高等植物の葉緑体には、チラコイド膜結合型とストロマ可溶型の2つのアスコルビン酸ペルオキシダーゼアイソザイム（tAPXおよびsAPX）が存在する。シロイヌナズナの葉緑体型APXは各々独立したパラログ遺伝子として存在することから、両アイソザイムの発現調節はホウレンソウやタバコなどに見られる同一遺伝子からの選択的スプライシングとは明らかに異なるが、その詳細は明らかではない。そこで本研究では、シロイヌナズナの葉緑体型APXの発現調節機構を明らかにするため、培養細胞を用いて光条件下での応答を検討した。シロイヌナズナT87緑色懸濁培養細胞を定常条件下（50 μmol/m²/s）で培養後、暗適応およびO₂発生が最大となる420μmol/m²/sの光条件下に移し、葉緑体型APXの経時変化を測定した。その結果、sAPXを含むオルガネラ可溶性画分のAPX活性は、暗条件下および光条件下のいずれの場合も変化が見られないが、tAPXを含むオルガネラ膜画分では、光条件下24時間までに約3倍の活性増加が認められた。イムノブロットの結果から、光条件下でのtAPXタンパク質レベルの増加が確認された。ノーザンブロットの結果、光照射後のsAPXおよびtAPX 転写量に変化は認められなかった。以上の結果より、シロイヌナズナtAPXは光により転写後調節を受けることが示唆された。

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We evaluated the scavenging activity of H2O2 in WWC of illuminated intact chloroplasts from wild tobacco leaves. An illumination caused intact chloroplasts to uptake O2 and to accumulate H2O2. With the O2-uptake both APX and GAPDH lost their activities. The loss of APX activity lowered the activity of WWC, as judged from the decrease in ψ(PSII)xPFD. For the verification of these implications, we made a transplastomic tobacco plant where APX originated from red alga, Galdieria partita, was overproduced in chloroplasts. In illuminated intact chloroplasts from transplastomic tobacco, neither O2-uptake nor H2O2-accumulation was observed. Furthermore, both activities of WWC and GAPDH were maintained. The present work is the first report that APX was inactivated by H2O2 intrinsically photoproduced in intact chloroplasts from wild plants. This would be the reason why plants die when plants are exposed to abiotic stress which suppresses photosynthesis.

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During culture, Brassica napus leaf protoplasts become swollen and finally degrade. Both morphological and biochemical approaches revealed that the process through which the death occurred were subjected to apoptotic-like manner. The Protease activity remained lower in leaves, but gradually increased during the culture. Several protease inhibitors added to the enzyme solution for protoplast isolation had no apparent effect on protoplast survival. The previous results showed that the amount of extracellular hydrogen peroxide and superoxide present in the medium during the isolation of leaf protoplasts may not be involved in triggering apoptosis from B. napus. DCFH-DA staining visualizes intracellular active oxygen species (AOS), especially hydrogen peroxide. Our data showed that greater levels of AOS were accumulated in B. napus chloroplasts. However, addition of radical scavengers to both the isolation and the culture medium had no effect on the cell death of B. napus protoplasts.

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【目的】好塩性クラミドモナスW80株由来のグルタチオンペルオキシダーゼ (C.WGPX) は動植物のそれらとは異なり、リン脂質ヒドロペルオキシドやH₂O₂を基質とせず、高度不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシド(PUFAOOH)に対し高い活性を示した。一方、高等植物にはGPXアイソザイムは存在するが、それらの活性は低く、生理機能が明らかになっていないのが現状である。そこで本研究では、C.WGPXを葉緑体もしくは細胞質に発現させた形質転換タバコの種々のストレスによる膜障害への影響を検討した。
【方法・結果】α-リノレン酸ヒドロペルオキシドに対するGPX活性は、野生株では全く認められなかったが、細胞質（TcGPX-1,7,9,13）および葉緑体（TpGPX-1,6,14）発現株において、それぞれ32.7～42.1、47.5～75.3 nmol/min/mg proteinであった。パラコート（5 μM）、低温（4℃）および塩（250mM NaCl）ストレス下において、両形質転換体では野生株と比較して脂質過酸化物の生成量が抑制され、CO₂固定能および光合成電子伝達能が高く保持されていた。また、すべてのストレス条件において葉緑体発現株の障害は、細胞質発現株よりも低く保持されていた。以上より、PUFAOOH消去能を付与することで膜脂質の過酸化に由来する障害に対する耐性能が向上することが明らかになった。(Yoshimura K. et al., Plant. J. 2003, 36(6) in press)

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頂芽は側芽の生長を阻害することが多くの植物種で知られているが、そのメカニズムは明らかではない。我々は芽の休眠機構を解析するために、Affymetrix社のシロイヌナズナ全遺伝子からなるDNAチップを用いて、休眠腋芽と主茎除去後24時間目の腋芽での遺伝子発現を比較した。チップ上の約23000個の遺伝子の中で、AtDRM1を含む1678個の遺伝子発現は主茎除去による低下が見られた。また1188個の発現が上昇した遺伝子群には細胞分裂や蛋白質合成に関わる遺伝子が含まれていた。in silico解析から、発現量低下に関わるsugar-repressive element (SRE)と発現量上昇に関わるUp1-とUp2-boxの3個のシス因子が得られた。これら因子のin vivoでの機能を調べるために、それぞれの因子を3つtandemに繋いだ人工プロモーターGUS融合遺伝子をもつ形質転換体植物を作成した。組織化学的にその発現を調べた結果、3つの因子が実際に腋芽休眠とその生長に伴って遺伝子発現を制御していることが示された。SREは糖による発現抑制に関わっており、主に休眠腋芽での代謝関連遺伝子の発現を制御している。一方2つのUp-boxは共に腋芽生長に伴う蛋白質合成の促進に関わっていると考えられる。この3つの因子による腋芽休眠とその生長のメカニズムについて議論を行う予定である。

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ジベレリン酸（GA）の作用は、情報伝達の末端で抑制因子である DELLA タンパク質の機能を解除することにより発現することが知られている。穀物種子の糊粉層細胞でも、このタンパク質が機能していることは確認されているが、DELLA タンパク質の消失から、GA の生理作用発現までの道筋は断片化している。発芽種子での DELLA タンパク質の具体的な機能を推定するため、糊粉層細胞の GA 初期反応遺伝子である GAMyb や OsDof3 との機能的な接点を探索した。初期反応遺伝子より調製した発現調節領域は、GA に依存したレポーター活性の上昇を示したが、5’上流域からの欠損実験により、顕著な GA 誘導性を与えるシス配列の存在は確認できなかった。5’上流域を CaMV35S プロモーターと置換しても、依然として GA 誘導性は保持されたので、初期反応遺伝子の GA 応答性は、プロモーター上流域に依存しないことが推定される。CaMV35S プロモーターとの互換性実験により、コアプロモーター領域に抑制効果、第1イントロン内に促進効果を見出しており、このいずれの領域も、DELLA タンパク質の共発現による抑制作用の標的となっていた。これら多彩な調節ドメインの存在は、DELLA タンパク質を中心とした初期反応遺伝子の発現に関わる複雑な調節機構の存在を予見させる。

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　我々はイネにおけるα-アミラーゼ多型発現の生理的役割に関する研究を進めている。イネα-アミラーゼには多くのアイソフォームが存在し、発芽種子及び胚由来のカルスから11種類のアイソフォームが同定され、酵素学的諸性質が調べられている。その一つであるα-アミラーゼI-1 (RAmy1A) は、発芽イネ種子の胚盤上皮細胞およびアリューロン層において活発に生合成・分泌されるN-結合型糖鎖を有する糖タンパク質であることが示されている。本報告においてはα-アミラーゼI-1に着目し、35Sプロモーターとα-アミラーゼI-1　cDNA遺伝子を融合したコンストラクトを作製し、アグロバクテリウム法によるイネの形質転換を行った。得られた形質転換体は外来遺伝子2～5コピーを持っており、その大部分においてサイレンシングによるmRNAおよびタンパク質レベルにおけるα-アミラーゼI-1の発現抑制が見られた。α-アミラーゼI-1が抑制された系統は正常イネと比べ発芽、伸長生長が著しく抑えられたが、ショ糖を加えることによって正常イネと同様な発芽、伸長生長を示した。さらに興味深いことに発芽5日目の形質転換イネの第2葉の根元において顕著なデンプンの蓄積増加が見られ、α-アミラーゼI-1が第2葉のデンプン蓄積・分解に関与しているのではないかと考えられた。

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レタス（Grand Rapids）種子の暗黒中での発芽は高温によって阻害される。マイルドな高温（28℃）の発芽阻害はABA生合成阻害剤フルリドン処理で回避されたが、シビアな高温（33℃）下での発芽誘導にはフルリドンとGA₃の同時処理が必要であった。33℃では、ABA生合成の鍵酵素9-cis-エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼの遺伝子発現が増大し、さらに、発芽阻害にかかる種子のABA感受性が著しく上昇した。また、ファゼイン酸とジヒドロファゼイン酸の定量結果は、GA₃処理が種子のABA代謝を促進することを示した。フルリドンとGA₃の同時処理は、ABA生合成阻害とABA代謝促進の相加的作用によって、レタス種子のABA含量をシビアな高温下で発芽が可能なレベルに低下させたと考えられる。

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シロイヌナズナ種子の休眠が低温刺激により打破されることに着目し、その低温依存的な休眠打破調節機構の解明に着手した。植物材料は、ABRCより供与されたシロイヌナズナのエコタイプの中で最も顕著に低温要求性を示すAbd-0系統を用いて、低温刺激が休眠打破に及ぼす影響を調査した。Abd-0種子は吸水した状態でも常温では発芽せず、休眠打破に一定期間の低温刺激を必要とする。しかし、その低温刺激による休眠打破はジベレリン（GA）合成阻害剤処理により阻害され、また低温刺激を与えない条件下でもGA添加のみで休眠打破が誘導されることから、低温刺激による休眠打破にGA生合成かそれ以前の生理過程が関与していることが示唆された。さらに、Abd-0種子は低温刺激を受けることによりGAに対する応答性が増加している可能性が示唆された。そこで、発芽におけるGAシグナル伝達の抑制因子であるRGL2のmRNAの蓄積を定量的RT-PCR法で調べたところ、常温で水浸漬したCol-0種子では吸水48時間後に大きく低下したのに対し、Abd-0種子では吸水後7日目でも高レベルの蓄積が維持されていることが確認された。
また、Abd-0の低温特異的な休眠性には遺伝性があり、その原因遺伝子は優性であることが確認された。現在、その遺伝子座の同定も試みている。

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高等植物は、一度分化した体細胞であっても、特定の条件下で胚発生を開始することができる。こうした体細胞不定胚形成は、植物の持つ分化全能性の直接的な証拠として知られている。しかし、体細胞が胚発生を起こす細胞へと変化する機構についてはほとんど明らかにされていない。
ニンジンストレス不定胚誘導系では、形態的に変化が見られないストレス処理中にすでに胚発生関連遺伝子が発現していることが知られており、ストレス処理および未処理の外植片の間で遺伝子発現の比較を行うことにより、胚発生プログラムのきわめて初期に働く遺伝子の単離が可能であると考えられる。そこで、シロイヌナズナマイクロアレイを用いて遺伝子発現を比較し、ストレス処理時に発現が増加する遺伝子の選抜を行った。その中から、発生初期の種子胚を含む花で発現量が増加するNAC domain転写因子、No Apical Meristem-like 1(NAM-like 1)を見いだした。GUSレポーターによる発現部位の解析から、このNAM-like 1遺伝子は不定胚自身での発現は認められないものの、不定胚形成能力を有するカルスで発現することが明らかとなった。また、過剰発現体においては、抽苔後、花茎の付け根に形成されるシュートの数が増えるという表現型が観察された。こうした特性を示すことからNAM-like 1遺伝子は、形態形成を促進する機能を有していることが推測され、また、形態形成に先んじて発現する因子であることが考えられる。

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　カラマツの不定胚は、細胞質に富む細胞から成る胚本体と液胞化した細胞が集まった胚柄という2つの異なる組織で構成されている。カラマツの不定胚形成は、培養初期の細胞密度の影響を強く受け、低細胞密度条件下で培養すると進行し、高細胞密度条件下で培養すると強く阻害される。また、高細胞密度で培養した培地（HCM）を回収し、低細胞密度培養時に添加すると、不定胚形成、特に胚柄の発達が阻害される。そこで、本研究では、このカラマツの不定胚形成を阻害する因子を培地中から精製し、同定することを試みた。HCMを出発材料とし、不定胚形成阻害を指標とするバイオアッセイにより、透析、酢酸エチルによる溶媒分画、ODS-カラムクロマトグラフィー、HPLCによって、順次分画、精製を行った。精製画分について、マススペクトロメトリー、1H-および13C-NMRによる構造解析を行ったところ、不定胚形成阻害の主要因子はバニリンベンジルエーテル（VBE）と同定された。VBEは、ウィリアムソン合成法により、バニリンとベンジルクロライドから合成した。VBEをカラマツの不定胚誘導時に投与したところ、不定胚形成、特に胚柄の発達が強く阻害された。このような結果から、カラマツを高細胞密度条件で培養すると、VBEが培地中に蓄積し、不定胚形成を阻害することが示唆された。

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シロイヌナズナのLEAFY COTYLEDON1 (LEC1 )遺伝子は、胚形成において重要な機能を担っており、CCAAT-box binding factor (CBF)の構成要素HAP3 subunit様の転写制御因子をコードしている。我々はこれまでにニンジンのLEC1 ホモローグC-LEC1 を単離し、発達初期の種子胚・不定胚など胚的な性質を持つ組織において特異的に発現していることを明らかにしてきた。他の生物のCBFの報告から、C-LEC1はHAP2、HAP5様の因子と複合体を形成し、プロモーター上のCCAAT配列を認識して、胚形成制御遺伝子の発現を制御するというモデルが考えられる。
今回、酵母two-hybridスクリーニングやdegenerate primerを用いたPCRを行い、胚形成時にC-LEC1と複合体を形成すると予想される4つの因子を単離した。2つの因子（C-HAP2A、C-HAP2B）は酵母HAP2 subunitと高い相同性を示した。また、他の2つの因子（C-HAP5A、C-HAP5B）は酵母HAP5 subunitと高い相同性を示し、C-LEC1とin vitro で結合することが確認された。さらに、C-HAP2B/C-LEC1/C-HAP5AまたはC-HAP5Bが複合体を形成し、CCAAT配列を持つDNA断片を特異的に認識して結合することも明らかとなった。

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シロイヌナズナABI3遺伝子は胚発生初期から発現する転写制御因子の一つとして知られている。我々はこれまでに、ABI3のニンジンにおける相同遺伝子C-ABI3のプロモーター解析を行い、胚特異的発現を制御する10 bpのプロモーターシス配列Carrot Embryonic Element 1（CEE1）を決定してきた。今回は、植物の胚発生特異的な遺伝子発現を制御するプロモーターシス配列の共通のコア配列の決定を目的とし、シロイヌナズナABI3遺伝子プロモーター領域の解析を行った。まず、シロイヌナズナABI3プロモーター領域のデリーションクローンを作成し、GUS遺伝子をレポーターとしてシロイヌナズナ種子胚および不定胚におけるプロモーター活性の有無を確認した。また、ABI3プロモーター上のCEE1類似配列を検索し、見いだされた複数のCEE1類似配列についてニンジンのCEE1結合因子との結合性をゲルシフト法によって確認した。両実験の結果から、二つのCEE1逆配列を含む約100 bpの領域（Atd3-1L1）をシス配列を含む候補領域とし、この領域をCaMV35S最小プロモーターに結合してgain of function 実験を行った。その結果、Atd3-1L1領域はシロイヌナズナ種子胚において胚発生の初期からの遺伝子発現を誘導するのに十分であることを確認した。

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ニンジン (Daucus carota L.) の不定胚形成初期に，同調的に多数の開始点からDNA複製が行われるため，レプリコンサイズが小さくなることが1981年に藤村らによって本学会で発表されている．私たちは，この系を用いることで，植物の複製開始領域をクローニングすることが可能であると考えた．そこで，観察とともに回収が可能な方法として，複製領域をブロモデオキシウリジン（BrdU）で標識することを試みた．まず，DNA合成が活発に行われる時期を特定するために，培地30mlあたりの全細胞についてDNA量増加のタイムコースを調べた．培養細胞を，オーキシンを含まずゼアチンを含む培地に移植し，不定胚形成を誘導してから5日目の前後でDNAが急激に増加した．そこで，不定胚誘導後0日目，2日目，5日目，8日目の細胞にBrdUを15分間処理することでパルス標識を行った．その後，細胞質DNAの混入を防ぐために，細胞から核を単離し，スライドグラス上にDNA繊維を展開した．BrdU標識部位は抗BrdU抗体と蛍光標識した抗体によって可視化した．これを蛍光顕微鏡で観察し，標識間の距離を計測したところ，レプリコンサイズの平均は0日目が35.2μm，5日目が24.2μmであり，球状胚が形成される時期にレプリコンサイズが短くなることが確認された．この結果は1981年の藤村らの研究結果と一致した．また，この技術を用いて，レーザーマイクロダイセクションによる，DNAの標識された領域の切り出しを行った．

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　私達は、ニンジン体細胞から直接体細胞胚を経て幼植物体に至る系を確立して研究を行っている。即ち、短時間の2,4-D処理により体細胞は分裂を始め、不定形な細胞塊を形成し、それが球状の胚になり、やがて心臓型胚、魚雷型胚を経て幼植物体へと発達する。不定形な細胞塊の球状胚や心臓型胚への発達段階は胚の形態形成の中でも非常に興味深い過程である。
　私達はこの細胞塊から球状胚を経て心臓型胚になる過程を連続的に観察した。その過程で様々な形態的変化が見られた。この中で、細胞塊の一部の細胞は盛んに分裂を繰り返し球状胚に発達するが、残りの部分は分裂を停止し退化するという現象が観察された。
　また、私達はこの細胞塊に、細胞塊の一部の退化に関与すると思われる遺伝子を見出した。この遺伝子は、大麦の受精後に珠心が胚の発達に伴って退化する過程で発現するnucellin（Chen and Foolad, 1997）と相同性があることから、nucellin-like protein遺伝子と命名した。nucellinはアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質をコードし細胞死に関わると考えられている。northern blot分析では、このnucellin-like protein遺伝子の転写産物は体細胞胚形成過程で初期および後期段階の細胞塊に強く発現し、球状胚でわずかに検出されたが、心臓型胚、魚雷型胚および幼植物体ではほとんど検出されなかった。

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　転移因子は染色体上を転移する遺伝因子で、原核生物から動物を含めた真核生物まで、あらゆる生物に存在している。転移因子の転移機構についてはこれまでにトウモロコシの En/Spm において、Sub-Terminal Inverted Repeat(STR) に転移酵素 (TNPA) が結合することが確認されているが、未だその詳細については明らかにされていない。
ニンジン培養細胞から見出された Tdc は構造的特徴から En/Spm 型転移因子であると考えられている。これまでに Tdc はニンジンゲノム内で20～30のファミリーを形成し、少なくとも3種類の独立した進化を遂げた転移酵素(Tdc cDNA)が存在することが明らかにされている。
　本研究では、Tdc の詳細な転移機構を明らかにするため、まず始めに Yeast one-hybrid system を用いて、ニンジン cDNA ライブラリーから STR 配列に作用する因子の探索を行なった。その結果、不完全長ではあるが Tdc cDNAが得られたことから、Tdc においても転移酵素がSTR 配列に結合することが明らかとなった。さらに STR 配列と相互作用する Tdc ORF 領域を特定する為に、これらデリーション Tdc cDNA を作成し、β-galactosidase 活性を測定することで結合能評価をおこなった。また、STR 配列に変異を導入し、Tdc 転移酵素の結合領域とその特異性について調べた。

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工業原材料生産に関わる多種多様な植物での代謝制御方法の開発を最終目標として、モデル植物を用いた代謝関連遺伝子に関するハイスループットな遺伝子機能解析（ファンクショナルゲノミクス）を行なっている。特に、シロイヌナズナ、ミヤコグサのメタボロミクスを進めるために、代謝関連遺伝子を網羅的に遺伝子導入した培養細胞リソースの整備を進めている。制御された生育環境下で均一な実験材料を確保することが容易な培養細胞は、植物体を用いる方法と比べて遺伝子発現・代謝プロファイリングに適した材料である。その反面、ハイスループットな遺伝子機能解析を行なうには、多数の形質転換培養細胞系統を長期間安定的に維持・保存するための技術が必要である。
本研究では、シロイヌナズナ懸濁培養細胞T87株を材料に培養細胞の保存を可能とする種々の手法・条件を検討し、培養細胞を簡便かつ安定して保存できる超低温保存法を確立した。アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁した培養細胞を塩化カルシウム溶液に滴下することでビーズ化し、このビーズをシリカゲル上で脱水処理した後に液体窒素中で急速冷却・保存することで再加温後に培養細胞の再増殖に成功した。至適条件下では、ほぼ100%のビーズから培養細胞の旺盛な再増殖が認められた。超低温保存が及ぼす影響を調べるためにDNAアレイ法による網羅的遺伝子発現解析、質量分析器を用いる代謝プロファイリングを行なっている。

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　工業原材料植物に蓄積する有用な代謝産物の生産を制御するために、代謝経路に関与する遺伝子の機能解析を行う必要がある。ゲノム解読されているモデル植物のメタボローム（細胞の全代謝物）解析は、植物に共通な代謝経路の解明が可能となり、その成果は多種多様の植物の代謝経路の解明及び生産制御に応用可能である。この目的のため、発生・分化に関わらない代謝経路の解明には、培養細胞が適している。
　我々はHPLC/PDA/MS（液体クロマトグラフ/フォトダイオードアレイ検出器/イオントラップ型質量分析計）、CE/MS（キャピラリー電気泳動/質量分析計）、GC/TOF/MS（ガスクロマトグラフ/飛行時間型質量分析計）から得られた分析データを統合して網羅的な代謝産物を分析することにより1000近くのピークの検出が可能となった。
　シロイヌナズナT87培養細胞の80%エタノール抽出液を逆相HPLC/PDA/MSに付し、作成したフラボノイドマスライブラリーとタンデムMS分析結果より、数種のフラボノイド配糖体（Kaempferol配糖体）を同定した。HPLC/PDA/MS分析で得られる他の芳香性化合物の同定を進め、脂質などの揮発性誘導体を検出可能なGC/TOF/MS及びアミノ酸、有機酸などの代謝産物の検出可能なCE/MSでシロイヌナズナT87培養細胞の代謝産物を分析したので報告する。

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代謝産物プロファイル（メタボローム）解析によって特定の代謝産物に顕著な変動が見られた場合、この過程での遺伝子発現プロファイル（トランスクリプトーム）の変化を解析しメタボロームと詳細に比較することによって、その代謝経路に深く関わる遺伝子候補の推定が可能である。本研究チームでは、モデル植物での両プロファイルの比較情報を蓄積し、実用植物での工業原材料の生産制御に応用できる手法の開発に向けた研究基盤（情報リソース）の整備を行っている。本講演では、均質な実験材料として詳細な比較解析に適しているシロイヌナズナの培養細胞（T87）を用いたトランスクリプトーム解析について報告する。安価なマクロアレイを用いて各種処理効果の確認を行った後、データ取得用の解析にはアジレント社22kアレイ（21,500遺伝子用）を用いた。最初の解析として、細胞の生育段階や光環境などについて解析し、T87の標準データを取得した。通常明所で培養するT87は葉緑体関連遺伝子の発現が高く維持されており、葉緑体の代謝解析にもT87は利用できる。イソプレノイドなどの二次代謝産物の生産を促すメチルジャスモン酸（MeJA）処理では、処理後1時間で見られるMeJA合成系の遺伝子の発現に伴い、モノテルペン合成酵素や4CL等の他いくつかの転写因子やP450、糖転移酵素などが似た変動パターンを示すことが分かった。現在メタボロームの変化と連動して発現する遺伝子の解析を進めている。

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植物物質生産機能の解析・改良は、工業原材料植物が生産する多様な代謝産物をより高度に利用するための重要な課題である。植物ゲノムの解読が進み、トランスクリプトミクス、メタボロミクス等の網羅的な研究手法が可能となった。植物物質生産機能の解析のため、DNA アレイと代謝プロファイリングにより代謝の変化を比較し、代謝関連遺伝子の同定を行う過程で、DNAアレイと代謝プロファイリングを統合するWebベースの代謝経路データベース、Kazusa Pathway Viewer (KPV)の開発を行った。KPVの主要な機能は、1）代謝産物プロファイルデータと遺伝子発現プロファイルデータのデータベース化、2）任意の実験間の代謝産物プロファイルデータと遺伝子発現プロファイルデータを植物代謝マップ上で同時に比較・表示である。代謝マップは、工業原材料物質の生産に主に関与する二次代謝経路を中心に、代謝経路間の連携を理解しやすいように作成をした。代謝マップの描画形式はScalable vector graphic (SVG) 形式を用いている。SVG形式の採用は、Web上でプロファイルの変化を動的に色表示することを可能にした。今回、モデル植物シロイヌナズナの代謝マップを載せたシステムを紹介する。今後、他のモデル植物や工業原材料植物の代謝マップの追加、解析機能の強化等を行う予定である。

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　2002年度大会において，スターチシンターゼI型(SSI)活性が約1/6に低下したイネ変異体の解析結果について述べた。本大会では，新たにTos17ノックアウトイネ集団(約4万系統)からPCR法で選抜した酵素活性レベルが異なる複数の系統の解析によってデンプン合成におけるSSIの機能をより詳細に解明することを目的とした。変異体のM₂登熟種子のNative-PAGE/活性染色によって胚乳SSI活性を測定したところ、野生型に対してそれぞれ約1/4, 1/5, 1/6およびゼロに低下していた。これらの胚乳アミロペクチンの鎖長分布はいずれも重合度(DP)8-12が減少しDP6-7およびDP16-20が増加しており，その変化はSSI活性が少ない系統ほど大きかった。また，葉身のアミロペクチンも胚乳のものと同様の変化を示した。このことから，SSIは，アミロペクチンのDP8-12の短鎖を合成する特異的な機能を有すると考えられた。一方，SSI活性を完全に失った系統においても種子やデンプン粒の大きさや形態には変化がなかったため，他のSSアイソザイムがそれらを相補していると考えられた。

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真核生物の細胞内にはさまざまな単膜系のオルガネラが存在し、小胞輸送によって物質交換が行われている。高等植物細胞においても、トランスゴルジ網、エンドソーム、液胞、細胞膜といったオルガネラ間を結ぶ小胞輸送網であるポストゴルジ・ネットワークが発達しており、細胞の極性形成や個体形成、環境応答などのさまざまな局面で重要な役割を果たしている。しかしながら、植物細胞のポストゴルジ・ネットワークにおける小胞輸送の分子機構は未だ不明な点が多い。我々は、植物細胞のポストゴルジ・ネットワークにおける小胞輸送の分子機構を解明するために、小胞輸送において膜融合過程に関与するSNARE分子の解析を行っている。シロイヌナズナゲノム中には54種類のSNARE遺伝子が存在しており、RT-PCR法により53種類の遺伝子の発現が確認された。次に、GFPとの融合タンパク質をシロイヌナズナ培養細胞で一過的発現させることにより、53種類のSNARE分子全ての細胞内局在を解析した。更に、ゴルジ体以降に局在するさまざまなSNARE分子のGFP融合タンパク質とVenus(YFP)融合タンパク質とを共発現することによって、ポストゴルジ・ネットワークに存在するSNARE分子間の関係を明らかにした。これらの結果から、SNARE分子の局在ドメインについても議論したい。

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　エンドサイトーシスは，細胞外，もしくは細胞膜上の物質を細胞内へと取り込む機構であり，細胞膜上のタンパク質，脂質，細胞壁の構成成分，細胞外の栄養分等，多くのものがエンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれる．このエンドサイトーシスを担うオルガネラはエンドソームと総称され，動物細胞においては，初期エンドソーム，後期エンドソーム，リサイクリングエンドソーム等の機能的に分化したエンドソームが存在することが知られている．しかしながら，植物細胞におけるエンドソームに，機能的分化が存在するのか，また，存在するとすれば，それぞれのエンドソームにどのようなタンパク質が局在し，どのような機能を担っているのか，という点に関しては，これまで全くわかっていなかった．この問題を解明するため，我々はシロイヌナズナにおいてエンドサイトーシスを制御するRab GTPase群とSNAREタンパク質群の細胞内局在を蛍光タンパク質を用いた詳細な解析により比較し，シロイヌナズナ細胞中に少なくとも2種類の機能的に異なるエンドソームが存在することを明らかにした．また，その2種類のエンドソームは，独立したオルガネラではなく，一方から他方へと連続的に成熟する可能性が高いことも見いだした．本大会では，このエンドソーム成熟モデルとそれにより維持されていると期待される機能的分化の関係について議論したい．

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シロイヌナズナのeye（embryo yellow）変異体は、胚軸や子葉の表皮細胞が丸く、茎頂部からは非周期的に葉原基を形成するという特徴を持つ。また、eye変異の原因遺伝子は、T-DNAを指標にクローニングされ、ホニュウ動物においてゴルジ体の形態や機能の維持に関わっているCOG複合体の構成因子の一つと相同なタンパク質をコードしていると予測された。このことからeye変異体では、ゴルジ体の機能が低下していると推察され、細胞が正常な形を示すためや茎頂分裂組織において適切な位置から葉原基が形成されるためには、 COG複合体によりゴルジ体の機能が正常に維持されることが必要であると考えられた。次に、eye変異体においてゴルジ体の形態や機能に異常がみられるかを解析するため、ゴルジ体マーカー AtERD2-GFPのeye変異体における細胞内局在を観察したところ、GFPの蛍光は主にERから検出された。この結果から、eye変異体では、AtERD2-GFPはERからゴルジ体に輸送されていないと考えられた。このことから、EYE の機能について以下の2つの可能性が推察された。(1) EYE は ERからゴルジ体への小胞輸送に直接関与している。(2) EYE はゴルジ体の機能維持に関与しており、eye変異体では、ゴルジ体が正常に機能しなくなったために ER からゴルジ体へのタンパク質の輸送が異常となった。今後は、この二つの可能性について検証していきたいと考えている。

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高等植物の重力屈性の分子機構を明らかにするため、我々は花茎の重力屈性が異常なshoot gravitropism (sgr) 変異体を単離してきた。zig/sgr4は重力屈性の他に花茎および葉の形態にも異常を示す。zig-1では重力感受の場である内皮細胞において液胞の形状に異常がみられ、その他の組織では中心液胞の断片化が起こっていた。また、ZIGはトランスゴルジネットワーク-液胞間の小胞輸送に関わるQb-SNAREタンパク質であるAtVTI11をコードしていた。したがって、ZIGが関与する小胞輸送系は植物体において重力屈性と形態に対して多面的に機能するということが考えられる。ZIGの多面的な機能を詳細に解析するために、我々はzigのサプレッサー変異体を多数単離し解析を行っている。このうちzig suppressor (zip) 3変異はzig-1の重力屈性異常と形態異常を部分的に回復した。詳細なマッピングの結果、ZIP3遺伝子は2番染色体の中央部に存在し、zip3において小胞輸送に関わると推測されるこの領域の遺伝子に変異が発見された。現在はZIP3遺伝子の機能解析及び、zigの抑制機構の解析を進めている。

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真核細胞は、細胞内にタンパク質凝集体を形成することが知られている。タバコ培養細胞BY-2株にチトクロムb5とRFPの融合タンパク質を発現させた場合、RFPは増殖期に凝集パターンを呈し、定常状態期には液胞内に検出された。そこで我々は、RFPの蛍光を指標にタンパク質凝集体の液胞移行について解析を行った。様々な細胞小器官に対するマーカー抗体を用いた間接蛍光抗体染色法により、ドット状のRFP (RFP aggregate; Rag)の蛍光は各種の細胞小器官と異なる局在を示したことから、既知のオルガネラではないことが推定された。そして、微細構造観察により、Ragは脂肪粒のような凝集体であった。Ragの液胞移行を誘導する条件を検討した結果、栄養飢餓条件で、RFPの蛍光が液胞に観察された。栄養飢餓条件下で、プロテアーゼ阻害剤(E-64)を加え培養した場合、Ragは液胞移行せずに核のオートリソソーム様の構造体内に観察されることから、オートファジー機構により液胞内へ取り込まれることが示唆された。そこで、酵母のオートファジーに中心的な働きを担っているApg8のBY-2ホモログとYFPの融合タンパク質を発現させて動的解析を行った。その結果、リング状のオートファゴソーム(AP)が形成され、APは液胞へ移行することが確認された。そして、RagはAPにより取り込まれていた。以上の結果から、Ragは栄養飢餓条件でオートファジー機構により液胞へ取り込まれることが推定された。

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　オートファジー（自食作用）は、栄養飢餓等に伴って細胞質成分を液胞に輸送して分解する細胞内分解システムである。我々は、酵母においてAtg8タンパク質のC末端がAtg4プロテアーゼにより切断された後、ユビキチン化に類似した反応により脂質修飾されること、そして、このAtg8脂質修飾反応がオートファジー進行を担う分子機構の鍵になることを見いだしている。
　シロイヌナズナにはATG8, ATG4オーソログ（AtATG8, AtATG4）が存在し、その詳細が明らかになっていない植物のオートファジーにおいても同様の役割を担っていることが予想される。酵母Atg8はオートファジーの進行に伴い液胞内に移行することが知られている。そこで、GFP-AtATG8融合タンパク質を発現させた形質転換植物を作製し、その挙動を観察した。GFP融合タンパク質は細胞質中のリング状構造に局在し、窒素飢餓条件下で液胞内への移行が観察された。また、2種のAtATG4のT-DNA挿入株をそれぞれ取得し、その二重変異株におけるGFP-AtATG8融合タンパク質の挙動を解析したところ、GFP融合タンパク質は窒素飢餓条件下でも液胞内へ移行しなかった。以上の結果は，植物個体において、初めてオートファジーをモニターすることが可能となったことを意味している。

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　植物細胞は小胞体を中心とした細胞内膜系を構造的にも機能的にも複雑に発達させている．しかしながら，これら細胞内膜系の構造がどのような機構で維持され，植物体の高次機能に寄与しているかは不明である．私たちが作製した液胞輸送型GFPを発現する形質転換シロイヌナズナは，小胞体から液胞へのタンパク質の分泌経路を植物の組織，器官レベルで可視化できる非常に強力なツールである．この形質転換シロイヌナズナを突然変異誘起処理し，細胞内膜系の構造に異常がある変異体のスクリーニングを行った．得られたkatamari1変異体の細胞内ではGFP蛍光のアグリゲーションの形成が観察され，植物体は矮性の表現型を示す．蛍光マーカー及び電子顕微鏡観察により，小胞体，ゴルジ体，エンドソーム，ペルオキシソーム，液胞がアグリゲーションしていることがわかった．興味深いことにアクチン繊維の一部もアグリゲーションを起こしていた．ポジショナルクローニングによりkatamari1変異体の原因遺伝子KAM1を同定した．KAM1タンパク質に対する特異抗体を用いた解析により，KAM1はType II型のゴルジ体局在膜タンパク質であった．免役沈降実験によりKAM1タンパク質はアクチンと共沈したことから，KAM1タンパク質はアクチンのオーガナイズを通じて細胞内膜系の構造維持に何らかの機能を果たすものと考えられた．

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高等植物の種子には発芽後の窒素源として大量の貯蔵タンパク質が蓄えられている．貯蔵タンパク質は種子の登熟期に小胞体でプロ型前駆体として合成され，小胞輸送によりタンパク質蓄積型液胞に運ばれ，プロセシングを受けて成熟型になり蓄積する．最近，私達はシロイヌナズナにおいて貯蔵タンパク質の選別輸送に関わるレセプターAtVSR1を明らかにした1）．AtVSR1欠損変異体の種子では大量の貯蔵タンパク質が前駆体となり，細胞外に分泌されていた．本研究では貯蔵タンパク質を分泌する新たなT-DNA挿入株A06の解析結果を報告する．A06変異体の種子には一部の貯蔵タンパク質が前駆体として蓄積していた．電子顕微鏡観察の結果，A06変異体の種子ではAtVSR1欠損変異体と同様に貯蔵タンパク質が細胞外に分泌されていた．一方，細胞内には小型化し数が増加したタンパク質蓄積型液胞が見られた．この表現型はAtVSR1欠損変異とは異なっていた．AtVSR1特異抗体を用いたウエスタン解析でA06変異体にはAtVSR1の存在が確認された．
1) T. Shimada et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 16095 (2003)

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イネにおけるジベレリン（GA）代謝系の概容を明らかにすることを目的として、ジベレリンの生合成に関わるCPD合成酵素（CPS）、カウレン合成酵素（KS）、カウレン酸化酵素（KO）、カウレン酸酸化酵素（KAO）、20酸化酵素（GA20ox）、3酸化酵素（GA3ox）と、ジベレリンの不活化に関わる2酸化酵素（GA2ox）をコードすると考えられる29の候補遺伝子を、ゲノムデータベース解析により単離した。発現解析や突然変異体の解析の結果、ジベレリン生合成の前半に関与するCPS、KS、KO、KAOはそれぞれ1遺伝子にコードされていると考えられたのに対し、後半に関与するGA20ox、GA3ox、GA2oxは遺伝子ファミリーを構成していた。シロイヌナズナとは異なり、CPS様、KS様、KO様遺伝子はイネに複数存在し、染色体上でクラスターを構成していた。それらのうちのいくつかの遺伝子は、紫外線処理やエリシター処理により発現が誘導されたことから、ジベレリン生合成ではなくファイトアレキシン生合成に関与していると考えられた。

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種子の休眠と発芽は種々の内的、外的因子により制御される。我々は今までに、シロイヌナズナの種子発芽を促進する事が知られている光（赤色光）や低温処理（暗所、4°C）が、ジベレリン生合成酵素GA 3-oxidaseをコードする遺伝子の発現を増加させることを報告した。一方、活性型ジベレリン量はその不活性化を触媒するGA 2-oxidaseによっても直接的に制御されうる。GA 2-oxidaseをコードする遺伝子群の発現量は、明所(連続白色光下)での発芽種子中では低かったが、AtGA2ox2遺伝子の転写産物量は、暗黒下吸水中(22°C)に顕著に増加した。また、暗所でのAtGA2ox2 mRNAの増加は、4°Cでは認められなかった。AtGA2ox2の機能欠損変異株の種子においては、遠赤色光(FR)パルス照射による発芽抑制が一部解除されることから、FR照射による発芽抑制の維持にはAtGA2ox2の発現増加が重要であることが示唆された。以上の結果から、温度や光等の環境要因による発芽や休眠の制御には、活性型GAの合成と不活性化の両経路が関わっていることが示唆された。

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GAMybは単子葉穀類の発芽種子中の糊粉層において、ジベレリン誘導型α-アミラーゼ遺伝子の転写を活性化するMyb様転写因子として知られている。しかし、最近のドクムギやシロイヌナヅナの知見から、長日植物では生殖期への転換後、花序分裂組織や未熟な葯のタペート細胞でGAMYBのmRNAが優位に検出されることが分かった。私たちはイネにおいても、発達途上の花序でOsGAMybが発現することを見いだした。さらに、OsGAMybの発現が低下した変異体において、(1)発芽遅延、 (2)節間伸長の抑制、(3)花序の形態変異、(一次枝梗および二次枝梗の減少)を観察した。さらに、Ubi::OsGAMyb RNAiを導入したトランスジェニックイネを解析したところ、同様の表現型が観察された。発芽および花序形成におけるOsGAMybの役割について考察する。

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GAMYB遺伝子はジベレリン（GA）シグナルにおいて最初に見つかった因子であり、胚乳におけるαアミラーゼ発現を正に制御することが知られている。しかし、本遺伝子の胚乳以外における機能についてはほとんど分かっていない。そこで、イネにおけるGEMYB遺伝子の機能を調べるために、我々は、本遺伝子のイネレトロトランスポゾンTos17による機能破壊株を選抜した。選抜した独立の3ラインともに胚乳におけるαアミラーゼの発現が全く観察されなかったことから、これらはGAMYBの機能欠失型変異体と判断した。これらの変異体は花芽形成時まで野生型と全く変わらない生育を示したが、花を形成した後は花器官の発達に異常を示し、特に花粉の発達は完全に阻害された。一方、雌蕊の形成は比較的正常に行われるために、野生型の花粉とは交配することができ、雄性不稔の形質を示した。また、in situ hybridizationの結果等から、GAMYBの発現とこれらの異常は良く一致することが確認された。これらの結果から、イネのGAMYB遺伝子は胚乳における貯蔵物質の分解酵素遺伝子群の発現誘導とともに、花器官における発達にも必須であるが、花芽誘導には影響を与えないことが分かった。
本研究の一部は生研機構の支援を得て行った。

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RSGはジベレリン（GA）内生量調節に関与するbZIP型転写活性化因子である。植物体においてその機能を阻害するとGA内生量が著しく低下し矮化形質を示す。これまでの解析により、1）真核生物に広く保存された制御因子、14-3-3蛋白質とリン酸化された114番目のセリン残基を介して相互作用すること、2）14-3-3蛋白質はRSGと結合するとRSGの核局在を阻害すること、3）RSGは14-3-3により細胞質に静的に拘束されているのではなく、核-細胞質間を高速にシャトルしていること、4）RSGの細胞内局在はGA内生量により制御されていること等を明らかとしてきた。
GA信号伝達系ではDELLAモチーフを持つRGAなどの負の信号伝達因子がGA刺激によりタンパク質レベルで分解され核から消失することが、GA応答の引き金になると考えられている。そこでGAによるRSGの核からの消失にもタンパク質レベルでのRSG分解が関与しているかを調べた。その結果、GA刺激受容後のRSGおよび14-3-3と結合しない変異型RSGともにタンパク質レベルに大きな変動は認められなかった。従って、GAによるRSGの機能調節は主に14-3-3との結合を介した細胞内局在調節によると考えられる。

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We isolated a rice brassinosteroid-related mutant, which displayed dwarfism, erect leaves and stunted leaf sheath. Application of brassinolide rescued the mutant phenotype, indicating that the mutant was defective in BR biosynthesis. Mutated gene was located on the Chr. 10 and this locus contains a homologous gene to Arabidopsis DIMINUTO. The putative amino acid sequence of this gene (OsDIM) shared 80% identity with AtDIM. Sequencing analysis revealed that the mutant produced a premature stop codon in the OsDIM gene. We could not found any OsDIM homologous genes in the rice genome. Although the phenotype of the Osdim was typical for BR-deficient mutants, the severeness of its phenotype was much milder than that of the brd1-1 plants, which is defected in BR-6 oxidase. This suggests a possibility that there is an alternative BR biosynthesis pathway not involved DIM in contrast to Arabidopsis, in which defect in DIM induces a severe phenotype.

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我々はイネ種子の長径を支配する分子機構を明らかにするために粒型が変異した短粒変異体の変異原因遺伝子の同定を進めている。今回はイネ矮性変異体dwarf11（d11）の変異原因遺伝子を同定したのでその結果を報告する。この変異体はブラシノステロイド変異体d61,d2と同様に第2節間の伸長阻害が見られた。このことよりd11変異体はブラシノステロイドに関係する変異体の可能性が考えられた。Map-based cloningを用いてd11変異体の原因遺伝子を同定・単離を行った結果、この変異原因遺伝子は新規なチトクロムP450遺伝子をコードしていると推定された。D11遺伝子のアミノ酸配列をBLASTサーチで解析したところアラビドピシスDWF4に40％程度の相同性を示した。幼苗組織でのD11mRNAの転写量は野生型と比較してd11変異体で上昇していた。また、D11mRNAの転写はブラシノライド添加前後の野生型で減少しており、フィードバック阻害がかかっていると考えられた。d11変異体と野生型の植物体を用いたブラシノステロイド中間体の定量より、D11遺伝子は6-Deoxo3DTから6-DeoxoTYへのステップと3DTからTYへのステップを触媒する可能性が推測された。以上の結果よりD11遺伝子はブラシノステロイド生合成経路の新規遺伝子であり、イネにおいて種子の長径を支配すること考えた。

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我々はこれまでイネの極わい性変異体brd1の単離，解析を行い，この変異体ではブラシノステロイド(BR)生合成酵素BR-6-oxidaseをコードしているOsBR6ox中の欠失によりBR生合成がdefectiveになっていることを明らかにしている¹⁾．今回はBR生合成変異体brd1及びイネ22Kマイクロアレイを用い，ブラシノライド(BL)添加により発現量の変化する遺伝子を網羅的に探索することを目的とした．brd1にBL添加3時間後，及び24時間後の遺伝子発現を非添加のものと比較した．その結果BL添加3時間後では，コントロールに対して2倍以上発現量の増大する遺伝子が21個，減少する遺伝子が20個見いだされた．また，BL添加24時間後では，コントロールに対して発現量の増大する遺伝子が95個，減少する遺伝子が17個見いだされた．発現量に変動のみられた遺伝子43個を選抜しreal time-PCRを用いて確認した結果，約90％がマイクロアレイの結果と一致した．また，同条件で再度栽培，抽出したRNAを用いてbiologicalな再現性をreal time-PCR で調べたところ、現在までに調べた23個のうち約50％の遺伝子について再現性が確認された．これらの中には転写因子，細胞壁合成関連遺伝子，植物ホルモン関連遺伝子等が含まれていた．
¹⁾ Mori et al.,Plant Physiol. 130:1152-1161. (2002)

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ブラシノステロイドは、細胞伸長と細胞分裂の制御などの高等生物のステロイドホルモン類と共通する機能を持つことが知られるが、光形態形成や葉緑体制御となどの植物特有の生長機構調節においても重要な役割を担っている事が明らかにされつつある。我々は、ブラシノステロイド生合成阻害剤Brzを手掛かりとして、ブラシノステロイド情報伝達突然変異体の選抜を行い、ブラシノステロイド情報伝達機構の解明を目指している。
Brz存在下で発芽した野生株は、暗所にも関わらず光形態形成を示す。これに反してBrz暗所下胚軸が徒長する変異体bil（Brz-insensitive-long hypocotyl）を選抜して来ている。最初に単離されたbil変異から特定したBIL1タンパク質は、ブラシノステロイド刺激によって細胞質から核へ移行する性質を持ち、ブラシノステロイド情報の担体因子であると考えている。Fast Neutron変異誘発ラインから選抜されたbil5は、暗所Brz発芽時には徒長した下胚軸長を示すが、成長後の形質は、茎長の短化・細化、ロゼッタ葉の細化・低緑化、等の著しい異常形態を示した。これらの詳細な組織観察を行った結果、葉緑体発達の遅延、導管組織の発達阻害、花茎細胞の伸長阻害、等が観察された。さらに数ラインのBrz関連突然変異体が得られており、平行して解析中である。

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　我々は早期オーキシン応答性遺伝子、IAA3, 5, 19, SAUR-AC1と、オーキシン応答性エレメントDR5がブラシノステロイド(BR)処理により早期に誘導されることを既に報告した。BRとオーキシンの誘導パターンは早期応答性遺伝子とDR5との間で非常によく似ていた。GeneChipを用いてブラシノステロイドとオーキシン応答性遺伝子を網羅的に解析して分類し、それら遺伝子の上流配列を解析した結果、オーキシン応答性エレメントTGTCTCはオーキシン特異的に応答する遺伝子ではなく、BRとオーキシンで共通に応答する遺伝子に保存されていた。ユビキチン活性化酵素E1の類似タンパク質AXR1は、オーキシンのシグナル伝達を制御していると考えられている。axr1変異体ではBRによる下胚軸や葉柄の伸長促進とSAUR-AC1遺伝子のBRによる発現誘導が阻害されていた。従ってAXR1はオーキシンとBRで共通のシグナル伝達因子として伸長誘導に関わっていると考えられた。オーキシン競争阻害剤とされるPCIB及びシグナル伝達阻害剤YkBの存在下でオーキシン早期応答性遺伝子の発現を調べた結果、BRによる誘導はPCIBでは阻害されずYkBで阻害されたことから、BRのシグナル伝達はオーキシンの受容からプロテオソームによるタンパク質分解系の上流でオーキシンのシグナル伝達と相互作用していることが示唆された。

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　IAAタンパク質はオーキシンのシグナル伝達系路で働く転写調節因子である。昨年の大会でオーキシンの非感受性突然変異体axr2/iaa7はブラシノステロイド(BR)感受性と内生量が異常になっていることを報告した。今回は、axr2/iaa7, axr3/iaa17変異体におけるBR応答性遺伝子発現について主に調べた。IAA5, IAA19のオーキシンとBRによる発現誘導はaxr2, axr3において共に阻害されていた。このBRによる誘導阻害は播種後7日目の芽生えで観察されたが14日目では観察されなかった。axr2ではSAUR-AC1遺伝子のオーキシン誘導は阻害されていたがBR誘導は正常であった。さらにpSAUR-AC1-GUS形質転換体を用いて解析すると、axr2ではBRによる発現制御は下胚軸でのみ失われていた。この結果はBRによる胚軸の伸長促進がaxr2において失われていることと一致した。BR生合成遺伝子の発現は7日目のaxr2で野生型植物(WT)よりも全体的に高くなっていたが、20日目には生合成鍵酵素であると考えられているDWF4及びBR6ox2の発現はWTと同じレベルに戻っていた。一方、axr2をGeneChipを用いて解析し、AXR2遺伝子により制御される遺伝子群を同定した。これらの結果からAXR2はBR応答性遺伝子を遺伝子毎に生育段階に依存して器官特異的に制御をしていると考えられた。

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イネ矮性突然変異体dal1は、矮性形質と同時に葉身先端が丸みを帯びる形態異常を示す。本変異体の解析を目的として、まず初めに原因遺伝子を単離するために、ポジショナルクローニングを行った。その結果、本遺伝子を2つの分子マーカーにより約40kbの範囲内に限定することに成功した。この範囲には微小管切断活性を持つカタニン (katanin)様タンパク質が存在していたので、この遺伝子に注目し変異体アリルについてシーケンスを行ったところ、ATP結合部位と推定される位置に1アミノ酸置換を導く突然変異が見つかった。またdal1変異体には、クローニングに用いたdal1-1以外に3つのアリル(dal1-2~4)が存在するが、これらのアリルにおいても本遺伝子に変異が見つかったことから、DAL1はカタニン様タンパク質をコードすると結論した。イネDAL1タンパク質は、既に単離されていたシロイヌナズナの矮性突然変異体fra2の原因遺伝子産物と高い相同性を示した。fra2は矮性形質と伴に茎が折れやすく葉に丸みを帯びる特徴を持ち、微小管とセルロース微繊維の配向性に異常を示すことが報告されている。イネdal1とシロイヌナズナfra2の形態的特徴や遺伝子構造の類似性から、イネdal1変異体はカタニンの異常が微小管の配向性を乱し、その結果、セルロース微繊維の配向性の異常を導くことで矮性かつ葉の異常を示す可能性が示唆された。

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個々の微小管は伸長 ( 重合 ) と収縮 ( 脱重合 ) という二つの状態をダイナミックに変化させており、この動態を「動的不安定性」と呼ぶ。植物の間期細胞では、微小管は表層微小管束を構築し、速く伸長する細胞では表層微小管は伸長方向に対して直角に配向する。我々は動的不安定性がいかに伸長細胞の表層微小管の配向ひいては細胞の伸長方向に影響しているかを評価するため、GFP を付加した β－チューブリン 6 たんぱく質を構成的に発現させるシロイヌナズナ形質転換体を用い、共焦点レーザースキャン顕微鏡により、植物体の in vivo での表層微小管の動態を観察し、動態のパラメーターを数値化した。さらに、微小管薬剤無添加培地の植物体と根が左巻きねじれを示す微小管薬剤添加培地の植物体で表層微小管動態のパラメーターを比較した。ねじれ変異株についても同様に解析を計画している。

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植物細胞の伸長方向は表層微小管の配向により少なくとも部分的に制御される。伸長方向が右または左にずれるアラビドプシスねじれ変異株の解析により、微小管機能と細胞伸長の密接な関係が改めて示唆されてきた。
　α-tubulinのN末端にヘマグルチニン（HA）やmycタグまたはGFPを付加し、CaMV35Sプロモーターで強制発現させたアラビドプシス形質転換体では導入したα-tubulinが微小管ポリマーに取り込まれ、葉柄や花弁で右巻きのねじれを示した。一方、α-tubulinのC末端にmycを付加した系統やβ-tubulinのN末端にGFPを付加した系統では導入したtubulinは微小管ポリマーに取り込まれるが、ねじれ形質を示さなかった。我々は、α-tubulinのN末にペプチドを付加することによりα-tubulinのもつβ-tubulin GTPase活性が阻害され、長いGTPキャップを持つ安定な微小管を形成し、伸長細胞に右巻きねじれを引き起こしたと推測した。この仮説の検証するため、GTPase促進活性に重要なアミノ酸を変異させたα-tubulinを強制発現させた形質転換体を作製したところ、葉柄と花弁において右巻きのねじれを示し、トライコームの分岐数が増大していた。

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微小管構造は全ての真核生物でほぼ共通である。すなわち、αチューブリンとβチューブリンが安定なヘテロ二量体を形成し、これが縦につながって微小管原繊維が形成され、原繊維が通常13本横に束ねられて中空の微小管となる。微小管の構造と動態には、二量体内と二量体間の縦方向のα－β相互作用、及び原繊維間の横方向の相互作用が重要である。これまで我々は左巻きねじれ変異株lefty1とlefty2が二量体内のα－β接触部位のアミノ酸置換により、不安定な微小管を形成するdominant negative変異であると報告した。
　今回、微小管重合阻害剤に対して高感受性を示す変異株を多数スクリーニングすることにより、チューブリン変異とねじれ形成との関係を詳細に調べた。その結果、二量体内のα－β接触部位の左巻き変異が新たに3種得られた。二量体間の接触部位の変異は右巻きが4種、左巻きが3種あった。原繊維間の横方向の変異は右巻きが10種に対し、左巻きは1種のみであった。αチューブリンのGTPase活性化領域の変異も二種あり、これらは右巻きの表現型を示した。
　現在これらのねじれチューブリン変異株に関して表層微小管の配向や動態の観察を進めている。

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シロイヌナズナ半優性変異株propyzamide hypersensitive1-1 (phs1-1)は寒天培地上で育てると根が左巻きにねじれ、3μMの微小管重合阻害剤プロピザミドを添加した培地では根の表皮細胞層は細胞肥大し高感受性を示す。根の表皮細胞層の表層微小管は、phs1-1変異株では野生株に比べやや短く、全体としてはランダムでやや右肩上がりの配向に変わっていた。このphs1-1変異株の原因遺伝子をマップベーストクローニング法により同定したところ、PHS1タンパク質はC末端にdual-specificity protein tyrosine phosphatase (DsPTP) catalytic domainを持っていた。PHS1タンパク質をglutathione-S-transferase融合タンパク質として大腸菌で過剰発現させて、in vitroでフォスファターゼ活性を測定したところ、野生型PHS1融合タンパク質は人工基質を脱リン酸化する活性を示した。PHS1遺伝子内にT-DNAが挿入したヌル変異株phs1-2は劣性の胚性致死を示した。PHS1ゲノム領域を導入した形質転換体の解析より、phs1-1変異(R64C)はドミナント・ネガティブ変異であると結論した。

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　陸上植物の細胞では一般的に中心体は見られず、微小管は分散型の微小管形成中心（MTOC）から発達する。単色素体性の減数分裂を行うコケ植物では、減数分裂前期に色素体表面が、終期には核表面がMTOCとして働くと考えられている。これら膜表面をMTOCとする微小管形成は、陸上植物のMTOCの進化を考える上で鍵となる構造と考えられる。そこで、コケ植物の膜表面に存在するMTOCについて、単色素体性の減数分裂を行うケゼニゴケの減数分裂期の細胞を使って詳しく調べた。γ-チューブリンは減数分裂前期の色素体表面と終期の核膜表面に存在する。オリザリンを使って微小管を破壊しても、この色素体や核表面のγ-チューブリンの局在は影響を受けなかった。次に、減数分裂期の細胞から核と葉緑体を単離しγ-チューブリンの局在を調べた。その結果、単離した色素体、核の表面にγ-チューブリンが局在することを見つけた。γ-チューブリンの局在がみられる色素体、核の数は全体の半分以下であったが、これは色素体や核表面が細胞周期の特定の時期にのみ微小管形成能をもつことを反映した結果と考えられる。また単離した色素体表面から牛脳由来のチューブリンからなる微小管を形成させることに成功した。これらの結果は，微小管形成に関して，色素体表面や核表面においても中心体と同様の分子メカニズムが関与していることを示唆する。

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我々は、原形質流動に関与するミオシンXIをタバコ培養細胞BY-2から精製し、これが1分子のATP分解によって、35nmステップでアクチンフィラメント上をプロセッシブ（連続的）歩けるタンパク質モーターであることを明らかにした（EMBO J. 2003 vol. 22 pp. 1263-1272）。形質流動は細胞内Ca²⁺の上昇によって阻害されることが知られているが、分子レベルでの制御機構に関してはほとんど分かっていない。本研究では、原形質流動に関与するミオシンのCa²⁺制御機構を解析した。ミオシンをpCa5.5以上の高濃度のCa²⁺で処理をすると、軽鎖であるカルモジュリンが解離し、アクチンフィラメント上を運動する能力が低下した。in vitro運動アッセイにおいて、ミオシンの表面密度をあげると、Ca²⁺存在下でも滑り運動が観察された。以上の結果は、Ca²⁺によってミオシンXIの連続的な運動が抑制されたことを示している。短いアクチンフィラメントをミオシン1分子にrigor結合させて、ブラウン運動によるアクチンフィラメントの回転からミオシン分子のねじれ弾性を見積もったところ、pCa 5.5以下で回転は抑制された。この結果から、軽鎖カルモジュリンが外れることにより、軽鎖結合部位が折りたたまれて短くなり、硬くなったと考えられる。この軽鎖結合部位の弾性変化がミオシンの連続的な運動を抑制したと考えられる。

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Myosin XI is a molecular motor responsible for the cytoplasmic streaming in plant cells. In cultured tobacco BY-2 cells, two subclasses of myosin XI, 170-kDa and 175-kDa myosins, have been identified biochemically and immunocytologically. It has been revealed that the 175-kDa myosin was accumulated in phragmoplasts in mitotic cells. In the present study, we identified the organelle transported by the 175-kDa myosin. In transgenic BY-2 cells expressing GFP-labeled endplasmic reticulum (GFP-ER), the intracellular localization of 175-kDa myosin and ER was studied. Especially in mitotic cells, both were accumulated in the phragmoplasts. This phenomenon was suppressed by laturanculin B, an actin-depolymerizing drug. These results suggested that the 175-kDa myosin is concerned with translocation of ER in the cytoplasmic streaming and in phragmoplast formation.

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　C₄植物の維管束鞘細胞（BSC）葉緑体は，維管束に対して遠心的または求心的に配列している．この細胞内配向性は細胞の成長に伴い獲得される．また，遠心処理により葉緑体の配列を乱れさせても，大半の葉緑体は数時間以内に元の位置へと移動する．したがって，BSC葉緑体には細胞内の特定の場所へと移動する分子機構を備えていることが予想される．本研究ではC₄植物シコクビエを対象とし，遠心処理後のBSC葉緑体の配向性回復が各種阻害剤でどのように影響されるかを調べた．
　その結果，微小管重合阻害剤であるコルヒチンは阻害効果がない一方，アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンBおよびラトランクリンBは配向性回復を阻害した．また，ミオシンATPaseの阻害剤であるBDMやタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドも配向性回復を阻害した．したがって，配向性回復には新規タンパク質合成とともにアクチン・ミオシン系が重要な役割を担っていることが示唆された．

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細胞壁を持つ緑色植物の細胞では、細胞膜に沿って微小管が並び、表層微小管列がつくられる。表層微小管は細胞膜近傍で生じたあと形成部位から切り出され、細胞膜に沿ってトレッドミルにより動くことが知られている。本研究では、表層微小管が細胞膜近傍で生じる分子機構を明らかにするため、in vitro系での解析を行った。タバコ培養細胞プロトプラストから調製した単離細胞表層（細胞膜ゴースト）を細胞質抽出液で処理するとゴースト上の微小管が増加する。抽出液にローダミン標識チューブリンを加えることにより、新たに生じた微小管を処理前から存在していた微小管と識別することに成功した。表層微小管上に点在するγ-チューブリンは抽出液処理により増加し、新たに生じた微小管は、表層微小管に結合したγ-チューブリンのある場所から伸長した。抗γーチューブリン抗体は新たな微小管形成を阻害した。抽出液処理前にゴースト上の微小管を破壊すると、新たな微小管は形成されなかった。これらの結果から、細胞内においては、既存の表層微小管に細胞質中のγ-チューブリンが結合し、新たな表層微小管がそこから伸長開始することが予想された。in vivoにおける微小管の分枝とγ-チューブリンの関係をNicotiana benthamianaを用いた遺伝子サイレンシングの実験系を用いて解析中である。

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