葉緑体は光定位運動を示し、弱光下では光合成の効率を高めるため光に向かって集り（集合反応）、強光下では光から逃避し光によるダメージを避ける（逃避反応）。蘚類ヒメツリガネゴケ細胞の葉緑体光定位運動は青色光とともに赤色光によって誘導される。青色光反応では集合反応、逃避反応とも光定位した葉緑体上にcp-アクチンのメッシュワーク構造が出現することが知られている。本研究では、ヒメツリガネゴケのアクチンフィラメント可視化株を用いて、赤色光による葉緑体光定位運動にともなうアクチン細胞骨格の変化について解析した。赤色光下で培養した原糸体細胞では赤色光による反応が認められるが、白色光下で培養すると赤色光に対する反応性が失われることが報告されている。そこでまず、通常の白色光下培養の細胞で赤色光反応が誘導される条件を調べた結果、白色光下で培養した原糸体細胞を2日間暗所で培養することで、赤色光に対する反応性が回復し、集合反応、逃避反応とも認められることがわかった。この細胞を用いて赤色光による葉緑体光定位運動時のアクチンフィラメントの変化を調べたところ、青色光反応と同様、光定位した葉緑体上にcp-アクチンのメッシュワーク構造が形成されることが観察された。シロイヌナズナではcp-アクチンが葉緑体の定位部位への定着に働くことが知られており、メッシュワーク構造の形成と葉緑体の運動性の関係も調べる予定である。

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本研究では基部陸上植物である苔類ゼニゴケを用いて、フィトクロムを介する光応答の制御メカニズムの原形と進化を解明することを目的に、これまでにゼニゴケフィトクロム遺伝子 (MpPHY) を単離し、Mpphyが1分子種しか存在しないこと、光可逆性を備えたフィトクロム分子であることを報告した。さらに、Mpphyが赤色光依存的に核内へ局在することや、活性型Mpphyにより発芽後胞子の分裂や無性芽からの生長、栄養生長相から生殖生長相への移行が制御されることを見出した。今回、MpPHYのプロモーター領域の制御下でレポーター遺伝子としてGUSを発現する形質転換体を作出し、MpPHYの発現組織を解析したところ、MpPHYが葉状体全体で発現していることが示唆された。また、抗Mpphy抗体を作製し、明所および暗所における植物体内のMpphyの蓄積量の経時的な変化を調べることでMpphyの光に対する安定性を評価した。被子植物のフィトクロムには光に不安定なI型と安定なII型が存在する。暗所で蓄積したMpphyは24時間の光照射後も50%程度が観察されたため、Mpphyが光に対して安定であることが明らかとなった。赤色光/遠赤色光可逆的な生理応答と、光に安定な性質から、基部陸上植物である苔類ゼニゴケに1分子種しかないMpphyが被子植物におけるII型フィトクロムに近い性質をもつことが示唆された。

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柵状組織は葉の向軸側にある葉肉細胞から成る組織で、強光によって縦に長く伸長する。シロザにおいて柵状組織が発達する際には、下位の成熟葉が強光を感知して、上位の未成熟葉にその情報が伝わることや、シロイヌナズナにおいて細胞の縦方向への伸長に青色光が関与することが報告されているが、その詳細なメカニズムは明らかになっていない。そこで我々は柵状組織の発達を誘導する長距離シグナル伝達機構を解明するためにシロイヌナズナを用いて解析を行った。成熟葉に強光を照射し、弱光条件下で新しく形成された葉の形態を調べたところ、柵状組織の発達が見られたことからシロイヌナズナにおいても成熟葉から未成熟葉への長距離シグナルにより柵状組織が発達することが明らかとなった。次に青色光シグナルが長距離シグナルの上流で作用するか調べるために、赤色光下で下位の成熟葉にのみ青色光を照射した。赤色光下で新しく形成された葉では、柵状組織の発達が見られなかったことから、青色光は柵状組織の発達を促進するが、柵状組織が発達する際の強光シグナルとして未成熟葉に伝達されないことが示唆された。また、環境ストレス応答機構に関与するreactive oxygen species (ROS)の一種であるH₂O₂を成熟葉に処理した所、処理後新たに形成された葉において柵状組織が縦方向へと伸長し、H₂O₂シグナルが柵状組織の発達に関与する可能性が示唆された。

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植物の光屈性は青色光受容後にIAA偏差分布がつくられることによって生じると提唱されてきた。シロイヌナズナでは青色光受容体であるphot1と光屈性シグナル伝達因子NPH3の光屈性への関与は明らかだが、光受容からIAA偏差分布形成までのシグナル伝達機構の詳細は不明だ。私たちはトウモロコシ幼葉鞘を用い光屈性に必要な部位に注目することより、光屈性シグナル伝達因子の解明を試みた。これまでの研究により、トウモロコシ幼葉鞘の光屈性には幼葉鞘先端0-2mmへの光照射が必須であること、また光照射後の内生IAA測定により先端0-3mm以内でIAA偏差分布が形成されることが明らかになった。またトランスクリプトーム解析の結果、幼葉鞘先端で多く発現している遺伝子中に、IAA輸送に関連すると考えられるNPH3-like 遺伝子とPGP-like 遺伝子を検出した。さらにq-PCRによりNPH3-、PGP-like 遺伝子発現量を先端から1mm毎に調べると、両遺伝子は先端0-1mm、0-2mmで極めて特徴的に強い発現を示すことが明らかになった。以上の結果より、NPH3-、PGP-like 遺伝子産物はトウモロコシ幼葉鞘先端における光受容とIAA横輸送の間でシグナル伝達因子として関与していることが示唆される。現在、これら遺伝子産物の組織･細胞内分布、相互作用するタンパク質の探索について研究を進めている。

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フィトクロムは赤色光と遠赤色光を受容する光受容体である。フィトクロム相互作用因子の探索を目的に、抽苔時のシロイヌナズナから作成したcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行った結果、陸上植物に広く保存されているVOZ（Vascular plant One Zinc-finger）を単離同定した。シロイヌナズナにはVOZ1、VOZ2の2遺伝子が存在し、重複して花成を促進する。また、VOZはphyBの下流、FTの上流で機能する。花成応答においてphyBは葉肉細胞で機能し、FTは維管束組織で発現することに着目し、VOZの発現組織解析を行った。まず、野生株の維管束組織と葉肉細胞を分離し、VOZのmRNA発現量を解析した。その結果、VOZ1は維管束組織のみで、VOZ2は維管束組織を中心に葉肉細胞でも発現が見られた。次に、voz1 voz2二重変異体背景で、GUS-VOZ融合タンパク質をVOZプロモーター制御下で発現する株を作成した。得られた形質転換体で遅咲きの表現型が相補されることを確認し、GUS染色により発現組織を解析した。いずれの成長段階でも、VOZ1は維管束組織において、VOZ2は植物体全体で蓄積していた。さらに、植物の切片の観察より、VOZ1タンパク質は維管束師部に蓄積が見られた。これらの結果より、両者に共通する維管束師部でのVOZの発現が花成制御に重要であることが示唆された。

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植物が他の植物の陰に入ると、避陰応答により陰から抜け出ようとする。この応答は、陰のなかでフィトクロムの光平衡がPfr型からPr型に傾くことでおきる。我々は、避陰応答における器官間情報伝達に興味をもち、シロイヌナズナ芽生えを材料に避陰応答の時空間的な解析を進めてきた。その結果、1）暗期（夜）初期に子葉でFR光刺激が感知されること、2）その効果は4，6時間以内に子葉から別の部位に移行すること、3）実際の伸長は暗期開始後10時間くらいから顕著になること、などを見出した（小林他、第51回日本植物生理学会年会、2010年）。一方、避陰応答時にオーキシン応答遺伝子の発現が誘導されることが広く知られる。そこで本研究では、避陰応答におけるオーキシンの関与について、レーザー顕微手術と遺伝子発現解析により調べた。まず、オーキシンの供給源として茎頂を想定し、FR照射4時間後、レーザー顕微鏡手術により茎頂と胚軸伸長部位の接続を遮断した。その結果、FR光による伸長促進効果が見れらなくなったが、オーキシン（IAA）の存在下で同様の実験を行うと、あらかじめFR処理した芽生えでのみ、胚軸伸長の促進が見られた。従って、子葉で感知された光刺激により、胚軸伸長部のオーキシン応答性が変化することが示唆された。現在、これらの過程で遺伝子発現が部位ごとにどのように変化するかを、子葉と茎頂および胚軸に分けて解析中である。

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青色光受容体フォトトロピンは、最終的に細胞膜H⁺-ATPaseを活性化することによって気孔開口の駆動力を形成する。我々はすでに、ソラマメ孔辺細胞においてタンパク質脱リン酸化酵素であるプロテインホスファターゼ1（PP1）が、フォトトロピンからH⁺-ATPaseまでのシグナル経路を正に制御することを明らかにした。本報告ではPP1の役割をさらに詳細に調べるためシロイヌナズナを材料に用いた。まず、膜透過性のPP1阻害剤であるtautomycinを用いた実験により、シロイヌナズナにおいてもPP1がH⁺-ATPaseの上流で青色光依存の気孔開口に関与することを確認した。tautomycinは表皮における青色光依存の気孔開口と孔辺細胞プロトプラストからの青色光によるH+放出を阻害した。しかし、細胞膜H⁺-ATPaseの活性化剤fusicoccinによるH⁺放出は阻害しなかった。以上の結果から、孔辺細胞にはPP1により脱リン酸化される基質タンパク質が存在するはずである。そこで、シロイヌナズナおよびソラマメ孔辺細胞を材料として青色光依存的にリン酸化レベルの変動するタンパク質の同定を試みている。タンパク質の分離とリン酸化の検出には2D-DIGEを、タンパク質同定にはLC-MS/MSを用いて実験を進めており、得られた結果を報告する予定である。

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植物は、生育環境への適応戦略として光受容体を用いている。フィトクロムは赤色光と遠赤色光（FR）の光受容体であり、フィトクロムA－C（phyA-C）の3種が知られる。なかでもphyAは特殊で、赤色光よりむしろFRに対して強い応答性を示す。我々の研究グループではフィトクロム分子を4つの領域（N-PAS, GAF, PHY, C末端）に分け、phyA／phyB間のキメラ遺伝子（16通り）を構築し、その生理活性を調べた（小野他、第50回日本植物生理学会年会、2009年）。それによると、N-PASさえphyA配列であるれば連続FR光で核蓄積が観察された。一方、核内でのシグナル伝達には、N-PASに加えてPHYのphyA配列が重要であった。本研究では、これらの成果を踏まえさらに詳細な解析を進めた。まず、上記のN-PASを3つにわけ、phyA配列をphyB配列で置き換えたコンストラクトを構築し、残りのphyB配列へとつないだ。予備的な結果によれば、N-PAS領域内のN末端突出がphyA配列であれば、他の全ての部位がphyB配列でもFRで核蓄積が見られた。従って、この領域が遠赤色光による核移行誘導に重要な部位であると考えられる。また、PHYドメインの役割をさらに詳しく調べるため、PHYドメインのみをphyA配列としたキメラ分子に核移行シグナルをつないだものを発現させその性質を解析している。

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低温に曝されたイネでは、組織において著しいショ糖量の変動が起きる。フルクタンはショ糖を基質として液胞内に蓄積する多糖であり、耐乾性や耐凍性に関与する。コムギの1-SSTを導入したイネ（I22）では、本来イネにはないフルクタンが蓄積し、耐冷性が向上する（川上ら、J.Exp.Bot. 2008）。このI22を利用して耐冷性における糖代謝の役割を明らかにする目的で、前大会までに穂ばらみ期イネにおいて低温下でのショ糖輸送タンパク質遺伝子(OsSUT)やショ糖分解酵素遺伝子の発現変化を報告してきた。本年は、ショ糖合成酵素遺伝子（OsSPS）の発現変化を組織別にReal-time PCRにより解析した。解析の結果、OsSPS1を除くOsSPSsの発現量は、低温処理中のソース葉とその葉鞘で減少し、幼穂においては全てのOsSPSsの発現量が増加していた。ショ糖量はそれとは逆にソース葉とその葉鞘において低温下で増加し、幼穂においては減少した。OsSPSs発現量変化とショ糖蓄積量変化には相関がみられなかったことから、低温下におけるショ糖量変化にはOsSUTやショ糖分解酵素遺伝子が関与していると推察する。また、OsSPSsの発現変化および量はI22と非形質転換体で差異はなかった。低温下におけるイネのショ糖の合成や分解、輸送変化と別のスクロース代謝経路を備えた形質転換体の耐冷性機構を総合的に考察する。

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植物の低温応答シグナルでは，AP2/DREBファミリーに属するCリピート結合転写因子(CBF)の活性化が低温／乾燥ストレスに応答した遺伝子発現制御に関与していることが示されている．近年，シロイヌナズナを用いた分子遺伝学によりCBF遺伝子の発現調節にMYC様bHLH型転写因子ICE1 (Inducer of CBF Expression) とその翻訳後修飾が重要な働きをすることが報告された．イネでは必ずしも解明されていないことから，イネICE1ホモログの機能解明について着手した．RT-PCRによりイネのICE1ホモログの遺伝子を解析したところ，mRNAレベルでの発現量は一定であることを確認した． そこで，タンパク質レベルでの発現量の経時変化を解析するために，ICE1で保存された共通ペプチドモチーフを認識する抗-ICE1ペプチド抗体を作成した．この抗体を用いたイムノブロットよりイネ幼植物において低温に応答する約40kDaのICE様タンパク質が増加することが明らかとなった．以上のことから，イネの低温応答シグナルにおいてもICE-CBFカスケードが機能していることが示唆された．ICE-CBFの塩ストレスの応答についても合わせて報告する．

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温帯以北を起源とする植物の多くは、低温順化、すなわち、秋から冬にかけての気温低下あるいは日照変化を感知し、凍耐性を増大させる能力を有する。耐凍性の高い植物細胞では小胞体(ER)や細胞膜が特徴的な凍結挙動を示すことが報告されているが、凍結下での直接的な膜動態の観察が困難であることもあり、その生理作用は不明である。
カナダ・サスカチュワンでは冬期に-40℃を下回るにも関わらず、ネギは越冬する。このネギの葉鞘からは、顕微鏡観察に適した単一細胞層からなる表皮が簡便に採取できるため、この表皮およびER特異的蛍光試薬（ER-Tracker）を用いて凍結下でのER動態の観察を試みた。まず、低温未順化に比べ低温順化した細胞ではERが増加しているのが確認された。さらに、凍結下におけるERの凍結挙動を観察したところ、細胞周辺が凍結したと同時にフィラメント状の構造をしていたERが小胞状へと変化した。このERの小胞化は低温順化前後のどちらでも観察されたが、低温順化後の方が形成された小胞は大きかった。次に、融解時の挙動を観察したところ、低温未順化の細胞では小胞状構造のままであったのに対し、低温順化した細胞についてはフィラメント状の構造を再構築するのが確認された。このことから、ERの凍結挙動は耐凍性機構になんらかの影響を及ぼしていると考えられる。

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Heat shock transcription factor (HSF)は真核生物に広く保存された転写因子であり、高温ストレス応答に関与している。HSFは動物には数個程度しかないのに対し、高等植物にはA、B、Cの3つのクラスに分類される数十個が存在している。そのため、植物内ではHSFが複雑なネットワークを形成している可能性が考えられる。BクラスのHSF（HSFB）は植物特異的な構造を持っているが、その機能については不明な点が多い。そこで、我々はシロイヌナズナを用いてHSFBの高温ストレス応答における機能解析を行った。シロイヌナズナは21個のHSFを持ち、そのうちHSFBは5個である。HSFBの高温ストレス時における転写産物の蓄積パターンを解析したところ、HSFB1、HSFB2A、HSFB2Bの3つについて高温誘導性が確認された。また、プロトプラストを用いた一過的発現実験でHSFBがレポーター活性に与える影響を解析したところ、高温誘導性HSFBは転写抑制能を示した。これらのことから、HSFBは高温ストレス応答遺伝子の転写を負に制御することで、微妙な転写レベルの調節やストレス応答の終結に関与している可能性が考えられた。そこでHSFBの過剰発現体やT-DNA挿入変異体の高温ストレス応答について野生型との比較を行った。

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陸上植物は固着性であるため、環境ストレスに直接さらされており、種々の遺伝子発現や代謝を調節して様々な環境に適応している。低温ストレス環境下においても、多くの低温誘導性遺伝子が発現していることや糖やアミノ酸の蓄積量が増加していることが報告されている。シロイヌナズナにおいては、低温誘導性転写因子DREB1A/CBF3についての研究報告が数多くあり、DREB1Aを恒常的に過剰発現させた形質転換植物は、低温ストレス耐性が向上することから、DREB1Aが制御する下流遺伝子は、低温耐性の獲得において重要な役割を果たしていると考えられた。
我々は、DREB1Aが制御する機能未知のタンパク質ファミリーであるCOR413ファミリーに注目して研究を行った。このファミリーに属する3遺伝子IM1、IM2.1、PM1は低温で誘導されることが確認された。また、GFPタンパク質を利用して、この3遺伝子がコードする各タンパク質の細胞内局在を調べた結果、IM1とIM2.1は葉緑体膜に局在していることが明らかになった。一方PM1は小胞体に局在していると考えられた。さらに各遺伝子のT-DNA挿入型変異株の観察を行ったところ、im1およびim2.1変異体は低温条件下で野生型株と比較して、アントシアニンをより多く蓄積することが示された。そこで、これらの変異株を用いて、マイクロアレイ解析やメタボローム解析を行った。

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Most of the leaf tissues of bamboos employ deep supercooling as the mechanisms of cold hardiness. Their mechanisms of deep supercooling and freezing injury still remain unknown. Here, we analyzed precise freezing behaviors in leaf tissues of Sasa kurilensis. Differential thermal analyses (DTA) of both leaf blades and leaf sheath revealed that a large low temperature exotherm (LTE) initiated around -20C. We observed acoustic emission (AE) during the course of DTA using three sensors of pocket AE or AE tester. Detected number of AE events differed considerably depending on the sensor. But they showed clear distribution patterns compared to control: AE in leaf blades occurred mainly in the later half of the LTE while those in leaf sheath occurred mainly in the first half of the LTE. AE has been observed in association with cavitation bubble formation in xylem vessels caused by desiccation or freezing. Cryomicroscopy detected freeze-induced cavitation in the later half of LTE only in leaf blades. But the number of cavitation events was much less than AE events. AE events were most probably resulted from freezing of deep-surpercooled cells in this species.

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植物を凍らない程度の低温に暴露すると凍結耐性が上昇（低温馴化）し、その機構には細胞膜の組成・機能の変化が重要な役割を果たすことが知られている。低温馴化過程では、エンドサイトーシスやエキトサイトーシス等により細胞膜の構成成分が変動し、選択的な膜改変が行われていると推測される。最近、低温馴化過程におけるシロイヌナズナ細胞膜タンパク質のプロテオーム解析により、エンドサイトーシスに関するダイナミン様タンパク質（DRP1E）が低温馴化に伴って細胞膜に蓄積することが明らかになり（Minami et al.,2009）、DRP1Eが低温馴化過程で起こる細胞膜改変に関わっていることが示唆された。さらに、本研究において電解質漏出法を用いて凍結耐性を評価したところ、（1）低温馴化後には野生株の方がDRP1E欠損株よりも高い凍結耐性を示すこと、及び（2）その差は葉齢が若いほど顕著に表れること、が明らかになった。さらに、DRP1E特異抗体を用いたウエスタンブロットによって低温馴化過程でDRP1Eが細胞膜に蓄積することを確認した。現在、低温馴化過程において葉齢の異なる葉から単離された細胞膜を用い、葉齢によるDRP1E蓄積量と低温馴化機能の関連を解析し、さらに野生株とDRP1E欠損株の細胞膜プロテオーム解析を行い、それらの結果を基にDRP1Eによる細胞膜改変と凍結耐性の関係について議論したい。

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以前我々は、赤外線サーモビュアを用いて冬季のブルーベリー(Vaccinium ashei cv. Woodard)枝の凍結挙動を示差画像により可視化解析（新解析手法）した。その結果、枝は二段階で凍結しており、最初の凍結は木部でなく枝の表面で生じていることがわかった。また、枝及び木部と皮層部の氷核活性(INA)を測定し、皮層部分に高い活性があることがわかり、サーモビュアの解析結果と一致した。冬季の枝の凍結開始には、皮層部氷核活性が重要な働きをすると考えられ、今回はさらに、冬季枝の氷核活性の特徴を詳しく調べた。まず、INAに対する曝露時間と枝の量の効果を調べた。INAは枝の量が増すにつれ高まり、72mg(7.5mmの枝10本分)の時のINAは-0.6℃となった。量が1.5mg（枝約2mm）でも-1℃程度の高いINAを示した(曝露時間25分)。ブルーベリー枝はおそらく生物起源で最も高い氷核活性を持っている。組織別に分けたINAを測定すると、これまでの結果では、木部＋髄、ファイバー＋師部、表皮はINAが低く、柔細胞と空隙に高いINAが見られた。エタノールの影響を調べると、20%までは高いINAを維持していたが、40%以上になるとINAは低下した。その他、枝に切り込みを入れる処理、乾燥処理、抗氷核活性物質処理などの結果とともに報告する。

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植物は重力に応答して自身の姿勢制御を行っていることが知られている。回旋転頭運動は、器官端部の螺旋状の運動で、生存に適した成長方向の決定や、つる巻き運動に機能していると考えられている。その重力応答依存性については古くから示唆されており、近年我々は双子葉植物のアサガオやシロイヌナズナの重力応答異常突然変異体を用いて、回旋転頭運動に重力応答が必要であることを証明した。また、双子葉植物における回旋転頭運動はオーキシン極性輸送阻害剤処理により停止することから、回旋転頭運動には重力応答依存的なオーキシンの極性輸送が必要であることも示唆されてきた。しかしながら、単子葉植物における回旋転頭運動の制御機構は未解明である。そこで我々はイネの重力屈性突然変異体lazy1を用いて、子葉鞘の回旋転頭運動の重力応答依存性について解析を行った。野生型イネにおいては、子葉鞘が最も成長する時期において回旋転頭運動が観察された。一方、lazy1においては、成長量は野生型と有意な差がないのに対し、重力屈性の低下と回旋転頭運動の欠損が観察された。また、野生型イネ子葉鞘にオーキシン極性輸送阻害剤NPAを処理することでも回旋転頭運動が阻害されることから、単子葉植物の回旋転頭運動にも重力応答依存的なオーキシンの極性輸送が必要であることが示唆された。

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キャッサバはアジアやアフリカ地域での食糧安全保障、農家の収入源としだけでなく、産業上でも活用されている重要な作物である。しかし、地球規模の環境変動によりキャッサバの安定供給が脅かされているため、耐病虫害性、高デンプン収量性、高付加価値なキャッサバ品種の作出が望まれている。これを実行するためにキャッサバの分子育種を迅速かつ効率的に行う必要がある。しかしながら、分子育種に必要なゲノム解析基盤整備は十分に行われていない。現在、理研グループはCIAT（コロンビア共和国）やマヒドール大学（タイ王国）と共同しながら、キャッサバゲノム解析基盤の構築を目指して以下の研究を推進している。6項目について研究を推進している。1）根茎の高収量品種（KU50）や耐虫性品種（ECU72とMPER417-003）由来の完全長cDNAリソースの収集、2）次世代シークエンサーを用いたEST解析、3）キャッサバデータベースの構築、4）30000以上の遺伝子を含むDNAオリゴアレイの構築、5）有用な分子マーカーの探索、6）アジア、アフリカの実用品種を用いた形質転換系の構築。最終的にこれらツールを用いてキャッサバ分子育種を推進する予定である。本研究は科学振興調整費事業『熱帯作物分子育種基盤構築による食糧保障』のサポートにより進行中である。

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キクは短日性多年生草本であり、光周期と温度履歴によって開花時期が厳密に制御されている。我々は、キクの開花反応の分子機構を明らかにする目的で、二倍体野生ギクのキクタニギク(Chrysanthemum seticuspe f. boreale)をモデル植物と位置付け、網羅的な発現遺伝子情報の収集および形質転換系の開発を行っている。まず、様々な光周期処理および温度処理を行ったキクタニギク（系統：NIFS-3)の葉および茎頂部からtotal RNAを抽出し、完全長cDNAライブラリを作製した。均一化処理後、3’EST-, 5’EST- およびfragment ライブラリを作製し、Genome Sequencer FLX (Roche)による高速シークエンス解析を実施した結果、合計で約2,724,000リードの発現遺伝子情報を獲得した。クラスタリングおよびアセンブルの結果、約42,000のクラスターと約60,000のコンティグが得られた。さらに、約60,000のコンティグ配列を中心としてカスタムアレイ(Agilent)を作製した。次に、遺伝子の機能解析を目的としてキクタニギク (系統：NIFS-3)における形質転換系の最適化を行った。これまでに複数の花成関連遺伝子の形質転換体を作出し、約2~5%の形質転換効率を達成している。現在、花成関連遺伝子の網羅的発現解析および機能解析を進行中である。

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次世代シーケンサーの登場により、従来は難しかった個体間、品種間のゲノム配列の違いを明らかにして、1塩基多型(SNP)や挿入欠失(InDel)などの多型情報をゲノムワイドに短期間で得ることが可能になった。SNPやInDelは、有用形質の選抜などにおいてDNAマーカーとして広く使われており、これらの効率的な遺伝解析に欠かせない。そこで、日本型イネ品種間で利用可能なDNAマーカーの大量取得を目指し、日本型イネ在来品種「雄町」の全ゲノムを次世代シーケンサーGenome Analyzer II (イルミナ社製)で解読し、SNP及びInDelの検出を試みた。
解読した「雄町」ゲノム配列と「日本晴」ゲノムを比較し、ゲノムワイドな135,462 SNPs及び35,776 InDelsを検出することができた。ゲノム上に分散する712箇所のSNPsを用いたSNPアレイ解析により、577 個のSNPsの有効性が検証された。また、「雄町」、「日本晴」以外の日本型イネ品種についても、検出したInDelの一部をサンガー法で検証し、ジェノタイピングに利用できることを確認した。本大会では得られたSNP及びInDelのDNAマーカーとしての利用について報告する。
本研究は文部科学省「私立大学戦略的研究基盤形成支援事業」の一環として実施したものである。

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イネは既に全ゲノム配列の解析がO.sativa（日本晴）で完了しているので、近縁種の解析において正確なリファレンス配列が利用可能である。高速シークエンサーを用いて野生型イネと栽培種のゲノムシークエンスを詳細に比較することで、ゲノム構造の多様性を解析する作業を進めている。AAゲノム野生型イネのなかでも栽培種と近縁であるO.rufipogon一年生及び多年生各1系統、栽培イネから遠いO.longistaminata2系統について、（O.sativa:日本晴）へのマッピングを行い、ゲノムワイドな比較解析を行った。illumina GAIIxの解析から得られた、4997万-8177万paired readsを対象にして、DDBJのクラウド型解析パイプラインに実装されたBWAプログラムを用いてマッピングを行った。O.rufipogonの2系統ではリピート配列を除いたゲノムの85%以上のマッピング率が得られたので、このシークエンスをドラフトシークエンスとして詳細な解析等を行った。一方でO.longistaminataでは、マッピング率が63-67%だったことより、de novo assembly解析も行う必要が示された。現在、O.sativaのjaponicaとindica栽培種と野生イネの類似度のSNPsによる比較解析等を行っておりその結果についても報告したい。

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The ionotropic glutamate receptor (iGluR) gene family has been widely studied in animals and is known to play a key role in excitatory neurotransmission and other neuronal processes. In tomato, since glutamate is a major free amino acid component in the ripe fruit, the identification and the characterization of glutamate-receptor-like genes is of great importance. In the present study, we identified 15 novel tomato GLR (SlGLR) gene family from tomato genome databases. We performed a phylogenetic analysis of SlGLRs in comparison with Arabidopsis AtGLRs and prokaryotic iGluRs. Our analysis suggested that SlGLR gene family could be classified into 3 clades and among them, 2 showed a high homology to the Arabidopsis clades II and III. In addition to conserved amino acid residues in both prokaryotic and eukaryotic iGluRs, we could also identify those conserved only in AtGLRs and SlGLRs. We conducted the first comprehensive mRNA expression analysis of the SlGLR gene family. The result of realtime RT-PCR revealed that each gene was differentially regulated in terms of organs (leaf, stem, root, flower and fruit) as well as fruit developmental stages.

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現在, イネの様々なオミックス情報がデータベースより提供されている. それらには, ゲノム・アノテーション, 代謝パスウェイ, マイクロアレイ実験データなどが含まれる. これらの機能アノテーションや遺伝子発現データなどのオンライン・リソースを最大限に活用するためには, 各データベースにおいて用いられている遺伝子のIDなどを対応付ける必要がある. さらに, 遺伝子発現データから発現ネットワークを構築し, 機能アノテーション情報と統合することによって, 候補遺伝子の探索が促進され得る.
当プロジェクトでは, 主要データベースが提供するアノテーション情報を収集すると共に, 遺伝子発現ネットワーク解析から得られた情報と統合し, データベースOryzaExpressから提供している（http://riceball.lab.nig.ac.jp/oryzaexpress/）.現バージョンでは, 624サンプルのマイクロアレイ実験データから構築した遺伝子発現ネットワーク情報をインタラクティブなWebインターフェースを通して抽出できる. また, ATTED-IIが提供するシロイヌナズナの遺伝子発現ネットワークを統合し, イネとシロイヌナズナのオーソログにおける発現パターンの保存性を閲覧可能とした. 現在, 新たな遺伝子発現ネットワーク解析手法を構築中であり, 得られた結果を統合していく予定である.

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当プロジェクトでは, トマト（Solanum lycopersicum）の矮性品種マイクロトムに由来するcDNAリソース解析とデータベース整備を進めている. これまでに得られたトランスクリプトームの解析結果は, データベースMiBASE（http://www.pgb.kazusa.or.jp/mibase/）とKaFTom（http://www.pgb.kazusa.or.jp/kaftom/）から提供している. MiBASEからは, マイクロトムcDNAを含むトマトESTから構築したUnigene（KTU; Kazusa Tomato Unigene）の配列および機能アノテーションなどの情報を提供している. KaFTomには, マイクロトム完全長cDNAから解読した約1.3万個のHTC（High Throughput cDNA）のアノテーションを格納している.
現在, マニュアルキュレーションより精査したゲノムの構造アノテーションやKTUの更新（KTU version 4）などを進めており, MiBASEとKaFTomの情報を格納した統合データベースTOMATOMICSを構築している.
[謝辞] 本研究は, ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）のサポートを受けるとともに, 佐藤忍先生（筑波大学）および有江力先生（東京農工大）の協力のもと, 実施しています.

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国立遺伝学研究所日本DNAデータバンク(以下DDBJ)では、新型シーケンサからの出力データをアーカイブするため、DDBJ Sequence Read Archive(DRA)を運営している。新型シーケンサの配列は個々のリード長が短いこと、リード数が膨大なことから、解析に大規模なコンピュータシステムや解析の為のスキルが要求される。そこでDDBJでは、大規模配列処理にクラウド型で計算機資源を利用する方法を提案しており、その一環として、新型シーケンサ配列を解析するクラウド型解析パイプライン DDBJ Read Annotation Pipeline(http://p.ddbj.nig.ac.jp/)を開発している。
パイプラインの特徴を以下に挙げる。
1) 様々な新型シーケンサ(illumina, Roche/454, Life Techonology)に対応した
解析ツールが利用可能である。
2) 結果を統一ファイル形式に変換して、ベースコールの平均クオリティスコアや参照配列被覆率(coverage)、アライメント深度(depth)等の標準的な統計量を計算する。
3) ウェブアプリケーションの遠隔操作で、国立遺伝学研究所スーパーコンピュータのPCクラスタを利用したクラウド解析を行うことが出来る。
本発表ではパイプラインの最新機能を紹介する。

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理研PSCでは、植物比較ゲノム情報基盤の整備を推進している。このたび、ゲノム概要配列が公開された主要マメ科植物のダイズ(Glycine max)、ミヤコグサ(Lotus japonicus)、タルウマゴヤシ(Medicago truncatula)の、予測遺伝子モデル情報から転写因子ファミリーを計算機的に予測し、マメ科転写因子データベースLegumeTFDBを作成した。ダイズ、ミヤコグサ、タルウマゴヤシそれぞれのゲノム中に、各転写因子ドメインに特徴的な隠れマルコフモデルを用いた検索によって予測された転写因子数(割合)は、それぞれ5035(6.64%),1626 (3.83%),1467(3.78%)であった。本DBは、これらの転写因子について、予測遺伝子機能、遺伝子構造、ドメイン構成、Gene Ontologyなどの機能アノテーションとともに、シロイヌナズナ、イネ、ポプラといったモデル植物との比較ゲノム情報を提供する。また、予測されたそれぞれの転写因子の転写上流域に対して、PLACEデータベースから提供されるcis-motifの検索を行い、その分布をDBに実装した。LegumeTFDBはWeb上からアクセスできるDBとして、機能アノテーションやcis-mtifをクエリとした多様な検索インタフェースを実装し、マメ科植物の転写制御ネットワークの解明に有用な情報基盤として機能する。

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さまざまな植物のゲノム情報が利用可能になり、遺伝子ファミリーの網羅的な探索とその比較解析が進んでいる。私たちは、イネ科植物でゲノム配列情報が利用可能な、イネ、ブラキポディウム、ソルガム、トウモロコシについて、また、オオムギ、コムギの全長cDNA情報について、情報学的に転写因子ファミリーを探索し、統合的なデータベースGramineaeTFDBを構築した。GramineaeTFDBは、これらイネ科植物の転写因子について、予測遺伝子機能、遺伝子構造、ドメイン構成、Gene Ontologyなどの基本的な機能アノテーションとともに、GeneChipのプローブデータなど、それぞれの生物種の多様な配列情報への関連づけ情報を提供する。また、予測されたそれぞれの転写因子の転写上流域に対して、PLACEデータベースから提供されるcis-motifの検索を行い、その分布をGramineaeTFDBに実装した。GramineaeTFDBはWeb上からアクセスできるデータベースとして、機能アノテーションやcis-motifをクエリとした多様な検索インタフェースを実装し、イネ科植物の転写制御ネットワークの解明に有用な情報基盤として機能すると考えられる。

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植物ホルモン、アブシジン酸(ABA)は非生物的ストレスに関与している一方で、サリチル酸(SA)、ジャスモン酸(JA)等が制御する生物的ストレスにも関与している。近年の報告から、防御応答時においてABA、SA、JAがほぼ同時に作用することが明らかになっている。我々は、培養細胞を対象にしたNMRによる一斉代謝物解析から、ABAとSA同時処理により単独ホルモン処理とは異なる生理状態が誘導されることを示した。本研究では、ABAとSA同時処理により誘導される生理状態をより詳細に把握する目的で、マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を試みた。その結果、ABAまたはSA処理により発現変動が誘導される遺伝子は、これまでの報告のようにもう一方のホルモン処理により抑制される傾向を示した。その一方で、ABAとSAで同時処理した場合、多くの細胞周期関連遺伝子が単独処理に比べて発現がより強く抑制されることがわかった。これらの多くがG2/M期移行に関するものであったことから、培養細胞の核相を観測したところ、4C核が増加していることが確認された。また、ABAとSA同時処理のみで発現が変動する遺伝子が多く見いだされた。以上の結果から、複数の植物ホルモンの情報は、単に加算的に働くのではなく新たな刺激として働き、単独の刺激とは異なる生理状態を誘導すると考えられる。

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マメ科植物はその根において根粒菌との共生系による根粒を形成し、その内部の根粒菌感染細胞で共生窒素固定を行う。根粒内部では根粒菌感染細胞と非感染細胞が共存しており、非感染細胞は感染細胞への炭素源の供給や、固定された窒素化合物の転流に関する役割を担っている。共生窒素固定の確立に際して、マメ科植物は根粒菌を病原菌と厳密に区別し、根粒菌感染細胞と非感染細胞それぞれの特異的な分化を制御する機構を有しており、さらに根粒内の感染細胞数もまた厳密に制御されている。これまでに根粒内のこれらの細胞の機能分担を網羅的に調べた研究は少なく、また植物の根における感染細胞の分化制御機構も未だほとんど解明されていない。そこで本研究では根粒内細胞の機能分担の詳細な解明を目的とし、根粒の細胞型特異的マイクロアレイ解析を行った。
マメ科のモデル植物であるミヤコグサ根粒から感染細胞および2種の非感染細胞をレーザーマイクロダイセクション（LM）を用いて切り出した。得られたそれぞれの細胞からRNAを抽出して、マイクロアレイ解析を行い、根粒内細胞の機能分担に関する新たな知見を見出した。

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寄生植物は他の植物に水分や栄養分を頼って暮らす植物である。寄生植物には独立栄養でも生育できる条件的寄生植物と、宿主なしでは生活環を全うできない絶対寄生植物がある。ハマウツボ科の絶対寄生植物であるストライガやオロバンキは世界各地で甚大な農業被害をもたらしている。我々は寄生植物の寄生の仕組みを理解することにより、寄生植物の防除法を確立することを目指している。
彼岸の季節に低山帯でピンクの花を咲かせるコシオガマは、日本に自生するハマウツボ科の条件的寄生植物である。単独でも生育できるため実験系として優れていると考え、我々は、コシオガマを用いて寄生過程における遺伝子発現解析を試みた。コシオガマではEST情報等はほぼ存在しないため、次世代シーケンサーを用いたde novo RNA sequencing解析をおこなった。独立栄養で生育させたコシオガマとイネに寄生したコシオガマ根からRNAを抽出し、454型およびillumina型シーケンサーで解析し、アセンブリにより約5万の重複のない塩基配列を得た。さらに、各サンプルのリード配列をアセンブリ配列にマップし、特異的発現遺伝子の同定を試みた。その結果、寄生時のコシオガマ根ではプロテアーゼなどの分解酵素群が特異的に発現していた。本発表では、次世代シーケンサーを用いたde novo 解析および遺伝子発現の定量化における方法論や問題点等も議論したい。

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Mg-キラターゼはクロロフィル合成の第一段階を触媒する酵素で、CHLI、CHLD、CHLHサブユニットから構成される。Mg-キラターゼ活性は、触媒サブユニットであるCHLHにGUN4が結合する事で活性化されると考えられている。さらにCHLHおよびGUN4の変異体は、葉緑体から核へのシグナル伝達に異常を来したgun表現型を示すことが知られている。今回、我々はエンドウの単離葉緑体画分とシロイヌナズナの組換えタンパク質を用いて、Mg-キラターゼ活性の再構成を行なった。エンドウより無傷葉緑体を単離し、可溶性画分(S)と膜画分(LM)に分画した。これらの画分の組み合わせによりMg-キラターゼ活性を得た。得られた活性はMg2+およびDTT依存性を示した。葉緑体チオレドキシン添加による還元では、Mg-キラターゼは活性化されなかったことから、CHLI以外のサブユニットの還元が活性化に必要であると考えられた。また、0 mM Mg2+では、全てのサブユニットはSに存在していたが、5~10 mM Mg2+でCHLHとGUN4がSからLMに移行した。この条件で、SにシロイヌナズナのCHLHおよびGUN4組換えタンパク質を添加すると、Mg-キラターゼ活性を再構成する事が出来た。今後、Mg-キラターゼの再構成系を用いて調節機構やgun変異との関わりについて、解析を行なって行く予定である。

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Acaryochloris spp.は遠赤色光をも利用して光合成を行うことができるシアノバクテリアである。本特徴は、クロロフィルdの吸収極大波長が他のクロロフィルと比較して長波長側にシフトしていることに起因するが、クロロフィルd合成能をもつ生物はAcaryochloris spp.しか報告されていない。クロロフィル結合タンパク質である光化学系の特性は、含有するクロロフィルの性質に大きく依存している。よって、Acaryochloris spp.のクロロフィル組成を改変すれば、その光化学系に新たな特性を付与することができる。クロロフィル組成を改変するためには、代謝工学的アプローチが有効な手段であるが、それには形質転換系の開発が必要とされた。昨年度の本会において、我々は基準株であるAcaryochloris marina MBIC 11017での形質転換系の開発とクロロフィルb合成酵素遺伝子であるCAOの導入による新奇クロロフィル（7-formyl-Chl d_P）の生体内での合成を報告した。今回、我々は新奇クロロフィルを蓄積する形質転換体から光化学系Iおよび光化学系IIを単離して、その性質について解析した。その結果、光化学系I、光化学系IIともに新奇クロロフィルを取り込んでおり、一部のクロロフィルdが置換されていた。発表では、新奇クロロフィルの光化学系における役割について考察する。

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Heme production lies at the branchpoint of the tetrapyrrole biosynthetic pathway where protoporphyrin IX is catalyzed by ferrochelatases. Arabidopsis contains two ferrochelatase genes, FC1 and FC2, the latter has characteristic C-terminal LHC motif. In this study, we characterized Arabidopsis T-DNA insertion mutants of fc1 and fc2. fc2 in which T-DNA is inserted between exons 6 and 7 showed a reduced expression of FC2 and have a pale green to yellowish phenotype. Growth is also highly impaired in this mutant lagging in both size and root length. fc1, on the other hand, had an insert in the promoter region and also showing a reduced expression level amidst having the wild-type phenotype in both color and size. Surprisingly, heme levels in both mutants were almost unchanged when evaluated by fresh weight level suggesting that the level of endogenous heme is highly maintained even in the absence of one of the ferrochelatase isoforms.

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Acaryochloris 属はChlorophyll(Chl) dを主要色素とするシアノバクテリアである。我々はAcaryochloris marina MBIC 11017より光化学系IIを単離し、光誘起差FT-IRおよび吸収変化により、special pair がChl d二量体、初期電子受容体がPheophytin(Pheo) aである事を報告した。また、2010年には初期電子受容体の酸化還元電位が約80mVポジティブシフトしていることから、反応中心ChlがChl dであることを再確認した。 しかし、単離光化学系IIにおいてChl a領域に遅延蛍光が観測されることからspecial pairを含む反応中心タンパク質の色素組成にはまだ議論が残されている。本研究では、光化学系IIの単離精製方法の改良を試み、CP43およびCP47をほとんど除去した標品の調製に成功した。この標品の室温吸収スペクトルには、Pheo aの特異的な吸収帯が確認された。本大会では光化学系IIの色素組成について報告する。

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The components of photosystem II (PSII) from cyanobacteria include 20 subunits and over 70 cofactors such as chlorophylls (Chls), carotenoids, Mn, Ca, Fe, and plastoquinones. In a recent study, we have succeeded in improving the resolution of PSII crystals significantly. As a result, we were able to collect a diffraction data set at a 1.9 angstrom resolution with the beamline BL44XU of SPring-8 in JAPAN, and resolve the crystal structure of PSII at this resolution.
More than one thousand of water molecules per monomer were found in the structure of PSII dimer, some of which form a network linking the metal cluster. In addition, 4 water molecules were found to be associated with the metal cluster, which may function as substrates for the oxygen-evolving reaction. Most of water molecules existed in the surface of the lumenal side and the stromal side, however, very few molecules of water existed in the membrane regions, most of which served as ligands to chlorophylls. Moreover, the precise arrangements of cofactors such as chlorophylls and β-carotenes were determined, allowing a detailed analysis of their functions in energy and electron transfer reactions in PSII possible.

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強光や高温ストレス下では、光化学系II（PSII）の反応中心結合タンパク質D1が酸化的損傷を受けて、PSIIの機能が低下する。損傷D1タンパク質の分解には、チラコイド膜に存在する金属プロテアーゼFtsHが関与していることが示唆されている。ホウレンソウチラコイド膜とPSII膜（グラナに相当）についてFtsHプロテアーゼの分布を調べたところ、チラコイド膜では単量体、二量体、および六量体のFtsHが、またPSII膜では六量体のみが存在していることが分かった (Yoshioka et al. J. Biol. Chem. 2010)。FtsHプロテアーゼは、タイプAとタイプBの二種類のサブユニットから形成されている。活性型の六量体FtsHが存在するPSII膜に強光を照射すると、亜鉛イオンで促進されるD1タンパク質の分解が起きた。このことから、チラコイド膜上ではPSIIが多く存在するグラナでFtsHプロテアーゼによる損傷D1タンパク質の分解が行われている可能性がある。現在、強光処理後のチラコイド膜からPSII膜を単離し、FtsHプロテアーゼが損傷D1タンパク質の集中しているグラナへ集合する可能性があるかどうかを調べている。

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高効率な人工光合成系の開発は、現在人類が直面するエネルギー問題、地球温暖化問題を解決するために極めて重要な課題である。高い量子効率で光エネルギー変換反応を行う天然の光合成蛋白質を利用したハイブリッド型人工光合成系の開発は、その一つの方向性として注目されてきた。本研究では、光水分解ナノシステムの開発を目指して、光化学系IIコア蛋白質(PSII)と金ナノ粒子との複合体形成を行った。CP47サブユニットのC末端にヒスチジンタグを導入した好熱性シアノバクテリアT. elongatus のPSII二量体を、Ni-NTAを介して直径20 nmの金ナノ粒子へ結合させた。PSIIのクロロフィルQyバンド(674 nm)と金ナノ粒子のプラズモン吸収(530 nm)の吸光度の比から、金ナノ粒子あたり約4つのPSII二量体が結合したことが示された。金ナノ粒子へのPSII蛋白質の結合は、透過型電子顕微鏡観察によっても確認することができた。Niアフィニティーカラムへの結合能から、PSIIのほとんどはヒスチジンタグを介して金ナノ粒子に結合していると結論された。このPSII-金ナノ粒子複合体は、コントロールPSII試料に対し約26%の酸素発生活性を示した。これらの結果から、本研究で得られたPSII-金ナノ粒子複合体は、水から電子を得る光エネルギー変換ナノデバイスとして応用が可能であると考えられる。

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葉緑体チラコイド膜上には光化学系II・光化学系Iを経由するリニア電子伝達反応と、光化学系Iの回りに電子を循環させるサイクリック電子伝達反応が存在する。リニア電子伝達が炭素固定に必要なATP・NADPHの供給源であるのに対し、サイクリック電子伝達は補助的なATP供給源であると同時に光障害回避のための制御機構として重要である。リニア電子伝達における二つの反応中心の励起バランスはコアタンパクに付随する集光アンテナタンパク質を可逆的に移動させるステート遷移と呼ばれる機構によって制御されている。緑藻クラミドモナスではこのステート遷移の能力が特に高く、励起バランスの制御のみならずサイクリック電子伝達の制御にも関与していることがわかっている。クラミドモナス生細胞中でのステート遷移と電子伝達反応を精密に測定し、相関関係を調べると、その電子伝達反応はステート遷移によって2段階の制御を受けていることが明らかとなった。1）光条件の変化のような比較的緩やかな環境変動に対しては光化学系I及びIIのアンテナサイズを変化させてリニア電子伝達を最適化するように働き、2）嫌気条件のような激しい環境変動にはリニア電子伝達からサイクリック電子伝達へ電子伝達経路を転換して光障害を回避するように働く。環境変動の程度はプラストキノンプールの酸化還元状態に反映され、必要なレベルでのステート遷移を引き起こしている。

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The chloroplast NDH complex is involved in PSI cyclic and chlororespiratory electron transport in higher plants. We previously showed that NDH interacts with at least two copies of PSI to form the unique NDH-PSI supercomplex, which is required for protection of NDH from high-light stress. Despite the substantial progress that has been made in elucidating the structure of NDH, the mechanism of the NDH assembly has remained elusive. Here, we employed ten Arabidopsis mutants specifically defective in accumulation of the NDH subcomplex A to investigate the assembly process of this subcomplex. Our detailed proteomic, biochemical and genetic studies provide some insights into the mechanism of the NDH subcomplex A assembly and our working model will be discussed.

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光合成の明反応はリニア電子伝達とサイクリック電子伝達から成る。近年、リニア電子伝達だけではCO₂固定にATPを充分に供給できない事が明らかになった。不足のATPはPSIサイクリック電子伝達により作られる。高等植物におけるPSIサイクリックの主な経路はPGR5タンパク質に依存し、葉緑体NDH複合体はストレス緩和に主に機能する経路を触媒する。PGR5依存のサイクリック電子伝達はアンチマイシンAで阻害されることが知られているが、その作用機構は未知である。我々は、クロマツ(Pinus thunbergii)PGR5遺伝子をシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に導入した植物がアンチマイシンAに耐性を示すことを報告した。シロイヌナズナとクロマツのPGR5の間では8アミノ酸が異なるが、すべての残基について置換実験を行い、アンチマイシンA耐性を付与する1残基を決定した。アンチマイシンA未処理の条件では全ての1アミノ酸置換されたラインで野生型と同様の光合成活性を示した。これらの結果は、アンチマイシンAがPGR5あるいは、その近傍に位置するタンパク質に作用することを示唆している。また、PGR5依存とアンチマシンA感受性のサイクリック電子伝達経路が同一であることを強く示唆している。

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植物は炭素と窒素各々の代謝調節機構に加えて、細胞内の炭素、窒素代謝物の相対量比（C/Nバランス）を感知すると考えられているが、詳細は明らかにされていない。そこで、C/Nバランス制御機構解明を目的として、シロイヌナズナ葉緑体でのFBP/SBPase発現による光合成能強化が窒素代謝系の代謝産物および関連酵素遺伝子群の発現に及ぼす影響を検討した。FBP/SBPaseを葉緑体で発現させたシロイヌナズナ(ApFS)は野生株と比較して光合成活性は約1.3倍に、8週齢における生重量は1.2～1.5倍に増加していた。2週齢におけるApFS株ではカルビン回路代謝物量の増加、種々のアミノ酸量の減少が見られたが、種々の炭素・窒素代謝関連遺伝子発現量に有意な増減は見られなかった。一方、5週齢のApFS株では光合成産物量の増加、カルビン回路関連酵素遺伝子発現量の減少や窒素代謝関連遺伝子の増加が認められた。これらの結果より、生育初期では光合成能の上昇に伴い光合成代謝物量が増加し、生育の促進に伴って一時的に窒素が不足することによりアミノ酸が減少する。このようなC/Nアンバランスが、炭素代謝関連遺伝子の発現を抑制、窒素代謝系遺伝子を誘導することによって、C/Nバランスを維持していると考えられる。さらに、グルコース応答遺伝子の発現量が上昇していたことから、C/N制御にグルコースシグナリングの関与が示唆された。

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海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumの葉緑体局在型carbonic anhydrase (CA)の1つPtCA1の発現はCO₂濃度に応答して転写レベルで抑制される。現在までにptca1プロモーター領域(Pptca1)に存在する3つのシスエレメントCO₂/cAMP response element (CCRE1-3)がCO₂応答及び光応答に機能しており、cAMPがセカンドメッセンジャーであることが示されている。またCCRE2がCCRE1またはCCRE3と共に存在することでCO₂応答及び光応答に機能していることが明らかになっている。本研究では、もう1つの葉緑体局在型CAであるPtCA2のプロモーター(Pptca2)を新たに単離し、GUSレポーターアッセイを用いて、比較解析から光応答機構を検討した。その結果、Pptca1の完全な抑制には光が必要であるのに対し、Pptca2では光の有無に関わらず高CO₂環境下における抑制のレベルが同程度であることが明らかとなり、Pptca1とPptca2が光に対して異なる応答を示すことが示唆された。Pptca2上流領域においてCO₂及び光応答性配列の探索を行なった結果、Pptca2のCO₂及び光応答領域にも複数のCCREが存在することが明らかになった。

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High-Nutrient, Low-Chlorophyll 海域において、珪藻を含む多くの植物プランクトンの生育や光合成活性が制限され、原因は鉄の欠乏であることが示唆された。海洋性珪藻類の鉄応答機構を解明するため、本研究では海洋性珪藻 Thalassiosira pseudonana および Phaeodactylum tricornutum の鉄応答性プロモーターの探索および解析を行った。先行研究から、鉄制限時の光合成は溶存無機炭素との親和性が変化することが分かっている。RT-PCR を用いて鉄制限時に mRNA 蓄積量が増加した遺伝子を T. pseudonana で 2 遺伝子、P. tricornutum で11 遺伝子発見した。これらのうち、T. pseudonana の iron permease1、P. tricornutum の ferrichrome binding protein1、flavodoxin および iron starvation induced protein1、それぞれの予想プロモーター領域を単離し、egfp または uidA をレポーターとしてプロモーター活性を評価した。その結果、全てのプロモーターが鉄飢餓特異的なプロモーター活性の上昇を示したことから、単離した領域内に鉄飢餓応答配列を有すると考えられる。

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In A. thaliana, CTP:phosphorylethanolamine cytidyltransferase (PECT1; EC 2.7.7.14) regulates phosphatidylethanolamine (PE) biosynthesis via the CDP-ethanolamine pathway. We previously reported that pect1-4 mutants show growth retardation at 8^oC (Mizoi et al. 2006). Because PE is the major mitochondrial phospholipid and PECT1 is localized on the outer surface of mitochondria, we investigated the effects of pect1-4 on the respiration capacity of isolated mitochondria. We found that pect1-4 mitochondria showed decreased total respiration (TOR) capacity due to decreased cytochrome oxidase pathway (COP) capacity compared to wild-type mitochondria. When plants were subjected to 8^oC, TOR capacity transiently decreased in both wild-type and pect1-4 mitochondria after 3 d mainly due to decreases in COP capacity. After 14 d at 8^oC, TOR capacity resumed with increasing COP capacity in wild-type and pect1-4 mitochondria. However, the difference between TOR and COP significantly decreased in pect1-4 mitochondria compared to that before cold treatment. The results will be discussed with respect to adjustment of the alternative oxidase pathway capacity in pect1-4 mutants at 8^oC.

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植物は多くの環境ストレスにおいて余剰な光エネルギーに暴露される。葉緑体チラコイド膜の光化学装置は，過剰な光エネルギーを回避するために、環境に応答して光合成タンパク質の構成因子の活性や蓄積量が巧妙に調節されていると考えられているが，その全容については不明な点が多い。そこで強光乾燥ストレス耐性能が高い野生種スイカを用い、葉の膜画分のプロテオーム挙動を解析した。その結果、葉緑体ATP合成酵素εサブユニットは単一コピーの遺伝子にコードされているにも関わらず、分子量がほぼ同等で等電点が大きく異なる2分子種のεタンパク質が存在することを見出した。さらに、2分子種のεを分離精製しMS解析に供した結果、より酸性側の等電点を示すεにはN末端にアセチル基が付加していることが判明した。興味深いことに、乾燥ストレス下において、2分子種のうち、アセチル基修飾を受けていないεが優先的に分解することが示された。また、εを選択的に分解するメタロプロテアーゼ活性が、ストレス下の野生種スイカ葉抽出液から検出された。以上のことから、アセチル基の翻訳後修飾の有無により、メタロプロテアーゼに対するεの感受性を変化させることで、εの蓄積量を制御していることが示唆された。

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Boron (B) is an essential element for higher plants. In general, B deficiency leads to the inhibition of cell elongation in growing tissues. To elucidate the function of B in plants, EMS-mutagenized M2 populations of Arabidopsis thaliana was screened for mutants with altered-root elongation in response to B conditions in media. The isolated mutant showed short roots under normal B (30 μM), while the supply of high B (1 mM) rescued the root elongation partially. Two such lines named brr1-1 and brr2-1 (Boron Root Response) were studied in detail. Both lines carried a single recessive mutation. BRR1 and BRR2 were located on chromosomes 1 and 2, respectively. Under 30 μM B supply, root lengths of brr1-1 and brr2-1 were about 30 and 20% of the wild type, respectively. When 1 mM B was supplied, root lengths of brr1-1 and brr2-1 recovered to 70 and 30% of the wild type, respectively. In brr2-1 B concentration was lower in both roots and shoots, compared with the wild type. These data suggest that the mutants are defective in B utilization for root elongation. We expect that these mutants will reveal new aspects of boron involvement in root elongation.

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我々は、オオムギがムギネ酸分泌による鉄の獲得以外にも鉄欠乏適応機構を有していることを報告しており、それに関連する可能性のある現象として鉄欠乏のオオムギでは黄化葉の窒素・硫黄同化関連遺伝子の発現が低下すること、下位葉の老化が促進されることを明らかにしている。これらのことから我々は、鉄欠乏のオオムギは下位葉の老化を促進することによって同化産物を転流させ、黄化葉で低下した同化能力を補っているという仮説を立てた。そこでオオムギの下位葉から同化産物が転流している可能性を検証するため、オオムギとイネを鉄欠乏条件下で24日間栽培し、各部位の元素含有率を経日的に調べた。
処理24日目の鉄欠乏のオオムギの1葉では対照区に比べ亜鉛とマンガンの含有率は上昇し、窒素とカリウム、硫黄の含有率は低下していた。またオオムギの葉身の窒素含有率は全体的に低下しており、下位葉ほど早期から、大きく低下する傾向が見られた。一方、処理24日目のイネの2葉でも亜鉛とマンガンの含有率は上昇していたが、窒素とカリウム、硫黄の含有率にあまり大きな変化は見られなかった。これらの結果から、オオムギは下位葉の老化を促進することによって同化窒素を転流させ、鉄欠乏によって低下した窒素同化を補っている可能性が示唆された。

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NRT2;3はヒメツリガネゴケがもつ8つの硝酸イオン輸送体の1つである。主要NRT2成分であるNRT2;1～NRT2;4の中では、NRT2;3の硝酸イオンに対する親和性は他に比べて低く、高濃度(10 mM)の硝酸イオン条件で培養した原糸体ではmRNA発現量が全NRT2 mRNA発現量の80％以上を占める主要成分であり、その硝酸イオン吸収活性は翻訳後段階で活性制御される。植物のNRT2の多くに存在している推定リン酸化部位であるセリン残基のひとつをアラニン残基に置換したNRT2;3変異株を作成したところ、S414A株ではNRT2;3 mRNAが正常に発現しているにもかかわらず、NRT2;3タンパク質の存在が確認されなかったことから、S414はNRT2;3タンパク質が安定して存在するために重要な役割を果たす可能性が示唆された。またS507A株ではPpNRT2;3タンパク質が存在するにもかかわらず、NRT2;3欠損株と同様にNRT2;3 mRNA以外のNRT2 mRNAの高発現を示したことから、S507がNRT2;3の機能発現に関与する可能性が示唆された。本研究ではNRT2;3の推定リン酸化部位であるセリン残基をアスパラギン酸に置換した変異株を作成し、それらのNRT2遺伝子発現、NRT2;3タンパク質発現、及びアンモニア添加によるNRT2;3の硝酸イオン吸収の阻害の有無を解析した。

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植物の硫黄同化系の第一反応は、ATPスルフリラーゼによる硫酸イオンのアデノシン5’-ホスホ硫酸への変換である。シロイヌナズナゲノムに存在する4つのATPスルフリラーゼ遺伝子(ATPS1、ATPS2、ATPS3、ATPS4)は全て葉緑体移行配列を含むが、細胞分画実験の結果からシロイヌナズナは葉緑体と細胞質の両方にATPスルフリラーゼ活性を持つことが報告されている。本研究では細胞質型ATPスルフリラーゼ遺伝子の同定を目的とし、ATPS-GFP融合蛋白質をシロイヌナズナに発現させた。その結果、ATPS1、ATPS3、ATPS4はプラスチドに局在するが、ATPS2は細胞質とプラスチドの両方に局在することが示された。ATPS2のコード配列は、5’側の葉緑体移行配列と3’側のATPスルフリラーゼ酵素活性配列で構成される。RLM-RACE法による転写開始点解析の結果、ATPS2遺伝子からは完全長の葉緑体移行配列を含む長いmRNAと、葉緑体移行配列を一部欠損する短いmRNAが産生されることが示された。ATPS2遺伝子の葉緑体移行配列切断部位の直前には、インフレームのATGコドンが存在する。長いmRNAからは葉緑体移行配列前のATGコドンからの翻訳により葉緑体局在性の、短いmRNAからは移行配列切断部位直前のATGコドンからの翻訳により細胞質局在性のATPS2蛋白質が作られると考えられる。

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緑色硫黄細菌は絶対嫌気性の光独立栄養細菌である。その光合成系は、光合成反応中心（RC）がホモダイマー構造である、カルビン回路ではなく還元的TCA回路で炭素固定を行うなど、他の光合成生物にはない多くの興味深い特質をもつ。しかしながら絶対嫌気性であるために、生化学的手法を用いた光合成系の研究は困難である場合が多い。緑色硫黄細菌Chlorobaculum (Cba.) tepidumは、全ゲノム情報と相同組換えによる形質転換系が利用可能であり、これまで光合成に関連するタンパク質の機能の多くは遺伝子破壊株作成によって調べられてきた。一方、緑色硫黄細菌は光合成でしか生育できないため、光合成に必須な遺伝子産物の解析はほとんど進んでいない。より詳細な解析には、破壊株への相補遺伝子導入や部位特異的変異遺伝子の発現系構築など分子遺伝学的手法の改良が必要である。
今回、汎用性の高い系の開発を目指し、プラスミドによるCba. tepidumへの外来遺伝子導入とその発現系の構築を試みた。大腸菌との接合実験により、RSF1010由来の広宿主域プラスミドが安定に保持されることがわかった。これにRCコアタンパク質遺伝子pscAのプロモーター配列を組み込むことで発現プラスミドを構築し、外来遺伝子としてHisタグ付きRCコアタンパク質の発現を試みたところ、良好な発現が確認できた。

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