ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）はC4植物の葉肉細胞でHCO₃^-を炭素固定しホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸を生成する酵素である。この酵素はC4光合成回路の1つとしてよく知られているが、マメ科植物の根粒でも高いPEPC活性を示す。ミヤコグサの各器官のPEPC活性を測定した結果、葉に比べ根粒で約100倍高いPEPC活性を示した。我々は、根粒のPEPC機能解析を目的としてカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター領域下流にLjppc1cDNA遺伝子をセンスに連結させたLjpcと、アンチセンスに連結させたaLjpcのコンストラクトをアグロバクテリウム法によりミヤコグサに導入した。遺伝子導入が確認できた個体(Ljpc:25個体、aLjpc:29個体)からは種子(T1)を採取した。Ljpcミヤコグサ種子100粒重は、非形質転換体の100粒重に比べ、70-80％であったのに対し、aLjpcでは50-70％だった。形質転換体根粒のPEPC活性は、T1種子をハイグロマイシンの含む培地で発芽させた後根粒菌を感染させ感染後3週間目の根粒を用いて測定した。その結果、LjpcミヤコグサのPEPC活性は非形質転換体のPEPC活性の値とあまり大きな差はみられなかったが、aLjpcミヤコグサでは非形質転換体に比べ8-10倍減少していた。根粒でPEPC活性が低かったaLjpc個体とPEPC活性が高かったLjpc個体の表現型の違いについて報告する。

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　根粒菌との共生によってマメ科植物の根に着生する根粒の数は、複数の制御機構によって調節されている。植物ホルモンの一つであるエチレンによる根粒数の制御機構はその一つである。ホワイトクローバを用いた実験からエチレンの前駆体であるACCを培地に添加すると根粒数は減少し、逆に作用阻害剤のSTSを添加した場合は、根粒数が増加した。一方、アブシジン酸(ABA)も同様に、その濃度によって根粒数を調節する。最近の我々の研究によるとミヤコグサやホワイトクローバでは、培地にABAを添加した場合は根粒数が減少し、合成阻害剤のアバミンを添加した場合は、根粒数が増加する。そこで本研究では、2つの制御機構がどのような関係にあるのか調べることとした。
　アバミンとACCの両方を培地に添加し、根粒着生試験をおこなった。その結果アバミンで増加する根粒数はACCによってその効果が抑えられた。一方、STSとABAを組み合わせて培地に添加し根粒着生試験をおこなったところ、STSによる根粒数の増加は、ABAによって抑制された。以上の結果から、ABAによる根粒数制御機構とエチレンによるそれは、独立して機能している可能性が考えられる。

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クローバ根粒菌野生株Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 4S (野生株)の共生プラスミド(pRt4Sa, 315 kb)をTn5-mobで可動化し，Agrobacterium tumefaciens A136 (pTi cured, C58株由来)をrecipientとしてtriparental matingを行った。得られたAgrobacterium transconjugantsは，ホワイトクローバに無効根粒を形成，根粒より再単離した共生菌には，pRt4Saがプラスミドとして確認される株（Afp-series）と，主染色体内への組み込みを示唆させる株（Afcs1）を単離した。本研究ではAfcs1株におけるpRt4Saの存在部位について詳しく調査した。
　既に報告されているC58株の全ゲノム塩基配列を基に，A136株のDNA制限酵素断片のサイズを予測し，パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を行ったところ，Afcs1株ではpRt4SがA136株のlinear chromosome上に組み込まれていることを示唆させる結果が得られた。次にAfcs1株のpRt4Sa組込み部位を詳細に解析したところ，putative P4-family integrase gene（1191 bp, 以下int）内に，pRt4Saが組込みまれていると判断しうる結果が得られた。int-pRt4Saの左連結部位の塩基配列解析を行ったところ，int gene 1191～787 bpと，pRt4Saに付加させたTn5-mob由来と考えられるright inverted region (IS50; 4285～5818 bp) がタンデムに連結していることが明らかとなった。引き続き，int gene, Tn5-mob, pRt4Saそれぞれの位置関係を解析中である。

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アクチノリザル植物―フランキアの共生系は，マメ科―根粒菌の共生系に比べて，共生成立から窒素固定発現に至るまでのプロセスは不明な点が多い。マメ科植物の根粒中には，レグヘモグロビンというタンパク質が特異的に多量に生成・蓄積されており，窒素固定酵素の活性発現と密接に関わっていることが知られている。アクチノリザル植物では，モクマオウやヤマモモ，ハンノキでヘモグロビンタンパク質の存在が報告されている。
本研究では，ヤシャブシ（Alnus firma）の根粒よりcDNA libraryを作製し，ミヤコグサのヘモグロビン遺伝子（LjLb3, LjNSG1）をプローブとしたプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングの結果，ヘモグロビン様遺伝子を2クローン（AfNhb1, AfNhb2）単離した。推測されるアミノ酸配列はAfNhb1, AfNhb2ともに全く一致し，植物の非共生型ヘモグロビンクラスターに位置していた。両遺伝子の組織別，および様々なストレスに対する発現をRT-PCRにより解析したところ，AfNhb1は根粒で，AfNhb2は葉で高く発現しており，それぞれ異なるストレス応答を示した。現時点では，ヤシャブシに共生型に属するヘモグロビンの存在は確認されておらず，特に根粒で高く発現しているAfNhb1がフランキアとの共生に関与していると考えられる。

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ミヤコグサのゲノムライブラリーより，サイズの異なる2つの非共生型グロビン遺伝子( LjNSG1, LjNSG2)を単離，同定した。RT-PCRによる発現解析の結果，成熟個体において，LjNSG1とLjNSG2は様々な器官で発現し，特に根粒組織で非常に強く発現していた。また，LjNSG1は低温や低酸素ストレス下，及びサイトカイニンやABAなどの植物ホルモンを与えることによっても発現が上昇した。一方，LjNSG2は植物ホルモンでは発現誘導されず，1％のSucroseによって発現が上昇した。
近年，動物およびバクテリアのグロビンは，生体内の一酸化窒素（NO）の代謝に関わるとの報告がある。我々は，動物とは異なる立体構造をもつ植物のグロビンが，動物の場合と同様にNOの代謝に関与するかを調査した。生体内でのNOの生産を促すとされるNO donor ( S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine : SNAP )をミヤコグサの芽生えに与えたところ， NO donorの濃度に応じてLjNSG1が発現上昇した。さらに，ミヤコグサの共生菌であるMesorhizobium lotiを接種すると，数時間以内にLjNSG1とLjNSG2共に発現が上昇した。以上の結果より，ミヤコグサの非共生型グロビン遺伝子の発現とNO誘導，根粒菌接種による応答との関与について考察した。

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マメ科植物と根粒菌の共生成立には多段階の相互認証が必要であり、認証は根粒菌の宿主皮層細胞侵入時にも為されるとされている。侵入時の宿主側防御応答の回避に関わる遺伝子として、無限型根粒を形成するアルファルファの根粒菌では、バクテロイド化不全を示す変異株から複数回膜貫通タンパク質をコードするbacAが見出されている。bacAホモローグは動物病原菌Brucellaにも存在し宿主細胞内での生存に関わることが示されているが、アルファルファ菌以外の根粒菌では未解析である。我々は有限型根粒を形成するミヤコグサの根粒菌のbacAホモローグ（mlr7400）と周辺遺伝子について調べた。
Mesorhizobium loti MAFF303099株のmlr7400近傍領域を含むコスミドクローンにKAN2ミニトランスポゾン挿入を行い、派生物を用いた相同組換えによりゲノム上のmlr7400と近傍の5ORFへのKAN2挿入株を得た。ミヤコグサとの共生能を検定した結果、mlr7400への挿入株では、野生株に比べて根粒数の増加と窒素固定能の低下は認められたが、アルファルファ菌bacA変異株の様な窒素固定不能株では無く、エタノールやSDSに対する耐性低下も顕著ではなかった。興味深いことに、mlr7400下流のmll7402へのKAN2挿入株も、mlr7400挿入株と同様の形質を示した。KAN2挿入が産物機能の完全破壊に至っていない可能性を考慮し、2つのORFの蛋白質コード領域を欠失する株を作製した結果、いずれも挿入株と同様の共生形質を示した。

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モデルマメ科植物として注目を集めているミヤコグサ(Lotus japonicus)は根粒菌Mesorhizobium lotiと共生することで窒素固定根粒を形成する。根粒形成は宿主植物側の遺伝子によってコントロールされていることが知られており、Ljsym3は根粒形成能欠損変異体である。単離したすべてのLjsym3はM. loti NZP2235接種では根粒を形成しないが、M. loti TONOを接種した時、低頻度ではあるがLjsym3-1に根粒様構造を確認した。Ljsym3はAM菌共生能も欠失していた。またLjsym3は種子形成にも異常があり、成熟出来ない種子が多く、種子数も野生株に比べ減少していた。
　Ljsym3遺伝子を単離するためにマップベースクローニング法を用いた。L. japonicus Gifu B-129由来のLjsym3と異なるエコタイプであるL. japonicus MG-20を掛け合わせて作製したF2世代から変異体を822個体取得し、マーカーを用いてLjsym3遺伝子の領域を29kbにまで短縮することに成功した。Ljsym3遺伝子は1番染色体の短腕に存在している。

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Cation diffusion facilitator (CDF) family is thought to implicate in the metal tolerance mechanisms of a range of organisms. ZAT (zinc transporter of Arabidopsis thaliana) belongs to the CDF family, and the over-expressed Arabidopsis plant was reported to be strengthened zinc tolerance by internal sequestration. However, its subcellular localization is unclear. We investigated the localization of ZAT by immunological study using a ZAT specific antibody. Western blotting using sucrose density fractionated microsome and chloroplast fraction showed that 58 kDa ZAT protein was localized to the chloroplast envelope membrane. ZAT protein was detected in greenish organs but not in roots, seeds and etiolated seedlings as well as the RuBisCO large subunit and the amount of chlorophyll. Immunofluorescence staining of ZAT protein against the leaf section also showed the chloroplast localization. We will discuss the physiological function of ZAT

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In neutral and slightly alkaline aquatic habitats, plants incorporate HCO₃^- and use CO₂ for photosynthesis. Resultant OH^- is extruded to the cell exterior. Characean cells extrude OH ^- at limited sites of the cell surface, forming alkaline bands. Although chloroplasts are anchored to the gel ectoplasm in whole part of cells, OH ^- is carried by cytoplasmic streaming to the specialized sites for alkaline band formation. Lucas and Dainty (1977) studies the effect of cytochalasin B on alkaline band formation. However,
cytochalasin B had been reported to inhibit not only function of actin filaments but also membrane transport. In the present study, we analyzed the effect of other cytochalasins, which do not affect the membrane transport.

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植物細胞における液胞機能の多くは液胞膜を介した液胞内液と細胞質間の物質移動により成り立っている。したがって、液胞膜には液胞の代謝機能を支える多くのトランスポーターやチャネルの存在が考えられる。しかし、これまでに分子レベルで存在が確認されている液胞膜タンパク質は少なく、液胞機能の解明にはさらなる液胞膜タンパク質の解析が必要である。我々はこれまでにシロイヌナズナ培養細胞から高度に純化した液胞膜を回収することに成功している(2003奈良大会)。本研究では、その液胞膜を用いて、液胞膜のプロテオーム解析を行った。回収した液胞膜タンパク質を膜表在画分と膜貫通画分に分画し、それぞれの画分に含まれるタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。分離したタンパク質をトリプシンで消化後、LC-MS/MS分析を行い、タンパク質を同定した。その結果、膜表在画分で約90種、膜貫通画分で約100種のタンパク質を同定した。そのうち、両画分に共通して見いだされたタンパク質は約30種であった。同定したタンパク質には液胞膜タンパク質として代表的なV-H⁺-ATPase、V-H⁺-PPaseのほか、各種トランスポーターや未知の膜貫通タンパク質などが含まれていた。細胞質やその他のオルガネラ膜の既知タンパク質の混入はほとんど見られなかった。本結果は今後の液胞研究において重要な情報源となることが期待できる。本研究の一部はCREST、NEDO/METI、科研費の支援による。

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カサノリは、緑藻類に属し、巨大な単細胞から成る海棲の生物体である。我々は、このカサノリの液胞膜にも、高等植物と同様に二つのプロトンポンプ、V-ATPase 及び V-PPase の存在を証明し、V-ATPase, proteolipid subunit については 6 種類の cDNA (VHA-c1 - VHA-c6 ) を単離した。これらV-ATPase, proteolipid subunitアイソフォームの機能について、酵母 VMA3 あるいは VMA11 欠損並びに ade 変異を持つ株を用いて解析を行った。液胞の酸性化に伴うプリン中間代謝産物の蓄積を、蛍光顕微鏡により観察する方法を用いた。その結果、6 種類のアイソフォームはすべて Vma3p として機能し、Vma11p としては機能しないことを見い出した。各アイソフォームの N 末端領域のオリゴペプチドに対するポリクローナル抗体を作製し、それぞれ対応する発現タンパク質を特異的に認識することが明らかになった。また、カサ形成前のカサノリの粗ミクロソーム画分には、主に、VHA-c2 及び VHA-c4 が検出された。現在、各アイソフォームの局在性、細胞成長に伴うタンパク質の発現について、免疫組織学的検討を進めている。

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イノシトール六リン酸すなわちフィチン酸は，種子の形成過程において大量に合成され， CaやMgなどの金属イオンと結合して液胞に蓄積するリンの貯蔵物質である．我々は，ニチニチソウおよびシロイヌナズナ懸濁培養細胞にフィチン酸の大量合成を誘導し，液胞内に蓄積させることに成功している．種子のフィチン酸の大部分がCa, Mgなどと結合していることから，次にフィチン酸蓄積機構に対する金属イオンの効果について調べた．リン酸とともに種々の金属イオンを加えて培養したところ，Ca，Mg，Znを与えた細胞では，リン酸のみを与えた場合よりもフィチン酸の蓄積が促進された．このとき，フィチン酸合成の鍵酵素と考えられるイノシトール1リン酸合成酵素のタンパク質量に変化は見られなかった．また，Caを与えた細胞では主に液胞内にフィチン酸が蓄積していたが，Znを与えた細胞では，液胞にはフィチン酸が蓄積していないことをこれまでに明らかにしてきた．今回，Zn添加後の細胞におけるフィチン酸およびZnイオンの細胞内局在についてさらに詳細な解析を行ったので，その結果を報告する．また，フィチン酸合成に関与すると考えられるイノシトールリン酸キナーゼ遺伝子の発現パターンについても現在検討中である．

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カリウムチャンネルは植物の成長の様々な側面において重要な働きをしていることが知られているが、細胞周期の進行におけるその役割は知られていなかった。そこで、タバコBY-2 細胞の細胞周期同調系を使って細胞周期の進行におけるカリウムチャンネルの関与を調べたところ、カリウムチャンネルを通じたカリウムイオンの吸収が細胞周期のG1期からS期への正常な進行に必要なことがわかった。次に、この過程に関与するカリウムチャンネル遺伝子の探索を目的として、4つのShaker型カリウムチャンネル遺伝子をBY-2細胞から単離した。発現解析の結果、内向きチャンネルの一つをコードするNKT1遺伝子がG1期で発現することがわかった。NKT1遺伝子のアンチセンス株を作製したところ、NKT1遺伝子の発現量が低下するとカリウムイオンの吸収量が減り、細胞周期の進行が遅れることがわかった。これらの結果からShaker型内向きチャンネルの一つ、NKT1遺伝子産物が細胞周期の正常な進行に関与している可能性が示唆された。

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　液胞は高等植物の多くの細胞で生長にともなって発達し，体積の大半を占める．しかし細胞の形態変化における液胞構造の関与についての定量的な解析はあまりなされていない．我々はこれまでに，液胞膜に局在するシロイヌナズナのSNAREタンパク質であるAtVam3pとGFPの融合タンパク質を発現するタバコBY-2細胞の形質転換株BY-GV7を液胞の観察系として確立するとともに，連続光学切片からの立体再構築ソフトウェアSSRの開発を進めてきた．それにより，液胞は単純な袋状ではなく複雑な立体構造をとっており，細胞分裂や細胞周期の進行にともなってその形状が刻々と変化していることがわかってきた．
　本研究では細胞の形態変化における液胞の寄与を明らかにするために，細胞の形が著しく変化する原形質分離や細胞伸長の誘導系を用いて，液胞の立体構造と動態を得た．とくに立体再構築を介して一細胞レベルで液胞の体積や表面積を導出し，液胞の空間充填作用を定量的に解析した．その結果，原形質分離による細胞体積の変動をほぼ完全に液胞が担っていること，体積変動に関わらず液胞の表面積が一定に保たれていることなどの知見が得られた．さらに現在，このような細胞と液胞の構造変化について，計算力学的な手法を用いて検討を行なっている．

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[目的] 空色西洋アサガオ（Ipomoea tricolor cv. Heavenly blue）はツボミの時は赤紫色で開花時に青色に変化する。花弁の色素には変化がなく、開花ステージを通じてヘブンリーブルーアントシアニン(HBA)のみ存在する。既に我々は、この花色変化がツボミから開花するに従って液胞pHが6.6から7.7へと上昇するためであることを明らかにしている¹⁾。このpHの上昇は液胞膜上に存在する種々のポンプや輸送体²⁾の働きによると考えられる。そこでこれらのタンパク質の液胞膜上の局在や輸送活性を調べた。
[方法及び結果] 開花24時間前のツボミと開花時のアサガオ花弁から短時間の酵素処理により着色プロトプラストを得、これから液胞膜小胞を調製した。液胞膜小胞の免疫ブロッティングによりV-PPaseが開花時に増加することと、Na⁺/H⁺ exchangerがツボミには存在しないが開花時に多量に発現することが明らかとなった。このNa⁺/H⁺ exchangerは花の液胞膜上だけに局在することが確認できた。さらに開花花弁の液胞膜小胞でV-ATPaseとV-PPaseに基づくプロトン輸送活性があることを確認した。開花に伴う液胞pHの上昇は、V-ATPaseとV-PPaseにより生じたH⁺濃度勾配を利用してNa⁺/H⁺ exchangerがNa⁺またはK⁺とH⁺を交換輸送するためと考えられる。現在Na⁺/H⁺ exchangerの活性を測定中である。
1) K. Yoshida et al., Nature, 373, 291 (1995).
2) T. Yamaguchi et al., Plant Cell Physiol. 42, 451-461 (2001).

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アルミニウムの活性酸素応答性Ca²⁺チャネルへの影響を明らかにすることを目的として、オワンクラゲ由来のCa²⁺感受性発光タンパク質エクオリンを発現したBY-2タバコ細胞を用いて実験を行った。BY-2細胞において低濃度のアルミニウム処理が細胞外でのO₂^-の生成を誘導し、次いでO₂^-が活性酸素応答性のCa²⁺チャネルを活性化し、[Ca²⁺]_c上昇を誘導することを明らかにした。一方、活性酸素応答性のCa²⁺チャネルは、高濃度のアルミニウム存在下では、活性を完全に阻害され、O₂^-や過酸化水素などの活性酸素種が存在しても[Ca²⁺]_c上昇が起きないことが明らかになった。これは、低浸透圧ショックにより誘導される[Ca²⁺]_c上昇など、活性酸素応答性ではない[Ca²⁺]_c上昇に関与するCa²⁺チャネルとは挙動の大きく異なる点である。これまで活性酸素応答性のCa²⁺チャネルに特異的な阻害剤は報告されていなかったが、アルミニウムと希土類イオンを使い分けることにより、今後サリチル酸情報伝達経路やエリシター情報伝達経路における活性酸素応答性と非応答性のCa²⁺チャネルの異なる役割を解析することが可能になる。

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　シロイヌナズナのゲノム上には14種類の硫酸イオントランスポーター遺伝子が存在し、各々発現部位や硫酸イオンの吸収活性が異なることから、植物体内における硫酸イオン輸送は厳密に制御されていると考えられている。外界からの硫酸イオンの取り込みには高親和型が大きな働きをしていることが確かめられているが、低親和型の機能や吸収された硫酸イオンの地上部への移行制御についての詳細な解析は行われてこなかった。演者らによるレポーター遺伝子を用いた解析結果から、SULTR2;1及び SULTR3;5は根の内鞘細胞や木部柔細胞で発現することが示唆され、さらに、酵母の変異体を用いた実験より、SULTR2;1が低親和型であり、SULTR3;5はほとんど吸収活性を示さないことが確かめられた。興味深いことに、SULTR2;1及びSULTR3;5を共発現した酵母では、SULTR2;1の2～3倍の吸収活性が認められたことから、SULTR3;5は吸収促進因子としての機能が示唆された。ノックアウト体(KO)を用いて、植物体内における機能解析を行ったところ、SULTR2;1の発現が誘導される低S条件下では、いずれの遺伝子のKOにおいても、野生株に比較して地上部への硫酸イオンの輸送が抑制されることが示された。以上の結果は、SULTR2;1およびSULTR 3;5が導管への硫酸イオン輸送を促進する機能を有することを示唆している。

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私たちはオオムギ根で発現している原形質膜型水チャネルの遺伝子を3種類同定し、解析した結果をこれまでに報告している。また、3つの遺伝子のうちのひとつ、HvPIP2;1によってイネを形質転換して過剰発現させた。その作成と一部の形質については2002年度および2003年度の本大会において報告してきた。今回は、この形質転換体について、その根の形質と塩ストレス感受性についての解析結果を報告する。
形質転換T₂世代の6322系統では、根において非形質転換体（以下WT）に比べて根においてHvPIP2;1タンパクの過剰発現と水透過性の上昇が認められた。また地上部/根の重量比をとると、6322系統ではWTに比べて1.5倍になっていた。6322系統では根の水透過性が高くなったため、小さな根系でも地上部を維持するのに必要な水を供給できるようになったことを意味するものと考えている。次に水耕培養で100 mM NaClの塩ストレスを与えたところ、WTではストレスを受けて生育は遅くなるが、生育を続けた。形質転換T₂のうちで導入遺伝子が発現しなくなった6360系統については、塩ストレスに対する反応はWTと同様であった。一方過剰発現体6322系統では塩ストレスで生育が止まり、葉の含水量が低下して枯死した。塩ストレス条件下で水チャネルを介しておこる脱水を、過剰発現体は抑制できなかったためであろうと考えている。

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　生物界には多様なK⁺チャネルが存在し，機能も多様である。イネにおけるK⁺チャネルの役割を理解する目的で，「ひでこもち」と「ひとめぼれ」の2品種を対象に，播種後約3週間目の幼苗の葉から、共通の1つの遺伝子をクローニングした。推定一次構造には4つの膜貫通領域が存在し、K⁺イオン選択性に関わるモチーフ（TXGYG）が2つタンデムに並ぶ。これは外向き整流性K⁺チャネルの特徴である。この遺伝子（ROK，rice outwardly rectifying K⁺ channel）は、ゲノムデータベース（Oryza sativa japonica L. cv. Nipponbare）から1コピーであることがわかり、サザン解析の結果とも一致した。シロイヌナズナK⁺チャネルとの相同性は、内向き整流性K⁺チャネルKAT1、AKT2とはそれぞれ26、23％、外向き整流性K⁺チャネルKCO1、KCO2、KCO3、KCO5とはそれぞれ34、39、33、40％であった。植物K⁺チャネルの系統解析でも、ROKは外向き整流性を示すグループに入る。
　播種後2～3週間目の幼苗の葉、茎、根および出穂期の約10日前の穎花の葯におけるROKのmRNA量を、RT-PCR サザン分析およびリアルタイムPCR法で分析したところ、2品種いずれも葯での発現量が比較的多く、他の組織（葉、茎、根）の3～5倍であった（4-5 ng of mRNA / mg of total RNA）。酵母に異種発現させたROKタンパク質の分子サイズは、約50kDであった。

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高塩濃度環境における植物細胞内イオンの挙動を解析することは、耐塩性機構を明らかにする上で重要である。近年、植物の細胞膜型および液胞膜型のNa⁺/H⁺アンチポーター遺伝子が単離され、それぞれの遺伝子を破壊/過剰発現させることにより塩ストレスに対し高感受性/耐性を示すことが報告された。一方、Na⁺のカウンターイオンであるCl^-が、塩ストレス条件下においてどのように取り込まれ、どのように挙動するのかは知られていない。
　公開されたシロイヌナズナおよびイネのゲノム情報を用い、シロイヌナズナCLC遺伝子ファミリーおよびイネのCLC遺伝子(OsCLC-1, -2)とのゲノム構造を比較した。OsCLC-1, -2はシロイヌナズナのAtCLC-a,-b,-cとよく似た特徴を示し、これらがオーソロガス遺伝子であると考えられた。
　酵母において唯一のCLC遺伝子であるGEF1遺伝子破壊株にOsCLC-1, -2を導入し、相補性試験を行った。OsCLC-1, -2はGEF1遺伝子破壊株のいくつかの表現型を部分的に相補し、イオン環境の調節に関与することが示唆された。AtCLC-c,-dにおいてもGEF1遺伝子破壊株を相補するが、その相補のパターンはOsCLC-1, -2の場合と異なっており、それぞれの遺伝子が持つ機能に違いがみられた。

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　紅藻スサビノリPorphyra yezoensisは、巨視的な葉状体（配偶体）と微視的な糸状体（胞子体）からなる異形の世代交代を営む生物である。これら両世代の藻体から、分画遠心と二相分配法により細胞膜に富む画分を得た。これらの画分のバナジン酸感受性ATPase活性を調べたところ、最大活性に50 mM以上のNaClを要求し、最適pHが8.5付近にあることより、Na⁺-ATPaseである可能性が示唆された。この活性は糸状体で極めて高く、葉状体の2～10倍以上の値を示した。P型ATPaseに共通して保存されているATP結合部位の配列に対する特異的抗体を用いての免疫ブロット分析により、この抗体に反応する115 kDaタンパク質の糸状体における著しい蓄積を確認した。一方、スサビノリEST 解析情報データベースに対する、P型ATPaseに共通する保存配列のホモロジー検索により、糸状体に豊富な多数のESTクローンを抽出した。これらのクローンの塩基配列の結合・整列によって、アミノ酸数1144、推定分子量125851の連続したアミノ酸配列を得た。この配列中のモチーフ検索、ラフィド藻Heterosigma akashiwoのNa⁺-ATPase及び紅藻イデユコゴメCyanidium caldariumのH⁺-ATPaseのアミノ酸配列との比較などにより、この配列がスサビノリにおけるNa⁺-ATPaseの全長配列であると推定した。
　以上の結果は、スサビノリにおいては、少なくとも胞子体世代の細胞膜primary pumpが、Na⁺-ATPaseであることを示している。

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　テロメアは染色体末端領域のことであり、染色体の安定的な維持に必須である。本研究ではテロメア長の制御機構を明らかにすることを目的として、まず永年生植物であるリンゴ・サクラを用い、植物個体内の齢に沿ったテロメア長の測定を行った。その結果、テロメア長は各部位間で一定の範囲内に保たれ、少なくとも20年間に渡る細胞分裂を経てもテロメア長は変化しないことが示された。このことより、細胞分裂に伴ってテロメア長が減少する動物と異なり、植物では厳密なテロメア長制御機構の存在が考えられた。
　続いて、モデル園芸作物であるトマトを用い、テロメア長の制御に関わると考えられるテロメア結合タンパク質（TBP）のクローニングを行った。まず、トマトESTにおいてアラビドプシス、イネのTBPと相同性の高い配列を参考にして全翻訳領域を含むcDNAの単離を行った。この推定トマトTBP（LeTBP）は689アミノ酸から成り、C末端領域にMyb型DNA結合モチーフが確認できた。またLeTBP遺伝子はシングルコピーで存在し、解析に用いた全ての器官において発現がみられた。次に、Myb型DNA結合モチーフを含む部分タンパク質を大腸菌で発現させ、ゲルシフト解析に用い結果、LeTBPは2本鎖テロメア配列に特異的に結合するTBPであることが示された。

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イネにおけるフィトクロムの機能や分子種間(フィトクロム A,B,C)の役割分担を明らかにする目的でイネ・フィトクロム突然変異体の単離と解析を行っている。今回は、イネ・フィトクロム A(phyA)突然変異体を用いてイネ22K oligoarray (Rice Full-length cDNA Project and Agilent)によるマイクロアレイ解析を行った。
3日間暗所で生育させたイネphyA突然変異体に、遠赤色光(FR)を照射後、時間を追って（0.5、1、4h）、子葉鞘(coleoptile)先端部を採取した。野生型（日本晴）も同様の処理を行って、対照に用いた。マイクロアレイの解析は、TMEV (Saeed et al., 2003　Biotechniques, 34(2):374-8.)を用いてSOTA(Herrero et al. 2001 Bioinfomatics, 17:126)法で行った。
野生型でFR光で誘導または抑制され、phyA突然変異体で変化しないことを指標にphyAで発現が制御されている遺伝子を選んだ結果、それぞれ約260（誘導）、130（抑制）個の候補遺伝子が同定された。これらの詳しい解析を実行中である。

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メチオニン生合成の鍵段階を触媒するシスタチオニンγ-シンターゼ (CGS) 遺伝子の発現はメチオニンの次の代謝産物であるS－アデノシルメチオニン (SAM) に応答してmRNAの安定性の段階で負に制御されている。この制御は翻訳中に起こり、CGS新生ポリペプチドが関与すると考えられる。この制御にはCGSの第1エキソンが必要十分な領域であり、この領域内の十数アミノ酸の配列 (MTO1領域) が特に重要である。In vitro系でGSTタグ付きCGS第1エキソンを翻訳させると、SAM添加に応答してMTO1領域近傍で翻訳が停止したと考えられるポリペプチドが検出される。今回、翻訳停止が起こるためにはCGS第1エキソンのどのコドンまで翻訳される必要があるかについて検討した。そのためにMTO1領域の下流の様々な位置のコドンを終止コドンに置換し、その影響を調べた。その結果、96番目以降を終止コドンに変えた場合には野生型と同程度の翻訳停止産物の蓄積がみられたが、95，94，93番目のコドンを終止コドンに置換するとその蓄積量が減少し、92番目またはそれより上流を終止コドンに置換すると翻訳停止産物の蓄積はみられなくなった。さらに92-95番目のコドンをそれぞれアラニンに置換したところ、93番目のコドンを変えた場合のみ翻訳停止産物の蓄積がほとんどみられなかった。この結果から、93番目のトリプトファンが翻訳停止に重要であることが示唆された。

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植物はそのゲノム中に多数のABCタンパク質遺伝子を有しており、シロイヌナズナではデータベース上に約130種のABCタンパク質遺伝子が見出されている。最近の研究から、これらのメンバーが植物の重要な生理機能に複雑に関わっていることが解明されつつある。本研究では、植物のABCタンパク質の中でも、特に機能解明の遅れているPGP（P-glycoprotein-like）サブファミリーのAtPGP4に焦点を絞り、同サブファミリー内の相同遺伝子と比較しつつ、その機能解析を行った。まず、AtPGP4の発現様式及びその発現の環境応答性を明らかにするため、組織特異的Northern解析とRT-PCRによる解析を行った。その結果、植物体各組織においてAtpgp4の発現を認め、特に根における強い発現を確認した。またAtpgp4プロモーターにGUSレポーター遺伝子を連結したコンストラクトを用いて解析を行ったところ、同様に根における強い発現を認めた。また、地上部では葉の鋸歯の先端及び莢の基部のみに特異的な発現を認めた。一方、seedlingに様々な化合物を添加し応答を調べた結果、同サブファミリー内の他の分子種と比較して、Atpgp4はサイトカイニンに対する強い応答を示すことが認められた。現在、AtPGP4過剰発現体を作製し、T-DNA挿入変異株と比較しつつ機能解析を進めている。

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Specific protein degradation has been observed in several aspects of development and differentiation in many organisms. One example of such proteolysis is regulated by protein polyubiquitination that is promoted by the SCF complex consisting of Skp1, cullin, and an F-box protein. We examined the activities of the Arabidopsis Skp1-related proteins (ASKs). Among 19 annotated ASK genes, we isolated 16 of the corresponding cDNAs, their gene products examined as for interactions with 24 representatives of F-box proteins carrying various classes of the C-terminal domains using the yeast two-hybrid system. As a result, we found diverse binding specificities: ASK1, ASK2, ASK11 and ASK12 interacted well with COI1, FKF1, UFO-like protein, LRR-containing F-box proteins, and other F-box proteins with unknown C-terminal motifs. Both histochemical and RT-PCR analysis of 8 ASK genes expression revealed unique expression patterns for the respective genes.

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ホスホリパーゼA₂（PLA₂）はリン脂質のsn-2位のエステル結合に作用して脂肪酸とリゾリン脂質を生成する脂質加水分解酵素である。植物のPLA₂は、動物と同様に構造的に類似した遺伝子ファミリーを形成し、分泌型PLA₂（sPLA₂）、パタチン様PLA₂からなっている。また動物のプロスタグランジン生合成系は植物のジャスモン酸生合成系に類似するが、この初発酵素である細胞質型PLA₂は植物では報告されてない。植物のPLA₂は、脂質の分解、細胞膜の修復、病害・傷害に対する防御応答、さらには情報伝達といった様々な細胞内プロセスに関わっていることが示されてきた。本研究では、シロイヌナズナsPLA₂遺伝子のジャスモン酸応答性と細胞内局在性を解析した。その結果、シロイヌナズナ培養細胞T87におけるsPLA₂遺伝子は、ジャスモン酸応答性遺伝子であるvegetative storage proteinと同様に、メチルジャスモン酸処理により遺伝子発現が誘導された。またシロイヌナズナの4種あるsPLA₂のうちsPLA₂αについて、タマネギ表皮細胞を用いて細胞内局在性を調べた結果、sPLA₂α-GFPは主に細胞間領域に局在することが示された。従ってシロイヌナズナsPLA₂αの作用機序としては、ジャスモン酸に応答して細胞外に分泌され、標的細胞に作用してリン脂質を分解することが示唆された。

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　我々はこれまでにシロイヌナズナゲノムから多くのLINE (Long INterspersed Element) を同定した。LINEの多くは2つのタンパク質、ORF1とORF2、をコードするが、ORF1の機能については詳しくわかっていない。そこで我々はその機能を調べるため、まずシロイヌナズナLINEのひとつATLN39のORF1をGFPと融合させ、タバコBY2細胞およびタマネギ表皮細胞で発現させて、その細胞内局在を調べた。その結果、GFP-ORF1融合タンパク質は核に局在することがわかった。そのC末領域に存在する塩基性に富んだアミノ酸配列をGFPと融合させても核に局在することなどから、ORF1はC末領域に核局在シグナルを持つことがわかった。次にORF1同士、あるいはORF1とORF2の相互作用を酵母のtwo-hybrid系を用いて調べたところ、ORF1同士は相互作用したが、ORF2との相互作用は検出されなかった。ORF1同士の相互作用にはN末領域が必要であり、特に保存されているzinc-finger様ドメインに変異を導入すると相互作用しなくなった。C末領域の核局在シグナルを欠いたORF1変異体とGFPとの融合タンパク質とORF1タンパク質をタバコBY2細胞などで同時に発現させると、融合タンパク質は核に局在した。これは、ORF1同士が植物細胞内で多量体を形成して核に局在していることを示唆する。

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RNA エディティングとは、ゲノム DNA の配列が RNA レベルで改変される現象で、高等植物の葉緑体 mRNA では 20 ～ 30 ヶ所の C から U への変換型 RNA エディティング部位が同定されている。しかし、その部位認識機構を含め生理的意義や進化的背景は不明な点が多い。我々は、栽培タバコ（Nicotiana tabacum）とその原種 N. sylvestris と N. tomentosiformis 、イネ、エンドウの葉緑体エディティング部位を組織的に同定した。これらとトウモロコシ、シロイヌナズナ等の部位を in silico 解析し部位認識に関与が考えられる特徴を抽出した。一方、タバコ in vitro 系を用いた生化学的な解析により、4 ヶ所のエディティングのシス配列が決定されているが、網羅的な解析には、より効率的な実験系が必要である。そこで、従来の ³²P 基質を用いる in vitro 実験系に非 IR アッセイ法を導入することにより、簡便かつ効率的に高速アッセイ化に成功した。

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オルガネラから核へのDNA転移は、従来予想されたよりも遙かに高頻度で生じ得ることが最近明らかになってきた。しかしながら転移したDNA断片が核内でどのようにプロセスされていくのかはよくわかっていない。そこで、本研究では、イネの核ゲノム中に存在する葉緑体DNAを、ゲノム情報を用いて包括的に解析した。BLAST プログラムを用いてイネ核ゲノム中に存在する葉緑体DNA様配列を検索したところ、700個以上の部位で挿入が見いだされた。これら葉緑体様DNA断片が核に転移した時期をSNPsの数から推定したところ、その大半が100万年以内に葉緑体から転移してきたこと、さらに、転移した断片の多くは核ゲノムから急速に失われていったこと、が示唆された。またこれらの断片では重複、逆位、欠失、葉緑体ゲノム以外のDNA配列の挿入といった構造上での著しい変化が生じていた。葉緑体DNAの取り込み頻度はペリセントロメア領域で高かった。核ゲノムは、葉緑体ゲノムを活発に取り込み、それらをシャフリングし、さらには核から排斥する結果、定常的な「葉緑体から核へのDNAの流れ」を作り出していると考えられる。

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　高等植物のFtsHプロテアーゼは膜結合型のタンパク質で葉緑体のチラコイド膜に結合した状態で存在している．現在その生体内の機能は光ダメージを受けた光化学系IIの反応中心であるD1タンパク質の分解を行っていることが示されている．
　本講演では，我々はタバコFtsHプロテアーゼの全長cDNAを用いて発現系を構築し，発現タンパク質の解析を行なったので報告する．FtsHプロテアーゼは膜結合型タンパク質であるため，一般的に精製や発現系の構築は難しいとされている．我々はFtsH遺伝子をpETベクターに組み込み，FtsHプロテアーゼとT7・tagを融合させることにより可溶化したT7・tag融合FtsHプロテアーゼを得た．この融合タンパクをT7・tagアフィニティカラムによりほぼ均一に精製し，タンパク質分解活性を測定したところ，カゼイン分解活性を示した．このカゼイン分解活性はZn²⁺，ATPにより活性化され，これまでの報告とも一致している．現在，融合FtsHプロテアーゼにおけるATP分解活性およびタンパク質分解活性などの酵素学的性質について解析を進めている．また，このFtsHプロテアーゼに対する阻害剤の影響などもあわせて報告する予定である．

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We cloned a novel prolyl 4-hydroxylase (PH; EC 1.14.11.2) homologue cDNA from tobacco BY-2 cells based on expression sequence tag information. Like other PHs, this tobacco PH polypeptide has two conserved histidine residues. It consisted of 286 amino acids with a calculated molecular mass of 32 kDa. This protein and homologues in Arabidopsis and rice have possible transmembrane regions at their N-terminus. This PH homologue was expressed in BY-2 cells as a His-tagged protein, and the expressed protein showed PH activity. Incubation of membranes with high salt, urea and detergents indicated that this protein was an integral membrane protein with a type II configuration. The tobacco PH formed several large protein complexes devoid of protein disulphide isomerase in the membrane.

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植物は光によりその生育状態を大きく変える．葉の緑化及び老化は最も劇的な変化の一つである．この変化にはプロテアソームの関与が示唆されるが，その実態は明らかではない．
　我々は，葉の緑化及び老化の誘導が行いやすいオオムギを材料として，プロテアソームの一般的基質である Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA を用いて，プロテアソーム様活性の解析を行った．オオムギ緑葉抽出液をDEAE-celluloseで分画したところ，3種類のプロテアソーム様活性が見られた．これらはSDS濃度が0，0.02％，0.1％において最も活性化された．また，エチオ，エチオクロロ，セネセンス葉の3種から得られた抽出液を DEAE-celluloseで分画したところ，同様に3種のプロテアソーム様活性が見られた．しかし，活性量から見たそれぞれの存在比は異なり，特に0.1％ SDSにおいて活性化される成分は緑葉と比して顕著に低下していた．これらのうち，0.02％のSDS濃度において活性化される成分は，至適pHが8.5を示した．プロテアソームの特異的阻害剤であるPSI, MG-115, MG-132 による阻害効果を検討したところ，すべての阻害剤で著しい活性の低下が見られた．対称としてホウレンソウ緑葉抽出液のプロテアソーム様活性についても比較検討したので，合わせて報告する予定である．

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　デンプンの主要構成成分であるアミロペクチンは、可溶性スターチシンターゼ(SSS)、スターチブランチングエンザイム(SBE)、及びスターチデブランチングエンザイム(DBE)の作用によって合成されることが知られている。特にDBEであるイソアミラーゼ(ISA)とプルラナーゼ(PUL)はマルチプルクラスター構造の構築に必要不可欠であるとされている。本研究ではオオムギDBEのうちISAに着目して特性解析を行っている。
　ISA遺伝子はトウモロコシやジャガイモなどにおいて3種類存在することが知られている。今回は、これまでに同定されている2つのオオムギISA遺伝子（HvISO1, HvISO2）に加え、オオムギISA3遺伝子ホモログをRT-PCRおよび3’、5’RACE法を用いて単離した（HvISO3）。発現解析の結果、HvISO3はこれまでに同定されているHvISO1および2とは異なっており、緑色組織、特に若葉で強く発現していた。しかし、胚乳組織ではほとんど発現していないことが明らかになった。このことから、HvISO3は他の2つのHvISOとは異なる発現特性を有する遺伝子であることが考えられる。現在、3つのHvISO由来のタンパク質と、組織別に発現するイソアミラーゼ分子のサブユニット構成との関連性について解析を行っている。

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Lipoxygenase (LOX)(EC 1,13,11,12) is widely distributed in the plant kingdom. Plant LOXs are thought to have a significant importance on food quality. For instance, they are responsible for `beany` and `green` flavors whether they are desirable or undesirable. Among many crops, buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) has a characteristic flavors in its flour. Flavor compounds of buckwheat flour are mainly consist of alcohols, aldehyds and ketones. Among them, several volatile compounds such as n-haxanal were the same compounds produced from unsaturated fatty acid such as linoleic acid by LOXs activity in soybean seed. Therefore, we focused on LOX in buckwheat flour. However, very little work has focused on LOX in buckwheat flour. To investigate the occurrence of the LOX protein in buckwheat seed, we perform the immunoblotting analysis using a LOX specific antibody. Buckwheat seeds had at least two LOX isozymes, and were localized in embryo.

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