個の遺伝子のうちの一つ、BIG遺伝子の変異株（Gil et al. 2001）は、根の形態等の表現型がnbm2に似ていた。通常条件で14日間栽培したnbm2-1, 2それぞれのゲノムにおいてBIG遺伝子のORFには、ナンセンス変異があった。nbm2-2の葉の硫黄代謝関連化合物を定量したところ、硫酸イオンとグルタチオンの蓄積量は変化せず、硝酸イオンは減少していた。また、システインが減少し、γ-ECが増加している傾向が見られた。γ-EC合成酵素のmRNAの蓄積量は、nbm2で増加していた。big変異株では、オーキシンの極性輸送が抑制されていると報告されている。NOBをオーキシン処理しても、葉の蛍光は増加しない(Ohkama et al. 2002)が、極性輸送と硫黄欠乏応答に関連がある可能性も考えられ、検討を進めている。
Gil et al. (2001) Genes Dev. 15, 1985-1997: Ohkama et al. (2002) PCP 43, 1493-1501

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硫黄欠乏下で植物は、硫酸イオンの吸収活性を増すことでより多くの硫酸イオンを獲得しようとする。シロイヌナズナではSULTR1;1, SULTR1;2という二つの高親和型硫酸イオントランスポーター(SULTR)が外界からの硫酸イオン吸収を担っている。硫黄源以外の要因として、窒素や炭素のレベルによる硫酸イオン吸収活性の制御が知られている。近年植物ホルモンによる窒素・リン代謝の制御が報告されており、硫黄代謝においても植物ホルモンが何らかの役割を果たすことが推察される。SULTR1;2 5ユ領域の制御下にGFPを発現させた形質転換植物では、GFPの蓄積が内生SULTR1;2の発現を反映する。この植物を用いて、各種植物ホルモンのSULTR1;2発現に対する影響を調べたところ、GFPの蓄積、SULTR1;2発現ともにサイトカイニンにより著しく抑制された。硫酸イオンの吸収活性もサイトカイニンにより抑制され、さらにcre1-1植物では、その抑制の程度が減少していた。また、SULTR1;2欠損変異体を用いて、SULTR1;1も同様の制御を受けることを明らかにした。しかし、硫酸イオン濃度の減少に伴うSULTR遺伝子の発現誘導はLer, cre1-1の間で違いがなく、硫黄栄養とサイトカイニンは独立の機構で硫酸イオン吸収を制御していることが示唆された。

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オオムギの鉄欠乏誘導性遺伝子IDS2 (iron deficiency specific clone no. 2) のプロモーター領域の鉄欠乏応答性を形質転換タバコの系を用いて解析した。欠失解析および変異解析の結果、新規の2つのシスエレメント、すなわち翻訳開始点を+1として数えたとき -153/-136領域のIDE1 (iron-deficiency-responsive element 1) および -262/-236領域のIDE2が主に同プロモーターの鉄欠乏応答性を制御していることが明らかとなった。IDE1とIDE2は協同的に鉄欠乏誘導性・根特異的発現を付与したが、それぞれ単独ではこれらの特性を示さなかった。主要な発現部位は根の内鞘細胞、内皮細胞および皮層細胞であった。IDE2はIDE1と相同性を持っていた。また、検索の結果、IDE1 と相同性のある配列がオオムギ、イネ、シロイヌナズナの多くの鉄欠乏誘導性遺伝子のプロモーターにも存在することが明らかになった。このことから、鉄欠乏誘導性のシスエレメントが多くの遺伝子や植物種において保存されている可能性が示された。IDE1とIDE2は、高等植物の微量要素欠乏誘導性に関与するシスエレメントとして同定された最初のものである。

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　シダ植物のヘビノネゴザは重金属集積植物として知られ、高濃度の重金属を植物体内に蓄積する。一般にシダ植物は、独立した配偶体世代を持つが、ヘビノネゴザの配偶体が重金属に耐性があるかどうかは不明である。そこで本研究では、ヘビノネゴザの胞子発芽や配偶体の初期発生における重金属の影響を調べた。
　　最初に、鉛、カドミウム、銅、亜鉛およびヒ素の胞子発芽に対する影響を調べた。結果は、ヘビノネゴザの胞子がこれら有害金属の存在下（10^-5-10^-4M）においても、高い発芽能力を持っていることを示していた。なお、ヒ素に関しては、モエジマシダの胞子が最も高い発芽能力を示した。また、10μMの鉛イオン存在下においてもヘビノネゴザの配偶体は、その初期の生長においてほとんど影響を受けなかった。次に、10μMの鉛イオン存在下で培養したヘビノネゴザの配偶体において、配偶体への鉛の蓄積量を調べた。ヘビノネゴザの胞子体は、その植物体内に高濃度の鉛を蓄積する性質を持っているが、配偶体においても、高濃度（23,337 mg/kg）の鉛を蓄積する能力を有していることが分かった。ロジゾン酸ナトリウムによる染色像から、ヘビノネゴザの配偶体は仮根に鉛を蓄積していることが明らかになった。よって配偶体では、仮根に鉛を蓄積して鉛を無毒化しているものと思われる。現在、仮根における鉛の局在性について電子顕微鏡レベルでの解析を行っている。

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一般植物のNi耐性機構を明らかにする目的で、段階的にNi濃度を700μMまで高めて継代培養したタバコ培養細胞BY-2からNi耐性変異株NITを選抜し、その生理的性質の分析とNi耐性に関わる分子の検索を行った。このNIT細胞に様々なストレスをかけて野生株と比較したところ、Cu過剰とAl過剰についても弱い耐性を示したが、顕著な耐性はNi過剰にのみ見られた。またNi添加量の増加に伴って細胞内のNi含有量も増加し、NITがNiを集積していることが分かった。細胞内Fe含有量もNi添加により増加したが、これは細胞内のNi過剰によりFe代謝が阻害され、NITのFe要求性が高まったためと考えられる。さらにNi添加によりMg含有量が増加しており、これまでに報告のあるMg活性化型膜トランスポーターの機能とNi吸収に関連性がないか現在検討している。一方でNIT細胞は野生株よりも相対的に有機酸を多く含有しており、また700μM Ni処理をした場合のNIT細胞で特異的にヒスチジンが3～5倍多く含まれていた。ヒスチジンや有機酸はNiとキレート化合物を形成しNIT細胞内でNi毒性を抑えている可能性が高い。加えてNIT細胞で特異的に分泌されるタンパク質が見つかっており、これら分泌タンパク質の配列解析を進めている。またプロトプラストと液胞を単離し細胞内のNi分布を明らかにしようと試みている。

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酵母の重金属輸送P-type ATPaseであるPCA1は細胞膜上に存在し、銅を細胞外に排出していると予測されている。またPCA1の変異タンパク質であるCAD2が銅の他にカドミウム輸送能を獲得し、細胞外へこれらの金属を排出することで細胞に銅及びカドミウム耐性を与えていることが知られている。これらのタンパク質は細胞内の重金属イオンのホメオスタシスと耐性機構に大きく関わっていると考えられるため、これらの遺伝子をシロイヌナズナに導入し、形質転換体の重金属耐性について解析した。
　酵母のPCA1, CAD2遺伝子それぞれがCaMV35Sプロモーターの制御下で発現するコンストラクトを作成し、シロイヌナズナに導入した。　MS培地上での生長についてWTと比較したところ、PCA1, CAD2を導入したどちらの形質転換体も根の伸張が著しく抑制されていた。その後、これらの植物体を10 μM CuSO₄を含むMS培地上に移植したところWTと同様に生育した。これは細胞内の銅イオンがPCA1, CAD2によって細胞外に過剰に排出され銅の欠乏が生じたために生長抑制が起こったと考えられる。またPCA1の形質転換体は銅に対して耐性を、CAD2の形質転換体は銅とカドミウムに対して耐性を獲得していた。以上の結果から、酵母のPCA1, CAD2タンパク質は植物内で機能し、細胞内の重金属イオンのホメオスタシスと耐性機構に大きく影響を与えることがわかった。

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ニコチアナミン合成酵素（NAS）、ニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)は共にムギネ酸類（MAs）合成経路上の酵素である。MAsの前駆体であるニコチアナミン（NA）は植物に広く存在する金属のキレーターであるが、MAsはイネ科植物だけがもつ金属のキレーターである。NAを欠くタバコは不稔でありNAは双子葉植物の生殖成長に必須と考えられた（Takahashi et al., 2003, 15, 1263-1280, Plant Cell）。生殖成長におけるNAの役割を明らかにすることを目的とし、花と種子におけるNAS遺伝子の発現をレポーター遺伝子（GUS）を用いて解析した。またイネ科植物の生殖成長におけるNAとMAsの役割を明らかにするため、イネの花と種子におけるNAS、NAAT遺伝子の発現を同様に解析した。シロイヌナズナにおいてAtNAS遺伝子は花の各器官と維管束、さや、さやの維管束、若い種子、珠柄、胚に発現しており、分子種によって時期や発現部位に違いがみられた。イネにおいてもOsNASの発現は分子種によって時期や部位に差があった。またNAからMAsへの合成に関わるOsNAAT遺伝子の発現の時期や部位は、OsNASの発現と完全には一致しなかった。以上の結果はNAやMAsが花や種子への金属輸送に果たす役割だけではなく、胚発生においても重要な役割を持つことを示唆している。

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細胞内には様々な機能を持つオルガネラが存在する。それらは複雑な構造をもち、また機能的にも高度に分化している。葉緑体やミトコンドリアなどは固有のゲノムを持つが、これらがコードしている遺伝子はごくわずかであり、オルガネラを構成する遺伝子のほとんどは核ゲノムに依存している。シロイヌナズナなどいくつかの植物はゲノムプロジェクトが終了しているが、「どの遺伝子が」「いつ」「どこで」機能しているかについてはゲノムの解読だけではわからない。これまでに様々な生化学的、形態学的な見地からオルガネラの研究が行われてきたが、複雑な構造や機能を制御する分子生物的な仕組みについては未解明の部分が多い。
　本研究では、ゲノム上の様々な遺伝子に対して、遺伝子産物を可視化するレポーターを付加するシステムを開発した。トランスポゾンを用いてGFP遺伝子を配布し、融合タンパク質を発現する挿入変異株を作成する仕組みである。これを用いて作成した変異体の集団から、ターゲットとするオルガネラにGFPの蛍光が局在している株、すなわちオルガネラの構造や機能に関与しているタンパク質の遺伝子の挿入変異株をヘテロの世代で探すことができる。もちろん、ホモとなった場合の表現型は次世代で観察できる。このシステムを用いて得られた変異体と思われる株について紹介する。

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葉緑体は、光合成を行う植物固有の細胞小器官で、独自のゲノムとその遺伝子発現系を持つ。葉緑体遺伝子の発現における最終的なタンパク質合成量は、転写レベルやRNAの蓄積量にあまり影響を受けず、翻訳レベルに依ることが明らかにされているが、葉緑体の翻訳過程の分子機構は不明な点が多い。
葉緑体は原核生物型の細胞構造を有するが、葉緑体遺伝子の翻訳は、原核生物のそれとは大きく異なる。原核生物のmRNAでは5'非翻訳領域のシャイン・ダルガーノ（SD）配列が30Sリボソーム中の16S rRNAと相互作用することによって、翻訳が開始される。しかし、葉緑体mRNA（全79種）中の2/3はSD配列を持たず、これらのmRNAがどのような翻訳機構に依存するかは不明である。
そこで、様々な育成段階のタバコから抽出したプラスチド全RNAとポリソーム画分に含まれるmRNA（翻訳されているmRNA）を葉緑体DNAマイクロアレイにより解析し、翻訳が活性化されているmRNA中の5' 及び3'UTRの保存配列の抽出を進めている。現在までに葉緑体in vitro翻訳系などを用いて明らかにされている翻訳シス配列と比較して、葉緑体mRNAの翻訳に必要な配列に関して議論する。

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EMSを用いて作出したシロイヌナズナのpcb2 (pale-green and chlorophyll b reduced 2) 変異株は、野性株に比べて淡い体色が特徴で、クロロフィル含量が約1/3に減少しており、特にクロロフィルbが減少していた。葉緑体の形状と数は野生株と大きく変わらなかったが、葉肉細胞の電子顕微鏡観察を行ったところ、グラナスタックが極度に減少していることがわかった。その原因遺伝子をマッピングしたところ、第5染色体の上腕の約190kbの範囲にあることがわかった。この領域には49個の遺伝子がコードされている。細胞内局在予測プログラムを利用して、葉緑体への局在が強く示唆される遺伝子に注目して野生株と変異株の塩基配列を比較したところ、そのうちの1つの遺伝子で一塩基置換の変異が見つかった。この遺伝子はイントロンを持たず、コードされるタンパク質は417のアミノ酸で構成され、N末端に葉緑体移行シグナルを持っており、変異は29番目のグルタミンコドンを終止コドンに変える、ナンセンス変異であった。データベースを検索したところ、イネや光合成細菌から相同性の高い配列が見つかったが、いずれも機能はまだ分かっていないようである。
この遺伝子をpcb2変異の原因遺伝子と仮定して解析を進めている。

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植物における子葉の役割は多岐にわたる。本葉が展開するまでに必要なエネルギーの生産や、周囲の光・生育条件などの環境シグナルを受信し適応する、といった重要な働きをしている。子葉は、高等植物の発生における初期に位置し、本葉とは一線を画す存在であり、その機能の全容は明らかになっていない。
wcoは子葉が白色で展開し、本葉からは正常な葉が展開する変異体である。以前の解析によって、子葉特異的に16S rRNAの成熟欠損が引き起こされることが明らかになっている。16S rRNAは葉緑体にコードされる遺伝子を翻訳する際に必要となるが、wco変異体の子葉では、葉緑体にコードされる光合成関連遺伝子の発現は抑制されていた。さらに核にコードされる光合成関連遺伝子の発現には、野生株と比べて変化は見られなかった。
クロロフィル合成系はどうなっているのか、なぜ本葉は緑になるのか、といった多くの疑問が発生してくる。そこで、wcoをよりくわしく解析するために、原因遺伝子の特定のための遺伝子学的解析と、wco変異表現型の生理学的解析を行ったので報告する。

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高等植物の核ゲノムは葉緑体の光合成装置や、葉緑体の遺伝子発現の制御を行う多くのタンパク質をコードしている。また、核ゲノムにコードされるタンパク質が葉緑体の分化や分裂の制御も行っていると考えられる。
葉緑体の形態形成機構に関与すると考えられる遺伝子はARCやFtsZなどが報告されているが、それらだけでは形態制御過程・分裂過程の一部しか説明できないので、まだ多くの未知の遺伝子が葉緑体の形態形成に関与していると考えられる。
Arabidopsis tharianaの野生株Colの葉緑体は、大きさも形態もほぼ均一な円盤型をしているのに対し、EMS処理で得られた系統5-45変異株では、葉緑体の大きさが不均一になっていた。野生株のものの数倍まで大きく膨張したようなものや、逆に数分の一に縮小したものが観察され、形状も円盤型でないものが観察された。また、出芽中の酵母のようなくびれを持つ葉緑体も観察された。
5-45変異株の原因遺伝子をマッピングした結果、第五染色体の上腕、8044kb～8301kbの間に位置することが分かった。また、arc11 (accumulation and replication of chloroplasts)は葉緑体の数と形態異常を持つ系統であることが報告されているが、5-45変異株はarc11を相補しなかったので、これらは同じ遺伝子座に変異を持つ、異なるalleleであることが明らかになった。
本発表では5-45変異株とarc11の原因遺伝子について解析したので報告する。

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大腸菌におけるRNAの分解機構は、連続した複数の過程からなる。まず、分解されるRNA分子は、エキソ型のRNase Eによる切断を受ける。その分解断片は、3’末端にポリ(A)付加を受け、その後エキソ型のpolynucleotide phosphorylase (PNPase)、もしくはRNase IIによる分解を受ける。葉緑体は、進化的にその起源を原核生物型の光合成細菌に持つと考えられており、遺伝子発現機構にも多くの共通点を含んでいる。そこで我々は、これらのRNA分解に関与する葉緑体RNaseの同定を目指し、シロイヌナズナT-DNA挿入変異株におけるRNaseホモログ破壊株の探索を行った。候補変異株の中から、葉色、生育、クロロフィル蛍光をもとに選抜を行い、RNase E、PNPase及びRNase II/Rの3種の葉緑体RNase候補遺伝子の破壊株をを単離した。PNPase破壊株は、葉の基部が退色する表現型を示した。また、RNase E及びRNase II/R破壊株は、光独立栄養条件下では生育できず、これらのRNaseが葉緑体のRNA代謝に重要な役割を担っていることが示唆された。現在、これらの破壊株について詳細な解析を行っている。

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　　葉緑体形成や色素合成に関与する遺伝子を調べるうえで、葉緑体機能が欠損（アルビノ）あるいは低下した（pale-green）変異体の解析は極めて重要である。
　　我々はこれまでに、トランスポゾン Ac/Ds 挿入変異体の幼苗期表現型の探索により、数多くのアルビノまたは pale-green 変異体 (apg: albino or pale green) を同定した。その中の1つの pale-green 変異体 (apg6) は、熱ショック蛋白質 Hsp101 のホモログ遺伝子内にトランスポゾンが挿入していた。我々はこれまでにリバータントを単離し、APG6 遺伝子内の異なる位置に Ds または T-DNAが挿入した3つの Allele全てが pale-green の表現型を示すことから、この遺伝子の欠失が原因で pale-green の表現型を示すことが明らかとなった。 APG6 遺伝子がコードするタンパク質の N 末には葉緑体移行に必要なトランジットペプチドが存在し、膜貫通ドメインは存在しない。また、電子顕微鏡による葉緑体の形態観察から apg6 変異体では野生型に比べ葉緑体の大きさが小さく、チラコイド膜が未発達であった。APG6 は熱により強く発現誘導されることから、APG6 タンパク質は葉緑体移行のシャペロンとして葉緑体内ストロマで重要な働きを担っていると考えられる。

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ヒメツリガネゴケは、ファージタイプRNAポリメラーゼ遺伝子を2個（PpRPOT1、PpRPOT2）持ち、いずれも開始コドンとなり得る2個のAUGコドンが存在する。5′非翻訳領域と2個のAUGを含むN末端配列にGFPをつないだコンストラクトをヒメツリガネゴケに導入したところ、GFPの蛍光はミトコンドリア（Mt）にのみ局在し、どの組織でも葉緑体への局在は見られなかった。また、一番目のAUGから強制的に翻訳させると葉緑体（Cp）とMtに、二番目のAUGから翻訳させるとMtに局在するという結果が得られた。しかし、それぞれのAUGからの翻訳効率を調べたところ、2番目のAUGのみが翻訳開始コドンとして用いられていることが示唆された。これらのことは、単離CpとMtの転写に対するタゲチトキシンの効果や免疫ブロットの結果とも一致する。
　一方、シロイヌナズナにはRPOT遺伝子が3個存在し、それぞれMt、Cp、そして両方へ輸送されることが知られている。両方に輸送されるAtRpoT;2は、PpRPOT1とPpRPOT2と同様にN末端に2個のAUGコドンを持つ．5′非翻訳領域と2個のAUGを含む配列にGFPをつないだコンストラクトを用いて、安定な形質転換体を作製しGFPの局在を観察したところ、Mtのみに局在していた。

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C. merolaeの葉緑体ゲノムには、4種の転写因子 (Ycf27-30)が保持されており、これらは環境の変化に応答して、主要な光合成遺伝子群の転写制御を行っていることが予想される。私達は、これらの転写因子が認識しているシグナルや標的遺伝子群の同定は、複雑な光合成系の転写制御機構の最も単純なモデルを提供することになると考えて研究を進めている。本大会では、1）Ycf30によるルビスコ遺伝子群の転写制御機構と、2）集光装置の形成に働く転写因子の検討について報告する。1）精製したYcf30タンパク質は、ルビスコ遺伝子オペロンの上流域に結合した。転写開始点決定の結果、ルビスコ遺伝子オペロンは一箇所の転写開始点からの転写が活性化されていることが強く示唆された。2）C. merolaeを強光下で培養すると、通常条件で培養したものに比べて黄緑色を呈したが、弱光条件へ移すと通常の青緑色へと変わった。これは、強光から弱光へシフトにより、集光装置の形成が起きたものと考えられた。そこで、強光条件から弱光条件へ移して3時間後までの転写産物量を調べたところ、cpcA遺伝子とycf29遺伝子の転写産物量の増加がみられた。この結果は、Ycf29が集光装置の形成に関わる転写因子である可能性を示唆した。現在、Ycf29と集光装置に対応した遺伝子群の発現制御機構の関連について検討中である。

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植物の葉緑体ゲノムにコードされた光合成遺伝子の多くは、原核型のRNAポリメラーゼ(PEP)によって転写される。PEPのプロモータ認識と転写開始には、核にコードされたシグマ因子が関与する。バクテリアのシグマ因子には主要型と置換型が存在し、転写制御において重要な役割を担っている。高等植物にも複数の葉緑体シグマ因子が存在するが、その機能分担や転写制御における役割は十分に分かっていない。シロイヌナズナは6種の葉緑体シグマ因子を有する。本研究では、T-DNA挿入によるSIG6欠損株sig6-1を詳しく解析した。sig6-1は、発芽後初期の子葉の葉緑体形成が遅れ、子葉が薄緑色を呈した。これはPEPが転写する光合成遺伝子やtRNA、rRNA遺伝子の転写産物量が大きく減少したためである。Sig6依存遺伝子の上流には典型的なシグマ70型プロモータが見られることから、AtSig6がシグマ70型プロモータをひろく認識するシグマ因子であることが分かる。AtSig6はバクテリアの主要型シグマ因子に相当する機能をもち、子葉における葉緑体分化の初期段階で中心的な役割を果たしていると考えられる。一方、sig6-1でのPEP転写の異常と葉緑体発達の遅延は、8日齢実生ではほぼ正常に戻った。成熟葉緑体では、別のシグマ因子がAtSig6の機能を相補していると考えられる。SIG6過剰発現体の解析ついても併せて報告する。

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　独自のゲノムと遺伝子発現系を持つ葉緑体には、転写装置の一つとして真正細菌型RNAポリメラーゼ（PEP）が存在する。PEPは主として光合成遺伝子の発現に関わっており、葉緑体の機能発現に必須である。PEPのコア酵素遺伝子群が葉緑体ゲノム上に存在するのに対し、PEPにプロモーター認識特異性を与える6種のシグマ因子（SIG1～6）は核染色体にコードされ、葉緑体機能の構築や修復に関わることが示唆されている。
　我々はストレス時における葉緑体転写制御に興味をもち、ストレスで誘導されるシグマ因子の検索を行った。その結果、SIG5の発現が強光、塩、浸透圧、低温ストレスにより、転写レベルですみやかに誘導されることを見出した。さらに、新たに同定したSIG5遺伝子のT-DNA挿入変異（sig5-2）株を用いた解析の結果、psbDの光誘導プロモーター（LRP）からの転写が強くSIG5に依存していることが明らかになった。これまでも、（青色）光がSIG5を介してpsbD-LRPの転写誘導に関わることは示唆されてきたが、本研究によりこの応答が光のみならず広範なストレスに対応した転写制御であることが明らかになった。強光ストレス後のPSII活性の回復過程をクロロフィル蛍光で観察したところ、sig5-2株では野生株に対する若干の修復の遅れが見られる。従って、SIG5による遺伝子発現制御は、ストレス下で損傷した光合成活性中心の修復に関わると考えることができる。

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　光合成は光条件下において葉緑体で営まれ，葉緑体内の環境は昼夜の変化により大きく変動する．D1タンパク質に代表されるタンパク質は，その分子種の更新により光合成機能が維持される．したがって，葉緑体内環境の変化を感知した遺伝子発現制御系の介在が想定される．
　葉緑体光合成遺伝子は，細菌型RNAポリメラーゼ（PEP）によって転写され，そのプロモーター認識および転写開始には核コードである複数種のσ因子が必須である．シロイヌナズナを用い，リン酸化予想部位を欠損させたSIG1およびSIG3分子種のコンストラクトを作製し，これらによりシロイヌナズナを形質転換した．これらの形質転換系統においては，暗所における葉緑体光合成遺伝子の転写産物量の低下が軽減されていた．[³²P]正リン酸をシロイヌナズナに取り込ませ，σ因子をリン酸化標識した．ショ糖密度勾配遠心および免疫沈降により，SIG1およびその複合体のリン酸化の状態を解析した．以上の結果より，暗所においてはσ因子のSer/Thrタンパク質キナーゼリン酸化部位がリン酸化され，その結果，葉緑体光合成遺伝子の転写が抑制されていることが明らかになった．これはRNAポリメラーゼを構成するサブユニット (因子) のリン酸化を介した転写抑制機構の初めての証明と考えられる．

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グルタミン合成酵素は植物において窒素同化の中心的役割を果たすキー酵素の1つであり、維管束細胞の細胞質(GS1)と葉及び根の葉緑体(GS2)においてアンモニアをグルタミンへ同化させる。C3植物の葉において光呼吸で生成されたアンモニアはGS2ミGOGAT系で再同化を受ける。以前、我々はアグロバクテリウム法による核の形質転換によってGS2を過剰発現する形質転換タバコを作成した。このGS2 高発現体では光呼吸能が高まり、強光ストレスに対して耐性を示した。しかしGS2の発現レベルは野生型の最大3倍であった。一方葉緑体形質転換法を用いると、導入遺伝子の高発現が期待される。そこで今回、イネGS2遺伝子を葉緑体ゲノムに導入したGS2 高発現タバコの作成を試みた。
　葉緑体移行ペプチドを除いたイネGS2 cDNAを、緑葉で強力に発現するタバコpsbA 遺伝子のプロモーターと5'-UTRから発現させた。GS2 発現カセットは選択マーカー遺伝子 (aadA) と共にタバコ葉緑体ゲノムのIR 領域に相同組み換えによって導入した。得られた形質転換体の葉においてGS2タンパク質の発現レベルは野生型の30～40倍に増加していた。また、GSの酵素活性も7～9倍に増加していた。一方、根におけるGS酵素活性は野生型と顕著な差異が認められず、組み換えGS2の発現は高い器官特異性を示すことがわかった。現在この形質転換体の生理学的特性を解析中である。

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A growing body of evidence indicates that a RecA-mediated recombination system exists in chloroplast. However very little is known about mechanism for plastome homologous recombination. Using E. coli producing recombinant protein, we examined the enzymatic properties of chloroplast-targeted RecA homologue, recA-AT, encoded on the Arabidopsis nuclear genome (see Cerutti et al 1992). Although predicted mature recA-AT showed ATPase and DNA-binding activities, it had little strand exchange activity. More detailed characterization revealed that enzymatic properties of the recA-AT were distinct from those of authentic E. coli RecA: the effect of DNA on ATPase activity, the strength of DNA-binding activity and the migration pattern of DNA-protein complex in gel retardation assays. These differences between the recA-AT and the RecA raise a possibility that biochemical mechanism of the plastome homologous recombination is different from that of RecA-mediated homologous recombination in E. coli. Supported by METI/NEDO partly.

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Mitochondrial citrate synthase was overexpressed in Eucalyptus plant and its effects on organic acid excretion and low phosphorus tolerance were examined. The transformants and control plants were grown with a hydropoinc culture solution containing AlPO₄ as a sole phosphorus source. CS activity in roots of the transformants showed 1.4- to 2.5-fold increase in comparison with that in the control. Symptom of phosphorus deficiency was ameliorated in the transformants as judged form their phosphorus content. One transgenic line showed slightly higher (1.6-fold) citrate excretion than the control. This line was then grown with an acid soil containing insoluble phosphate and its growth tended to be slightly greater than that of the control. Therefore, it is suggested that overexpression of mitochondrial citrate synthase improves the growth performance of Eucalyptus plant under low phosphorus stress due to the high ability of phosphate-acquisition caused by the enhanced citrate excretion.

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100kbもの長鎖DNA断片を用いた形質転換技術は、植物への複数の遺伝子や量的形質遺伝子座（QTL : Quantitative Trait Loci ）等の遺伝子座を含む大きな染色体領域の導入を可能にする。我々はイントロンを含むゲノムDNAの導入による異種植物への新形質付与の可能性を、約80kbのシロイヌナズナゲノムDNA断片を挿入したTACベクター（長鎖DNA断片の植物形質転換用ベクター）を用いて検討している。本研究ではシロイヌナズナゲノム上の病害抵抗性遺伝子（推定の病害抵抗性遺伝子を含む）を含む染色体領域を、アグロバクテリウム法を用いてわい性トマトMicro-Tomに導入した。現在までに11個の病害抵抗性遺伝子を導入した33系統のトマト形質転換体を作出した。トマト葉で発現の認められた遺伝子で正常なスプライシングが起きていることを確かめるために、イントロンを挟んだ配列でプライマーを設計し、RT-PCRを行ってPCR産物のサイズを比較した。導入された病害抵抗性遺伝子ではシロイヌナズナと同様のスプライシングが生じていた。1遺伝子ではサイズの異なる2種類のPCR産物が増幅し、シロイヌナズナと導入された病害抵抗性遺伝子で同じ結果が得られた。シークエンスで塩基配列を比較し、選択的スプライシングの保存が確認された。今後は病害抵抗性遺伝子を誘導するサリチル酸処理等による遺伝子発現の変動を調べる。

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　1億年以上前に分岐した植物間の多様性を分子レベルで解明するために、シロイヌナズナの多数の遺伝子を異種植物ゲノム環境に移し、それらがどのような挙動を示すかを調べている。本研究ではTACベクター（長鎖DNA断片を植物に導入できるバイナリーベクター）に挿入されたシロイヌナズナの長鎖ゲノムDNA断片を、アグロバクテリウムを介してトマトに導入した。導入に用いた4種のDNAの断片は61、75、76、78kbpであり、それぞれ17、20、22、23個の遺伝子が含まれている。これらの遺伝子の発現を調べるために、9,600種のシロイヌナズナ遺伝子断片及び3,600種のトマト遺伝子断片がスポットされているDNAマクロアレイを用いた。アレイフィルターには導入に用いた遺伝子断片を加えた。シロイヌナズナDNA断片導入によるトマトの内在性遺伝子の発現の変化は認められなかった。約4割の遺伝子のトマトの葉、葉軸、根での発現は、シロイヌナズナの対応する器官での発現とよく一致しており、両植物間で遺伝子発現制御機構が強く保存されていることを示唆する。約6割の遺伝子に関しては、シロイヌナズナとトマトのゲノム環境における遺伝子発現レベルの違いが検出された。この結果は、進化的に離れた植物間での多様性を分子レベルで明らかにする手がかりとなる。

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アラビドプシスのacetolactate synthase (ALS)遺伝子をジーンターゲッティングにより除草剤感受性型から耐性型へ置換する実験を行った。すなわち、除草剤耐性を付与する塩基置換を有し、5ユ領域を欠失したALS 遺伝子断片をin planta transformationにより導入し、後代種子約78万粒を除草剤選抜したところ、4個体の耐性個体が得られた。詳細な解析の結果、導入した塩基置換が確認された2個体のうち1個体ではdouble cross over modelにより説明可能なtrue gene targetingが生じ, もう1個体ではectopic gene targetingが生じたことにより除草剤耐性を獲得したと考えられた。ターゲッティングベクターにゲノム由来の塩基配列がコピーされ、それが再びゲノムに挿入される、ectopic gene targetingにより説明可能な現象はこれまでにも報告されているが、シークエンスレベルで解析した例はない。本研究により、ジーンターゲッティングによる塩基置換の導入が可能であることが示されたが、その実用化には、頻度の向上とともに、同時に起こりうるectopic gene targetingの機構についてもその解明と頻度の把握が求められることが明らかになった。

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我々は単子葉のモデル植物であるイネで相同組換えを介した遺伝子ターゲティング法の開発を行い、Waxy遺伝子を標的モデルとして再現性のある実験系を確立した。Waxy遺伝子座では極めて正確な組換えが生じ、次世代にメンデル遺伝していることを明らかにして、昨年までの本大会でその成果を報告した。我々のターゲティング法は強力なポジティブ・ネガティブ選抜法を基本とし、Waxy以外のイネ遺伝子も改変できると考えられるので、その可能性を複数の遺伝子について検討を進めた結果、Waxy以外のイネ遺伝子でも相同組換えによる遺伝子ターゲティングができることが明らかになってきた。今回は、第11番染色体短腕にタンデムに2コピー存在するアルコール脱水素酵素遺伝子 (Alcohol dehydrogenase) のターゲティングの概要を報告する。Adh1とAdh2は互いの遺伝子のコード領域の相同性が極めて高いが、イントロンとプロモーターの塩基配列は異なり、両遺伝子座周辺にはレトロトランスポゾンも存在する。Waxy遺伝子ターゲティングと同様のポジティブ・ネガティブ選抜マーカーを持つ基本ベクターに各々Adh1とAdh2の相同領域を導入したベクターを構築して実験を行った結果、ターゲティングされたと考えられる形質転換カルスが得られ、我々の技法がイネの遺伝子を汎用的に改変出来る可能性が示唆された。

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イネは単子葉のモデル植物でそのゲノム情報や新規トランスポゾン等が急速に充実しつつある。遺伝子ターゲティングは、自在にゲノムを改変することが可能で遺伝子の機能を解析する上で優れた手法と考えられる。我々はイネのターゲティングによる遺伝子改変法の汎用化に向けて、冠水ストレスに関わるアルコール脱水素酵素(Alcohol dehydrogenase: Adh) 遺伝子の改変を試みた。イネのAdh1とAdh2は第11番染色体上にタンデムに存在し、それぞれ約40kDaのタンパクをコードし、ホモダイマーあるいはヘテロダイマーで組織特異的に発現していることが報告されている。Adh2はイネの根でホモダイマーとして強く発現することが報告され、水田で育成されるイネの特徴的な形質を担っている。すでに開発したWaxy遺伝子のターゲティング法に基づき、Adh2遺伝子の翻訳開始点(ATG)の上流の第1エクソンにHm^r（Hygromycin耐性）遺伝子と転写終止領域を挿入し、遺伝子破壊するターゲティングベクターを構築し、強力なポジティブ・ネガティブ選抜によるターゲティングを行った。その結果PCR解析で相同組換えが生じたと推定される複数のカルスを得た。さらに詳細なサザン解析を行ったので、その結果についても報告する。

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　デンプン顆粒結合型アミロース合成酵素をコードするイネWx遺伝子は花粉・胚乳で組織特異的に発現する。我々は、intron-spacerを持つWx 5'UTR dsRNAを転写するベクター、pWRI-Aおよび pWRI-Bを構築した。これらを導入した形質転換体を解析し、組織特異的なRNAiとその抑制効果の量的制御について検討した。その結果、pWRI-Aおよび pWRI-B双方とも、約140塩基から成る5'UTRのdsRNAをtriggerとして、胚乳におけるWx遺伝子の発現を抑えることが可能であった。さらに、イントロン5'側スプライシング部位に置換変異を持つpWRI-Bを導入した系統では、遺伝子不活性化を量的に減ずる事が可能であった。他方、いずれにおいても、花粉における強い抑制効果は観察されなかった。
　今回、intron-spacer及びforeign sequence-spacerのRNAiに対する効果について、種々のベクターを設計することにより、さらに検証を試みたので報告する。

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遺伝子導入植物では独立した遺伝子導入個体間で導入遺伝子発現のばらつきが生じ、導入遺伝子が安定発現している個体の獲得がしばしば困難となる。ばらつきの原因のうち導入遺伝子の周辺環境の違いに着目し、これを一定にすることにより遺伝子導入個体間での導入遺伝子発現の安定化を試みた。
導入遺伝子の周辺環境を一定にするために、長鎖DNAを植物に導入可能なバイナリーベクターであるTransformation-competent Artificial Chromosome（TAC）ベクターを改良し、両端に一定配列の長鎖（32 kb、41 kb）DNAを付加した状態で遺伝子導入できる改良TACベクターを開発した。効果を調べるため、改良TACベクターを用いβ-glucuronidase（GUS）遺伝子をシロイヌナズナに導入し、GUS遺伝子コピー数、mRNA蓄積量、GUS活性等を調べた。
その結果、コントロールであるTACベクターによる遺伝子導入シロイヌナズナ個体間でのGUS活性のばらつきの主な原因は、導入遺伝子の染色体上での挿入位置の影響（位置効果）ではなく、複数のGUS遺伝子が導入された個体でのジーンサイレンシングであると考えられた。これら個体ではGUSmRNA蓄積量の低下、20-25 ntの小分子RNAが確認されたことからPTGSが起こっていると推察され、改良TACベクターはこれを回避し発現を安定化していると推察した。改良TACベクターを用いた場合、導入遺伝子を1コピー持つ個体をコントロールの約2倍の確率で獲得できることもわかった。

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　導入遺伝子の発現は、個体間で大きく異なることが知られている。これは位置効果と呼ばれ、導入遺伝子の染色体上の挿入位置に依存した現象と考えられている。動物での知見から、真核生物の染色体上では多様なクロマチン構造が形成され、遺伝子発現に影響を与えうることが示されている。このため位置効果を抑制するには、導入遺伝子を周辺の染色体構造から保護することが必要と考えられる。
　我々は染色体の構造上の境界として機能すると考えられるインスレーターを用いて位置効果を抑制できるか解析した。ウニ由来のArs（Arylsulfatase）インスレーターをCaMV（cauliflower mosaic virus）35Sコアプロモーター（90 bp）-GUS（β-glucuronidase）遺伝子の5'上流に付加してタバコ培養細胞BY2の染色体上へ導入し、独立した50クローンについてGUS活性染色を行った。インスレーターを付加していない対照遺伝子では、有意なGUS活性が認められるクローンは約6割であったが、インスレーターを付加した場合では全クローンにGUS活性が認められた。この結果から、Arsインスレーターは個体間における導入遺伝子発現のばらつきを抑制できることが示された。現在、インスレーターの欠失解析を行い機能領域の限定を行っている。

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転写因子は標的遺伝子の発現を精巧に調節するための転写制御ネットワークを形成することにより植物の器官形成や環境応答を制御する。従来、転写因子の機能を明らかにするために遺伝子破壊株の単離やアンチセンス法、RNAi法などが行われてきた。しかし、転写因子は重複して存在する場合が多く、1遺伝子の機能のみを阻害する従来法を用いた解析において顕著な形態異常を示す例は限られていた。そこで、我々は任意の転写因子にEAR転写抑制ドメインを融合したキメラ転写抑制因子を植物内で発現させることにより、重複する内在転写因子に優先して標的遺伝子の発現を抑制することができる新規な転写因子の機能解析法CRES-Tシステムを構築した。
CRES-Tシステムを用いて植物特異的な転写因子ファミリーTCPの機能解析をするために各TCP転写因子を転写抑制因子に転換したキメラ転写抑制因子を発現させた形質転換植物を作製した。その結果、TCPキメラ転写抑制因子は芽生えや葉においての器官形成の異常を誘導することが明らかになった。一方、TCP転写因子を過剰発現した形質転換植物は同様の形態異常を示さなかった。この結果から内在するTCP転写因子は正常な胚発生や葉の形態の維持に必要であると考えられる。

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　ゲノムレベルで解析された遺伝子情報を基に生命現象を理解していくうえで、遺伝子産物間相互作用を明らかにすることは重要な課題となっている。我々は全ゲノム塩基配列を決定したラン藻Synechocystis sp. PCC 6803 について、遺伝子産物の機能解析の一環として大規模な相互作用解析を計画し、酵母two-hybrid法を基にして、ベクターの改良と酵母接合を利用したスクリーニング系の導入を行うことにより大規模解析可能な系を確立した。
　このスクリーニング系を用いて、これまでにSynechocystisの二成分制御系を構成する84遺伝子および、シロイヌナズナゲノムにオルソログが保存されている605のSynechocystis遺伝子についての相互作用解析を行った結果、1,248の相互作用候補を検出し、918遺伝子で構成される相互作用ネットワークが得られた。　
　現在、解析規模をさらに拡大し遺伝子の機能アノテーションにつながるデータを得ることを目的としてSynechocystisゲノムに予測されている遺伝子のうち機能情報が得られていないものに着目し解析を行っている。また、相互作用解析と並行して、これらの相互作用情報を遺伝子機能のアノテーションに結び付けるために、得られた相互作用データをデータベース化しCyanoBaseに統合する準備も進めている。解析により得られたSynechocystis遺伝子産物相互作用ネットワークの最新情報と構築中の相互作用データベースについて報告する。

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To investigate the whole genetic system of legumes, we initiated
large-scale sequencing of the genome of a model legume, Lotus
japonicus. Using the information on ESTs and cDNA markers of
legume plants, genomic clones corresponding to the multiple seed
points of the genome have been chosen as initial targets. As the
accumulation of the seed sequences has progressed, clone selection by
walking has also initiated. Currently, a total of 1,550 clones have
been selected. One hundred and twenty seven of them are in the library
phase, 952 are in the finishing phase and 412 have been annotated. A
total of 3,975 protein coding genes were identified in 42.2
Mbp. Mapping of the seed clones has also been performed by generating
PCR-based markers from sequence information, and 1,140 clones have
been located on the linkage map. The sequence data, gene information
and mapping information are available through the WWW at
http://www.kazusa.or.jp/lotus/.

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シアノバクテリア祖先種の細胞内共生による葉緑体の起源が，ほぼ間違いのない仮説として信じられている。この細胞内共生に伴い，タンパク質をコードする遺伝子が，共生体から大量に始源真核光合成細胞に導入されたと考えられる。そこで，様々な生物のゲノムにコードされたタンパク質遺伝子の比較に基づき，共生体起源と考えられる植物遺伝子をまとめて選び出し，実験的に証明していくことを目的として，本研究を開始した。タンパク質配列の類似性に基づいてクラスタリングを行うソフトウェアGclustを開発し，8種のシアノバクテリア，3種の光合成細菌，2種の非光合成細菌，2種の真核非光合成生物，およびシロイヌナズナと原始紅藻，計17種の生物が持つ全推定タンパク質約11万個のクラスタリングを行った。植物・藻類と8種のシアノバクテリアすべてに共通するクラスタを選び出した。これらのクラスタに含まれる遺伝子のうちで，機能未知のものの機能解析を行うため，44個のSynechocystis遺伝子の高速遺伝子破壊と，57個のシロイヌナズナ遺伝子のタグライン解析，葉緑体ターゲティングの解析，発現解析などを進め，これらの知見を総合して，新規光合成関連遺伝子の大量同定を目指している。

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ゲノム情報に加えて各種リソースが充実しつつあるモデル植物のシロイヌナズナではタグラインなどを利用することにより、全ての遺伝子の破壊株を調べること（Saturation Mutagenesis）が可能であると考えられる。私たちはシロイヌナズナのゲノム機能研究に必要な研究リソースの一つとして、トランスポゾンを利用したタグラインの作製を行ってきた。これまでに約12,000の独立したタグラインのトランスポゾン挿入位置近傍の配列解析を行い、遺伝子コード領域へトランスポゾンが挿入されているライン数を調べたところ、合計約4,000遺伝子への挿入が含まれていることが分かった。そこで私たちはシロイヌナズナの遺伝子機能解析のゲノム学的方法として、遺伝子コード領域へトランスポゾンが挿入されている一つ一つのタグラインについての系統的な表現型解析（Phenome Analysis）を始めた。これまでのところ約3,000ラインについて、発芽率と初期育成率の測定、地上部各器官の形態について生育段階に合わせた観察と記載を行い、これらの観察結果を約100項目の表現型リストにまとめたので紹介する。

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イネの内在性レトロトランスポゾンTos17が培養細胞特異的に転移する性質を利用して、これまでに約5万系統のTos17が転移した日本晴系統を作出した。再分化植物ではTos17の転移活性は完全に抑制されるので、Tos17挿入変異は安定した遺伝解析材料として利用できる。また、Tos17挿入部位は、Tos17末端領域のプライマーを用いて挿入隣接領域の塩基配列を決定し、大部分の領域がすでに明らかになっているイネゲノム塩基配列を検索することでbpの精度で解析できる。
これまでに、およそ6000系統の隣接塩基配列解析を行い、47,000件の塩基配列情報が得られている。また、来年度には、全系統の圃場での表現型調査が完了する予定となっている。これらのTos17挿入による破壊部位と、観察した表現型データはリレーショナルデータベースに整理されている。このデータベースよりユーザが興味を持つ遺伝子をクエリにしてTos17破壊部位を検索するWWWページ(http://tos.nias.affrc.go.jp/)を公開して運用している。このシステムを利用したin silicoミュータントスクリーニングと解析のポイントを紹介する。

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Full-length cDNAs are essential for the correct annotation of genomic sequences and for the functional analysis of genes and their products. Using the biotinylated CAP trapper method, we have constructed full-length cDNA libraries from Arabidopsis plants and isolated 224,641 RIKEN Arabidopsis full-length (RAFL) cDNA clones. They were clustered into 18,127 nonredundant cDNA groups, about 70% of predicted genes¹⁾. We have determined full-length cDNA sequences of 13,181 RAFL cDNA clones²⁾. We have also used the RAFL cDNAs for the microarray analysis^{3), 4)} of expression profiles and the structure analysis of Arabidopsis genes. In this meeting, overview of our RAFL cDNA project will be presented.
1) Seki et al. (2002) Science 296:141. 2) Yamada et al. (2003) Science 302:842. 3) Seki et al. (2003) Topics Curr. Genet. 4:271. 4) Seki et al. (2004) J. Exp. Bot. (in press).

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優性突然変異を引き起こすアクチベーションタギングは、遺伝子破壊型のタギング法では表現型が現れない遺伝子群の機能解析に欠かせないテクニックである。本研究では次世代型アクチベーションタギング法を構築するため、以下の2点の特徴を導入した新システムを作製した。1、遺伝子破壊型タギングのように1つのタグ（T-DNA）の導入に対して1遺伝子が候補遺伝子として対応する。2、シロイヌナズナ以外の有用生物の遺伝子機能解析にも利用できる。これらの目的のもと、約1万種の独立シロイヌナズナ完全長cDNAからなる標準化cDNAライブラリーを、アグロバクテリアの発現ベクター上で作成した。このバクテリアライブラリーをシロイヌナズナに花感染させ、約1200ラインの独立した形質転換植物を作成した。形態形成や色素合成など肉眼で容易に確認できる表現型が現れたT1植物93ラインのうち43ラインのcDNAを解析したところ、全ての植物ゲノム中で、別々の完全長cDNA挿入されていた。このラインに挿入された106個の完全長cDNAの長さは、最小で0,3 kb、最大で4,2 kb、平均鎖長は1,4 kbであった。我々はこのような完全長cDNAアグロライブラリーを用いた新たな遺伝子機能解析法をFox Hunting System (full-length cDNA over-expressor gene hunting system)と呼び、シロイヌナズナの遺伝子のみならず有用生物遺伝子のファンクショナルゲノミクスのための新技術として確立させるための準備をしている。

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Here we report the complete nucleotide sequence of the chloroplast genome of Populus alba. This is the first report on angiosperm in terms of tree chloroplast genomes. The genome as a circular DNA is composed of 156,505 bp, in which a pair of 27,660 bp-inverted repeat are contained. The inverted repeat region disrupts the others into the large (85,017 bp) and the small (16,168 bp) single copy regions. The genome contains genes which are identified to have similarity to the chloroplast genes previously reported. Those are 85 potential protein-coding genes, 4 ribosomal RNA genes and 37 tRNA genes. The chloroplast genome of P. alba lacks rpl32 & rps16 though it resembles that of tobacco in overall structure. In addition to the structural organization, the expression pattern of each gene in the chloroplast genome of the P. alba will be discussed. This work was partly supported by METI.

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The complete nucleotide sequence of the chloroplast genome of Lactuca sativa (lettuce) has been determined. The chloroplast was isolated from 1-month-old seedlings by two stepwise percoll density gradient centrifugation. The Chloroplast DNA was extracted with CTAB and randomly cloned for DNA sequencing. Sequencing of the 5,000 individual clones by shotgun method covered the whole lettuce chloroplast genome. The chloroplast genome of lettuce is a circular double-stranded DNA of 152,765 bp. Two inverted repeat regions are separated by a large single copy (LSC) region of 84,103 bp and a small single copy (SSC) region of 18,595 bp. We have identified 121 genes including 80 potential-protein coding genes, 4 rRNA genes and 37 tRNA genes based on previously reported chloroplast genes. The gene content of total 80 potential-protein encoding genes in lettuce (compositae) chloroplast genome is identical with the chloroplast DNA of the different species tobacco (solanaceae). Supported by KEIHANNA/MEXT.

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　GH3 遺伝子はオーキシンによって誘導される遺伝子として最初にダイズより単離が報告された。シロイヌナズナのゲノムには20のGH3 遺伝子ファミリーが存在しており、その一つであるYDK1 遺伝子の優性変異株、ydk1-D は明所で胚軸の伸長が抑制され、成長した植物体は矮性を示す。また、この変異株は主根の伸長が抑制され、側根の数も野生株に比べて少ない。YDK1 遺伝子の発現はオーキシン処理によって誘導され、この制御にはARF7が関わっていることが分かった。本研究では、YDK1 遺伝子発現の制御についてさらに詳しい解析をおこなった。
　GUS レポーター遺伝子を用いた解析では、YDK1 遺伝子はシロイヌナズナ実生のほぼ全ての組織で発現していたが、特に根での発現がく、同様の傾向はRT-PCRによる解析でも見られた。この結果は、ydk1-D の根が異常な形態を示すという観察と一致する。いくつかのシロイヌナズナGH3 遺伝子の発現は光シグナルによっても制御されていることが知られており、RT-PCRの解析によって、YDK1 遺伝子の発現は青色光と遠赤色光の照射によって減少することが明らかになった。また、YDK1はin vitro でオーキシンをアデニル化する活性を示すことが報告されている。現在、YDK1 の過剰発現がオーキシンによって誘導される遺伝子の発現にどのような影響を与えるのか検討中である。

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　リンは植物にとって最も重要な栄養素の一つであり、その不足に対し、植物は様々な応答を示す。最近の研究から、そのリン酸欠乏適応機構の一つとしてプラスチド特有の糖脂質の合成が活性化され、プラスチド外で不足したリン脂質を糖脂質で補っている可能性が示された。
　我々はシロイヌナズナを材料にモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)合成酵素の解析を行っている。これまでの解析から、シロイヌナズナにはtypeA (MGD1), typeB (MGD2,3)の2つのタイプのMGDG合成酵素が存在することを明らかにし、そのうち、typeBのみがリン酸欠乏に応答して発現が上昇することを示した。リン酸欠乏時におけるtypeB遺伝子の発現解析を行ったところ、リン酸欠乏応答した根におけるtypeBの発現がオーキシン輸送阻害剤によって抑制されることが分かった。オーキシン処理により発現が再び見られるようになったことから、これらの発現にオーキシンが必要であることが分かった。一方、サイトカイニン処理によりtypeBの根での発現が抑制されたことから、これらのホルモンがリン酸欠乏時におけるtypeBの発現に拮抗的に作用している可能性が示された。これらの遺伝子は通常の条件下ではどの植物ホルモンにも応答を示さないことから、リン酸欠乏時におこるtypeB遺伝子の発現誘導にはホルモン以外の他のシグナルも必要であると考えられる。

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　双子葉植物の根において、外性のオーキシンが主根の内鞘細胞の分裂を促進させることにより、側根形成を誘導させることが知られている。オーキシンを介したこのような形態形成の分子機構を解明するためには、個々の遺伝子の解析だけではなく、多数の遺伝子発現プロファイルの分析も重要であり、複数の因子の働きを包括的に理解するアプローチが必須である。
　そこで我々は、オーキシンを介した側根形成などの根の形態形成に関与する遺伝子発現プロファイルを明らかにする目的で、シロイヌナズナオーキシン耐性変異体slr（solitary-root）と野生株の根で発現しているRNA（オーキシン処理区・非処理区）を、DNAマイクロアレイ（Agilent Arabidopsis-1, 14,403遺伝子を搭載）を用いて網羅的に比較・解析した。SLR遺伝子はオーキシン応答に関与する転写調節因子Aux/IAAファミリーのIAA14をコードしており、その機能獲得変異体であるslrでは、側根形成が全く起こらない、根毛形成が起こらない、根と胚軸の重力屈性に異常がみられる、などオーキシン関連の表現型を示す。上述したマイクロアレイ解析によってオーキシンを介した側根形成に関わる可能性の高い遺伝子を複数同定した。現在これらの遺伝子についての発現の組織特異性を解析している。

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シロイヌナズナsolitary-root（slr）変異体は、側根形成が全く起こらない。この変異はオーキシン誘導性遺伝子Aux/IAAファミリーIAA14の機能獲得変異である。本来オーキシンにより不安定になるIAA14タンパク質はslr変異により安定化する。その結果、オーキシン応答性転写調節因子ARFsの機能を恒常的に抑制し、そのために側根形成や根毛形成、根や胚軸の重力屈性反応を阻害していると考えられる。そこで、組織特異的なオーキシン応答と根の形態形成の関係を明らかにする目的で、変異型IAA14(mIAA14)タンパク質とGRとの融合タンパク質(mIAA14-GR)を組織特異的に発現する形質転換体を作出した。mIAA14-GR融合タンパク質をIAA14プロモータ－で発現させた植物体では、Dex処理により主根がslr変異型の表現型を示した。このことから、mIAA14-GRはこの誘導系において機能することが確認された。そこでmIAA14-GRを根の中心柱特異的プロモーター（SHOOT-ROOT ）で発現させたところ、側根形成が著しく抑制された。それに対して、側根原基形成時に特定の細胞で発現するSCARECROW遺伝子のプロモーターでmIAA14-GRを発現させたところ、異常な構造を持つ側根原基が形成された。これらの結果から、オーキシン応答が側根形成開始時には中心柱で重要であり、さらに側根原基形成過程においても原基内部で重要である事が示された。

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オーキシン応答性転写調節因子であるARF7をコードするNPH4は、オーキシンによる偏差成長で中心的な役割を果たしている。nph4突然変異体はオーキシンに対して非感受性となり、胚軸の屈性、フック形成、葉の偏差成長、側根形成に欠損を持つ。我々はEMS処理した5000粒のnph4-103種子から得た22000個体のM2植物を用いて、子葉と第一葉の下偏成長の回復を指標として抑制突然変異体の一次スクリーニングを行った。さらに胚軸の屈性の回復を指標として二次スクリーニングを行った結果、nph4-103の表現型であるロゼット葉の下偏成長と胚軸の屈性について回復した抑制突然変異体を7ライン単離し、そのうち3ラインについて詳しい解析を行った。この3ラインはいずれも劣性突然変異で、それぞれ異なる表現型を示した。このうちの1つは、葉が野生型よりも強い上偏成長を示し、胚軸の屈地性は野生型の半分程度まで回復したが、屈光性は異常なままだった。もう一つは矮性で、濃緑色で丸い葉をもち、暗所芽生えの胚軸は短く脱黄化の表現型を示した。胚軸の屈地性と屈光性は刺激開始後4時間までは野生型と同様の反応を示した。最後の一つも半矮性で濃緑色で丸い葉を持ち、屈地性は野生型の半分程度回復したが、屈光性は回復していなかった。また、いずれの抑制突然変異体においても側根形成の欠損に回復は見られなかった。

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