三回の繰り返し構造をMybドメインに持つ動物型のMyb (3Rmyb)は、タバコではサイクリンBのG2/M期特異的転写を規定するシスエレメントに結合し、転写活性を調節する。これらには転写活性化因子として働くNtmybA1およびNtmybA2、転写抑制因子として働くNtmybBがあり、競合的に転写活性を制御することをこれまでに報告している。シロイヌナズナのゲノムには3Rmybをコードする遺伝子が5個あり（MYB3R-1からMYB3R-5）、それらのT-DNA挿入破壊株の解析を進めている。各々単独の破壊では明瞭な表現型が見られなかったため、いろいろな組み合わせでかけあわせることにより二重破壊株を作成した。そのうち転写活性化因子として働くタバコのNtmybA1, NtmybA2に構造的によく似た二つの遺伝子（MYB3R-1とMYB3R-4）の破壊により、サイトキネシスの欠損に起因すると考えられる以下のような表現型が得られた。(1) 孔辺母細胞の細胞質分裂の異常が原因と考えられる特徴的な気孔の形態異常が高頻度で認められ、(2) 表皮細胞においてギャップのある細胞壁や細胞壁の小断片、および多核化が観察された。細胞質分裂に必須なタバコのキネシン様タンパク質をコードするNACK1遺伝子が3Rmybの標的遺伝子であり、タバコにおいてG2/M期特異的に発現することを我々は既に報告しているが、今回観察されたシロイヌナズナの表現型はこれと符合するものである。

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サイクリンDは増殖シグナルのセンサーとして機能し、動物では活躍の場は主にG1期に限られる。シロイヌナズナでゲノム解読が完了した結果、サイクリンDは合計10種と動物の3種に比べ多数存在し、中には特徴的な機能の1つであるRbとの結合配列(LxCxE)を持たないものもある。現在までの解析からタバコサイクリンDはin vitroで G2期からM期に特異的に発現するCDKBと結合しその複合体が活性を持つ事が示され、サイクリンDがG2/M期移行も制御する可能性が示唆された。
サイクリンDの主要なターゲットはRbと考えられ、Rbにより転写因子E2Fが制御されている。タバコRbにはサイクリン/CDK推定リン酸化部位が13箇所存在し、低リン酸化状態でE2Fと結合して転写を抑制するが、高リン酸化状態ではE2Fから解離される。本研究ではG2期からM期に周期依存的に発現する2種のタバコサイクリンD3(CycD3;1a, CycD3;1b)と周期を通じて一定に発現しG1/S期移行に関与する事が示唆されているCycD3;3を特異的に認識するペプチド抗体を作製し、これを用いて各サイクリンDによりリン酸化されるRbのリン酸化部位の同定を行い、サイクリンDとその下流因子Rbとの関連を解析した。

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短日植物イネのHd6遺伝子は、長日条件での開花抑制能を持ち、カゼインキナーゼIIのαサブユニットをコードしている。カゼインキナーゼIIは他のモデル生物において概日時計の重要な因子であり、長日植物シロイヌナズナにおいては概日時計を介した開花制御が示唆されている。そこで機能欠損型Hd6アリルをもつイネ品種「日本晴」、と機能型Hd6を日本晴に導入した準同質遺伝子系統NIL (Hd6)を用いて、イネの概日時計関連遺伝子であるOsLHY、OsGIおよび光周性花成制御遺伝子Hd1の発現をリアルタイム定量PCRで解析した。長日条件下の播種後30日では、Hd6の機能有無による上記遺伝子の日周変動発現に有意な違いは観察されなかった。また、CAB1R::lucレポーター遺伝子を用いた幼苗での概日リズムにも有意な差はみられなかった。これらの結果はHd6によるイネの開花制御は概日時計の位相変化を介してはいないことを示唆している。一方、長日条件下での生育段階ごとの解析では、Hd6の有無により、花成スイッチ遺伝子であるイネFT相同遺伝子の発現に播種後50日目以降有意な差が見られた。同じサンプルで、OsGIやHd1の発現に差はなかった。Hd6はFT相同遺伝子の発現を抑制することによって開花をコントロールしていると考えられる。本発表では、上記の結果をふまえ、イネにおけるHd6の開花制御機構について考察する。

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短日植物であるイネにおいて光周性反応の分子機構を明らかにするために、イネFTホモログであるHd3a遺伝子の発現調節機構の解析を行った。イネFT遺伝子ファミリーに属するHd3a (FTのイネ相同性遺伝子) は短日条件下では発現が上昇し、長日条件下では発現が抑制される事が明らかとなっている。またこの遺伝子の発現調節には、Hd1 (COのイネ相同性遺伝子) が関与している。イネプロトプラストにおいてHd3a遺伝子のプロモーター領域にgus遺伝子を連結したキメラ遺伝子が、Hd1遺伝子の存在下では発現が抑制される事を明らかにした。このHd1による発現抑制は、他のFT遺伝子ファミリーであるFTLのプロモーター領域においても確認された。現在、Hd3aのプロモーター領域においてHd1が作用する領域を詳細に解析中である。次にFT遺伝子ファミリーのプロモーター領域にgusを連結したキメラ遺伝子を野生型および日長非依存的な早咲きを示すse5変異体に導入し、その発現部位を解析した。その結果Hd3a :: gusを導入した野生型ではGUSの発現部位が、葉身の維間束周辺に特異的に発現するが、se5変異体においては葉身における発現部位が維間束周辺のみでなく葉肉細胞においても観察される事が明らかとなった。

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　イネは開花遺伝子として、長日植物シロイヌナズナと同じ遺伝子であるOsGI、Hd1、Hd3a遺伝子(シロイヌナズナ：GI, CO, FT )を有していることが明らかになっており、我々はイネとシロイヌナズナの花芽誘導機構の違いを遺伝子レベルで説明した。本研究では、イネの光周性花芽誘導機構の解明に向けて開花関連遺伝子間の相互作用を解析するため、短日植物に特有な光中断による花成遅延現象を利用して発現解析を行った。光中断に関する生理学的な報告は複数の短日植物に見られるが分子生物学的な報告はこれまでに殆どない。
　播種1ヶ月後のイネに暗期の中央で2時間の光中断処理を一度行った結果、開花のスイッチとされるHd3a遺伝子の急激な発現抑制が見られた。また光中断によってCAB1R遺伝子の発現パターンが両処理条件において酷似していることから、CAB1Rを制御する概日リズムの位相変化が生じていないことが示唆された。次に光中断処理を暗期の前半と後半に処理したところ、Hd3aの強い発現抑制は観察されなかった。さらにフィトクロム経路に変異の生じたse5変異体に対して光中断処理を行ったところ、Hd3aの発現抑制は観察されなかった。この結果はフィトクロム経路が光中断によるHd3aの発現抑制に関係していることを示唆している。
本発表では光中断による解析結果から、現在までに得られた内在性のリズムと光の直接刺激の統合によるイネの花芽形成機構について考察する。
　

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　植物にとって光周性による開花制御は、生殖を成功させる上で非常に重要な戦略である。我々はこれまでに長日植物のシロイヌナズナと短日植物のイネが開花関連遺伝子として相同の遺伝子セットを持つが、一部の制御機構を逆転させることで、日長への反応を逆にしていることを報告した。
　我々はT-DNA挿入変異体のスクリーニングから、自然日長条件下で遅咲きになる変異体を単離した。この変異体の長日条件下と短日条件下における出穂時期を調査したところ、短日条件下では野生型と変わらず、播種後80日前後で出穂がみられたのに対し、長日条件下では野生型よりも50日前後遅く出穂が確認された。T-DNAはOsMADS50/OsSOC1遺伝子の第4イントロンに挿入しており、発現解析から遺伝子の発現が認められないnullの変異体であることが明らかになった。OsGI　・Hd1 ・Hd3aの発現を調査したところ、両条件下においてどの遺伝子の発現パターンも野生型と顕著な差は認められなかった。これらの結果と欠失変異体において短日条件で開花遅延の表現型が認められないことと考え合わせると、イネにおいてOsMADS50/OsSOC1は、OsGI ・Hd1 ・Hd3aを介した光周性の経路とは別の経路で機能しており、長日条件下でのイネの開花に関与している遺伝子であることが示唆された。本発表では、OsMADS50/OsSOC1の変異体を用いた解析から新規の開花シグナル経路の存在の可能性を報告する。

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AtC401は、アサガオにおいて花成誘導暗期特異的に発現する新規時計制御遺伝子PnC401のシロイヌナズナ相同遺伝子である。C401遺伝子は、高度に保存されたpentatricopeptide repeat（PPR）ドメインをもつタンパク質をコードするが、その機能は未知である。これまでに、我々はAtC401の発現が概日時計によって制御されることを明らかにしてきた。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc+）を用いたレポーター解析により、転写開始点下流の5’UTR配列が概日発現制御に関わることが示唆された。そこで、シロイヌナズナ培養細胞を用い、概日発現制御に関わるプロモーター領域の絞り込みを進めた。その結果、転写開始点下流の5’UTR 73 ntを含む断片86 ntは、概日発現制御に十分であることが明らかとなった。この断片は、TATA boxを含まず、TATA boxを介さない転写装置によってAtC401の転写が制御されることが強く示唆された。AtC401プロモーターは、転写開始点付近の保存配列Inr（YYANWYY; Y=C/T, W=A/T）と5’UTRに4回のGAKAA（K=T/G）リピート配列を含むため、AtC401の転写制御においては、Inrが基本プロモーターとして機能し、GAKAAリピートが概日発現制御に機能すると予想している。現在、この仮説の検証を進めており、併せて報告する予定である。

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絶対的短日植物であるアサガオの品種紫（Pharbitis nil cv. Violet）は、光周性花成誘導研究のモデル植物であり、播種後7日目の子葉の段階でも16時間の暗期を一回与えることにより花成を誘導できる。以前に我々は、蛍光ディファレンシャルディスプレイ（FDD）法を用い、花成誘導暗期特異的に発現が増加する遺伝子の単離を試み、青色光受容体Cryptochrome 1 (CRY1) のホモログであるPnCRY1 (Pharbitis nil Cryptochrome 1)を単離し、解析を進めていた。しかし、シロイヌナズナにおいては、青色光による花成促進にCRY2が主要な役割を果たすことが知られている。そこで今回我々は、CRY2 のホモログであるPnCRY2を単離し、解析を行った。PnCRY2の全長塩基配列を決定した結果、この遺伝子は653アミノ酸から成るタンパク質をコードし、推定アミノ酸配列はトマトとシロイヌナズナのCRY2と比較して、70%程度の高い相同性を示した。PnCRY2の発現はPnCRY1と同様、約24時間周期のサーカディアン発現変動を示し、光照射によってその発現は抑制された。PnCRY1, PnCRY2 の光による発現抑制は、青色光のみでなく、赤色光によっても観察されたことから、両遺伝子の発現制御にはフィトクロムが関与していることが示唆された。

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シロイヌナズナの概日リズムは、概日時計本体の因子であるLHY、CCA1、TOC1、GIなどが形成するフィードバックループによって生み出されていると考えられる。光周期に依存したシロイヌナズナの花成促進経路にも、概日リズムによる制御機構が深く関与している。我々は、多重変異体を用いた遺伝学的解析および発現解析を主な手法とし、概日リズムによる花成時期の制御機構の解明を目指している。短日条件下ではlhy cca1 二重機能欠損株は極端な早咲き形質を示す。今回我々は、この形質が主に、1）GI の発現の位相の前進、2）CO の発現位相の前進、3）FT の発現レベルの大幅な上昇によって引き起こされている可能性を提示した。また、このようにFT の発現は主にGI-CO-FT という転写のカスケードを介して概日リズムに制御されているのに対し、CO の下流でFT と並んで花成促進因子として働くと考えられるSOC1 は、各種多重変異体においてFT と異なる発現パターンを示し、GI 依存経路とGI 非依存経路の二つの経路を介して、概日時計からの制御を受けていることを見出した。今回は、SOC1 の発現制御機構の解析結果を中心に報告する。

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多くの生物で多様な生体機能が約24時間周期の内因性リズム（概日リズム）により調節されている。二つのMyb関連遺伝子、LHYとCCA1がシロイヌナズナの概日リズム制御系において中心的な役割を果たすことが明らかにされている。lhy cca1二重変異体では、連続明条件下での概日リズムが消失し、短日条件下では花芽形成期間が短縮される。最近我々は、lhy cca1二重変異体において花成促進因子FTの発現が上昇していることを見出した。今回我々は、lhy cca1二重変異またはGI過剰発現による花成促進効果が、co とfha/cry2それぞれの機能欠損により部分的に抑制されること、co fha/cry2二重変異によりさらに強く抑制されることを報告する。また、lhy cca1二重変異体またはGI過剰発現体における、FTの発現上昇に対するfha/cry2やco変異の効果について報告する。

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概日リズムは約24時間周期の生命活動の変動で、個体における時間生成機構としてバクテリアから植物、ヒトに至るまで普遍的に保存されている制御機構である。Myb様の転写因子をコードするLATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)とCIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1)は、シロイヌナズナの概日リズム制御系において中心的役割を果たしている。LHYを過剰発現する突然変異体lhy-1は長日条件下での花成遅延と胚軸伸長形質を持つ。我々は、lhy-1を親株として新たに変異を導入し、3つのLHY機能欠損変異体（lhy-11, 12, 13）を単離し、これらの花成期間が短日条件下で野生型よりも短くなることを明らかにしてきた。今回我々は、lhy-12の形質を抑制する突然変異体として新規lhyアリル（lhy-2）を単離した。lhy-2は長日条件下での花成遅延と胚軸伸長形質を持つ点でlhy-1と類似している。lhy-12ではLHY遺伝子の第5イントロンの末端部に一塩基置換が見られ、この変異によりLHYのスプライシング異常が引き起こされることを見出した。このLHYのスプライシング異常は、lhy-2で部分的に抑制されている可能性が考えられた。LHY遺伝子のスプライシング異常の程度と、その花成及び胚軸伸長への効果について報告する。

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We have recently proposed that LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) and CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) are essential components for circadian clock function and flowering time regulation in Arabidopsis. Over-expression of clock-associated genes such as LHY, CCA1 and LKP2 causes a dominant late flowering phenotype under LD. To isolate novel mutations which closely associated with clock function, we are screening Arabidopsis mutants similar to the gain-of function mutants of LHY, CCA1 and LKP2. Recently we have isolated such a mutant from one of our T-DNA tagged transgenic populations. We named it dll1 (dominant late flowering under long day 1). Consistent with the late flowering phenotype, expression level of a floral activator gene, FT, is significantly lowered in this mutant under LD. Details on genetic interactions between the dll1 and other flowering mutations will be reported.

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植物における光周性花成誘導は概日リズムと光によって制御されている。概日リズムはTOC1がポジティブにLHY/CCA1の発現を制御し、LHY/CCA1がTOC1の発現をネガティブに制御することを中心としたフィードバックループによって形成されていると考えられている。bHLH(basic Helix Loop Helix)型の転写因子PIF3（Phytochrome Interacting Factor 3）は1）TOC1と赤色光受容体ファイトクロムBの両者に結合すること、2）LHY、CCA1の両プロモーターのG-box領域に結合すること、3）赤色光条件下でLHY/CCA1の発現誘導に関わることから、概日リズムの光入力系の重要因子と考えられてきた。そこで我々は、PIF3発現抑制株における概日リズムの解析を試みた。PIF3アンチセンス植物体において概日リズムの中心因子をコードするLHY、CCA1、TOC1、GIは明暗周期下、連続明条件下でともに、発現量、周期、位相に変化が見られなかった。しかし、長日条件下においてPIF3アンチセンス植物体では有為な花成時期の短縮が見られ、花成促進因子CO、FTの遺伝子発現が上昇していた。以上の結果から、PIF3は概日リズム制御とは独立に、COとFTの発現制御に関わることで花成時期の決定に関与している可能性が考えられた。

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モデル植物シロイヌナズナを用いた概日時計分子メカニズムの解析が精力的に行なわれ、その全体像が明らかになりつつある。我々は、Arabidopsis pseudo response regulator(APRR)と名付けた5つの時計関連ファミリー遺伝子について、時計関連の機能に着目して解析を進めている。特にAPRR1は中心振動体構成因子TOC1と同一であり、残りのAPRRファミリー因子も時計機能に密接に関連していることが予想された。事実、各種APRR遺伝子のT-DNA挿入変異株や過剰発現植物体の解析から、APRR因子群が協調して概日リズム、花成制御、光応答形態形成などの時計関連の生理応答に深く関わっていることが明らかになりつつある。しかし、APRR3に関してはT-DNA挿入変異株や過剰発現植物体が困難なこともあり、遺伝学的な研究が遅れていた。今回、我々はAPRR3過剰発現植物体を取得してその表現型を解析した。その結果、赤色光への感受性の低下（胚軸伸長）、花成遅延、概日リズム周期の遅延といった顕著な表現型が認められた。これらのAPRR3過剰発現体の表現型はこれまでに報告してきた他のAPRR過剰発現体の表現型とは逆の傾向があり、APRR3が単独でユニークな時計関連機能を担っていることが強く示唆された。これらの結果と、他のARPPファミリー因子に関して既に得られている遺伝学的解析結果を総合しながら、シロイヌナズナの時計分子機構に関して考察する。

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モデル植物シロイヌナズナを用いた概日時計分子メカニズムの解析が精力的に行なわれ、その全体像が明らかになりつつある。我々は、Arabidopsis pseudo response regulator(APRR)と名付けた5つの時計関連ファミリー遺伝子について、時計関連の機能に着目して解析を進めている。特にAPRR1は中心振動体構成因子TOC1と同一であり、残りのAPRRファミリー因子も時計機能に密接に関連していることが予想された。事実、各種APRR遺伝子のT-DNA挿入変異株や過剰発現植物体の解析から、APRR因子群が協調して概日リズム、花成制御、光応答形態形成などの時計関連の生理応答に深く関わっていることが明らかになりつつある。しかし、APRR1/TOC1自身を含め、APRR因子群の具体的分子機能は不明である。この点を解析するアプローチの一つとして我々はAPRR1と相互作用する因子を検索し、Phytochrome Interacting Factor 3 (PIF3)を含むbHLH型転写因子ファミリーを同定した（PIL因子ファミリーと命名）。中でも特にPIF4、PIL6、PIL8の転写発現は概日リズムを示すことが分かり、時計機構との関連が示唆された。今回は、PIF4, PIL6, PIL8の過剰発現体を用いて光感受性・花成時期・概日リズムに関して解析した結果を報告しながら、これら新規に見いだされたbHLH転写因子の光情報伝達機構や概日時計機構との関わりについて考察する。

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生物時計は普遍的な生命機能であり、人からバクテリアまでを対象とした広範な研究が展開されている。光シグナルと密接に関連した時計機構は高等植物にとってこそ重要な生命機構であることは疑いない。この十年間のシロイヌナズナを対象とした時計研究により、分子レベルでの知見が多く蓄積してきた。しかし、これらの研究のほとんどは分子遺伝学的アプローチに依存している。しかし今回我々は、シロイヌナズナ培養細胞（T87系）を用いて、時計分子機構解析の新しい可能性を切り開いた。まず、今までの植物体を用いた研究から時計関連因子として同定されているCCA1転写因子や、APRR1/TOC1五重奏因子の転写は、T87細胞において自律的概日リズムを刻むことを明らかにした。次いで、CCA1::LUCやAPRRs::LUC遺伝子導入培養細胞系を用いて、概日リズムの簡便なリアルタイム測定系を確立した。これらを用いて測定したリズムは、生物時計の三大特性である“光シグナル同調性（entrainment）”、“自由継続性（free-running）”、“温度補償性”の全てにおいて期待される性質を示した。また、時計の属性を特徴付ける古典的PRC（位相応答曲線）の解析も可能であった。これらの結果をふまえ、高等植物時計研究の画期的手法としての培養細胞系の可能性に関して考察する。

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恒常暗期条件下のイネ（Oryza sativa L.）の葉身・葉鞘RNAを用いたイネcDNAマイクロアレイ解析から、光のない条件下においても転写量が約24時間周期で変動する遺伝子を同定した。同定した遺伝子の中から3つの遺伝子を選び、転写量が明暗条件下、恒常明期条件下においても日周変動することを確認した。これらの遺伝子の役割について調べるために、cDNAを植物の大量発現用プロモーターの下流にセンス方向（S）もしくはアンチセンス方向（AS）につないだ形質転換イネを作出した。今回は類似性検索により植物の転写因子であるDofと有意な類似性がみられた遺伝子（Dof様遺伝子）の発現解析の結果について報告する。Dof様遺伝子はS、AS両形質転換イネともに転写量の大幅な増加もしくは減少はみられなかったが、器官ごとの転写量はSイネとASイネの間で違いがみられた。転写量を内在性遺伝子と外来遺伝子に区別して調べたところ、内在性遺伝子の器官ごとの転写量が変化していることがわかった。また、外来遺伝子の器官ごとの転写量も内在性遺伝子の転写量と似た変化を示した。転写量の日周変動パターンを調べたところ、転写量が最大値を示す時間はSイネ、ASイネともに親系統イネと同様であったが、最大値を示す時間の前後の時間における転写量がわずかに増加していることがわかった。形質転換イネにおける既知の概日リズム制御下遺伝子の発現解析の結果から、Dof様遺伝子との関連について考察する。

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Circadian clocks control the expression of Lhcb genes encoding the chlorophyll a/b-binding proteins broadly in seed plants. We show here that this regulation is also conserved in the primitive moss Physcomitrella patens. Northern blotting analyses revealed a robust daily oscillation of Lhcb mRNA levels in protonema cells in 12-hr:12-hr light-dark cycles (12:12LD) that damped rapidly in continuous darkness (DD). In continuous light (LL), by contrast with typical profiles in higher plants, Lhcb mRNA levels only peaked during the first day and thereafter it showed constant levels. Reverse transcription (RT)-PCR analyses showed similar patterns of expression in LL for three distinct Lhcb genes. At a higher concentration (4.5%) of glucose in the medium, transgenic reporter strains expressing luciferase under the control of the PpLhcb2 promoter showed self-sustained bioluminescence rhythms in DD, which was entrained to a differently phased 12:12LD, revealing a circadian regulation on the transcription.

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概日時計関連遺伝子pex（period extender）は概日リズムの周期を延長させる能力を持っており、pex遺伝子を破壊すると周期は1時間短くなり、過剰発現すると3時間長くなる (Kutsuna et al., 1998)。そして、これまでの研究により、このpex遺伝子は、概日時計の必須遺伝子kaiAの発現調節を介して周期を延長していることがわかってきた。しかしながら、pex遺伝子の周期調節能がどのような役割を持っているのかは不明である。最近になって、環境の明暗の変化に対してpex発現が誘導されることがわかったので、我々は、pex遺伝子の光環境における時計機能を生理学的に解析した。連続明で培養したpex破壊型と野生型の概日リズムの位相に差はなかったが、明暗サイクルの下で培養した場合、pex破壊型のリズムは野生型のリズムより約3時間位相が前進することがわかった。この結果と、pex遺伝子が概日時計の周期延長因子であることから、暗期の繰り返しによって発現したPexタンパクは概日時計のサイクルを遅くすることで、時計の運行を環境サイクルに調和させているという概日入力系モデルが考えられる。

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pex 遺伝子は概日時計の周期を延長する機能を持っており、その発現は暗期で誘導される。このことからpex の発現調節経路の存在が考えられた。そこでpex の生物発光レポーター株をつかって、pex 発現の突然変異体をスクリーニングした。その結果発光とpex mRNAレベルが共に強い突然変異体を得ることができた。変異の原因であると考えられるカナマイシン耐性遺伝子は重炭酸塩のトランスポーターの遺伝子群を調節する転写因子CmpRをコードするcmpR （小俣ら2001）を遺伝子破壊していた。変異体のリズムの位相は野生型のものより6時間後退していたが、この変異表現型はcmpR 遺伝子断片による形質転換体では正常に戻ることが確認できた。また、この変異体のpex 遺伝子を破壊して得られたcmpR /pex 二重遺伝子破壊体のリズムは野生型に近付いたので、cmpR 破壊体のリズム異常にはpex 発現が必要であることが暗示された。これらの結果から、cmpR とpex は同じ経路で概日振動体を調節していると考えられる。

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アサガオの牡丹(dp)突然変異体では、CクラスMADS-box遺伝子であるDP遺伝子の機能を完全に欠損しており、生殖器官から萼や花弁への完全な転換を示すのに対し、マルバアサガオのflora pleno (fp)突然変異体では、雄ずいが花弁化し、雌ずいは太く萎縮し、しばしば先端が萼様組織に変化する。fp変異体ではアサガオの牡丹遺伝子のオーソログ(FP)の転写が見られず、FP遺伝子の第2イントロンに12.7 kbにおよぶ新規のトランスポゾン(Helip1)が挿入していた。このトランスポゾンは最近高等生物に多数存在することが明らかになったHelitronと非常によく似た配列を持ち、末端の配列も保存されていた。これまでHelitronが転移した例はほとんど知られていないが、この変異体はしばしば復帰変異を起こし、遺伝子構造も完全な野生型に復帰する。このようにマルバアサガオのfp変異体は高等生物に普遍的に存在するHelitronの転移機構に迫ることができる唯一のシステムである。fp変異体がアサガオの牡丹変異と比較して弱い表現型しか示さない理由として、fpの遺伝子構造からは正常なFP産物は作られそうにないが高頻度の復帰変異によってある程度の正常なFP産物が供給されている、もしくはマルバアサガオではFPだけではなくもう1つのCクラスMADS-box遺伝子であるPNのオーソログも重要な働きをしている可能性が考えられる。

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　花成は植物にとって重要な現象であり、様々な内的及び外的要因に影響を受ける。光は花成誘導の重要因子であり、多くの花成関与遺伝子が光情報による花成誘導経路に存在する。
　cop1 は暗黒下で光形態形成する突然変異体として単離され、その弱いアリルであるcop1-6 突然変異体は花成において日長非感受性を示し、長日、短日条件共に花成が促進する。そこで、COP1 遺伝子の花成における影響を調べるために、cop1-6 と花成遅延突然変異体cry2、gi、co、ld の二重変異体を作成し、連続光照射下、短日条件下での花成について解析を行った。すべてのcop1-6 二重変異体がcop1-6 と同様に日長非感受性を示した。cry2-1 cop1-6 を除くすべての二重変異体がcop1-6 に比べ花成遅延を示したが、cry2-1 変異による花成遅延はcop1-6 変異によりほぼ完全に抑制された。このことから、CRY2 がCOP1 を介して花成に関与している可能性が示唆された。また、gi-2 cop1-6 とgi-2 の花成遅延率がほぼ同じであるにもかかわらず、co-1 cop1-6 はco-1 と比較して、著しく花成遅延率が増加した。

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　シロイヌナズナの遺伝子 FD は、花成経路統合遺伝子 FT と協調して花成を促進することを、われわれはこれまでに報告している。FD は bZIP 蛋白質をコードしており、転写因子として働くことが予想されるので、その標的遺伝子の候補である花芽分裂組織遺伝子の発現解析を行った。その結果、35S::FD 植物の芽生えでは、AP1, CAL, FUL の発現が上昇しており、fd-1; lfy-26 の花序では AP1, CAL, FUL の発現が減少していた。1.7 kb の AP1 プロモータを持つ AP1::GUS 植物の 10 日目の芽生えでは、GUS の発現が認められないのに対して、35S::FD を導入した植物では、子葉や本葉の維管束を中心に、GUS が発現していた。 発現部位が一様ではないことより、FD 以外の因子が必要であると考えられたが、そのパターンより FT の関与が示唆された。 ft-3 背景の 35S::FD 植物における AP1 の発現を調べたところ、ft-3 背景では、AP1 の発現はほとんど認められなかった。酵母細胞内で、FDは FT と蛋白質間相互作用する。これらの結果より、AP1 の発現には、FD の過剰発現だけでは十分ではなく、FT の存在が必要であること、すなわち、FD は FT と相互作用することにより、AP1 の発現を活性化し、花芽形成を促進すると考えられる。

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　FT遺伝子は、花成を制御する種々の経路を統合する遺伝子の一つである。シロイヌナズナには、TFL1およびTSFを含めてFT相同遺伝子が6個存在する。TFL1は花成と花序分裂組織の維持に関わりFTとは相反する役割を持つ遺伝子である。一方、TSFはFTと非常に高い相同性を持ち、過剰発現体の表現型、生育温度に対する発現応答などが報告されている。しかし、その本来の機能は不明である。
　そこで、TSFの発現様態をFTと比較した。TSFは長日および短日条件下でFTと同様に光周期に依存した日周変動を示した。また、長日条件下ではFTとともに徐々に発現の増大が見られた。これらに加えてTSFは、花成時期変異体のうちco変異体において発現が低下していた。そこで、CO活性を一過的に誘導した際の発現応答を検討したところ、FTと同様にTSFの発現が転写制御因子であるCOにより直接的に誘導された。これらの結果からTSFはFTとよく似た発現制御を受けることが示唆された。
　異なるエコタイプ間でTSFの遺伝子構造を調べたところ、Colの3'UTRを含む約1 kbの配列は、LerおよびCviにはみられないことがわかった。現在、この配列の有無がTSF遺伝子の発現に与える影響について解析を進めている。
　また、TSFのT-DNA挿入変異体を取得し、発現が顕著に低下していることを確認したので、その表現型についても言及したい。

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シロイヌナズナの優性花成遅延変異体fwaでは、プロモーター領域のDNAメチル化の低下により、GL2型ホメオボックス遺伝子FWAが異所発現していることが報告されている。我々はFWA遺伝子が野生型植物の栄養成長期には発現していないことを確認した。したがって、異所発現したFWA遺伝子の異所発現によって、本来の制御機構が撹乱され、花成が阻害されると推測される。遺伝学的解析の結果、FWAはFTそのもの、あるいはFTの下流の因子を阻害すると推測された。そこで、FWAを用いることによりFTより下流の制御経路についての情報が得られると期待し、FWA蛋白質によって機能が阻害されるような蛋白質の候補の探索を行った。yeast two-hybrid系を用いてFTおよびその下流のbZIP型転写因子FDなどの花成制御因子との相互作用を検討した結果、FWAはFTとのみ強く相互作用した。また、in vitro においてもFWAとFTの相互作用が認められた。これらの結果から、異所的に発現したFWAはFTと強く相互作用することにより、FTとFDの相互作用を阻害し、花成を阻害している可能性が考えられた。また、fwaの表現型の全てがFT機能の阻害で説明できるわけではないことから、FWAと相互作用する他の蛋白質についてもスクリーニングを行っており、その結果もあわせて報告する。

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　シソは短日処理で誘導された花成状態が長期間持続する特徴があり、これはバーナリゼーションにおける低温効果が長期間維持されることを連想させ、両者に共通する機構の存在を想起させる。バーナリゼーションにはDNAメチル化・脱メチル化による遺伝子発現制御が関与することが報告されている。
　そこで、赤ジソ品種を用いて、種子または茎頂を250μMの5-azacytidineで処理したところ、短日処理なしに花成を誘導できた。5-azacytidine処理により若干生長が抑制されたが、その他に顕著な異常はなく、脱メチル化による花成関連遺伝子の発現変化が花成誘導に関与していると考えられた。
　rDNAスペーサー領域ではDNAがメチル化していることが知られているので、5-azacytidine処理区および無処理区の葉から抽出したゲノムDNAを、メチル化DNA感受性の制限酵素Hpa IIまたは非感受性酵素Msp Iで切断後、25S-18S rDNAスペーサー領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、処理区ではシグナルパターンが低分子側にシフトしたことから、5-azacytidine処理によってDNAが脱メチル化されたことが明らかになった。これらの結果から、シソの花成にはDNA脱メチル化が関与することが示唆された。

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　ゲノムインプリンティングは、どちらの親に由来するかによって、2つの対立遺伝子のうち片方だけを発現するように制御する現象である。哺乳動物ではゲノムインプリンティングは世代ごとに一旦リセットされ、対立遺伝子特異的なde novoのメチル化により再確立されることが知られている。一方、植物ではその分子機構は良くわかっていなかった。
　前回大会では、シロイヌナズナのFWA遺伝子は、胚乳において母親対立遺伝子のみ発現するインプリント遺伝子であることを報告した。今回大会では、1）FWA遺伝子のゲノムインプリンティングには、哺乳動物同様、維持型のDNAのメチル化酵素遺伝子が必要であること、2）哺乳動物とは異なり、de novoのメチル化酵素遺伝子は必要ではないこと、3）FWAのゲノムインプリンティングは雌性配偶体においてDNAグリコシダーゼにより確立されることを報告する。これらの結果より、哺乳動物と被子植物の生殖様式の違いと、メチル化修飾の制御の違いについても討論したい。

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　我々は、シロイヌナズナの花成制御の分子機構を明らかにするために、花成促進に働くMADS-box遺伝子AGL24の解析を行ってきた。シロイヌナズナの花成には他にもMADS-box遺伝子が関与し、SOC1は花成促進に、FLC, FLM, SVPは花成抑制に働く。また興味深いことに、AGL24とSVPは進化系統学的に非常に近縁である。MADS-boxタンパク質はMADS-boxタンパク質同士で転写因子複合体を形成することが示唆されているが、これらが複合体を形成するのかは不明である。本研究では、AGL24が複合体を形成しているかどうかを明らかにし、AGL24の転写因子としての機能を明らかにすることを目的としている。さらに、AGL24とSVPの拮抗作用についても解析を行っている。これまでに、酵母Two-hybridスクリーニングによりAGL24と相互作用する因子を選抜した結果、SOC1, AP1, FULなどを単離した。発現パターンから、AGL24は栄養生長期茎頂においてはSOC1と、分化初期の花分裂組織においてはAP1, FULと相互作用するものと考えられた。次に、プルダウン法による結合アッセイなどを行い、相互作用についてさらに検証した。以上の結果から、AGL24とSVPはホモ二量体を形成し、互いに相互作用すること、また同じMADS-boxタンパク質と相互作用することが明らかとなった。

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被子植物のMADS-box遺伝子は花器官形成を中心に発生過程の様々な段階に関与している転写遺伝子である。我々はシロイヌナズナに存在する全MADS-box遺伝子の網羅的発現解析により、複数の遺伝子が雄配偶体である花粉で特異的に発現していることを明らかにした。また花が咲かないシダ植物、コケ植物、緑藻類では卵精子成熟時にMADS-box遺伝子が発現していることが示唆されている。以上のことからMADS-box遺伝子は卵精子形成時における機能を進化的に保持していると考えられる。そこで我々は様々な植物の配偶体でMADS-box遺伝子の解析を行うことで、卵精子形成時において進化的に保持されている機能の解明を目指し研究を進めている。本大会ではシロイヌナズナの研究に関して報告する。
シロイヌナズナの花粉で特異的に発現しているMADS-box遺伝子の多くがMIKC*型の遺伝子であったことから、MIKC*型の3つの遺伝子に着目し解析を進めている。各遺伝子のtag挿入変異株で表現型の変異は観察されなかったが、各系統をかけ合わせた三重変異株ではin vitroにおいて花粉の発芽が抑制されることが明らかになった。しかし通常の受粉過程においては野生株同様に受精し正常な種子を形成した。現在変異原因を解明するためにマイクロアレイ解析を行っており、MADS-box遺伝子の発現解析および花粉形態の変化と併せて報告する。

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胚珠への花粉管誘導は植物の生殖に必須な現象である。花粉は柱頭で発芽し、花柱から胎座、珠柄を介して胚珠へと伸長する。その過程で花粉管誘導は、段階に応じて幾重にも制御されていることが示唆されているが、その分子実体はほとんど未解明である。我々は、花粉管における胚珠側からの誘導因子に対する受容体を単離するため、シロイヌナズナ花粉管における受容体型キナーゼの網羅的解析を行い、実際に花粉管伸長パターンに影響を与える遺伝子が単離できたので報告する。花粉管伸長培地上で発芽伸長させた花粉、無処理の花粉、花序からそれぞれ単離した全RNAについて遺伝子チップ（Affymetrix）を用いて遺伝子発現を調べ、比較結果から、花粉管で優勢に発現していた45受容体様キナーゼ遺伝子の機能解析を行っている。これらの遺伝子はシロイヌナズナの全ゲノム配列上に存在し機能していると予測された417受容体様キナーゼ遺伝子の約9％を占め、細胞外ドメイン構造からクラス分けされた21グループのうち11に渡っていた。現在、T-DNA挿入による遺伝子破壊株、RNAiによる機能阻害株の雌蕊をアニーリンブルー染色し、雌蕊内部における花粉管伸長様式を野生型と比較しており、実際に花粉管が十分伸長しない変異体候補を得たので報告する。

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単細胞シャジクモ藻類ミカヅキモClosterium peracerosum-strigosum-littorale complexでは、性フェロモンを介した有性生殖機構が知られており、これまでに有性生殖期及び無性増殖期の細胞より3231のESTが取得されている。それらを用いてcDNAマイクロアレイを作製し、有性生殖進行に機能する遺伝子の検索を行った。＋型及び－型細胞の混合培養開始後、経時的（2, 8, 24, 72 h）に回収した細胞からCy-5標識cDNAを合成し、シグナルを比較した結果、35種類の遺伝子（うち機能未知26種類）が、いずれかのステージにおいて5倍以上に発現上昇した。さらに、精製した性フェロモンを＋型または－型細胞に投与した結果、ロイシンリッチリピートをもつものを含めて8遺伝子がPR-IP処理に反応して－型細胞で発現し、受容体型プロテインキナーゼをコードすると思われるものを含め14遺伝子がPR-IP inducer処理に反応して＋型細胞で発現することも見出された。さらに接合時に発現上昇するが、フェロモンに反応しないものも11種類見られた。これらの他に、接合誘起前の段階で、＋型細胞、－型細胞特異的に発現する10及び23種類の遺伝子の存在がそれぞれ確認された。現在、これらの有性生殖における挙動について、定量的real-time PCRを用いて解析中である。

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雌雄異株植物であるゼニゴケ Marchantia polymorphaは、長日条件で生殖成長に移行し、葉状体上に生殖器官を形成する。しかし、ゼニゴケのような下等陸上植物において、栄養成長から生殖成長への移行を制御する遺伝子はまだ同定されていない。そのような遺伝子を探索するため、パーティクルガン法を用いてハイグロマイシン耐性遺伝子をゼニゴケ雄ゲノムにランダムに挿入し、約2,100のタグラインを作成した。その中に、恒常的に生殖器官を形成する変異体hpt2040を見いだした。この変異体の雄生殖器官および精子は形態的に正常であり、雌野生株との交配でF₁世代を生じた。F₁株には、変異表現型を示す雄個体とともに、雌生殖器官を恒常的に形成する雌個体も観察された。このことから、hpt2040変異は雌雄両方の生殖器官の形成に関わることが明らかとなった。hpt2040変異に関わる遺伝子座の数を検討するため、F₁における表現型の分離比の検定を行ったところ、 雄変異型：雌変異型：雄野生型：雌野生型 = 1:1:1:1の分離比を示した。以上の結果より、hpt2040変異が常染色体上の1遺伝子座の変異であることが明らかとなり、その遺伝子座がゼニゴケにおいて栄養成長から生殖成長への移行を制御している可能性が示唆された。(Sex Plant Reprod, in press)

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花粉の形成は、顕花植物の発生において重要な生物学的過程である。雄性配偶体の形成に影響を及ぼす変異体が多数単離されているが、その分子機構についてはほとんど分かっていない。我々はTCP16遺伝子について2種類のT-DNA挿入変異を同定した。これら変異のホモ接合体は確立できず、ヘテロ接合体の次世代において1:1の分離を示す。tcp16ヘテロ接合体と野生型との相互掛け合わせの結果から、雄性配偶体を通した変異アリルの継承が特異的に起こりづらいことが判明した。このことはtcp16変異において雄性配偶子形成が何らかの異常をきたしていることを示唆する。tcp16ヘテロ接合体の成熟花粉を観察したところ、葯内に正常花粉と異常花粉が約半数ずつ含まれており、異常花粉はゲノムDNAの消失、エキシンネットワークの異常、生存能力の欠損などの特徴を示した。GUS融合遺伝子の解析から、TCP16遺伝子の発現は花粉の四分子期から始まり、花粉有糸分裂前の小胞子成熟時期に最も強くなることが明らかとなった。tcp16ヘテロ接合体の小胞子を観察したところ、ゲノムDNAの消失が見出され、発現時期と表現型出現時期の一致が認められた。TCP16遺伝子はbHLH構造からなるTCPドメインをもつ転写因子をコードしている。これらの結果は、TCP16が花粉の形成過程に必須な役割を担う転写因子であることを強く示唆する。

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近縁野生種 Aegilops crassa 細胞質は、「農林26号」などいくつかの日本コムギ品種に、雄ずいの雌ずい化（pistillody）による雄性不稔を誘発する。一方、コムギ品種「Chinese Spring」(CS)の7B染色体長腕(7BL)には、この pistillody を抑制する優性の主働遺伝子Rfd1が存在し、Ae. crassa 細胞質を導入しても pistillody は起こらない。このRfd1遺伝子が座乗する7BLを両方欠失したダイテロソミック7BS系統では、正常細胞質の場合(CSdt7BS系統)、正常な雄ずいを持つが、Ae. crassa 細胞質を導入した場合((cr)-CSdt7BS系統)、完全に pistillody となる。雌ずいおよび雄ずいが分化する頴花分化期の幼穂において、クラスB MADSボックス遺伝子の発現を調べたところ、CSdt7BS系統の雄ずい原基では正常に発現が見られるが、pistillody を誘発する(cr)-CSdt7BS系統の雄ずい原基では発現が見られなかった。一方、雌ずいの identity を決定するYABBY遺伝子TaDLが、(cr)-CSdt7BS系統の雌ずい化した雄ずい原基で発現していた。このことは、Ae. crassa 細胞質による pistillody 誘発に、花器官決定遺伝子の発現パターンの変化が関係することを示す。

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インディカ品種Chinsurah Boro IIの細胞質をもち、ジャポニカ品種である台中65号の核遺伝子を持つイネはBoro型細胞質雄性不稔を示す。しかし、この雄性不稔系統では、第10染色体に存在する1個の稔性回復遺伝子（Rf1）が配偶体型で機能することで、花粉稔性が回復する。また、ミトコンドリアにコードされているキメラ遺伝子B-atp6が雄性不稔性の原因遺伝子として指摘されている。B-atp6 RNAは、雄性不稔系統では2.0kbであるが、回復系統やF₁では、プロセッシングを受けて1.5kbと0.45kbとなることが知られている。マッピングによって狭めた領域に座乗する遺伝子のなかから、雄性不稔系統に導入した際にB-atp6 RNAのプロセッシングが起こるような遺伝子をスクリーニングした。この結果、PPRモチーフをコードする遺伝子PPR8-1を導入したときのみプロセッシングが観察された。さらに、この遺伝子PPR8-1を導入した個体では花粉稔性、種子稔性ともに回復した。以上のことから、PPR8-1が稔性回復遺伝子Rf1であり、雄性不稔性の原因遺伝子がB-atp6であることが分かった。また、稔性回復遺伝子近傍にはPPRモチーフをコードし、Rf1と相同性の高い遺伝子PPR8-2, PPR8-3が存在するが、これらの遺伝子は相同性が非常に高いにも関らず、B-atp6 RNAのプロセッシングや稔性回復には関与しないことが明らかとなった。現在、これらの遺伝子とB-atp6 RNAの転写後制御についての解析を行っている。

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T-DNAタギングにより、新規のシロイヌナズナの雄性不稔変異体を単離した。この変異体では一核期から小胞子の崩壊が始まり、開花期には完全に花粉が消失した。透過型電子顕微鏡を用いてWTと変異体のエキシンの発達過程を調べたところ、変異体ではエキシンの構成要素であるスポロポレニンの付着の足場となるプライムエキシンがほとんど形成されないことが明らかとなった。またエキシンの構成要素であるスポロポレニンは作られるが、小胞子の細胞膜に付着することはなかった。細胞膜に付着できないスポロポレニンは凝集し、顆粒様の構造となった。その結果、変異体ではエキシンが形成されなかった。この表現型よりnef1(no exine formation 1)変異体と名付けた。nef1遺伝子をクローニングしたところ、既知の遺伝子とは相同性を示さず、新規の遺伝子と考えられたが、膜タンパク質やトランスポーター様の遺伝子とかすかな相同性を示した。発現解析の結果、nef1遺伝子は花序で強く発現し、葉では弱く発現していることがわかった。ここではNEF1タンパク質の機能について考察した。

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高等植物の葉をはじめとする地上部器官はメリステムと呼ばれる未分化な細胞から分化することで形成される。このメリステムの維持機能に重要であると考えられている遺伝子の中にclass 1 knox 遺伝子ファミリーがある。シロイヌナズナではSTM,　KNAT1, KNAT2, KNAT6の4遺伝子から構成されるclass 1 knox遺伝子ファミリーは、互いに相同性の高いホメオドメイン蛋白質をコードし茎頂周辺で発現しているが、それらの単独変異体は、stm以外はメリステムにおいて顕著な表現型を示さず、その機能の詳細は未解明であった。今回、我々はKNAT2, KNAT6遺伝子のT-DNA挿入変異体を単離し表現形を解析したが、これらの変異体は顕著な表現形は示さなかった。しかし、他のclass 1 knox遺伝子がその機能を補っている可能性を考え、現在、これらの変異体とknat1変異体またはas1変異体との二重、三重変異体を作成しその表現形を解析中である。

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植物の先端成長は遺伝・環境要因によって大きく変化し、その結果は細胞増殖と成長（体積増大）の違いとして現れる。しかし、この2つの側面は独立ではなく相互に影響しており、それらはさらに様々な要素から成り立っている。したがって、遺伝・環境要因の効果の本質を捉えるためには、従来の研究のように単に細胞増殖と成長を測定するだけではなく、この複合的な関係を解体し定量的分析を行う必要がある。我々はこれに対し、細胞増殖と成長とを関連づける簡単な数理モデルを考案し、モデルが根の皮層細胞列の成長に概ね当てはまることも既に示している。今回、これまでに我々が行ってきた数理モデル解析にノンパラメトリック平滑化を取り入れて改良を施し、シロイヌナズナの根の成長に適用してその有用性を検討した。まず、コロンビア系統の根端皮層細胞列について成長解析を行った結果、この成長が本モデルによって説明されることが確認された。また、エコタイプ間に見いだされる成長パターンの違いについて解析し、これが成長のどのような側面あるいは要素の差に起因するものであるかを分析した。これにより、本モデルで示される細胞増殖と体積増大の制約関係が実際の器官成長において成立していること、さらにこの数理モデルによって器官成長の定量的比較解析をより掘り下げ、本質的な違いを抽出できることを示した。

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The ETO1 family is thought to be a conserved negative regulator of ethylene biosynthesis in higher plants, that interacts with a class of ACC synthases (type 2 ACS) and decreases their stability through the proteasome-dependent pathway. By Y2H analysis, we identified a C-terminal amino acid sequence of the type 2 ACS required for the interaction with ETO1, and named TOE (target of ETO1). When the TOE from LE-ACS3 was fused to the C-terminus of GFP and introduced into rice callus, fluorescence of GFP-TOE^LE-ACS3 was significantly reduced compared to the native GFP. Furthermore, Western blot analysis showed significant reduction of the fusion protein in rice callus. These results indicate TOE is sufficient to decrease the protein stability.

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　MBF1 (Multiprotein bridging factor 1)は真核生物で広く保存された約140アミノ酸からなるタンパク質で、酵母、ヒト、ショウジョウバエなどでは、主にbZIP型転写因子とTBPとの間にブリッジ構造を形成し、標的遺伝子の転写を活性化する転写コアクチベーターとしての機能が報告されている。しかし、植物における機能についてはほとんど解明されていない。
　我々はシロイヌナズナに3種存在するMBF1ホモログ(AtMBF1a, AtMBF1b, AtMBF1c)のコアクチベーターとしての機能を酵母のmbf1欠損体を用いた相補性実験により調べ、3つのAtMBF1は全て酵母mbf1欠損体の表現型を部分的に相補することを明らかにした。さらに、ファーウェスタン法を用いた実験から、AtMBF1とTBP, 酵母のbZIP型転写因子であるGCN4が直接結合することがわかった。これらのことはシロイヌナズナの3つのMBF1ホモログが転写コアクチベーターとして機能することを示している。また、3つのMBF1遺伝子の組織特異的発現や植物ホルモン、刺激に対する応答をノーザン法やそれぞれのプロモーター::GUS遺伝子を持つ形質転換体を用いて調べたところ、それぞれ異なる発現様式を示した。これらの結果と現在行っているT-DNA挿入変異体の解析からシロイヌナズナにおけるMBF1の役割について考察する。

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ABAの生理作用発現にはABAの内生量が深く関わっており、ABAの生合成と不活化の絶妙なバランスが重要である。ABAは主として8'位の水酸化を経てファゼイン酸へと代謝される。このABA 8'水酸化酵素はシトクロームP450（P450）であることが示されていたが、遺伝子は同定されていなかった。シロイヌナズナの272個のP450遺伝子の中より、系統樹解析、イネのゲノム情報、さらに種子吸水時におけるジーンチップによる遺伝子発現解析の情報をもとに候補遺伝子を絞り込んだ。これらの遺伝子を酵母の系にて機能発現させたところ、CYP707Aファミリーに属するCYP707A1からCYP707A4までの4つの遺伝子を組み込んだ酵母において、ファゼイン酸合成活性が検出された。シロイヌナズナにおけるこれらの遺伝子の発現解析を行ったところ、種子吸水時においてCYP707A2が速やかに誘導されており、吸水時の一過的なABAの代謝を担っているものと考えられた。また乾燥ストレスを与えた植物に再吸水させると急激に4つの遺伝子の発現が増加することが分かり、ABAの内生量の変動と良い相関を示した。さらにCYP707A2欠損変異株において顕著な発芽遅延が観察され、種子においてABAの内生量が極端に蓄積しており、CYP707A2が種子吸水時のABA量の調節に重要な役割を担っていることが明らかとなった。

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【目的】アブシジン酸 (ABA) は、シトクロム P450 (CYP or P450) により 8'-位が水酸化され、さらにファゼイン酸 (PA) へと異性化されて不活性化される。しかしながら不活性化に関わる酵素および遺伝子は単離されていない。我々は CYP707A が (+)-ABA 8'-位水酸化酵素であることを同定したので報告する。
【結果および考察】シロイヌナズナに存在する全 4 種類の CYP707A 遺伝子の発現レベルは ABA、高塩、高浸透圧処理により増加した。そこで、CYP707A を発現している昆虫細胞に (+)-ABA を投与したところ、PA と 8'-hydroxy ABA が検出された。組換え CYP707A3 酵素の (+)-ABA に対する速度論定数は、K_m = 1.3 μM、k_cat = 15 min^-1 であった。また、酵素反応液を直接 HPLC 分析したところ、PA への異性化は触媒せず、ABA 8'-位水酸化のみを触媒することがわかった。次に、CYP707A3 可溶化上清に (+)-ABA を添加すると基質結合スペクトルが得られた (K_s = 3.5 μM) が、(-)-ABA では得られなかった。以上より CYP707A は (+)-ABA 8'-位水酸化酵素であると結論付けた。

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アブシジン酸（ABA）は、乾燥などの環境ストレス応答に関わる植物ホルモンとして知られている。植物は乾燥ストレスを受けるとABAを蓄積し、気孔の閉鎖などが誘導され乾燥耐性を獲得する。しかしながら、植物体のどの部位でストレスを感受し、どの部位でABA合成が行なわれまた輸送されるのかなどの詳細は、いまだ不明な点が多い。本研究では、GC-MSを用いて葉と根におけるABA量の測定を進め、これらの問題を明らかにすることを試みた。
野生型植物では、数時間の乾燥処理により葉および根において内生ABA量の急速な増加が見られたが、ABA欠損突然変異体においては増加が見られなかった。この時、葉のみを乾燥処理した場合、葉におけるABAの増加が観察されたが、根のみを処理した場合、根と葉両方ともABA量の増加は見られなかった。さらに、野生型植物を葉と根に切り離し別々に乾燥処理したところ、ABA量の増加は乾燥処理した葉でのみ観察された。また、葉に塗付した¹³C-ABAが少なくとも60分後には、根において検出された。これらのことから、乾燥に応答した急速なABA合成は主に葉で行われ、AAO3がこのABA合成に重要な役割を持つことが明らかになり、また、葉で合成されたABAの根への移動が明らかになった。現在、各ストレス条件下におけるABA合成遺伝子と乾燥及びABA応答遺伝子の発現解析を行なっている。

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アブシジン酸(ABA)は、種子形成時に貯蔵物質の合成を促進し、種子が成熟し休眠性を獲得するのに重要な役割を果たしている。ABA存在下で発芽できる休眠性の浅い突然変異体abi5は、ABA応答配列(ABRE)に結合するbZIP型の転写因子を欠損していることが明らかとなっているが、この変異体の遺伝子発現がどのように変化しているかについては断片的な報告しかない。そこで、マイクロアレイによって種子での網羅的な発現解析を行い、野生型(WT)の発現プロファイルと比較した。WT種子の高発現遺伝子群で統計的にシス因子を探索した結果ABREが見出された。またin silico解析によって、CEやRYといった種子での機能が示唆されている因子とABREの組合せが種子における高発現とより強い相関を示すことが明らかとなった。一方abi5種子では、CEやRY単独の効果はWTとほぼ同様だったが、高発現遺伝子とABREの相関がかなり弱まっていた。また、abi5で発現が低下した遺伝子群からも、有意にABREが見出された。この結果は、このABREが種子登熟過程におけるABA誘導性の遺伝子発現に大きく寄与する因子であり、その発現誘導にABI5が重要であることを示している。また、ABI5がABREに結合するというこれまでのin vitroの解析結果に矛盾せず、我々のプロファイリングが有効であることが確かめられた。

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アブシジン酸（ABA）は種子の成熟から植物体の乾燥や塩ストレスへの応答やその耐性の獲得まで、多岐にわたって働くことが知られている。しかし、ABA情報伝達経路およびその制御機構については未だ不明な点が多い。そこでABA認識の特異性が変化した突然変異体を得ることによって新たな知見を得ることを期待し、ABA類縁体を用いて遺伝学的手法によるABA関連突然変異体の単離を試みた。これまでにABA類縁体であるPBI-51(ARI)を用いてスクリーニングを行い、ABA高感受性変異体候補を得ている。今回は新たなABA類縁体である#18を用いた研究について報告する。ABAはシロイヌナズナの根の伸長を強く抑制するのに対し、この類縁体は根の伸長よりも地上部の生長を強く抑制する。既知のABA非感受性変異体であるabi1, 2, 3, 4, 5はこの類縁体に非感受性を示し、ABA高感受性変異体であるera1は高感受性を示すことから、この類縁体はABA情報伝達に作用すると思われる。またエコタイプ間でこの類縁体の感受性の違いを調べたところ、Wsは強い感受性を示し、LerはColやWsに比べて感受性が低下していた。この感受性の差はABAの感受性の違いとは必ずしも相関はなかった。現在この類縁体への感受性が低下した個体のスクリーニングを行っている。

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我々はABAの受容から遺伝子発現制御に至るまでの情報伝達経路の解明を目指している。ABA情報伝達経路に異常を持つ突然変異体の分離、解析という遺伝学的なアプローチは古典的ではあるが未知の因子の同定に有効な手法である。我々は遺伝学的アプローチを用い、新たな突然変異体を得るため、シロイヌナズナCol株を対象にABA類縁体に感受性を示す突然変異体のスクリーニングを行い、ABA高感受性変異体ahg1～7を分離した。そのうちの一つであるahg3の解析の解析について報告する。生理学的解析によりahg3は、塩や浸透圧ストレスに高感受性を示す、野生型に比べて発芽が遅れる、ABA誘導性遺伝子の発現が若干遅くなる等の特徴が明らかとなった。一方、他の植物ホルモンに対する応答性に変化はなかった。また、ノーザン解析を行ったところ、ABA処理によるABA・ストレス誘導性遺伝子の発現が野生型に比べて若干遅いという結果が得られた。マッピングによるAHG3遺伝子座の同定を試み、プロテインフォスファターゼ2CであるAtPP2CAをahg3の原因遺伝子と推定した。AtPP2CAはABA情報伝達経路の負の制御因子と推察されている。今後ahg3の原因遺伝子がAtPP2CAであることを確認し、AHG3遺伝子を解析することでプロテインフォスファターゼ2CがABA情報伝達経路に果たす役割を明らかにすることができると思われる。

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Abscisic acid-β-D-glucosyl ester (ABA-GE) was recently found in Citrus junos peel as a main allelopathic substance. Aqueous methanol extracts of fruit peel of C. junos, C. unshiu and C. hassaku inhibited the growth of the roots and hypocotyls of lettuce, cress and alfalfa seedlings, and there was a good correlation between ABA-GE concentrations in fruit peel of C. junos, C. unshiu and C. hassaku and the inhibitory activities of their aqueous methanol extracts. Annual changes in concentrations of ABA-GE were determined in C. junos, C. unshiu, C. sudachi fruits and leaves. The concentrations in fruits of C. junos increased rapidly from the end of October, but the concentrations in the others did not increase so. The inhibitory activities of aqueous methanol extracts obtain from fruits and leaves of C. junos, C. unshiu, C. sudachi also correlated well with their ABA-GE concentrations.

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　5'α,8'-Cyclo-ABA (CycloABA) は，アブシジン酸 (ABA) と比較して30倍のイネ第二葉鞘伸長阻害活性を示すが，その理由は不明である。CycloABAの生理活性が増大した原因として，ABAより (1) 取り込まれやすい，(2) 受容体に対する親和性が高い，(3) 代謝不活性化されにくい，などが考えられる。演者らはABAの構造活性相関に鑑みて (3) に注目し，イネとダイコンの幼苗を用いてCycloABAの代謝を調べた。
　7日齢のイネ幼苗に投与したCycloABAは，ABAを投与した場合より約7倍多く残留した。ダイコン幼苗では，ABAの約65％が8'位水酸化によって代謝不活性化されたのに対して，CycloABAの場合は8'位水酸化による代謝物は検出されず，85％がそのままの形で植物体内に残留していた。CycloABAの主代謝物は，ABAの場合には副代謝物にあたる1位配糖体であった。以上よりCycloABAは，8'位水酸化酵素に代謝されないABAミミックであることが示された。CycloABAは，ABA代謝が関係する植物生理現象を研究するための有用なツールになるだろう。

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シロイヌナズナrd29B遺伝子の乾燥応答による発現は、主にABAを介して制御され、プロモーター領域に存在する2個のABREをシス因子として、これにbZIP型転写因子AREBが特異的に結合して下流の遺伝子発現を制御している。AREBの転写活性化にはABAに依存した翻訳後修飾が必要だと考えられるが、タンパク質リン酸化のターゲット配列が高度に保存されていることなどから、AREBのリン酸化と転写活性化について調べた。
アミノ酸置換を導入したAREBタンパク質断片を基質として活性ゲル内リン酸化実験を行ったところ、T87培養細胞抽出液中にAREBの保存領域を含む断片に存在するkinaseターゲット配列(RxxS/T)のSer/Thr残基をABA依存的にリン酸化すると考えられるkinase活性が存在した。また、このAREB1断片はABAで活性化するSRK2タイプのkinaseでリン酸化された。
このSer/Thr残基をAraに置換したAREB1は、transactivation実験においてABAによる転写活性化が抑制され、N末側に存在する4ヶ所を置換した場合、ほぼ完全に抑制された。一方、Araの代わりにAspで置換すると、転写活性はABA非依存的に高くなった。全てのターゲットサイトのSer/ThrをAspに置換した変異型AREB1を発現する形質転換体では、rd29B遺伝子がABA非依存的に発現していた。また、このconstitutive active型AREB1変異体をABA欠損変異体aba2-1に導入した場合もrd29B遺伝子の発現が認められた。

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アブシジン酸（ABA）は乾燥、低温ストレスの応答及び耐性の獲得、種子の成熟や休眠、発芽などの様々な過程に関わる植物ホルモンである。近年、高等植物に存在するレセプター型キナーゼが、頂芽分化、病原菌抵抗性、ホルモンシグナル伝達等様々な課程に関与することが示された。本報告は、ABAシグナル伝達に機能する制御因子の候補として、ABAにより転写誘導がおこるシロイヌナズナ受容体型キナーゼRPK1に着目し研究を行った。RPK1欠失変異体は発芽、根の伸長成長過程においてABA非感受性を示した。またアンチセンスRPK1遺伝子を導入したシロイヌナズナ由来のけん濁培養細胞はABAの増殖抑制効果に非感受性を示した。さらに欠失変異体はABAによる気孔閉鎖に対しても非感受性であった。以上のことから、RPK1が植物体におけるABAへの様々な応答反応に関与していることが示された。さらに、ABA非感受性を示すアンチセンスRPK1遺伝子形質転換体のマイクロアレイ解析よりABAシグナル伝達機構に含まれる多くの下流遺伝子が制御されることが明らかとなった。RPK1がABAシグナルの受容機構に重要な役割を持ち、その機能は下流の経路で働くと考えられる特異的な遺伝子発現調節過程にまで及ぶことが明らかとなった。

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