Cytokinins are mainly transported from root to shoot through the xylem in the form of nucleoside cytokinins. Because there is currently little information on how nucleoside cytokinins enter into and exit from the xylem, it is important to identify and characterize the transporters of nucleoside cytokinins. As an attempt, we isolated and characterized potential ENTs (equilibrative nucleoside transporters, designated OsENT1 to 4) of rice. OsENT2 complemented a Saccharomyces cerevisiae mutant that is unable to synthesize adenine. Adenosine import into yeast cells expressing OsENT2 appeared not to require a transmembrane proton gradient because protonophore did not abolish adenosine transport. In competition experiments using various nucleoside cytokinins, the transport of ³H-adenosine by OsENT2 was preferentially inhibited by isopentenyladenine riboside and kinetin riboside. The details of the transport characters and gene expressions of OsENT2 will be presented.

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　我々の研究室ではタバコカルスの細胞質に存在するサイトカイニン結合タンパク質（CBPs）の一種であるCBP2を単離・精製した。CBP2は分子量26kDa, Kd=1.06X10^-6 Mでstress proteinの一種であるOLPと高い相同性を持ち(Plant Cell Physiol.41:148-157, 2000), 両者はSDS-PAGEおよびWestern blot分析から、構造的に一致している（B.B.B.65:2806-2810, 2001）ことが分かっている。
　今回、相同性検索によりシロイヌナズナのCBP2ホモログAtOLP (61.2%)を得た。AtOLPを過剰発現させるため、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター下流に挿入し、プラスミドを構築した。このプラスミド内のDNA断片をアグロバクテリウムを介してFloral dip法によりシロイヌナズナに導入し、形質転換体を得た。その第2世代のseedlingの根を用いて、サイトカイニン(BA)の種々の濃度に対する応答を見た。その結果、10^-7 M BA で野性株よりも顕著な根の伸長抑制が見られた。
　このことは、タバコのみならず、シロイヌナズナにおいてもCBP2と相同なタンパク質（AtOLP）が存在し、サイトカイニンとの応答において、なんらかの機能を果たしていることが示唆される。

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サイトカイニンは細胞分裂の促進を通して植物の生長の多くの局面に作用すると考えられている植物ホルモンである。種々のホルモン投与実験や過剰生産植物体の解析からその機能的重要性は示唆されてはいるが、植物の生長において内在性サイトカイニンがいかなる機能を果たすかについてはよくわかっていない。最近サイトカイニン受容体をコードするAHK4遺伝子が同定されたが、その機能欠失変異体は何らの特異的表現型を示さなかった。我々はAHK4とファミリーを形成するAHK2、AHK3両遺伝子の機能欠失変異を同定し、多重変異体株を作成することで生理機能の解析を試みた。外性サイトカイニンに対する応答性の低下から、これらもAHK4同等にサイトカイニン受容体として機能することが示された。ahk2 ahk3二重変異体はシュートで弱い半矮性の表現型が、ahk2 ahk3 ahk4三重変異体は全身的に著しい生育阻害が観察された。本葉の成育過程解析および根端の組織学的観察から、本葉の矮化や根の生育阻害は細胞分裂活性の低下に伴う細胞数の減少に由来することが判明した。AHK遺伝子群の発現はおおむねオーバーラップしており、種々の分裂組織や維管束に強く、植物全体にわたっている。これらの結果から、植物の様々な組織・器官において、サイトカイニンが受容体の機能を通して細胞分裂活性の昂進と維持を行い、植物の生長を促すことを示している。

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His-Aspリン酸リレー情報伝達系が、植物のホルモン応答や環境応答において重要な役割を担っていることが強く示唆されている。His-Aspリン酸リレー情報伝達系はセンサーHis-キナーゼ（HK）、ヒスチジンホスホトランスミッター（HPt）とレスポンスレギュレーター（RR）の三つの因子から構成される。HKがシグナル受容体として働き、情報がHis残基とAsp残基の間のリン酸リレーを介してHPt因子、RR因子へと伝達される。RRは情報の出力を司る因子であり、シロイヌナズナにはRR（Arabidopsis Response Regulator: ARR）が22種類存在する。ARRはその発現パターンと一次構造の違いから、タイプA（10種類）、タイプB（11種類）、そしてどちらにも属さないタイプ（ARR22）に分類される。これまでの研究から、タイプA ARRとタイプ B ARRはそれぞれ、サイトカイニン情報伝達系の負及び正の制御因子として機能することが示されている。しかし、どちらのタイプにも属さないARR22については、これまで解析されていなかった。
本発表ではARR22に焦点をあて、他のARRとの比較、サイトカイニン情報伝達への関与、発現様式の解析、細胞内局在性の同定に加え、過剰発現体の表現型やマイクロアレイを用いた解析結果を報告する。

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高等植物においてサイトカイニンシグナルはヒスチジンカイネース（HK）、ヒスチジンフォスホトランファープロテイン、レスポンスレギュレーター（RR）の3つのモジュールからなる二成分制御系によって受容、伝達される。我々は、トウモロコシよりサイトカイニン受容体ヒスチジンカイネース（ ZmHK1,ZmHK2,ZmHK3a）を単離し、その機能解析を行った。大腸菌変異株[ΔrcsC, cps::lacZ]を用いた実験により、ZmHK1およびZmHK3aはヌクレオシド型よりもフリー型のサイトカイニンに高い活性を示し、一方ZmHK2についてはそのような差は見られないことが明らかとなった。また、すべてのZmHKは、今まで不活性型もしくは活性が弱いと考えられていたシスゼアチンをリガンドとして認識した。ZmRRはZmHKの下流に位置する情報伝達因子でありサイトカイニンによってその発現が誘導されることが知られている。トウモロコシの培養細胞をトランスゼアチンあるいはシスゼアチンで処理した場合、ZmRR1の発現はシスゼアチン、トランスゼアチンのどちらでも同程度上昇した。以上の結果からトウモロコシサイトカイニン受容体はそれぞれ異なるリガンドを認識すること、少なくともトウモロコシにおいてシスゼアチンは活性型分子として機能しうることが示唆された。ZmHKの細胞内局在性についてもあわせて発表する予定である。

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サイトカイニンは植物の発生・成長に深く関わっており、なかでも細胞増殖の制御においてはオーキシンとともに決定的に重要な役割を担っている。rrd4変異体は根の再分化を指標に単離したシロイヌナズナの突然変異体であり、脱分化・細胞増殖などに関してサイトカイニン依存的な温度感受性を示す。脱分化・細胞増殖に対するサイトカイニンの阻害作用は通常高濃度で処理したときに観察されるが、rrd4変異体ではこのような阻害作用が低濃度域でも表面化するものと思われる。つまり、RRD4の本来の役割は、サイトカイニンの阻害作用の抑圧にあると予想される。RRD4遺伝子は、マウスのTIP39やショウジョウバエのSIP1によく似たG-patchドメインタンパク質をコードしているが、いずれも分子機能は全く不明である。
　脱分化・細胞増殖に対する見かけのサイトカイニン作用は、複数のサイトカイニン作用経路のバランスによって決まっていると考えられる。そこで今回、サイトカイニンの様々な作用経路にRRD4がどのように関わっているかを明らかにするため、ARR5等の遺伝子発現を分子マーカーとして胚軸外植片のサイトカイニン応答と、それに対するrrd4変異の影響を調べた。これまでに得られた結果からは、rrd4変異がサイトカイニン応答に影響するわけではないこと、すなわちRRD4の関与は一部のサイトカイニン作用経路に限られていることが示唆された。

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P. Galuszka et al proposed that cytokinin oxidase(CKO) behaves as a dehydrogenase rather than an oxidase. We examine the mode of the side-chain cleavage by CKO using deuterium-labeled iPA.
CKO was extracted from Agrobacterium-transformed callus of sweet potato, and partially purified. CKs used as substrates were α-methyl-iPAs and deuterated iPAs that deuterium was substituted for hydrogen at α-methylene(d2) and at γ,γ-dimethyl(d6) of the side chain. The reaction rate was determined on the base of HPLC analysis.
When α-methyl-iPAs were used as substrates, no both the enantiomers were degraded by CKO. It seems that methylation at α position of the side-chain rendered the CK resistant to CKO.
Deuterium substitution at α-methylene revealed a K_iPA/K_iPA-d2=3.5 and on the dimethyl group showed a K_iPA/K_iPA-d6=0.7. The results are explained in terms of both primary and secondary isotope effects on a possible rate-determining step in the side-chain cleavage.

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光エネルギーを利用してプラストシアニンもしくはシトクロムcを酸化し、フェレドキシンを還元する光化学系Iは100以上のコファクターと10以上のサブユニットを含む複合体を形成している。光化学系I複合体の機能と構成タンパク質の遺伝子解析、三次元立体構造の解析は大きく進展した。しかし、光化学系I複合体が分子集合する機構はほとんど明らかにされていない。緑藻Chlamydomonas reinhardtiiで光化学系I複合体の分子集合に必須な葉緑体にコードされるタンパクYcf4は、700kDa以上の大きさの複合体の成分である。昨年の植物生理学会では、Ycf4にTAP （Tandem Affinity Purification）タグを融合したクラミドモナスのチラコイド膜をドデシルマルトシドで可溶化し、ショ糖密度勾配超遠心、イオン交換カラム、そしてアフィニティーカラムでYcf4を含む複合体を精製した。本報告ではNaBr処理し表在性のタンパク質を除去したチラコイド膜を可溶化し、そのままアフィニティーカラムで複合体を精製した。このように精製操作を大幅に単純化しながら、これまで以上に高純度かつ大量の標品を精製する方法を確立できた。得られた複合体は60、32、28、20、16 kDaのポリペプチドを含み、このうち28と20 kDaのポリペプチドはYcf4とPsaFであった。他のポリペプチドのN末端アミノ酸配列は現在解析中である。

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葉緑体ゲノムにコードされるYcf4は、光化学系I複合体の分子集合に必須なタンパクである。しかし系I複合体の複雑な分子集合機構にYcf4タンパクがどのように関与するかは不明である。本研究では緑藻クラミドモナスのycf4遺伝子に部位特異的突然変異を導入し、系I複合体の分子集合に影響の出る変異株の作成を試みた。これまでにYcf4のN末端側から179と181番目のグルタミン酸を両方とも電荷を持たないグルタミン、もしくは側鎖が小さいアラニンに置換した株（E179/181Q, E179/181A）を作出した。E179/181Q株は光独立条件で生育できなかった。ウェスタン分析を行うとYcf4は野生株とほぼ同量蓄積していたがPsaAはほとんど検出されなかった。一方E179/181A株は弱光下では光独立的に生育できるが強光下では生育できなかった。Ycf4とPsaAは蓄積量が約30％に減少していた。次に各変異株の系I複合体の存在状態をショ糖密度勾配超遠心法を用いて調べた。E179/181A株には量は減少しているが正常な系I複合体が存在していた。しかしE179/181Q株に極微量存在した系Iタンパクは正常な複合体を形成していないと思われる画分と、Ycf4が存在する分子量の大きな画分に分離された。後者は分子集合中間体と考えられ、この変異が系Iの分子集合を初期の段階で停止させたと思われる。

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　1996年に群体ホヤ体内から発見された原核藻類Acaryochloris marinaは、主要色素としてクロロフィル d（Chl d ）を持つ。Chl dは高等植物で機能する主要色素Chl aのリングIのビニル基がホルミル基で置換されたもので、Chl aよりも長波長の光を吸収する。A. marinaは他の藻類と同様に酸素発生型の光合成を行い、二つの光化学系（PS1 & PS2）を持つ。これまでの酸素発生型の光合成生物では、Chl aが主要色素で、PS1およびPS2の反応中心には、それぞれChl a'とフェオフィチン a（Phe a ）が鍵色素として機能している。前者はPS1の電子供与体P700であり、また後者はPS2の一次電子受容体である。
　ところで、A. marinaには、微少量ではあるがChl aが存在することから、我々はA. marinaにもChl a'とPhe aが存在すると考えた。しかし、色素分析から、A. marinaにはChl a'は検出されず、代わりにChl d'が検出された。また、Phe dは存在せず、Phe aが検出された。光質を変えて培養した菌体の色素分析より、A. marinaのPS1初発電子供与体P740はChl d/d'のヘテロダイマーであり、PS2の初発電子供与体(P)がChl aのホモダイマー、アクセサリー(B)がChl d、一次電子受容体がPhe aであると推定した。PS2における光電荷分離はアクセサリーChl dの光励起から駆動されると推定される：PB^* → P^*B → P⁺B^-。

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種々の酸素発生型光合成生物から単離した光化学系(PS) I における初期電子供与体P700の酸化還元電位を、透明薄層電解セルをもちいた分光電気化学測定で求めた。好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatusのP700酸化還元電位 (+425 mV vs. SHE) はホウレンソウ (+475 mV)に比べ、50 mV程度低いという結果が得られた。T. elongatus, ホウレンソウP700の酸化還元電位は高濃度のTriton X-100でPS Iを処理しても10 mV以下しか変化しないことから、T. elongates, ホウレンソウで見られたP700酸化還元電位の差はPS Iの単離・精製時の界面活性剤処理で生じたのではなく、両生物のP700に固有の性質であることがわかった。さらに他の生物についてP700酸化還元電位の測定をおこなったところ、シアノバクテリア Synechochoccus PCC6301, 緑藻 Chlorella vulgarisのP700は+453 mVとT. elongatusとホウレンソウの中間の値を示すことがわかった。以上の結果から、酸素発生型光合成生物のP700はその酸化還元電位から少なくとも3つのタイプに分類できる可能性が示唆された。

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細胞内に一個の葉緑体しか持たない単細胞藻類は細胞分裂と葉緑体分裂が連動するため、細胞分裂期には光合成活性が低下し、細胞分裂が止まると葉緑体も成熟して光合成活性も上昇すると考えられる。この過程を調べるため、葉緑体を一つしか持たない単細胞藻類であるクロレラを有機栄養存在下・暗所で培養し、その増殖に伴う光合成色素類の変動をHPLCにより解析した。また、この変動に伴う光合成活性変化を低温ケイ光、およびP700量の測定によって解析した。(1) HPLCによる色素分析により、Chl aが酸化されたと思われるChl a誘導体が2種類検出された。これらは細胞増殖期に多く蓄積し、増殖停止期（定常期）には減少した。(2) 液体窒素温度におけるChl aの蛍光は、増殖期初期ではF685が主で、増殖が進むにつれてその蛍光収率は低下し、定常期ではF725が主となった。(3) 増殖期初期にはP700は殆ど検出されない。増殖が進むにつれてP700が形成され、Chl a/P700の比は約100になる。しかし、定常期ではその比は約300になった。(4) 以上の結果から、葉緑体の分裂期には、クロロフィルの膜への組み込みが正常に行われず、そのため光合成活性が著しく低下すると推定された。

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凍結乾燥した光化学系I（PSI）粒子粉末を、水を含んだジエチルエーテルで処理すると、P700活性を保ったまま大部分のアンテナクロロフィル、カロテノイド及びキノンが抽出され、PSI反応中心の電子伝達反応を観測しやすくなる。また、キノン除去により増大した電荷再結合反応によりP700の励起状態（P700^＊）が生成し、数10 ns程度の寿命を持つ遅い蛍光（遅延蛍光）が出現する。遅延蛍光成分の相対強度、寿命の温度依存性から、電荷分離状態（P700⁺-A₀^-）とP700^＊間の自由エネルギー差に関する情報が得られる。半導体レーザー（405 nm、パルス幅50 ps）でエーテル処理PSI試料を励起し、ストリークカメラを用いて77 Kから270 Kまでの温度範囲での試料の蛍光減衰ダイナミクスを測定し、遅延蛍光の相対強度、寿命を求めた。その結果、以下のような傾向が観測された。1）200 K以上の温度領域では、温度降下とともに遅延蛍光成分の相対強度が減少する。2）200 K以下では、温度降下とともにいったん遅延蛍光の相対強度は増加し、その後150 K以下で再び温度降下とともに減少する。講演では、低温でエネルギーギャップが分布を持つことなどを考慮してデータを解析し、PSI RC内での初期電荷分離過程のエナジェティクスを議論する

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Water-water cycle (WWC) は、当初、光合成における活性酸素の消去系として認識され、最近では光傷害の緩和に役立っていることが示唆されている光合成の代謝系である（Miyake, Makino 2003）。これに加え、WWCは光合成の光誘導過程においてスターターとして機能していることが示唆された（Makino et al. 2002）。しかし、WWCが機能しない0％酸素条件でも時間はかかるものの光合成は誘導されることから、WWCは必須ではないことが確認された。0％酸素条件ではチラコイド膜上のΔpHの指標であるNPQ形成も緩慢であった。従ってWWCは、光照射開始後の迅速なΔpH形成に貢献し、このΔpH形成によって生ずるATPが、Rubisco activase活性化に関与し、光合成が誘導されていることが考えられた。そこで、Rubisco活性測定を行った。しかしながら、まだ誘導初期の光合成速度が低い段階でRubiscoの活性化状態はすでに8割に達しており、Rubiscoの活性化が光合成の光誘導を律速しているとは言えなかった。イネでは、5時間以上の暗処理を施すと、強いdark-inhibitionが観察された。この5時間暗処理によって強く失活したRubiscoを活性化するためには、多量のATPが必要とされることが考えられた。しかし暗処理葉においても光照射後速やかにRubiscoの活性化が認められたことからRubiscoの活性化が光合成の光誘導を律速しているわけではなかった。

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The structure of the cytochrome b₆f complex from the thermophilic cyanobacterium, M. laminosus, has been solved to a resolution of 3.0 angstrome, thus completing the structural description of the architecture of the electron transport chain of oxygenic photosynthesis. The crystal structure shows that two monomers of an eight subunit dimeric complex surround a large inter-monomer cavity stabilized by lipids. The cavity reveals the quinone exchange pathway through a plastoquinone near a unique heme on the electronegative side of the cavity, and a quinone analogue inhibitor on the electropositive side that occludes a portal to the [2Fe-2S] cluster and b_p-heme. It is proposed that the mechanism of electron transfer from plastoquinol to the cytochrome f heme involves a small amplitude tethered rotation of the [2Fe-2S] protein about its hinge and the possible electron transfer around the unique heme for Fd-dependent cyclic electron transport.

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　イネ（ニッポンバレ）Tos17挿入株ライブラリー（ミュータントパネル）を材料として、クロロフィル蛍光による電子伝達系に関わる突然変異株のスクリーニングを行った。ニッポンバレTos17挿入株ライブラリーの一部（NC株約9600株およびND株1100株）から各株3個体ずつを播種した。二次元クロロフィル蛍光解析装置を用い、発芽後、2週間目の幼苗を材料として、高蛍光変異株を選抜した（一次選抜）。ついで、パルス変調蛍光計にて詳細に蛍光誘導パターンを解析し、それらを分類した（二次選抜）。
　約10700株のうち、一次選抜で103株の変異株が選抜された。2次選抜では、これらを、high-Fo (36株)、no-quenching　（24株）、slow-quenching（43株）の3タイプに分類した。High-Foタイプは、葉緑体遺伝子発現の異常またはP680酸化側の突然変異の可能性が高い。No-quenchingタイプは、P680の還元側の電子伝達系の変異の可能性が高く、量子収率が極めて低いため、その後致死になると考えられる。Slow-quenchingタイプは、キノンプールよりさらに還元側の変異もしくはnon-photochemical quenchingに関わる変異であると推定される。これらのうち、興味深い変異株について、原因遺伝子の解析を進めている。

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  The chloroplastic NAD(P)H:plastoquinone oxidoreductase complex (NDH) is homologue of respiratory complex I. Since NDH genes are encoded in plastid and possibly nucleus genome, we disrupted tobacco NDH genes in plastid. Their disruptants showed that NDH participates in cyclic electron flow around photosystem I and adjust ATP/NADPH ratio in chloroplast.

  To examine the physiological function of NDH, we investigated the NDH activity among different plant species using 152 plants on the basis of chlorophyll fluorescence analysis. C4 plants tended to show high NDH activity, possibly reflecting the high ATP/NADPH ratio. Interestingly, the highest activity was shown in NAD-ME type plants in three types of C4 photosynthesis. Further comparison of NADP-ME type with NAD-ME type plants, suggested that the differences of energy requirement between mesophyll and bundle sheath cell is responsible for the difference between two types.

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Rice phytochrome family is comprised of three members, phyA, phyB and phyC. In order to obtain the information about the fundamental characters of rice phytochromes, we have analyzed the expression levels and patterns of these three phytochromes in rice seedlings as well as different tissues under different light conditions. In dark-grown seedlings, PHYA protein was dominant over other two phytochromes. In contrast, PHYB was dominant in light-grown seedlings. PHYA was highly light-labile, and the protein level was reduced to less than one tenth after 8 h irradiation. PHYB was relatively light-stable, only showing a slight reduction by 8 h light treatment. We also analyzed phytochrome levels in various tissues of 6-day old dark-grown seedlings. PHYA was highest in coleoptiles, and relatively lower in roots and leaves, whereas PHYB and PHYC were highest in leaves. Light stability of three phytochromes was different among different tissues.

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我々は，光合成を行わない植物における光シグナル伝達経路が，光合成植物のものとどの程度異なっているかを明らかにし，植物の光シグナル伝達に関して新しい知見を得ることを目的として研究を進めている．本発表では，全寄生植物 Orobanche minor よりフィトクロム A (PHYA) 相同 cDNA を単離し，そのキャラクタリゼーションを行った結果に関して報告する．圃場にてアカクローバーに寄生させた O. minor より total RNA を抽出し，縮重プライマーを用いた RT-PCR および RACE 法によってPHYA 相同 cDNA をクローニングした．得られた配列 OmPHYA のコードするタンパク質 OmPHYA はシロイヌナズナの PHYA と約 70% の配列類似性を示した．また，realtime PCR による発現解析の結果，明所で生育させたものと比較して，暗所で生育させた植物体において OmPHYA の発現量が増加していた．OmPHYA の C 末端に sGFP を融合させたタンパク質をシロイヌナズナのプロトプラストで一過性に発現させたところ，暗所では細胞質に局在していた OmPHYA:sGFP が遠赤色光下では葉緑体に局在することが示された．

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双子葉植物の芽生えは暗黒では、胚軸先端が釣り針状に曲がりフックを形成しているが、光が当たるとフックは開いて胚軸は真直ぐに立ち上がるということが定説になっている。この光の作用は、赤色光(R)パルスによって引き起こされ、遠赤色光(FR)パルスによって打ち消されるフィトクロムlow-fluence-response (LFR)として、主としてエンドウ芽生えを用いた実験で広く知られてきた。しかし我々は、トマトの暗黒芽生えに、RあるいはFRのいずれを与えても、完全暗黒においた芽生えに比べ、フックが巻き込む（更に内側に曲がる）ことを見出した。同様の反応は、パセリ、ニンジン、キュウリでも認められた。特にトマトとパセリでは、FRパルス単独照射が、Rパルスと同程度の巻き込みを引き起こした。トマトのphyA欠損mutantでは、FRの効果が無くなることから、フィトクロムvery-low-fluence-response (VLFR)が重要な役割を果たしていると考えられる。一方、シロイヌナズナ、キャベツ、ナバナ（いずれもアブラナ科）ではR、FRのいずれもフックを開かせることが確認され、シロイヌナズナでは、顕著なVLFRが認められた。フィトクロムのVLFRとLFRによるフック巻き込みを、開く反応と対比し解析する。

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我々はこれまでにcDNAマイクロアレイ解析により，シロイヌナズナの根において暗所で発現量の増加する遺伝子群を特定している．これらの遺伝子の多くは暗処理に続く遠赤色光(FR)照射に応答して発現量が減少する．この遺伝子群には6つの水チャネルタンパク質 (AtTIP1;1, AtTIP1;2, AtTIP2;1, AtTIP2;2, AtPIP1;2, AtPIP2;3) 遺伝子が含まれていた¹⁾．
これらの水チャネル遺伝子のFR応答機構を調べるために，まず暗順応処理およびそれに続くFR連続照射を行ったシロイヌナズナ（Ler）の根において，AtTIP2;2の発現量の経時変化を追跡した．その結果，FR照射1時間でmRNA量の顕著な減少が見られ，その後増加に転じる事が分かった．このmRNA量の変化が水チャネルタンパク質の発現量に対応しているのならば，シロイヌナズナの根の水分動態もFR光に応答して変化している可能性がある．
現在，このFR光応答にかかわる光受容体を特定するためにフィトクロム変異体を用いたノザン解析を進めている．また，シロイヌナズナにおける水動態の経時的変化を解析するためにMRIを用いた研究を進めており，これらの結果も合わせて報告する．
¹⁾ Sato-Nara et al., 2003, Plant Cell Physiol. 44 suppl.: 150

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　植物の赤色光(R)/遠赤色光(FR)光受容体であるフィトクロムは、フィトクロモビリン(PΦB)を発色団に持ち、様々な光応答に関わっている。我々は、フィトクロム発色団の構造と光生理応答との相関をin vivoで調べるため、PCBをフィトクロム発色団にもつ発色団改変植物体（以下PCYA1）を作出した。PCYA1由来のフィトクロムタンパク質は、野生型（WT）よりも短波長側にシフトした波長吸収特性を示し、暗所での蓄積量や光分解レベルがWTと変わらないことを前年度本大会で報告した。そこで、PCYA1について大型スペクトログラフの単色光を用いて主なフィトクロム応答を調べた。R、FRに対する高照射反応（R-HIR、FR-HIR）は、間歇照射による胚軸の伸長抑制により評価した。PCYA1は、695-720nm付近でFR-HIRを示し、波長吸収特性が短波長側へシフトした影響が顕著に観察された。一方、R-HIRでは、PCYA1は、WTと基本的に変わらない反応を示した。種子の発芽率を指標に観察した低光量反応（LFR）、超低光量反応（VLFR）においても、PCYA1はWTとほぼ同様の応答を示した。このことからPCBを発色団にもつフィトクロムは、基本的に全ての反応において機能すること、FR-HIRには吸収波長シフトの影響が顕著に現れることが明らかになった。

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　フィトクロムは赤／遠赤色光の光受容体であり、フィトクロムB (phyB)を欠損する変異体では胚軸の徒長、花成の早期化などの表現型が見られる。我々は組織ごとのphyBの働きを明らかにするためにシロイヌナズナのphyB欠損株において組織特異的にphyB－GFP融合タンパク質を発現する系統（PBT系統）を多数作出した(中村賢志 他、第41回植物生理学会)。
　PBT系統の花成時期を連続白色光下で調べた結果、子葉葉肉細胞でphyB－GFPを発現する系統では花成遅延が認められたが、維管束や他の組織でphyB-GFPを発現する系統では早咲き表現型の回復が見られなかった。phyB変異体では花成を正の方向に制御するFT遺伝子の発現が上昇することが知られている。（Pablo et al.， 2003)。そこで、PBT系統でFT遺伝子の発現を器官ごとに調べた。芽生えを、子葉、茎頂部、胚軸と根の両方を含む部分に切り分け発現解析を行った結果、子葉葉肉細胞phyB-GFPは子葉におけるFT遺伝子の発現を抑制している事がわかった。ここで、FT遺伝子は主に維管束で発現することが知られている。(Takada et al., 2003)。そこで、葉肉細胞phyB-GFPにより子葉のどの組織でFT遺伝子の発現が抑制絵師されるのかを明らかにするため、LCM法やプロトプラストを用いた組織ごとの発現解析を試みている。

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フィトクロム反応は、超低光量反応（VLFR）、低光量反応（LFR）、遠赤色光誘導強光反応（FR-HIR）に分類することができる。典型的な光誘導性遺伝子であるLHCBは、これらの反応全てにおいて発現誘導を受けるが、個々の反応を引き起こしている情報伝達系に関する知見は乏しい。我々は、3量体Gタンパク質が光誘導性遺伝子発現制御においてフィトクロム下流の情報伝達に関わっているかを検証するため、このGタンパク質のαサブユニットに変異を持つイネdaikoku (d1)変異株を種々の光照射条件下で解析した。d1変異株では、光誘導性遺伝子の発現がVLFRとFR-HIRを誘導する条件下で有意に低下していた。一方LFRは、光誘導性遺伝子の発現レベルが明瞭な赤／遠赤色光可逆性を示すことから正常であると推測された。d1変異株における分光学的活性型フィトクロムの量は正常で、この変異株は光受容よりも情報伝達能に欠損があると解釈された。加えて、構成的に活性型のαサブユニット（Q223L）を発現した形質転換イネは、微弱な遠赤色光照射によって光誘導性遺伝子を有意に多く発現した。これらの結果を総合すると、3量体Gタンパク質αサブユニットは、フィトクロムA下流においてVLFRとFR-HIR反応の両方を誘導する情報伝達系の正の制御因子として機能している可能性を示している。

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　ランソウにはフィトクロム（類似）遺伝子が存在し、細胞内でタンパク質として発現していることが確認されている。遺伝子破壊株の観察より、そのいくつかは走光性の光受容体として働いていることが示唆されている。しかし多くのフィトクロム（類似）遺伝子のランソウ細胞内での機能については未だ明らかではない。
　2002年に全ゲノム配列が公開された好熱性ランソウThermosynechococcus elongatus BP-1のフィトクロム候補は、データベース（CyanoBase）ではtll0569、tll0899、tlr0911、tlr0924、tlr1999の5ORFがあげられている。しかし、この候補の中に高等植物フィトクロムとドメイン構造が類似しているものはなかった。tll0569遺伝子(SepixJ)は、Synechocystis sp. PCC6803で正の走光性の光受容体として報告されているpixJ1（sll0041）と相同性が非常に高く、pixJ1と同様に近傍遺伝子とクラスターを形成している。また、金コロイド抗体法によりこの遺伝子から造られるタンパク質は桿状ランソウ細胞内の両端の細胞膜に局在していることも明らかになっており、光受容体として働いているのではないかと推察されている。
　本研究ではTll0569タンパク質を発色団共発現型大腸菌で発現し、その機能について解析した。また遺伝子破壊株の走光性の観察からランソウ細胞内での機能について、他のフィトクロム候補遺伝子の結果も交えて報告する予定である。

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単細胞性のシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803は線毛によって運動し、光源へ向かう正の走光性、または遠ざかる負の走光性を示す。pixJ1 （gene ID: sll0041 in Cyanobase）は正の走光性に必須であり、フィトクロムの色素結合領域に保存されたGAFドメインをもつことから正の走光性の光受容体であると考えられた。PixJ1をSynechocystisから精製した結果、開環テトラピロールが色素として共有結合していることを見いだし、昨年度の本大会で報告した。精製したPixJ1は青色光（435 nm）と緑色光（535 nm）に最大吸収をもつ可逆的光変換を示し、暗所では青色光吸収型が安定であった。植物のフィトクロムは開環テトラピロールを結合し、赤色光吸収型（P_r）と遠赤色光吸収型 (P_fr) の光変換を示す特徴が知られている。近年、光合成能の有無に関わらず、多くのバクテリアのゲノムから、フィトクロム様の遺伝子が見いだされており、P_rとP_frの光変換も報告されている。SynechocystisのフィトクロムCph1はphycocyanobilinを色素として結合するが、その最大吸収は656 nm（P_r）と705 nm (P_fr)であることから、phycocyanobilinがPixJ1に結合する可能性は低い。そこで、開環テトラピロールの生合成にかかわると考えられる遺伝子をSynechocystisのゲノム上で探索し、複数の候補遺伝子を得た。それらの遺伝子破壊株の合成するタンパク質について報告する。

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シアノバクテリアThermosynechococcus elongatus BP-1由来のTll0078タンパク質は発色団としてflavin adenine dinucleotide (FAD)を結合している。このタンパク質を大腸菌で発現し精製した標品は室温・暗順応条件下で467 nm, 438 nm, 383 nmの吸収極大を持ち、青色光照射(405 nm, 11 mW)により、それぞれ479 nm, 448 nm, 389 nmにシフトする。このFADによる吸収変化は可逆的で、室温では半減期6.7秒で回復する。この反応機構を吸収変化、蛍光寿命、励起後10ナノ秒から400ミリ秒の過渡吸収変化の測定により解析した。青色光照射により約30%の量子効率で反応が進む。1分以上の青色光照射ではタンパク質の凝集が生じる。これらの結果に基づきFADとタンパクの分子構造の変化を検討した。

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BLUFはフラビンを色素としてもつ光受容体の中で、クリプトクロム及びフォトトロピンに次ぐ3番目の例として見つけられた紅色細菌のAppA又はミドリムシのPACタンパク質に見られる新規のFAD結合ドメインである。ゲノム配列データよりこのドメインは18生物種、30種のタンパク質より見出されている。今回我々は全長BLUFタンパク質の光照射に伴う色素及びタンパク質の構造変化を調べる目的で、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のSlr1694タンパク質の光化学的性質を赤外、紫外可視光及びNMR分光法により調べた。その結果、1）AppA同様フラビンの吸収が長波長シフトする光反応サイクルが見られること、2）光照射に伴いフラビン環C(4)=OとC(2)=Oの伸縮運動が減少し、タンパク質骨格由来の分子振動変化が観測されること、3）AppA同様フラビン環はπ結合を介してアミノ酸側鎖と相互作用していることがわかった。これらのことから、1）Slr1694は光反応サイクルに伴い構造変化を起こすこと、2）光反応中アミノ酸側鎖又はタンパク質骨格とフラビン環O(=C4)及びO(=C2)との新たな水素結合が形成されること、3）その反応にはチロシンとフラビンのπ結合を介した相互作用が重要であることがわかった。この光反応は全てのBLUFドメインに保存されていると考えられる。

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Illumination of Slr1694 protein, which has a novel FAD binding fold BLUF induced the changes in UV-Vis absorption , protein structure and FAD isoalloxazine ring at C4=O, C2=O, N1C10a and C4aN5 bonding. Furthermore, illumination induced changes in the state of weakly hydrogen bonded water molecules. The UV-Vis absorption change was normally induced when water content of the sample was reduced despite of somewhat reduced extent. Surprisingly, the structural changes of the protein, the FAD ring and water molecules disappeared at this condition with the exception of the change of FAD ring at C4=O, which was insensitive to reducing water content. Similar tendency was observed at lowering temperatures (- 30 C). The results indicate that the light-induced absorption change of FAD chromophore can be easily decoupled with the other light-induced structural changes, presumably due to disorder of water-involved hydrogen bonding networks in the protein.

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SULTR1;1とSULTR1;2はシロイヌナズナの根の表皮と皮層で発現する高親和型硫酸イオントランスポーター遺伝子である。SULTR1;2はSULTR1;1よりmRNA発現量が高いが、両遺伝子とも硫黄欠乏に応答しmRNA発現が誘導される。SULTR1;1とSULTR1;2のT-DNA挿入二重変異体は、低濃度の硫酸イオンを吸収できず生育が顕著に阻害された。SULTR1;1 T-DNA挿入変異体の硫酸イオン吸収活性は、高硫酸条件では野生型植物と同程度だが、低硫酸条件では野生型植物の約60％であった。SULTR1;2 T-DNA挿入変異体では、高硫酸・低硫酸条件の両方で硫酸イオン吸収量が野生型植物の約25％に減少した。よって、高硫酸条件では主にSULTR1;2が硫酸イオン吸収を担うと考えられる。また、低硫酸条件でSULTR1;1 T-DNA挿入変異体とSULTR1;2 T-DNA挿入変異体の硫酸イオン吸収活性の和が野生型の活性より低いことから、硫黄欠乏時にはSULTR1;1とSULTR1;2が相乗的に機能し、根における硫酸イオン吸収を効率的に仲介すると予想される。

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We previously reported that pumpkin phloem RNA-binding proteins, CmPP16-1 and CmPP16-2, have distinctive direction-selectivity in their long-distance movement (LDM) in the rice sieve tube. We are currently interested in elucidating the mechanisms controlling the selectivity. By using stylet-assisted introduction (MUSI) method, GFP was co-introduced with probe protein as an internal standard. Given that GFP represents the bulk flow transport, a comparative analysis of GFP and CmPP16s indicates that CmPP16 proteins are not just passively carried by the phloem bulk flow. Comparison of various CmPP16 preparations (with whole phloem proteins, purified native protein, or recombinant protein alone) implies the presence of *LDM factors* in the pumpkin phloem sap that help the selective LDM of CmPP16s, and the presence of amino acid sequence necessary for LDM. Analysis of arabidopsis expressing CmPP16s-GFP in the phloem implied that post-phloem movement is a part of control mechanisms of selective LDM.

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種々の二価金属元素の過剰により鉄が十分に供給されているにも関わらず鉄欠乏症状を呈すること（誘導製鉄欠乏）や、逆に鉄欠乏時に鉄以外の二価金属元素が過剰に吸収される現象が知られている。これらの現象は、鉄吸収に関与するトランスポーターが鉄以外の元素を吸収するために生じると考えられるが、誘導性鉄欠乏がどの元素によってどの程度誘導されるのか、またそのメカニズムについてなど、詳細は明らかになっていない。一方、Ids2 (Iron-deficiency specific clone)は、オオムギから単離した鉄欠乏応答性の遺伝子で、ムギネ酸生合成（デオキシムギネ酸の水酸化）に関与する酵素をコードしている。Ids2はネイティブホストのオオムギのみならず、鉄欠乏応答の仕組みが異なる（ムギネ酸を合成しない）タバコなど異種植物においても鉄欠乏時だけに根においてのみ発現し、その発現は遺伝子のプロモーター領域の特定の配列によって制御されている。また、このプロモーター領域をGUSレポーター遺伝子と連結したシステムによって、タバコにおける鉄欠乏状態の分子レベルでのモニタリングが可能であることが示されている。そこで我々は、誘導性鉄欠乏のメカニズム解明の一環として、このシステムを用いて各々の二価金属元素の過剰がどの程度誘導性鉄欠乏を惹起しているかGUSの活性値として相対化を試みた。本報告では、その結果について他の生理学的指標とともに議論する。

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　ホウ素は植物に欠乏害と過剰害の両方を引き起こしやすい必須栄養元素である。シロイヌナズナBOR1は、導管への積極的なホウ素輸送を行う排出型ホウ素トランスポーターであり、低ホウ素条件下に地上部のホウ素濃度を十分に保つ役割をもつ。本研究では、BOR1のホウ素栄養条件による制御を活性、タンパク質蓄積、RNA蓄積の各レベルで解析した。
　低ホウ素条件およびホウ素十分条件で前処理した植物についてホウ素安定同位体を用いたトレーサー実験を行ったところ、BOR1による導管へのホウ素輸送は、低ホウ素条件により誘導されることが明らかになった。しかし、定量的RT-PCR解析の結果、BOR1 mRNAの蓄積量にはホウ素栄養条件による大きな影響はみられなかった。一方、35Sプロモーター制御下でBOR1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換植物においてwestern解析を行ったところ、BOR1-GFPタンパク質の蓄積量は低ホウ素条件下で増加し、ホウ素十分条件下で減少した。
　以上より、BOR1はホウ素栄養状態によって翻訳時あるいは翻訳後に制御されていることを示した。植物は、低ホウ素条件下にBOR1を発現させ地上部のホウ素欠乏害を防ぎ、ホウ素十分条件下にはBOR1の発現を抑えホウ素の過剰な蓄積を防いでいると考えられる。

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　BOR1はシロイヌナズナより単離された排出型ホウ素トランスポーターである。シロイヌナズナのゲノムには6つのBOR1相同遺伝子が存在するが、このうち、最も相同性の高い（推定アミノ酸配列が91％一致）At3g62270の解析を行った。
　まず、At3g62270のホウ素輸送活性を検証した。At3g62270のcDNAを発現する酵母をホウ素を含む培地で培養したところ、対照と比較して菌体内水溶性ホウ素濃度が低下した。At3g62270がBOR1と同様にホウ素の細胞外への排出能を持つことが示唆された。
　次に、At3g62270にT-DNA挿入のある遺伝子破壊株の生理解析を行った。ホウ素濃度0.3μMの低ホウ素培地で破壊株を成育させたところ、野生型株と比較して根の伸長阻害、地上部新鮮重の低下、地上部ホウ素濃度の低下が観察された。表現型はBOR1破壊株より弱かった。さらに、BOR1とAt3g62270の両方の遺伝子が破壊された株を作成したところ、いずれの単一の破壊株よりも根と地上部の双方で深刻な生長抑制が観察された。一方、培地ホウ素濃度30μMのホウ素十分条件では、これらの遺伝子破壊株の生育には野生型株との違いは見られなかった。
　以上より、At3g62270は低ホウ素栄養条件下で働くホウ素トランスポーターであり、ホウ素輸送の過程でBOR1とは異なる役割を担っていると考えられる。

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Silicon is taken up by rice in the form of a non-charged molecule, silicic acid (H₄SiO₄). However, the form of Si for translocation in the xylem is unknown. The loading process of Si into the xylem was characterized and the translocation form of Si was identified by using ²⁹Si-NMR. When rice (cv. Oochikara) was exposed to a solution containing 0.5mM Si, the Si concentration in xylem reached as high as 6mM after only 30 min. Kinetic study showed that loading of Si into the xylem was mediated by a kind of transporter (Km 0.33mM). Only one signal at chemical shift of -72ppm was observed in the xylem sap, indicating that Si is translocated in the form of monosilicic acid. Si concentration in the xylem sap in vitro decreased with time to a certain level (2.6mM), suggesting that the existence of monosilicic acid at high concentration in the xylem is transient.

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Rice accumulates very high amounts of Si in shoots. Si may reach levels of up to 10% of shoot dry weight, however, mechanism involved in Si uptake are not well understood. The shoot Si content was similar between two rice cultivars, Nipponbare and Kasalath, but the Si uptake ability was lower in Kasalath. Kinetics study showed that Nipponbare and Kasalath had a similar Km value, whereas the Vmax was higher in Nipponbare. These results suggest that the same transporter for Si is present in Nipponbare and Kasalath, but that this transporter is more abundant in Nipponbare. A QTL analysis for Si uptake was performed in rice using 98 BILs derived from parents Nipponbare and Kasalath. Three QTL for Si uptake were detected on chromosomes 3, 5 and 9. These QTLs explained 47.1% of phenotypic variations in Si uptake. The confirmations of these QTLs are being undertaken by using substitution lines.

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Rice is a typical Si accumulating plant, however, the mechanism responsible for the high Si uptake by the roots is poorly understood. To understand the molecular mechanism of Si uptake, a rice mutant having low Si content has been isolated (Ma et al 2002). In the present study, further characterization of this mutant was undertaken. The concentration of Si in the xylem sap was much higher in the WT than in the mutant, but that in the root symplastic solution was similar between WT and the mutant. These results suggest that this mutant is defective in loading Si into xylem rather than Si uptake itself. To map the responsible gene, a bulked segregant analysis was performed by using both microsatellite and EST-PCR markers. As a result, the gene was mapped to the chromosome 2. Fine mapping of this gene is being undertaken.

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耐塩性のヨシ（Phragmites communis）は根から吸収したNa⁺を茎基部で根に転流させ、Na⁺の地上部移行割合を低く抑える。当研究室では「根分け実験」により、ヨシではNaCl処理した根から無処理の根へNa⁺が移行するがイネではそのような現象は観察されないことを明らかにした。また部位別のNa⁺含量を測定することにより、転流は根と茎の境界から茎側1cm以内で起こることを示した。今回演者らはヨシ茎基部においてNa⁺転流を行うNa⁺トランスポーター遺伝子の有力な候補を得たので報告する。まず現在までに知られているNa⁺を輸送することができるトランスポーターの遺伝子から、イネの液胞膜上のNa⁺/H⁺アンチポーターであるOsNHX1と、シロイヌナズナの原形質膜上のNa⁺/H⁺アンチポーターであるSOS1を選定した。それぞれの遺伝子について相同性検索の結果からよく保存されている配列を選びPCRプライマーとした。ヨシ幼植物から合成したcDNAに対してPCRを行い、PCR産物の塩基配列を決定した。得られたOsNHX1様遺伝子断片とSOS1様遺伝子断片をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行ったところ、OsNHX1様遺伝子の発現はヨシ茎基部でNaCl処理により誘導されていた。一方SOS1様遺伝子の発現は全体に弱く茎基部よりも上部ではNaCl処理により誘導された。現在イネでの発現パターンと比較しながらさらに解析を行っている。

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　前大会で我々はアサガオ（Pharbitis nil cv. Violet）におけるアポプラスト液（AP）の糖組成を報告した。サンプルのAP液はプレッシャーチェンバーを用いて0MPaと1MPaで加圧採取し、更に同一個体でシンプラスト（SY）を採取した。AP液を加水分解した後、アセチル化を行ないGC分析をすると、少量のFuc、Ara、Xyl、Man、Galと比較的多量のRha、Glcが含まれていた。それらの糖のうち特に GlcとRha、AraとGalがそれぞれ1：1の割合で存在していた。さらに、1MPaのサンプルではこの2組の糖は経時的にリズム変動をしていたため、この2組の糖が何の物質に由来するのか同定をした。加水分解によって得られたAra、Galはペクチンやアラビノガラクタンタンパク質（AGP）由来のものと考えられる。そこで、β-グルコシル-ヤリフ試薬を用いてAP液のAGP濃度を調べた。その結果、0 MPa、1 MPa、SYでそれぞれ0.27、0.04、0.31mg/mlであった。これは加水分解してGC分析で得られた遊離のAraとGal濃度にほぼ相当しており、AP中のAra、Galの大部分はAGP由来であることが示唆された。一方、RhaとGlcは1：1で結合するとルチノースになる。このような糖をもつ配糖体がアサガオのAPを流れていることが考えられ、現在同定中である。

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無機イオンは根から取り込まれ、アポプラスト(AP)を通って輸送される。輸送された無機イオンは到達した器官で、光合成、細胞伸長などをはじめとする様々な生理作用に関与している。このことはAPに含まれる無機イオンの変動を調べることが、植物の生長制御を理解する上で重要な意味をもつことを示している。野崎ら(2003)が開発したプレッシャーチェンバー法によってAP液を採取し無機イオンの経時的変動を調べた。材料にはアサガオ(Pharbitis nil cv. Violet)を用いた。芽生えを下胚軸で切り、根（R）および子葉（C）のついた側の切り口から浸出してくる液を0MPaのAP液(R0、C0)としてそれぞれ採取した。その後、プレッシャーチェンバーで根には0.5MPa、子葉には1MPaの圧力をかけAP液（R0.5、C1）を採取した。イオンクロマトグラフィーでイオンの測定をした。まず平均的なイオンの組成を調べた。C0に含まれる多くのイオンの濃度がR0よりも約2倍高かった。しかし圧力をかけたAP液を比較すると、C1よりもR0.5の方が濃かった。また根側のAP液にはNO3^－は検出できたが、子葉側のほうでは検出されなかった。次に子葉側のAP液の陽イオンの経時的変動を調べた。C0ではSD処理をするとCa²⁺の濃度がSD処理をしないときよりも高くなった。またC1のK⁺、Mg²⁺、Ca²⁺では周期性が見られた

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植物茎内における微量の水吸収速度を定量するため、植物体を非破壊に解析するための装置を開発した。水のトレーサーとして、ポジトロン放出核種¹⁵O(半減期122秒)を用いた（以下、[¹⁵O]water）。
定量性を得るために、擬似的な茎を線源として作成しキャリブレーションを行った。また、検出器で測定後の植物茎を切り出し、含まれる[¹⁵O]waterを定量する実験を行い、定量性を再確認した。
次に、播種後約3週間目のダイズの根から[¹⁵O]waterを吸収させ、上胚軸1cm部分における[¹⁵O]water 量の変化を測定したところ、5分後以降線形的な増加が示された。吸収開始15分後の[¹⁵O]water量は約15 μlであった。当初の予想では、導管内が[¹⁵O]waterで満たされた時点で、[¹⁵O]water量はプラトーに達すると思われた。そこで、検出部位の導管体積を測定したところ、2.1±0.3 μlであった。よって、線形的な増加が始まる5分後までには導管内が[¹⁵O]waterで満たされ、その後周囲組織へ漏出している可能性が示唆された。この導管漏出流は水平方向の流れであり、茎からの蒸散（蒸発）を補っている可能性が確認された。実際に植物全体の茎をワセリンでカバーしたところ、植物全体の蒸散量は約3/4に減少した。

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AP2/EREBPファミリーは植物における転写因子としては最大のグループであり、その機能は多岐にわたる。我々の研究室では、本ファミリーに属するAtEBP (Arabidopsis thaliana ethylene-responsive element binding protein)遺伝子を酵母の機能的スクリーニングにより単離した（Pan et al., 2001）。本研究では、植物におけるAtEBPの転写因子としての機能を解析し、新知見を得たので報告する。
まず、AtEBPの細胞内局在を明らかにするため、GFPを用いた解析の結果、AtEBPタンパク質は核に局在することが明らかになった。次にAtEBP過剰発現タバコと、GCCボックスを含むプロモーター配列にGUS遺伝子を連結したキメラ遺伝子を有するタバコとを交配し、後代を得た。この幼植物体を用いてGUS活性を測定したところ、AtEBPはGCCボックスを介した転写活性化能を有することが示された。また、AtEBP過剰発現シロイヌナズナを用いたノーザン解析の結果、PDF1.2遺伝子などの防御遺伝子の発現量が増加した。
エチレンシグナル伝達経路におけるAtEBPの位置を明らかにするため、エチレン関連突然変異体を用いてノーザン解析をおこなった。その結果、AtEBPはERF1とは異なる経路に位置することを明らかにした。

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植物ホルモンであるエチレンによって誘導される様々なpathogenesis-related （PR） タンパク質の発現制御は、これらをコードする遺伝子の転写調節領域に存在するGCC boxによって行われている。このGCC boxと結合する転写因子として単離されたERFs（Ethylene-responsive transcription factors）はERF domainを介してGCC boxに結合し、標的遺伝子の発現調節を行っていると考えられている。
現在タバコには4つのERFが存在することが明らかとなっており、ERF1/2/4はアクチベーター、ERF3はリプレッサーとして機能していると考えられている。しかし、エチレンなどを介した外界からのシグナル伝達において、これら4つのERFがどのように相互作用し、PR遺伝子を含む内在遺伝子の発現をどのように調節しているかは明らかとなっていない。本研究ではこれらERF遺伝子の発現をRNAi法により個別に抑制した形質転換体を作製し、このシグナルネットワークを解明することを試みた。
まず各ERFに特異的な部分配列を選定し、その逆向き繰り返し配列を発現するRNAiベクターを作製した。次いで各々のRNAiベクターをタバコに導入し、ERF3, ERF4の発現が抑制された形質転換タバコを得た。現在、これらの植物におけるERF並びにPR遺伝子発現の詳細な解析を行っている。

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植物がオゾンに暴露されると、体内で活性酸素を生じ、障害を引き起こすことが知られているが、詳細な機構は未解明である。我々はオゾン感受性シロイヌナズナ突然変異体を用いて植物の環境ストレス応答機構の解明を目指している。これまでに、オゾン感受性突然変異体oji1で、ジャスモン酸に低感受性であるためにオゾン暴露時におけるエチレン生成量が多いことから、オゾンによる傷害に深く関与するエチレンの生合成が、傷害の防御に働くと考えられるジャスモン酸によって抑制されていることを明らかにした。また、0.2 ppmオゾン暴露時のジャスモン酸含量は、4 時間で野生型、oji1共に最大値を示したが、oji1は野生型よりもその値がかなり高いことがわかった。一方、オゾン暴露時に誘導され、傷害を促進するといわれているサリチル酸を測定した結果、オゾン暴露時のサリチル酸含量はoji1と野生型で共に上昇したが、顕著な差は見られなかった。また、サリチル酸誘導性遺伝子 (AtPR-1) の発現量は、オゾン暴露開始後12 時間までは、野生型とoji1で差は見られなかった。これらの結果、及びoji1と野生型のマイクロアレイによるオゾン暴露時の網羅的遺伝子発現解析の結果を合わせ、オゾンによる傷害発現におけるジャスモン酸シグナル経路について、サリチル酸・エチレンとの相互作用を中心に考察する。

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RSGはジベレリン(GA)内生量調節に関与しているbZIP型転写因子である。RSGと相互作用するタンパク質の一つは14-3-3タンパク質であり、14-3-3タンパク質はRSGの細胞内局在を制御していた。14-3-3タンパク質は主にリン酸化されたセリン残基を認識して結合し、標的タンパク質の機能を制御している。RSGの114番目のセリン残基が14-3-3タンパク質との相互作用に必須であり、そのセリン残基のリン酸化にCa²⁺依存性プロテインキナーゼ（CDPK）が関与していることを前回の学会で報告した（2003年度日本植物生理学会年会）。
　本大会ではRSGとCDPKのin vivoにおける相互作用に関する解析を報告する。我々は in vivo 相互作用解析のためアグロインフィルタレーション法により Nicotiana benthamiana 葉身に発現プラスミドを導入する一過的発現系を用いた。GST融合RSGを一過的に発現させ抗GST抗体で免疫沈降を行い、沈降物中のCDPK活性を組み換えGST-RSGを基質にしたin-gel キナーゼアッセイにより調べた。その結果GST-RSGと共沈した画分にRSGのSer114残基をリン酸化するCDPK活性が検出され、RSGとCDPKの in vivo における結合が示された。またリン酸化RSGと同様にCDPK自身も14-3-3タンパク質と結合することを見出した。

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植物は病原菌の感染を認識すると、様々な抵抗性反応を誘導する。イネ液体培養細胞においても、イモチ病菌由来のキチンオリゴマーやセレブロシドなどのエリシターによってジテルペン型ファイトアレキシンの生産をはじめとする種々の抵抗性反応を示すことが知られている。我々は、イネの EST に対するマイクロアレイ解析から少なくとも2種類のキチンエリシター応答性 WRKY 型転写因子（OsSPF1, OsABF2 ）が存在していることを明らかにしてきた。WRKY 型転写因子は、エリシター及びサリチル酸応答性遺伝子の応答配列（W-box）に特異的に結合する転写因子であり、防御関連遺伝子の発現制御に重要な役割を果たすことが知られている。推定アミノ酸配列の解析の結果、OsSPF1 は WRKY ドメインを2個持つグループI、OsABF2 はCys₂His₂ 型WRKY ドメインを1個持つグループIIに属していた。ノーザン解析の結果、OsSPF1, OsABF2 の mRNA レベルはともにキチンエリシター処理によって15分以内に増加し始め、30分間ほどでピークとなり、以後漸減することが示された。また、イモチ病菌を接種した植物体、セレブロシド処理した培養細胞でも発現が認められ、OsSPF1、OsABF2 は病原菌感染のシグナル伝達に関与していることが強く示唆された。現在、OsSPF1, OsABF2 の標的遺伝子についても追求している。

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アラビドプシスのARR1 (Arabidopsis response regulator 1)遺伝子は、His-Aspリン酸リレー系によるサイトカイニンシグナルに応答し初発応答遺伝子の転写を活性化する転写因子であり、5'-(G/A)GAT(T/C)-3'という塩基配列をもつDNAに特異的に結合することが知られている。
我々は、サイトカイニンによって発現が誘導される遺伝子のプロモーターの配列構造がどのようにサイトカイニン応答性と関与しているのかを調べた。まず、サイトカイニンに応答する遺伝子の中でARR1により転写活性化を受けるものを決定するために、11種のAタイプARR及びサイトカイニンにより早期にmRNAレベルが増加する遺伝子について、ARR1の転写活性能を人為的に誘導できる形質転換体を用いてノーザンブロット解析を行った。その結果サイトカイニンに対する応答がARR1を介すると判明した遺伝子に対して、上流の塩基配列を解析し、ARR1による転写活性化に必要なプロモーターの配列構造を検討する。

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Two cDNAs encoding phosphatidylinositol-specific phospholipase C, PpPLC1 and PpPLC2, were isolated from Physcomitrella patens. The N domain identified in Arabidopsis PI-PLCs as an EF hand-like domain was found in both isoforms, although that in PpPLC2 was a split type. PpPLC1 preferentially hydrolyzed phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at micromolar Ca²⁺ concentrations, while hydrolyzed phosphatidylinositol at millimolar Ca²⁺ concentration. Thus, PpPLC1 and PpPLC2 are typical and novel types of plant PI-PLC, respectively. Moreover, knock-out mutants of the PpPLC1 gene showed 1) an yellowish color by the reduction of chlorophyll contents, 2) an altered response to gravity, and 3) a reduction of cytokinin-induced gametophore formation. Since PpPLC1-GFP fusion protein localized at plasma membranes in protonemal tip cells, PpPLC1 is likely involved in the early stage of gravitropic response and cytokinin signaling. Our results imply new roles of plant PI-PLC in the regulation of chlorophyll contents, gravitropism and cytokinin-induced differentiation of gamethophore.

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ABA応答性を示すコムギEm遺伝子プロモーターはヒメツリガネゴケ (Physcomitrella patens) においてもABA依存的に転写活性を増大する。我々はヒメツリガネゴケからシロイヌナズナABI3、あるいはトウモロコシにおける相同遺伝子VP1 (以下ABI3/VP1)と相同性を示すタンパク質(PpABI3)遺伝子を同定した。PpABI3はABI3/VP1の保存領域B1, B2およびB3ドメインを有し、このうちB3ドメインではABI3/VP1とアミノ酸レベルで60％以上という高い相同性を示したが、B1およびB2ドメインにおける相同性はB3ドメインに比べて低く、高等植物ABI3/VP1相同タンパク質間で絶対的に保存されているアミノ酸においても置換が見られた。
オオムギ糊粉層を用いた一過的発現系では、ABI3/VP1とbZIP型転写因子であるオオムギABI5 (HvABI5)の共発現はABA非存在下におけるEmプロモーターの転写活性化に十分であった。PpABI3とHvABI5の共発現も、その効果はABI3/VP1に比べて小さいものの、ABA非存在下で転写活性を増大した。一方、ヒメツリガネゴケ原糸体における一過的発現系では、ABI3/VP1およびPpABI3は単独でABA非存在化におけるEmプロモーターの転写を活性化したが、HvABI5との共発現実験ではABI3/VP1あるいはPpABI3いずれの組み合わせにおいても転写活性を低下させた。以上の結果から、コケおよび高等植物においてPpABI3とABI3/VP1は部分的ながらも機能的に相補できるが、ABI5は高等植物固有の因子であると考えられた。

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Only a few signal transduction components have been identified from recessive ABA insensitive disruption mutants, most likely due to redundancy in genes encoding ABA signaling components. To dissect redundant signal transduction genes, we have developed an alternative "single cell-type genomics" approach.
Reactive oxygen species (ROS) have been proposed to function as second messengers in ABA signaling in guard cells. However, the molecular mechanisms mediating ROS production remain unknown. Double knockout mutation of the Arabidopsis guard cell-expressed NADPH oxidases impairs ABA-induced stomatal closing, ROS production and cytosolic Ca²⁺ increases in guard cells and ABA-activation of plasma membrane Ca²⁺ channels. ABA promotes superoxide production in wildtype guard cell protoplasts, but not in the mutant. These data suggest that the ROS produced by NADPH oxidases function as second messengers in guard cell ABA signal transduction. Furthermore new data on analyzing roles of ROS generation and scavenging in guard cell will be presented.

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