Oxidative stress is one of the major environmental factors for all living organisms. DNA microarray analysis revealed that incubation of cyanobacterial cells of Synechocystis sp. PCC 6803 with 0.25 mM H₂O₂ dramatically changed the pattern of genome-wide expression of genes. It induced the expression of 225 genes and repressed the expression of 320 genes. Screening of the mutant libraries of histidine kinases (Hik) by means of the H₂O₂-inducible expression of genes revealed that four histidine kinases, Hik33, Hik34, Hik2, Hik41 and a transcription factor PerR are involved in the perception of H₂O₂ signals and in the regulation of the H₂O₂-inducible expression, with induction factors higher than four, of 25, 1, 6, 2 and 6 genes, respectively. Further analysis will be discussed.

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Plants and microorganisms respond to osmotic changes by regulating the gene expression. We previously found that histidine kinase Hik33 acts as a sensor of the hyperosmotic stress in the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. In this study, we further searched for components involved in hyperosmotic signal transduction pathway in this organism by dot-blotting and DNA-microarray analysis to screen the knockout libraries of all histidine kinases and response regulators. The results showed that cells perceived and transduced the hyperosmotic signal by several two-component systems such as Hik33/Rre31, Hik33/Rre18, Hik34/Rre1 and Hik16/Hik41/Rre17 and Hik10/Rre3. These results suggested that cells utilize various two-component systems to cascade the hyperosmotic signal. Moreover, the pathway is not a simple two-component system as one histidine kinase sensor and one response regulator, but also includes the complex two-component systems.

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　我々は、ラン藻Synechocystis PCC6803のヒスチジンキナーゼ遺伝子の網羅的破壊株のDNAマイクロアレイ解析から、ヒスチジンキナーゼHik33が低温、高浸透圧、強光など、様々な環境ストレスの検知に関わるセンサーであることを見いだしている。それぞれの環境条件でHik33により発現制御を受ける遺伝子群は、いずれの条件によっても共通に発現誘導が見られる遺伝子のほかに、それぞれの条件で特異的に発現の制御が見られる遺伝子が多数見いだされた。これらの結果は、Hik33が異なる環境シグナルを検知し、異なる遺伝子群を制御するきわめて特異なヒスチジンキナーゼ（マルチストレスセンサー）であることを示している。我々は、Hik33と相互作用しシグナルの分配に関わる因子の存在を予想し、酵母2ハイブリッドスクリーニングにより81アミノ酸からなる新奇タンパク質をコードする遺伝子（ssl3451）を同定した。この遺伝子を破壊した株では、Hik33によりストレス条件下で発現誘導が見られるhliB-slr1544遺伝子の発現が、通常の培養条件においても誘導され、ストレス条件下での発現レベルが野生株に比べて低下していた。これらの結果は、この新奇タンパク質はHik33と相互作用することによりその活性を制御する因子であることを示唆している。

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Thlaspi caerulescens is known as a Cd hyperaccumulator, especially the ecotype of Ganges. However, the form of Cd in the shoots (mainly leaves) is unknown, and therefore was identified by using ¹¹³Cd-NMR spectrometry in the present study. Leaves enriched with ¹¹³Cd were prepared by exposing the roots to ¹¹³Cd(NO₃)₂ in a hydroponic culture. Measurements of ¹¹³Cd-NMR with intact leaves showed a signal at the chemical shift around -15 ppm. Crude leaf sap also gave a similar chemical shift. Purification by gel filtration (Sephadex G-10), followed by cationic and anionic exchange chromatography showed that only the anionic fraction gave the same chemical shift as intact leaves. Further purification of the anionic fraction, combined with ¹¹³Cd- and ¹H-NMR studies revealed that only fraction mainly containing malate showed a chemical shift similar to the intact leaves. These results indicate that Cd coordinates with malate in the leaves of Thlaspi caerulescens.

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Citrate possesses an ability to chelate Al³⁺ and secretion of citrate from the root apex plays an important role in Al resistance in some plant species. The secretion of citrate is proposed to be mediated by an anion channel on the plasma membrane. In the present study, identification of Al-induced membrane-bound proteins was attempted in rye. Rye secrets both malate and citrate in response to Al and the secretion of citrate was delayed for several hours after the exposure to Al. Membrane proteins were extracted from the root apices (0-5 mm) exposed to Al or not for 12h and subjected to 2D-PAGE analysis. By comparing protein profile between different treatments, 26 Al-induced proteins were detected. Some candidate proteins were then subjected to LC-MS/MS analysis and 16 proteins were hit in the database. The relationship between these proteins and the citrate secretion is now under investigation.

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Rice is a highly Al-resistant species among small grain crops, but the mechanism responsible for the high Al resistance has not been understood. Rice mutants which are sensitive to Al were isolated from M₃ lines derived from a cultivar of Koshihikari radiated with γ-ray. Relative root elongation (RRE) was used as a parameter for evaluating Al resistance. After 3 rounds screening, two mutants (Alsr17, Alsr22) were isolated from F3 560 lines. These mutants showed highly Al sensitive compared with the wild type (WT, Koshihikari). Root elongation was hardly inhibited by 30*M Al in the WT, but was inhibited by 80% and 90%, respectively, in the mutant Alsr17and Alsr22. The Al content of root apices (0-1 cm) was much lower in the WT than in the two mutants. Further characterization of these mutants and mapping of responsible genes are currently being undertaken.

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　植物金属ストレスの1つであるAlストレスに対して誘導性を示す遺伝子は既に多数単離されているが、誘導機構そのものに関する解析は進んでいない。我々はその遺伝子レベルでの解明を試みている。
　アラビドプシス由来のAl誘導性遺伝子である2つのAtGST遺伝子 (AtGST1、AtGST11) のプロモーター領域とGUSリポーター遺伝子との融合遺伝子を持つアラビドプシス形質転換植物を用いて、各々の遺伝子のAlストレス条件下での発現時期と発現領域を蛍光定量法と染色法で検討した。その結果、AtGST1遺伝子は処理開始後約2時間目に主に葉で、AtGST11遺伝子は8時間目付近で葉と根で発現し、両者間ではAlストレスに対して異なった応答性を示した。　　
　また根の処理に対して葉で応答が見られたことから、根から葉へのシグナル伝達機構が存在している可能性が示唆された。さらにpAtGST11::GUS融合遺伝子形質転換体を用いた葉の組織学的観察では応答反応は葉脈部分で特異的に見られ、根からのシグナルや転写因子等は葉脈にそって移動すると思われる。またAlストレスの毒性の度合いに応じて葉での応答性に違いが見られたことから、このシグナル伝達は毒性度に依存することが示唆された。

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酸性土壌で発現するAlストレスに対し、イネは最も高い耐性を示す作物の一つである。イネは、有機酸放出非依存型のAl耐性機構を備えている可能性が高いが、その詳細なメカニズムは明らかにされていない。本研究では、Al耐性の異なるイネ2品種（コシヒカリ、Al耐性；カサラス、Al感受性）を用い、根端や地上部へのAlの集積に着目してイネのAl耐性機構を解析した。コシヒカリおよびカサラスの根伸長は、それぞれ50μM、15μM Alにおいて50％抑制され、この抑制率はAl処理開始後5時間から24時間まで常に一定であった。根伸長が50％抑制されるAl処理条件において、根端におけるAl集積量を比較したところ、両品種はほぼ同量のAlを集積していた。さらに、50μMAl処理において、コシヒカリではカサラスに比べ根端におけるAl集積量は低いものの、地上部のAl含量は高かった。これらの結果から、両品種において、Alによる根伸長抑制は根端Al集積量に依存する事、さらに、コシヒカリはカサラスに比べ地上部へのAl移行能力が高いために根端中のAl集積量が低くなりカサラスよりも高いAl耐性を示す可能性が示唆された。

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イネはアルミニウム(Al)に強い作物であるが、その耐性機構は不明である。本研究では、イネのAl耐性を細胞レベルで検討するために、ニッポンバレ由来の培養細胞株と、比較のためにタバコ培養細胞株(SL)を用い、Alに対する応答反応を解析した。
　イネ細胞はタバコ細胞よりもはるかに高いAl耐性を示すが、NaClに対する感受性は同程度であった。タバコ細胞に比較して、イネ細胞ではAl吸着量が抑制されていたことから、イネ細胞におけるAl吸着抑制機構について検討した。NMR解析の結果、イネ細胞の外液に存在するAlイオンは大部分モノマーであった。従って、イネ細胞がキレート物質を放出してAlの吸着を抑制している可能性は低い。イネ細胞とタバコ細胞の細胞外液のpH変動ならびに原形質膜画分のH⁺-ATPase活性を比較検討した結果、イネ細胞では原形質膜のH⁺-ポンプ活性を高めることによってアポプラスト領域のH⁺濃度を高め、陽イオンであるAlイオンの吸着を抑制している可能性が示唆された。

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複合形質であるAl耐性に関与する遺伝子群の特定には、自然のバリエーションを活用
することは非常に有用である。これまでに、我々はColumbia (Col)×Landsberg
erecta (Ler) RIラインを用いてAl耐性に関与するQTL (quantitative trait locus)
を複数推定している。これらの遺伝子座にはシロイヌナズナ種内のAl耐性のバリエー
ションを説明する遺伝子が存在するが、それらはColとLerのAl耐性の差異に基づくも
のだけである。先に報告したように、コレクションされている約260のアクセッショ
ンについてAl耐性を評価したところ、非常に異なったAl応答を示し、ColとLerの形質
値にはみられない値をとるアクッセッションが多数存在した。従って、シロイヌナズ
ナ種内にはCol、LerのAl耐性差異に基づく対立遺伝子で説明できない多くの遺伝要素
が存在すると考えられる。そこで、先とは異なるLer×Cape Verdi Island (Cvi)RIラ
インを用いてQTL解析を行った。その結果、今回推定された単因子QTL及び、エピスタ
シスの内、先のLer×ColのRIライン集団から推定されたQTLと同じ染色体上ポジ
ションに存在するものもあった。しかしながら、多くは異なる新規のAl耐性QTLであ
り、シロイヌナズナ種内のAl耐性のバリエーションを説明できる新規のQTLが明らか
となった。

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　植物根端の回旋運動にAlが与える影響を、超高感度カメラを用いて解析した。実験サンプルには播種後3~4日目のイネ(Oryza Sativa L., cv. Nipponbare)を用いた。水耕液のpHは全て4.5で行った。
　0.2μMCaCl2水耕液中ではイネ根端の回旋運動は、根長が約1cmに達してからあらわれ、根端から1.5mm付近で大きく屈曲した。また屈曲の角度（回旋角度）は平均して伸長方向に対して20度程度であり、根端が1回転するのに要した時間（回旋周期）は約50分であった。正常な回旋運動を示しているサンプルの水耕液をAl処理液に入れ替えても回旋周期に変化は見られなかったが、回旋角度はただちに減少、停止した。その後Al処理濃度が5および10μMの場合は回旋運動の再開が認められたが、50μMの場合は再開は確認できなかった。Al処理濃度が高くなるにつれて回旋運動はより短時間で停止し、再開までの時間は長くなる傾向にあった。
　また、Al障害の指標として用いられる根伸長阻害についても調べたところ、Al処理濃度が5μMの場合については根伸長阻害は確認されなかった。しかし同一条件下で回旋運動の抑制が見られたことから、今回確認されたAlによる根端の回旋運動の抑制は根伸長阻害よりもAl毒性の初期の影響であることが初めて示唆された。これは同時に、Alの毒性が根の伸長と根端の回旋運動という二つの異なる運動にそれぞれ影響を与えるということを示唆するものだと考えられる。

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ネリカ稲は90年代に西アフリカ・コートジボアールのWARDAにおいて開発された新規のイネである。ネリカ稲は病害虫や乾燥に強いことが知られているが、塩ストレスに対しての生理生化学的な応答については明らかになっていない。そこで本研究ではネリカ稲の耐塩機構を明らかにすることを目的に、それらの耐塩性の検定とともに塩ストレス時におけるNaの吸収性や遊離アミノ酸、ポリアミン含有量の変化について日本型イネ（日本晴）との比較を行った。
ネリカ稲7品種(NERICA 1-7)と日本晴について葉身部のクロロフィル蛍光（ΦII）に対する塩ストレスの影響を調べたところ、NERICA 2を除くとネリカ稲は日本晴よりもΦII低下の程度が抑えられており、耐塩性が強いことが認められた。塩感受性品種のNERICA 2や日本晴では葉身部へのNaの蓄積が大きく、また遊離アミノ酸含有量も塩処理によって増加した。ネリカ稲は7品種とも葉身部のポリアミン含有量が日本晴よりも高く、特にスペルミジン含有量が最も高かった。塩処理によって葉身部のポリアミン含有量は著しく低下したが、耐塩性の最も強かったNERICA 1では比較的高く維持されていた。以上のことから、ネリカ稲の耐塩性には葉身部へのNaの移行の抑制だけでなく、ポリアミンの生合成能力や代謝能力も関係していることが示唆された。

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Glycine betaine is an important osmoprotectant and synthesized in response to abiotic stresses. Although almost all known biosynthetic pathways of betaine are two-step oxidation of choline, we isolated two N-methyltransferase genes from a halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica. One of gene products catalyzed the methylation reactions of glycine and sarcosine with S-adenosylmethionine acting as the methyl donor. The other one specifically catalyzed the methylation of dimethylglycine to betaine. Both enzymes are active as monomers. Betaine did not show the feed back inhibition for the methyltransferases even in the presence of 2 M. S-Adenosyl homocysteine inhibited the methylation reactions with relatively low affinities. The co-expressing of two enzymes in E. coli increased the betaine level and enhanced the growth rates. Immunoblot analysis revealed that the accumulation levels of both enzymes increased with increasing the salinity. Physiological and functional properties of methyltransferases were discussed.

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Genome sequences of cyanobacteria revealed the presence of a single Ca²⁺/H⁺ antiporter in these organisms. We isolated the putative Ca²⁺/H⁺ antiporter gene from Synechocystis sp. PCC 6803 (synCAX) as well as a homologous gene from a halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica (apCAX). In contrast to plant vacuolar CAXs, the full length apCAX and synCAX genes complemented the Ca²⁺-sensitive phenotype of an E. coli mutant. ApCAX and synCAX proteins catalyzed specifically the Ca²⁺/H⁺ exchange reaction at alkaline pH. Immunological analysis suggested their localization in plasma membranes. The Synechocystis sp. PCC 6803 cells disrupted of synCAX exhibited lower Ca²⁺ efflux activity and a salt sensitive phenotype. Overexpression of apCAX and synCAX enhanced the salt tolerance of Synechococcus sp. PCC 7942 cells.

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　ベタインを蓄積する植物のベタイン生合成経路にはS-adenosylmethionine synthetase（SAMS） とcholine monooxygenase（CMO）が関与している。SAMSは他の物質の生合成経路、たとえばリグニンの合成経路等にも関わる。我々はアカザ科の塩生植物Atriplex nummulariaより推定のSAMSとCMO遺伝子をクローニングし、それぞれAnSAMSとAnCMOと名付けた。葉や茎においてAnSAMSのmRNA量と蛋白質量は塩処理により上昇した。AnCMOのmRNA量と蛋白質量は根より葉や茎で高く、塩処理により上昇した。塩処理時と塩除去時の葉におけるAnSAMSの転写量の調節パターンはAnCMOのそれと非常に似ていた。この植物の葉のベタインとリグニンの含有量は、SAMSが合成に関与する他の物質の含有量に比べ非常に高い。その葉におけるベタイン含有量は塩処理により上昇するのに比べリグニン量は変化しなかった。これらの結果は、この植物の葉においてAnSAMSの転写量はベタインの合成のために調節されていることを示唆している。

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Diatoms are secondary symbiotic photoautotrophs that contribute approximetly 25% global primary productivity. Many diatom species inhabit in brackish water and seem to acclimate to broad range salt concentrations. It was shown previously that the marine diatom Phaeodactylum tricornutum grew in [NaCl] from 0.1 to 1.5 M. In this study, Na⁺ and Cl^- fluxes were monitored under several ambient [NaCl] using ion-specific-fluorescence indicators. At [NaCl] below 0.5 M, both ions accumulated in periplastidal compartment, an intermembrane space of tetra-layered chloroplastic envelope of secondary endosymbionts, whereas only Na⁺ accumulated in chloroplast at 1.0 M NaCl. 360 μM ouabain and 100 μM EIPA, inhibitors respectively for Na⁺/K⁺-ATPase and Na⁺/H⁺-antiporter, completely abolished Na⁺ influx and dissipated periplastidal Cl^- accumulation at 0.5 M NaCl. These observations indicated that the periplastidal compartment might play a crucial role during acclimation of cells to broad range [NaCl], and that these ion fluxes are driven by Na⁺/K⁺-ATPase and/or Na⁺/H⁺-antiporter.

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　我々は植物およびラン藻のNa⁺/H⁺アンチポーターの機能解析を進めている。Synechocystis PCC 6803には、少なくとも5種類のNa⁺/H⁺アンチポーター遺伝子が存在するが、その中のNhaP型Na⁺/H⁺アンチポーター(SynNhaP1)は、植物、動物、バクテリアのものと相同性が高い（Plant Physiol., 125, 437-446 (2000))。また、耐塩性ラン藻から単離したNhaPタイプNa⁺/H⁺アンチポーター(ApNhaP1)は大腸菌の欠損株を相補して、0.2MNaClでも生育し、Ca²⁺/H⁺の交換活性をもち、しかもその活性は、pH5～9の広い範囲で高い値を示した（J. Biol. Chem 276, 36931-36938 (2001)）。ApNhaPを淡水性ラン藻Synechococcus PCC 7942で過剰発限させると、淡水性ラン藻は海水で生育した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4109-4114 (2002)）。これらの結果について報告する。

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塩性植物であるThellungiella halophila (salt cress)はArabidopsisの近似種で、外観の類似性以外にも、植物体が小さい、生活環が短い、種子の多産といったArabidopsis同様の形質を持つ。さらに塩基配列レベルでArabidopsis遺伝子の90-95%の相同性を有する。T.halophilaは500mMの塩水下でも生育することが出来るが、塩線や特別な形質変化を伴うことなく塩ストレスに適応する。このことからT.halophilaの耐塩性は非塩性植物の耐塩性機構と似た機構を用いていることが想像された。そこでT.halophilaの耐塩性機構を調べるために、Arabidopsis cDNA microarrayを用いてマイクロアレイ解析を行った。その結果、T.halophilaはArabidopsisに比べて、ストレス非存在下で塩ストレスを含む非生物ストレス誘導性遺伝子および生物ストレス誘導性遺伝子も高発現させていることが明らかとなった。活性酸素消去系の遺伝子が高発現していたことからT.halophilaに活性酸素ストレスを与えたところ、予想通り活性酸素にも耐性を示した。これらの結果からArabidopsis のcDNA microarrayを用いた解析が、その近似種であるT.halophilaの耐性機構を調べるのに有効であることが示された。

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One of the biochemical changes possibly occurring when plants are subjected to stress conditions is the production of active oxygen species (AOs). These AOs can seriously disrupt normal metabolism through peroxidative damage of lipids, proteins and nucleic acids. Antioxidative enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), and glutathion reductase (GR) are reported to take part in AOs scavenging systems and involve in stress tolerance of some plants.
The present study was conducted in order to find some evidences linking effects of salt stress on oxidative stress in rice. A significant increase in lipid peroxidation in stressed seedlings was found; this correlated with salt sensitivity of the tested cultivars. Increase in SOD, APX, GR, and decrease in CAT activities were observed. Relationships between constitutive and stress-induced activities of these enzymes with salt tolerance of rice were discussed by using cultivars with different levels of salt tolerance.

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The monogenic recessive mutation npct1-1 isolated by screening an Arabidopsis thaliana population of T-DNA insertion mutants causes NaCl sensitivity of seedlings. The T-DNA is inserted 680 bp upstream of the At5g44370 initiation codon. A second allele npct1-2 was obtained and both npct1-1 and 1-2 seedlings exhibit NaCl sensitivity that is characterized by cessation of terminal root growth, increased lateral branching and swelling of root tips. npct1 seedlings are hyperionic but not hyperosmotic sensitive with differential sensitivity to Cl^- that is greater than to Na⁺ or K⁺. NPCT1 is a member of the Na⁺-dependent inorganic phosphate co-transporter-like-protein family (organic solute co-transporter gene superfamily). Some of these are known as VGLUT (vesicular glutamate transporter) in mammal. A chimeric NPCT1-GFP localized to the Golgi apparatus based on transient expression assay. A salt adaptation function for NPCT1 in xyloglucan deposition to the cell wall is hypothesized.

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（目的）高等植物のペルオキシソームは、細胞の機能状態に応じて機能変換することが知られており、私達はトランスクリプトーム解析からグリオキシソーム、子葉ペルオキシソーム、緑葉ペルオキシソーム、根ペルオキシソーム、特殊化していないペルオキシソームの5種に分類できることを明らかにした^1）。発芽過程では、光照射により同一細胞内で直接的にグリオキシソームから緑葉ペルオキシソームへの機能変換がおこるが、その機構は明らかになっていない。私達は光照射で誘導されるペルオキシソーム機能変換過程を詳細に解析するため、マイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析を行った。
（結果）シロイヌナズナを4日間暗所で生育後、2、6、12、24時間連続光を照射した子葉での遺伝子発現パターンを調べた。この結果、既知のグリオキシソーム酵素遺伝子や緑葉ペルオキシソーム酵素遺伝子の光に応答した発現パターンと、同様の発現パターンを示す未知のペルオキシソームタンパク質の遺伝子が得られた。一方脂肪酸b-酸化系を欠損する突然変異体についても同様に、光照射に対する遺伝子発現パターンを解析したところ、未知のペルオキシソームタンパク質の遺伝子で、光に対して野生型とは異なる発現パターンを示すものが存在した。これらの結果をもとに、光依存的なペルオキシソーム機能変換の遺伝子発現制御について考察する。
1) PCP 2003 in press

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高等植物のペルオキシソームは、脂肪酸代謝、光呼吸など種々の重要な機能を担っているオルガネラである。我々は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) に peroxisome targeting signal 1 (PTS1) を付加することにより、ペルオキシソームが可視されたシロイヌナズナ形質転換体を親株として EMS により変異処理を行い、GFPの指標としたスクリーニングから、ペルオキシソーム形成が異常になったapm (aberrant peroxisome morphology) 突然変異体を多数選抜し、ペルオキシソームの形成機構の解析を進めている。
apm2突然変異体は、GFP蛍光がペルオキシソームのみならず、サイトソルでも検出されることからペルオキソームへの PTS1 経路の輸送効率が低下した変異体であると考えられる。興味深いことに、この変異体では PTS2 輸送経路の効率も低下していることが明らかとなり、APM2 タンパク質は両輸送経路の共通な因子であることが予想された。マッピングの結果、APM2 遺伝子は、ペルオキシソーム形成に関与するとされる PEROXIN13 (PEX13) に相同性のあるタンパク質をコードしていることが明らかとなった。免疫電子顕微鏡観察の結果、PEX13 タンパク質はペルオキシソームに局在し、また、酵母2 ハイブリッドの結果から、PTS2 レセプターである PEX7 と相互作用することが明らかとなった。

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[目的]高等植物のペルオキシソームは、個体の生長において脂肪酸代謝や光呼吸に関与する重要なオルガネラである。近年、他の生物種のペルオキシソーム研究から、ペルオキシソームの形成維持に関わる因子群（ペルオキシン）が26種報告されているが、その大部分の生理機能は未だ明らかでない。そこで我々は多細胞生物におけるペルオキシソーム形成とその機能調節を統合的に理解することを最終目的として、シロイヌナズナペルオキシンを全て網羅しRNAiを用いた機能解析を行った。
[結果]相同性検索によりシロイヌナズナゲノム上には、15種21個のペルオキシンホモログが存在することがわかった。次にGFPにペルオキシソーム輸送シグナル（PTS）を付加したタンパク質を発現しているシロイヌナズナを親株として、それぞれの因子を単独でまたは重複してRNAiにより遺伝子発現を抑制し、GFPの蛍光パターンを中心にいくつかの器官・組織における表現型解析を行った。その結果、それぞれの遺伝子抑制株が、（1）GFPが細胞質に留まるもの（2）ペルオキシソームが巨大化するもの（3）ペルオキシソームの形が変わるもの（4）全く親株と変化がないものに分類された。また、いくつかの個体では各器官・組織・生長過程によってGFPのパターンが変化したことから、これらの因子の機能発現が植物個体全体で一様ではないことも示された。

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コケ植物はセン類、タイ類、ツノゴケ類に分類されている。コケ植物のミトコンドリアゲノムの構造はタイ類のゼニゴケで報告されているが、セン類のヒメツリガネゴケでは4つの遺伝子(nad2、nad5、nad7、cox3)しか報告されておらず、ミトコンドリアゲノムの全体像は分かっていない。本研究ではヒメツリガネゴケのミトコンドリアゲノムの構造解析を行った。報告されているヒメツリガネゴケの4つの遺伝子とゼニゴケの遺伝子(cox1、cox2、nad1、nad3、nad4L、nad6、atp6、atp9)の特異的な配列より作製したプライマーを用い、考えられるすべてのプライマーの組み合わせで100通り以上のLA PCR法を行い、7つのDNA断片を得た。これらを用いてcox1からcox3遺伝子間(nad7、nad3、nad1を含む約30 kbp)とcox2からnad5遺伝子間(nad6、nad2を含む約20 kbp)の各々のコンティグのシークエンスを行った。同定した遺伝子では近縁のゼニゴケとのアミノ酸配列はほぼ一致したが、DNA配列ではイントロンの数やその入る場所が異なるものがあった。今後は、さらにヒメツリガネゴケのミトコンドリアゲノムの構造解析を進めていく予定である。

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CND41は葉緑体DNA結合タンパク質として単離され、アスパラギン酸プロテアーゼの活性部位を保存している新規なDNA結合性プロテアーゼである。精製CND41は酸性条件下で強いプロテアーゼ活性を示す（FEBS Lett. 468:15,2000）のみならず、生理的pH条件下(pH 7.5)においても変性したRubiscoを基質とすることが認められている。またCND41の発現を抑制した形質転換体を用いた解析からもCND41が生体内でRubiscoを分解し、植物個体の老化を制御している可能性が示唆された。しかし、CND41の活性の制御については不明な点が多くある。今回、CND41を特異的に認識する抗体を用い、CND41のプロセッシングとその活性について検討を進めた。これまでにCND41の発現は加齢に伴い転写レベルで増加することを認めていたが、今回、タンパク質レベルでも顕著に蓄積が増大することを認めた。さらにCND41は加齢に伴って、分子量の小さな分子にプロセッシングされていることを示す結果を得た。このことは野生株ならびにCND41高発現株のいずれにおいても観察され、特に高発現体を用いた結果より、プロセッシングがプロテアーゼ活性の活性化に寄与していることが示唆された。このことを確認するためにプロセッシングされたCND41の精製とその機能解析を進めている。

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植物のオルガネラ（色素体とミトコンドリア）のDNA複製機構については不明な点が多い。我々は、タバコBY-2細胞のオルガネラ核を用いた生化学的解析により、オルガネラDNAの合成が細胞増殖初期に一過的に活性化されること、両オルガネラのDNAポリメラーゼの性質は互いに酷似しており、動物や菌類のミトコンドリアDNAポリメラーゼ (polγ) よりも細菌のDNAポリメラーゼI (polI) に近いことを明らかにしている。アラビドプシスのゲノム中にはpolγ相同遺伝子は同定できず、代りに色素体とミトコンドリアへの輸送が予測される二つのpolI相同遺伝子が存在する。最近、イネでは実際にpolI型DNAポリメラーゼが葉緑体で働いていることが確認された。我々は、タバコESTクローン中からpolIの3'→5’エキソヌクレアーゼドメインと相同性を示すクローンを見いだし、RACE法によりcDNAの全長を単離した。1152アミノ酸からなる推定翻訳産物はTargetPプログラムにより葉緑体への移行が高い確率で予測された。アミノ酸配列を用いた分子系統樹は、この遺伝子がpolγより植物のpolI相同遺伝子に類縁であることを示唆した。また、RT-PCRによる発現解析の結果、mRNA量は培養開始直後に増大し、培養後期には減少することが分かった。

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　植物・藻類では、オルガネラゲノムの複製酵素は同定されていない。ゲノムプロジェクトによりゲノム塩基配列が決定されたArabidopsis thalianaや単細胞性紅藻Cyanidioschyzon merolaeには、ミトコンドリアの複製酵素と考えられているDNAポリメラーゼγは存在していない。C. merolaeの核ゲノムから、大腸菌DNAポリメラーゼIと相同なDNAポリメラーゼをコードする遺伝子が2個見つかった (PolA、PolBと呼ぶ)。
　PolAとPolBの細胞内局在を、GFPと単離プラスチドについての免疫ブロットで調べた。これらの結果から、PolAとPolBはプラスチドとミトコンドリアの両方に局在することが示唆された。PolAとPolBをチオレドキシンとの融合タンパク質として発現、精製し酵素活性を測定した。PolAとC. merolaeのプラスチド核様体のDNA合成活性に対する阻害剤の効果を調べた。その結果、100 μM ddTTPを加えた時PolAの活性はほぼなくなるが、プラスチド核様体の活性は半分になった。この結果は、C. merolaeのプラスチド核様体には2種類のDNAポリメラーゼが存在することを示唆している。現在、C. merolaeの同調培養を行っており、細胞周期におけるPolAとPolBの発現パターンを調べる予定である。

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亜硫酸還元酵素（SiR）は植物では核ゲノムにコードされ、プラスチドのストロマに局在するタンパク質で、エンドウではプラスチド核様体の主要構成成分であることが示されている。プラスチドDNAは、細胞内共生体であるシアノバクテリアに起源を有すると考えられているが、SiRの相同タンパク質がシアノバクテリアの核様体を構成する成分であるかは明らかでない。本研究では、シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120、および単細胞性原始紅藻Cyanidioschyzon merolae 10Dの亜硫酸還元酵素のDNA結合能を調べることを目的とした。N末端にGST、C末端にヒスチジンタグをつけたものを大腸菌を用いて発現させ、カラム操作等により可溶性のSiRタンパク質をほぼ単一に精製した。シロヘム合成酵素をコードする遺伝子を導入したプラスミドを宿主に共存させたところ、SiRの発現量が多くなった。可視部吸収スペクトルの測定により、これが発色団をもつタンパク質であることが確認された。GST融合タンパク質を抗原として作製した抗体は、紅藻の単離核様体と反応した。葉緑体DNAと精製SiRタンパク質を混合し、蛍光顕微鏡で観察したところ、顆粒がみられた。SiRのDNA結合性について、さらにゲルシフト解析などにより詳しく調べている。

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亜硫酸還元酵素（SiR）はプラスチドに局在し，フェレドキシンからの電子供与を受け亜硫酸塩を硫化水素に還元する酵素である。またSiRはプラスチド核様体を構成する主要なタンパク質でもある。すでに，シロイヌナズナ，トウモロコシ，タバコについてSiRのcDNAの塩基配列が決定されている。エンドウSiRのcDNAを得るため，それらのアラインメントからディジェネレートプライマーを設計し，エンドウのゲノムからPCRによってプローブを作成し，cDNAライブラリーからスクリーニングを行った。その結果，トランジットペプチドの途中からのアミノ酸配列をコードするcDNAを得た。また，別のライブラリーから下流側が重複する短いcDNAを得た。サザン解析の結果からエンドウではSiR遺伝子はシングルコピーであると推定されることから，二つのcDNAを繋げエンドウSiRの塩基配列とした。7日間明所と暗所で育てたエンドウを用いてノーザン解析を行った結果，SiR転写産物レベルに顕著な差は見られなかった。SiRのアミノ酸配列からは明らかなDNA結合モチーフは見つからなかったが，組換えタンパク質を用いたゲルシフト解析からSiRは葉緑体DNA以外にもクローニング用プラスミドや大腸菌由来のDNAと結合することが分かった。現在，SiRのDNAへの結合様式について詳細な解析を行っている。

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葉緑体（クロロプラスト）は、核とは別に120～150kbpの独自の2本鎖環状のDNAを持ち、これは核様体構造を形成している。植物には、クロロプラストの他にエチオプラスト、アミロプラスト、クロモプラストなどさまざまなプラスチドが存在するが、多くの組織細胞では、プラスチド核様体を観察することは容易ではない。プラスチド核様体を可視化する手法として、PENDタンパク質のN末端側とGFPとの融合タンパク質を発現するシロイヌナズナの安定な形質転換体を作成した。PENDタンパク質は、葉緑体包膜のDNA結合タンパク質であり、N末端近くにbZIP様のDNA結合ドメインをもち、N末端領域を含むGFP融合タンパク質は主に核様体に局在することがわかった。安定な形質転換体でも同様の局在が見られた。この安定な形質転換体を用いて、これまで固定した植物材料を用いてしか観察されていなかった核様体を選択的に生きたまま観察することに成功した。今までプラスチド核様体だけを観察することが困難であった緑でないプラスチドを持つ根、花、花粉などについても蛍光顕微鏡で観察した。また、トライコームや根冠のプラスチドのダイナミックな挙動をリアルタイムで観察した。さらに、プラスチドの分裂に伴う核様体の形態の変化や分配のされかたについても報告する予定である。

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シロイヌナズナのcrumpled leaf (crl)変異体では、細胞分裂、細胞分化及び色素体分裂に異常を示す。また、CRLタンパク質は色素体外包膜に局在していることが明らかとなっている。ルビスコ小サブユニットのトランジットペプチドを融合したGFPがcrl変異体の発生初期の葉や根においては色素体に輸送されないことなどから、CRLタンパク質は色素体へのタンパク質輸送に関与する新しい因子ではないかと考えている。
今回、CRLタンパク質が色素体へのタンパク質輸送に直接関与しているかを明らかにするための一つの方法として、抗CRL抗体カラムを用いて、シロイヌナズナよりCRLタンパク質複合体を精製した。その結果CRLタンパク質複合体にはルビスコ小サブユニットやその他の葉緑体に局在するタンパク質の前駆体タンパク質が含まれていることが明らかとなった。この結果は、CRLタンパク質が色素体へのタンパク質輸送に直接関与するという我々の仮説を支持するものと考えられる。また色素体へのタンパク質輸送と植物の形態形成の関連を調べる為に、葉緑体へのタンパク質輸送に関与するatToc159の変異体ppi2変異体の形態の解析及びcrl ppi2二重突然変異体の形態の解析を行っている。

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維管束は木部、篩部、前形成層からなる複合組織であり、その形成は非常に秩序だっている。しかし、その分子機構の詳細は明らかになっていない。私達はこれまでにヒャクニチソウHD-Zip型クラスIIIホメオボックス遺伝子を単離し、これらが木部分化に関わることを示してきた。今回、その中の一つZeHB-12について機能解析を進めた。まず、ZeHB-12の転写活性化能およびDNA結合能を調べた。その結果、ZeHB-12は正の転写活性化能を有すること、および、少なくともTAATNATTA配列に結合することがわかった。これらの結果は、ZeHB-12が転写因子としてはたらき得ることを示している。次に、ZeHB-12が制御する下流の遺伝子を23K genechipを用いて調べた。デキサメタゾン（DEX）存在下で目的遺伝子を過剰発現させる系を用い、シロイヌナズナにZeHB-12を導入した。DEXによるZeHB-12誘導後3時間あるいは6時間で約2.5倍以上発現量が変動しかつコントロールでは変動しない遺伝子を選抜した。ZeHB-12誘導後発現が上昇していく遺伝子群には、転写因子が多く含まれていた。また、木部分化のなかでも特に木部柔細胞に発現すると考えられる遺伝子が複数あった。これらの結果から、ZeHB-12制御下の転写カスケードの存在と、ZeHB-12が木部柔細胞分化の進行に関与していることが示唆された。

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　維管束植物の道管・仮道管を構成する管状要素は、その分化過程で二次細胞壁の形成、細胞死・自己分解を起こし、空洞の死細胞となる。我々は単離葉肉細胞から管状要素への分化を効率的に誘導できるヒャクニチソウ培養細胞系を用いて分化機構の分子生物学的な解析を行っており、これまでにcDNAマイクロアレイ解析などによって分化誘導条件特異的かつ一過的な発現を示す多数の遺伝子を単離している。その中に含まれるある脂質分解酵素遺伝子は、ヒャクニチソウ芽生えの茎頂部分を用いたin situ 発現解析でも細胞死を起こす前の管状要素にのみ発現することがわかっている。今回はそのシロイヌナズナホモログを同定し、分子生物学的・分子遺伝学的な解析を行った。まず上述の遺伝子配列と最も相同性の高いシロイヌナズナORFの上流域約2 kbpをレポーター遺伝子に接続したコンストラクトを作成してシロイヌナズナ植物体に導入し、得られた形質転換体を観察した。その結果やはり細胞死を起こす以前の管状要素に特異性の高い発現が見られ、このORFが相当する遺伝子をコードすると考えられた。また、他にも根冠、花器官の細胞などでも発現が観察された。さらに機能解析を行う目的でシロイヌナズナの過剰発現植物体を作出した。現在詳細な表現型解析を行っており、これらの結果を基にこの遺伝子の機能について考察する予定である。

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　私たちは、ヒャクニチソウのin vitro管状要素分化誘導系とそれを基に作成したcDNAマイクロアレイを用いて維管束分化・形成に関わる遺伝子について網羅的な解析を行ってきた。今回は、in vitro管状要素分化過程の中期に発現が一過的に上昇する遺伝子群の中から見いだされた植物特有の転写制御因子であるNACドメインタンパクをコードするヒャクニチソウ遺伝子(Z567)のシロイヌナズナのホモログの機能解析について報告する。シロイヌナズナゲノムからZ567ホモログを探索したところ、相同性の高い7つの遺伝子VND (Vascular related NAC-Domain protein) 1～7遺伝子が見いだされた。まず、プロモーター解析を行った結果、VND6遺伝子以外はシロイヌナズナの根の維管束において発現が観察され、そのうち、VND5とVND7遺伝子に関しては未成熟な道管に強い発現が認められた。さらにVND遺伝子の過剰発現体を作成したところ、VND7遺伝子過剰発現体の根の皮層などに異所的な道管分化が観察された。このことによりVND7遺伝子が道管分化の正の制御因子であることが強く示唆された。

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植物緑葉における葉緑体機能の構築過程は，光などの環境要因に加えて内的プログラムに依存する．このプログラムを解明するために，アクティベーションタギング法を適用し，シロイヌナズナのカルスにおいて光合成遺伝子RBCS が発現するようになった突然変異系統 ces 101 (callus expression of RBCS ) の選抜に成功した．発現が最も促進されていた受容体キナーゼ遺伝子を親系統に導入し発現させたところ，ces 101の表現型が再現できた．したがって，CES101は受容体キナーゼであると考えられた．リアルタイムRT-PCR解析によって，CES101は葉特異的に発現していることが明らかになった．また，CES101とmRFP1との融合タンパク質を発現するコンストラクトを構築し，ゴルジ体局在sGFP遺伝子と一過性発現させた．その細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ，CES101はゴルジ体に局在していた．ces101 系統カルスと親系統カルスにおける転写産物量をマイクロアレイにより解析した結果，ces101 系統において多くの光合成関連遺伝子の発現が高くなっていた．ces102 系統カルスにおいても，アクティベーションタグされ活性化された遺伝子の解析を行っているので，あわせて報告する．

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ムジナモは水面下に浮遊する食虫植物であり、ミジンコなどの水生小動物が捕虫葉表面の感覚毛に触れると、迅速に二枚貝様の葉を閉じてそれを捕える。その後消化腺毛から分泌した消化酵素で獲物を分解し、吸収毛で分解物を吸収すると考えられている。本研究は、in vitroで培養・増殖させたムジナモを用い、特に消化に関わると考えられている消化腺毛の微細形態と機能との関わりを明らかにすることをその目的とした。
培養液中で活発に生育しているムジナモから捕虫葉を切り出し、化学固定または急速凍結固定を行い、超薄切片を作製後、透過電子顕微鏡で観察した。消化腺毛ではラビリンチン壁や層状のER、タンニン液胞が発達していた。セリウムを用いた細胞化学法により、消化酵素の一つである酸性フォスファターゼ活性が、成熟葉の発達した消化腺毛の細胞壁とERに局在していることが観察された。これに対し、未成熟な捕虫葉の消化腺毛では、細胞化学的にフォスファターゼ活性の存在は確認できなかった。成熟葉と未成熟葉における酸性フォスファターゼ活性のこのような違いは、葉の粗抽出液中のフォスファターゼ活性を調べることによっても確認された。
さらに、ムジナモ捕虫葉にミジンコを捕食させ、その後の消化腺毛の微細構造変化と酵素活性の局在性の変化について検討した。捕食後の消化腺毛では、タンニン液胞やERの形態、細胞骨格などに顕著な変化が起こることが観察された。

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　動物細胞における細胞死促進因子Baxは、酵母や植物においても細胞死を誘引する（Kawai et al., PNAS 2001）。我々は、Baxが植物細胞中において、活性酸素を介し細胞死を引き起こすことを報告した（Kawai et al., Plant Cell 2004）。
　本研究ではBax形質転換シロイヌナズナとオルガネラ移行シグナルを有するGFP形質転換体との交配より得られた後代を作出し、細胞の観察を行った。これらの植物細胞ではBax発現後、原形質流動の停止がみられた。それに伴い、ミトコンドリアの桿状から球状への形態変化が起こり、葉緑体や液胞の選択的膜透過性が失われた。
　次に、外的ストレスに対する細胞内応答を観察することを試みた。すなわち、過酸化水素やサリチル酸処理により細胞死を誘導し、初期過程における細胞観察を行った。その結果、Bax誘導性細胞死と同様に、原形質流動の停止とそれに伴なうミトコンドリアの形態変化が確認された。植物細胞の原形質流動はアクトミオシン系により制御されている。そこでミオシンATPase阻害剤で葉を処理したところ、ミトコンドリアの流動性が失われ、イオンの漏出も起こった。従って、ATPやカルシウムにより制御される原形質流動の停止が細胞死を促進すると推測される。

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　AtBI-1 (Arabidopsis Bax inhibitor-1)は過剰発現させることにより、酵母やシロイヌナズナでBaxによる細胞死を(PNAS, 2001)、またタバコBY-2細胞でH₂O₂およびSAによって引き起こされる細胞死を (Plant Cell, 2004) 抑制する。AtBI-1はERに局在する膜タンパク質であり、C末端の14アミノ酸は細胞質側に局在すると考えられている。この14アミノ酸を欠損させても局在には影響がないが、BaxやH₂O₂による細胞死を抑制する機能が失われる。このC末端領域には動物や植物で保存されている、正や負の電荷を持つアミノ酸が存在している。また、この領域がcoiled-coil構造をとることが推測された。これらのアミノ酸や構造が細胞死抑制活性に関っているのかを調べるために、アミノ酸置換変異体の解析を行ったところ、電荷をもつアミノ酸を非電荷や非極性のものにそれぞれ置換しても、細胞死抑制活性は維持された。それに対し、coiled-coil構造をとれなくなった変異体だけが、細胞死の抑制活性を失った。これらのことから、AtBI-1の細胞死抑制活性にはC末端領域のcoiled-coil構造が必須であることが示唆された。また、酵母2-hybrid法により、AtBI-1がカルモジュリンと結合することを明らかにした。Coiled-coil構造をとれない変異体はカルモジュリンとの結合能も失っていたことから、カルシウムがAtBI-1による細胞死抑制に関与している可能性がある。

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動物のアポトーシス促進因子であるBaxは、植物や酵母にも細胞死を引き起こす。当研究室ではこの現象を利用してAtBI-1 (Arabidopsis Bax Inhibitor-1)遺伝子を単離し、植物内で細胞死抑制因子として機能することを明らかにしてきた。さらに植物細胞の生死コントロールの分子機構を明らかにするため、AtBI-1により機能が抑制される植物由来の細胞死促進因子の単離を酵母を用いて試みた。すなわち、GAL1プロモーターに連結したAtBI-1遺伝子を有する酵母に、シロイヌナズナcDNAライブラリーを導入した。そして、グルコース培地上では生育しないが、ガラクトース培地上で生育する株を単離した。その結果、1クローンが単離され、本遺伝子をcdf1 (cell growth defect factor-1)と命名した。Cdf1タンパク質は258aaをコードする機能未知の因子である。本遺伝子をGAL1プロモーターに連結し、酵母内で発現させると細胞死を誘導し、またその効果はAtBI-1により抑制された。さらに、本因子とGFPとの融合タンパク質は酵母内ではミトコンドリアに、植物細胞内では葉緑体に局在することが明らかとなった。現在、cdf1を高発現する形質転換体の作出を行っており、それらの結果と合わせて、cdf1 による細胞死誘導機構について議論する。

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感染シグナルにより誘導される生体防御反応に伴う局所的プログラム細胞死(PCD)のモデル系として、我々は、タバコ培養細胞BY-2が植物病原菌由来のタンパク質性エリシターを認識し、高度に同調的な細胞死を誘導する実験系を構築した(Kadota, Y. et al. Plant Cell Physiol. in press)。死細胞では、細胞の収縮や細胞質の凝集などの形態的な変化が観察されたが、核の凝集や断片化等、動物細胞のアポトーシスに見られる核の形態変化や顕著なDNAの断片化は観察されなかった。本研究では、このPCDの実行機構を明らかにするため細胞死過程における液胞の動態を解析した。液胞内腔に特異的に蓄積する蛍光色素を用いて、細胞死に至るまでの液胞構造を経時的に観察したところ、細胞死に先立って原形質糸が減少し、液胞の構造が変化することが明らかとなった。このような液胞の形態変化は、過酸化水素水を添加して誘導した細胞死では観察されず、感染シグナル誘導性の細胞死に特異的な現象である可能性が考えられる。また、死細胞では液胞内の蛍光が完全に消失しており、細胞死の実行過程で液胞膜の性質が変化した可能性が考えられた。エリシター誘導性プログラム細胞死において、液胞が形態的、生理的に変化する意義について議論したい。

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植物の感染防御応答の初期過程において、膜電位の脱分極に伴う細胞外からのCa²⁺流入がシグナル伝達に重要な役割を果たすと考えられているが、Ca²⁺動員機構やその分子的実体は、不明な部分が多い。最近我々はイネから膜電位依存性Ca²⁺チャネル候補遺伝子OsTPC1を単離し(2002年本大会)、その機能を解明するために、過剰発現体を作製すると共に、レトロトランスポゾン(Tos17)の挿入による遺伝子破壊株(Ostpc1)を単離した。イネ培養細胞にタンパク質性エリシターを処理して、過敏感細胞死を伴う防御応答を誘導したところ、過剰発現体では、MAPキナーゼの活性化や防御応答が著しく促進され、エリシターに対する感受性が高まったのに対して、Ostpc1では顕著に抑制されていた。これらの結果からOsTPC1は、植物の感染防御応答において、Ca²⁺流入を制御することにより、MAPキナーゼカスケードの活性化やプログラム細胞死の誘導を含む生体防御反応の調節因子として重要な役割を果たしていると考えられる。

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　リボソ－ムを不活性化するRibosome Inactivating Protein (RIP)は、植物に普遍的に存在すると考えられ、抗ウイルスタンパク質としても知られている。我々はさらにRIP依存的にrRNAを切断する新規酵素、RNA Apurinic site specific Lyase (RALyase)を小麦胚芽中から発見し、精製および遺伝子のクローニングに成功している。我々はこれら遺伝子が細胞の自殺機構に関わっているのではないかとの仮説のもと、老化機構との関連性に注目した研究から、RIPの誘導とそれに伴うリボソームの不活性化が老化過程に深く関与していると示唆する結果を得ている。本研究では、さらにこれら遺伝子の生理学的役割を解明することを目的とし、Dexamethasone (DEX)を用いて人為的にRIP、RALyaseを発現誘導できる形質転換タバコを用い、老化およびウイルスに対する過敏感反応について解析した。
　RIPを組み込んだ系統ではDEXによるRIP誘導3日目から顕著に葉が黄化し、成長が阻害された。RALyaseを組み込んだ系統ではDEXによるRALyase誘導30日目から徐々に葉が黄化し始めた。さらに、RIP、RALyaseを誘導したそれぞれの系統にタバコモザイクウイルスを感染させたところ、野生型と比べ、プラークが小さく、数も少なかった。以上より、RIP、RALyaseは老化と抗ウイルスに関するユニークな遺伝子であることが示唆された。現在、これら遺伝子を同時に発現誘導できる形質転換タバコを作出し解析を行っている。

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花弁老化の実行にはプログラム細胞死（PCD）の幾つかの過程が関与することが知られているが、その誘導メカニズムは明らかでない。これまでに演者らは、老化したアサガオ（Ipomoea nil cv. Violet）花弁でDNAのヌクレオソーム単位での断片化や核の断片化といったPCD特有の変化が生じることを確認した。さらに、開花直後から老化直前の各時期に採取した花にRNA合成阻害剤（アクチノマイシンD）を処理すると、花弁の萎れや核の断片化に対する抑制効果が経時的に減少することから、この期間中に花弁の老化誘導に関わる遺伝子が発現すると推定した。本研究では、cDNAサブトラクションとディファレンシャルスクリーニングを行い、推定した老化誘導期（開花直後から老化直前）の花弁で発現量が増加または減少している23種類の候補遺伝子を単離した。さらに、これらの遺伝子についてReal-time RT-PCRを行い、花弁におけるmRNAレベルの変化を詳細に検討したところ、機能未知の3種類のタンパク質や、システインプロテアーゼなど5種類の老化関連因子の他に、脂質転移タンパク質（LTP、SEC14）など4種類の細胞死関連因子をコードした遺伝子との相同性が高いアサガオ遺伝子の発現量が老化誘導期に著しく変化することを確認した。この結果、アサガオ花弁の老化誘導にもPCDの過程が関与している可能性が示唆された。

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液胞プロセシング酵素（VPE）は、液胞タンパク質の成熟化に関わる新規のシステインプロテアーゼである．これまで，シロイヌナズナの3種類のVPE遺伝子（αVPE，βVPE，γVPE）の解析から，βVPEは種子特異的，αVPEとγVPEは栄養器官特異的に発現し，それぞれ特殊化した機能を果たしていることが分かってきた．最近，シロイヌナズナの遺伝子データベースから新たなVPEホモログが見いだされ，δVPEと名付けた．δVPEのアミノ酸配列を既知の全てのVPEホモログと比較したところ，δVPEは種子型VPEs，栄養器官型VPEsとも異なるタイプであることが示唆された．この新規VPEの生理学的な機能を解明する目的で，δVPEに対する特異的抗体を作製した．イムノブロット及び蛍光抗体染色によってその局在を調べたところ，δVPEは種子の発生段階の初期に内珠皮の特定の細胞層(ii2・ii3層)に一過的に発現していることが分かった．δVPEが発現している層では種子形成の過程で細胞死が起きており，δVPE欠損株では内珠皮の細胞死に遅れがみられた．また，細胞死が起きる時期に電子密度の高い構造体が細胞膜と細胞壁の間に現れ，その新規の構造体にδVPEが局在することを明らかにした．これらの結果は，δVPEが内珠皮特定層の細胞死に重要な役割を果たしていることを示している．

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細胞質分裂は動物細胞と植物細胞でその機構が異なる．動物細胞では，アクチンとミオシンを主要な構成因子とする収縮環が分裂面で収縮し，細胞質が分裂する．高等植物では，細胞分裂面で細胞板が形成されることによって細胞質が分裂する．一方，単細胞緑藻類の細胞質分裂に関与する因子についてはほとんど知られていない．セプチンは，動物と菌類でのみ知られる細胞質分裂因子であり，細胞質分裂面に局在するGTPaseである．今回，単細胞緑藻N.bacillarisの核ゲノムで新たに見出されたセプチンNbSepついて報告する． NbSepは，セプチンに特有なGTPaseドメインをもち，ドメイン間の相同性はCDC10（出芽酵母）と41%，Peanut（ショウジョウバエ）と45%，Sept2（ヒト）と42%であった．また，分子系統解析の結果，NbSepは菌類のセプチンと同じグループ1に含まれていた．動物と酵母のセプチンはGTPの加水分解をともなう重合によって繊維状の構造体を形成する．大腸菌で強制発現したNbSepにGTPを加え室温で反応させると，粒状のタンパク質が繊維状(2μm以上)に連なった構造体が観察された．N.bacillarisは3から6μmになり二分裂で増殖する．NbSepの抗体を作製し，細胞分裂時の挙動を解析したところ，NbSepは細胞質分裂が起こる細胞中央にリング状に局在することが明らかとなった．

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私達は高等植物のDNA複製・修復のメカニズムを明らかにするために研究を進めてきた。本研究ではORC（origin recognition complex）と呼ばれる因子に注目した。ORCは複製開始の際に複製開始点を認識し結合する蛋白質複合体である。動物や酵母などでは6つのサブユニットから構成されていることが報告されている。今回、イネから高等植物のORC1～ORC5のサブユニットのcDNAクローニングを行った。すべてのOsORC subunitsで northern blotting解析により発現パターンを解析したところ、茎頂や根端の分裂組織や葉原基など細胞増殖の盛んな組織で発現していた。OsORC subunitsはDNA複製に必須の因子であるため、細胞増殖と関連して発現する事が期待される。そこで、イネの培養細胞を用いたOsORC subunits発現解析を行った。その結果、OsORC1,OsORC3,OsORC4とOsORC5の発現は細胞増殖と密接に関連していることが示唆された。興味深いことに、OsORC2は細胞増殖に関係なく恒常的に発現していた。OsORC2は他のOsORC subunitsとは異なる機能を持っているのかもしれない。

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我々は、NPK1 MAPKKK、NQK1 MAPKK、NRK1 MAPKを構成因子としたタバコのMAPKカスケードを同定している。このカスケードは、NPK1がNACK1キネシン様タンパク質と結合することによって、細胞周期M期後半に活性化される。この経路をNACK-PQRと提唱している。NACK1/NPK1複合体及びNQK1は隔膜形成体に局在しており、これらの機能を阻害したタバコやこれらのシロイヌナズナ・ホモログの変異体では、細胞板の形成が阻害されるために不完全な隔壁を持った多核細胞が観察される。これらの結果から、NACK-PQR経路は細胞板形成を正に制御していると示唆される。しかし、NRK1の生物学的機能は分かっていない。今回、我々は、シロイヌナズナのNQK1ホモログ（ANQ1）がin vitroで特異的にリン酸化するMAPKを同定し、ANR1と命名した。さらに、anr1変異体を分離し、その表現型を観察した。anr1変異体は、矮性を示し、根表面に大きな細胞の突出が観察された。また、anr1変異体の組織では、不完全な隔壁と複数の核を持った大きな細胞が観察された。これらの形質は、atnack1及びanq1変異体の表現型と一致していた。これらの結果から、ANR1はANQ1の下流で細胞板形成を正に制御していると考えられ、このことはNACK-PQR経路の考え方と一致する。

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細胞分裂の制御において中心的な役割を果たし、細胞周期進行のエンジンと言われているのが、CDK (Cyclin-Dependent Kinase) と呼ばれるセリン/スレオニンキナーゼである。 CDKの活性化には、T-ループ領域の特定のスレオニン残基のリン酸化が必須であり、このリン酸化反応は、CDK活性化キナーゼ (CAK) によって触媒される。これまでにシロイヌナズナの4種類のCAKについて機能解析が行なわれた結果、CAK1がCAK2やCAK4をリン酸化し、それらがCDKをリン酸化するというリン酸化カスケードを構成していることが明らかになった。一方でCDKはATP結合領域の特定のチロシンやスレオニン残基のリン酸化により不活性化される。このリン酸化を触媒するのはWee1キナーゼである。最近、我々はシロイヌナズナのWee1はCDKだけではなく、CAKもリン酸化し不活性化する機能も持っていることを明らかにした。また現在これらのキナーゼ群の細胞周期変動にともなう発現、活性レベルの変化および細胞内局在性について解析を行っている。サイトカイニンに対するRNAおよびタンパク質レベルの発現応答についても解析しているので合わせて報告する。

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　シロイヌナズナのsrd2は、脱分化と分裂組織形成に関して温度感受性を示す変異体である。但し、脱分化の温度感受性は胚軸では顕著な一方、根では見られない。この表現型については、胚軸は細胞増殖能が低く、増殖再開に先立ってSRD2に依存した増殖能励起を要求するのに対し、根では増殖能が高く保持されていてこうした過程が不要なためと解釈している。SRD2遺伝子がヒトsnRNA転写活性化因子のサブユニットによく似たタンパク質をコードしていることから、SRD2が関わる細胞増殖能の分子的実体をsnRNAと想定して、研究を行っている。胚軸脱分化過程においてsnRNA蓄積量が上昇し、この上昇がsrd2変異で抑制されることを既に報告した。また、培養外植片での一過的発現実験から、srd2変異がU2 snRNAプロモーターによる転写活性に直接影響することも判明している。今回新たに、snRNAのキャップ構造を認識する抗TMG抗体を用いたRNA免疫ブロット解析を行った結果、根では胚軸に比べてsnRNA蓄積量が高いことが分かった。さらにU2 snRNAプロモーター下流にGUSを配したキメラ遺伝子をもつ形質転換体においても、根では胚軸より高いGUS活性が観察され、胚軸の場合は脱分化に伴って活性が上昇した。以上の結果は細胞増殖能とsnRNAレベルとの対応関係を示しており、先に述べた仮説を支持するものと言える。

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シュート再生など器官再分化は、植物細胞のもつ分化全能性を端的に反映した現象である。シロイヌナズナの場合、シュート再生誘導は植物ホルモン組成の変更を伴う2段階培養、すなわちカルス誘導培地での前培養とシュート誘導培地での本培養による。我々の解釈によれば、胚軸外植片は前培養中に脱分化し、細胞増殖能、シュート再分化能を逐次獲得して、本培養後にシュートを形成する。一方、根外植片は増殖能を保持しており、前培養中に新たに獲得するのはシュート再分化能のみである。胚軸外植片の前培養の際、チミジン類似体のブロモデオキシウリジン（BrdU）を投与すると、低濃度ではシュート再生が促進されるが、高濃度では強く阻害される。このうち高濃度での阻害が根からのシュート再生では見られなかったことから、この阻害作用におけるBrdUの標的は細胞増殖能の獲得であると推定された。温度感受性変異体のsrd2を用いた研究から増殖能獲得にはSRD2遺伝子が関与することが分っているので、BrdUの作用時期とSRD2の作用時期を比較検討したところ、両者は重なった。srd2を用いて温度シフトとBrdUの一時投与を組み合わせた実験を行った結果、BrdUによる増殖能獲得阻害はSRD2機能の抑制によると考えられた。現在、BrdUの作用とSRD2との関連について、さらに解析を進めており、それらの結果も合わせて報告する予定である。

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