G繊維は、伸長を終え二次肥大成長している双子葉植物の茎が重力に応答して姿勢制御するために形成される引張あて材の繊維で、リグニンを全く含まない二次壁層（G層）を大量に蓄積する。引張あて材がその強い成長応力によって木化した茎を屈曲させる原動力はG繊維であると言われているが、引張応力の発生メカニズムについては未だ明らかにされていない。キシログルカンは二次壁にはほとんど存在しないが、G層には確実に存在することがメチル化分析によって示された。キシログルカナーゼ（XEG）構成発現ポプラは重力屈生のコントロールが不能になることを昨年の本大会で報告した。XEG形質転換体ポプラの引張あて材、G繊維の壁層構造などは野生型と比べて形態学的に大きな変化はなかった。そこでキシログルカンに対する抗体を用いて野生型・XEG形質転換体両ポプラの茎断面を処理し、G繊維の観察を試みた。野生型においては、形成途上の引張あて材のG層最内層に抗体による標識が観察されるのに対して、形質転換体では抗体の標識が観察されなかった。このことは、G繊維はG層形成中にキシログルカンを生成していること、そのキシログルカンが形質転換体では失われていることを示しており、G繊維の引張応力発生機構にキシログルカンの関与があることを意味している。

抄録全体を表示

細胞壁タンパク質のエクスパンシンとイールディンは、それぞれ壁展性（φ）と臨界降伏張力（y）の調節を介して伸長に伴う細胞壁伸展制御に寄与すると考えられている．しかし、それぞれの実験解析は、植物材料、試料調製法および解析法が全て異なり、未だ共通の場で論じられていない．そこで、エクスパンシン発見の材料であるキュウリ下胚軸で、グリセリン処理中空胚軸切片（GHC）を用いた細胞壁の降伏伸展特性解析を行い、壁伸展制御に対する壁降伏パラメータφ及びyの関与を調べた．
壁伸展速度の張力依存性から求まるキュウリの壁伸展の特性曲線は、ササゲと同様にyの存在とそのpHに依存する変化を明確に示し、同時に、yを越す張力下のφも著しくpHに依存して変化することを示した．何れも酸生長説を裏付ける結果であった．定張力下におけるGHCの壁伸展（クリープ）のpHによる制御には、壁展性に加え、臨界降伏張力の関与が明らかとなった．熱処理（boiling 15sec）によりpHに依存するGHC のy調節能は失われたが、φの調節能はほとんど影響を受けず、また、金属イオン等のクリープ阻害剤も壁伸展の特性曲線にそれぞれ特徴のある影響を及ぼした．以上の結果をもとに、キュウリの壁展性φは壁タンパク質の調節を受けないこと、特性曲線から推定した伸長生長時の壁伸展調節様式の特徴等について考察する．

抄録全体を表示

グリセリン処理ササゲ下胚軸を用いた引っ張り試験から、細胞壁の力学的パラメーターである壁展性（φ）と臨界降伏張力（y）がpHに応じて変化し、細胞壁伸長を制御することが示されている。加熱処理の影響からy調節にはタンパクが関与するが、φ調節にはタンパクが関与しない可能性が考えられた。さらに、EDTA処理やCa²⁺の添加によりφはpHに依存せずに変化することから、φ調節にCa²⁺が関与する可能性が示唆された。そこで、Ca²⁺と結合する細胞壁成分であるペクチンの生化学性状をin vitroで検討し、φの変化との相関を検証した。ササゲ黄化芽生えの下胚軸を伸長域、中間伸長域、既伸長域に分けペクチンを調製した。ゲルろ過により、ペクチン画分が1,600と180 kDaの二つの多糖成分から構成されることを明らかにした。1,600 kDaの成分は伸長域で最も多く、中間伸長域、既伸長域の順に減少した。pH 6.2でペクチン画分にCa²⁺を加えると、1,600 kDaのピークは3,600 kDaの位置にシフトしたが、EDTAの添加により3,600 kDaのピークは1,600 kDaにもどった。この間180 kDaの成分に大きな変化はなかった。pHを4.0に低下させても同様の変化が見られることから、Ca²⁺によるペクチン架橋がpH変化により可逆的に調節され、φ調節に関る可能性が示された。

抄録全体を表示

Yieldin(YLD)は、臨界降伏圧（Y）を制御して細胞壁の伸展を調節しているササゲ細胞壁から単離された約33kDのタンパク質である。我々はYLDが何らかの細胞壁構成物質と親和性があると予想し，YLD親和性分子（Yieldin Associated Molecule; YAM）の単離を試みた。
YLDを固定化したアフィニティクロマトグラフィを使って、ミトリササゲ芽生えの伸長成長部域由来の切片より分離した非セルロース性の細胞壁構成多糖からYAMの単離を行った。その結果、Xyl,Glc,ManおよびGalを5-6：3-4：1：8-10の割合で含む、分子量約120 kDの多糖が得られた。YAMとYLDの相互作用は酸性条件下で強く、pH4の条件下では1μgの YLDあたり約245μg のYAMが結合するのに対してpH6の条件下では結合量はその10分の1以下であった。またササゲ中空胚軸(GHC)を用いて再構成実験を行い、YAMがYにどのような影響を及ぼすかを検討したところ、100μg/mL以上の YAMをGHCにあらかじめ与えた場合、細胞壁の酸性化に伴うYの変化は完全に抑制された。これらの結果から、今回単離されたYAMがYLDによるY調節に何らかの重要な役割を持っていることが示唆された。

抄録全体を表示

WRKYタンパク質は植物特異的な転写因子であり、傷害・病原菌感染時のシグナル伝達に関与する転写因子と考えられてきた。WRKY40(At1g80840)は、サリチル酸処理で遺伝子発現が誘導されることがDongらによって報告された(Dong, 2003)。本研究において我々は、WRKY40がメチルジャスモン酸、アブシジン酸、エチレンのホルモン処理においても同様に、処理後30分で発現誘導が起こることをノーザンハイブリダイゼーション実験から得た。また、完全長cDNAマイクロアレイを用いた実験よりWRKY40遺伝子が乾燥、塩、低温のabiotic stressでも発現が誘導されることが明らかになり、この結果はノーザンハイブリダイゼーションでも確認できた。以上のことから、WRKY40がbiotic stressだけでなくabiotic stressの両方に機能していることが示唆された。植物体におけるWRKY40の機能を明らかにするため、WRKY40遺伝子の過剰発現、発現抑制、およびRNAi形質転換体をそれぞれ作製した。
　環境ストレス条件下での各変異株の生育及びWRKY40タンパク質の標的遺伝子候補について合わせて報告する。
Dong J, Chen C, Chen Z. (2003) Plant Mol Biol. 51(1):21-37

抄録全体を表示

ネオザンチン開裂酵素(NCED)は植物ホルモン（ABA）の生合成の鍵酵素として知られている。シロイヌナズナでは7種類のNCEDからなる遺伝子ファミリーを形成しているが、その一つであるAtNCED3遺伝子は乾燥で強く誘導されるこが報告されている。AtNCED3遺伝子をトウモロコシのユビキチン遺伝子のプロモーターの下流に結合させたコンストラクトをイネに導入して、AtNCED3を恒常的に発現する形質転換イネを作出した。得られた形質転換体はABA量の増加がみられ、耐乾燥性を示した。そこで、イネにおけるNCEDの機能を調べるために、イネのゲノム配列のホモロジー検索をおこなった。トウモロコシのNCEDであるVp14に相同性のある3つのNCEDが存在し、それらのNCEDはORF上でイントロンの無い遺伝子と推定された。配列情報をもとにして、ゲノムもしくはcDNAからPCRを用いてクローニングをおこなった。クローニングした3つのNCEDをノザン解析した結果、2つのNCEDが高塩もしくは乾燥ストレスによってmRNAの蓄積がみられた。

抄録全体を表示

アブシジン酸（ABA）の情報伝達には、タンパク質リン酸化が重要である。我々は、その中枢を担うシグナル因子としてシロイヌナズナSnRK2プロテインキナーゼ（SRK2A～J）に注目し、その一つであるSRK2E/OST1がABAによる孔辺細胞の閉鎖に関与することを明らかにした¹⁾。細胞レベルにおける活性化プロファイルを調査するため、SRK2E/OST1を過剰発現させたシロイヌナズナT87培養細胞を作成し解析に用いたところ、SRK2E/OST1はABAのみではなく浸透圧ストレス（OS)でも活性化されることが明らかにされた。そこで、このOSによる活性化がABAを介したシグナル経路に依存するか否かを、ABA非感受性変異体およびABA欠損変異体を用いて検討した。その結果、abi1-1はABAによるSRK2E/OST1の活性化を強く阻害するがOSによる活性化には影響しないこと、そして、aba2-1およびNCED3遺伝子破壊変異体でのOSによる活性化は正常であることが確認された。また、SRK2E/OST1のキナーゼドメイン以外のNおよびC末端領域を除いたコンストラクトを培養細胞で過剰発現させたところ、C末端のある領域がABAを介した活性化に重要であることが確認された。これらの結果は、ABAおよびOSによるSRK2E/OST1の活性化が互いに異なる経路により制御されることを示唆しており、今後、上流因子あるいは活性化機構を解明するための糸口になるものと期待される。
1) Yoshida et al. (2002) Plant Cell Physiol. 43(12): 1473-1483

抄録全体を表示

SnRK2ファミリーは酵母のSNF1プロテインキナーゼと相同なキナーゼドメインを持ち、植物に固有のプロテインキナーゼである。近年、SnRK2ファミリーに属するプロテインキナーゼが、アブシジン酸（ABA）シグナルの重要な中間因子であるという報告が相次ぎ、その役割が注目されている。我々は、シロイヌナズナSnRK2ファミリー（SRK2A～J）を網羅的に解析するために、GFPとの融合タンパク質を過剰発現させた培養細胞（T87）を作製した。この細胞を用いてゲル内リン酸化反応を行ったところ、SRK2Cが浸透ストレスおよび低温ストレスによって活性化されることを見いだした。植物における遺伝子発現をノーザン解析によって調べると、SRK2Cは根に多く発現しており、低温ストレスによって発現が誘導されることが明らかとなった。続いて、SRK2C-GFPを過剰発現させた植物を作製したところ、抽臺・開花遅延の表現型が認められ、凍結耐性および乾燥耐性を示した。この過剰発現植物では、ストレス応答性遺伝子の発現量が増加しており、このことが耐性獲得に寄与していると考えられた。以上のことから、SRK2Cはストレス時におけるシグナル伝達を正に制御するプロテインキナーゼであると考えられる。

抄録全体を表示

DREB1A遺伝子は、低温、乾燥および塩ストレスに関与する遺伝子発現を制御するシス領域であるDRE（Dehydration Responsive Element）配列に結合するタンパク質をコードするcDNAとして単離された。DREB1A遺伝子は、低温ストレス条件下において特異的に 誘導される。DREB1Aタンパク質は、詳細なゲルシフト分析によりA/GCCGAC配列に特異的に結合することが明らかにされている。DREB1A遺伝子を恒常的に過剰発現させた形質転換植物は、低温、乾燥、塩ストレスに対する耐性が向上する。DREB1Aの標的遺伝子を22Kオリゴアレイをもちいて網羅的に検索し、低温ストレス処理後の計時的なノーザン解析およびプロモーター領域の結合配列解析を行って分類した。また、植物特異的転写抑制領域をもちいた形質転換植物体を作製し、標的遺伝子の転写レベルを解析した。本研究ではさらにDREB1Aの標的遺伝子であるC2H2タイプ転写因子を恒常的に強制発現する形質転換植物を作製し解析した。C2H2タイプ転写因子の形質転換植物体は、DREB1A形質転換植物と同様に矮化し、乾燥ストレスに対する抵抗性が増すことがわかった。現在、このC2H2タイプ転写因子の標的遺伝子を22Kオリゴアレイをもちいて検索している。

抄録全体を表示

MAP kinase cascadeは真核生物に広く保存されているシグナル伝達系の一つであり、高等植物においては環境ストレスや病原菌感染などに対して重要な役割を果たすことが報告されている。近年、シロイヌナズナのGenome sequence projectが終了し、シロイヌナズナゲノム中にはMAPKKK遺伝子が60、MAPKK遺伝子が10、MAPK遺伝子が20個存在することが明らかとなった。今回、我々はMAPK kinaseの一つであるAtMKK3に着目し、AtMKK3がどのMAP kinaseを活性化するかについてin vitro活性法により検討した。その結果、AtMKK3はAtMPK6、AtMPK8を特異的に活性化することが示唆された。次に、グルココルチコイド誘導系を用いて、AtMKK3を植物体内で過剰発現させ、AtMKK3によって特異的にリン酸化されるタンパク質をゲル内リン酸化法により測定した。その結果、46kDa付近と、65kDa付近に存在するタンパク質が特異的に強く活性化されることが明らかとなった。更に、AtMPK6を特異的に認識する抗体を用いて、免疫沈降後、ゲル内リン酸化反応を行ったところ、AtMPK6がAtMKK3によって活性化されることが明らかとなった。以上のことから、in vivoにおいてもAtMKK3-AtMPK6カスケードが存在することが明らかとなった。現在、AtMKK3、AtMPK6遺伝子破壊植物体を用いて、AtMKK3-AtMPK6カスケードの植物体における生理作用についても解析を行っている。

抄録全体を表示

The dehydration-dependent expression of the erd1 gene is under the control of co-operative activity of two cis elements, NACRS (NAC recognition sequence) and ZFHDRS (zinc finger homeodomain recognition sequence). Last year, we reported the isolation and functional analyses of three NACRS binding NAC transcriptional activators. Recently, a ZFHDRS binding ZFHD1 transcriptional activator was isolated using yeast one-hybrid system. ZFHD1 protein specifically binds to ZFHDRS both in vitro and in vivo. The expression of ZFHD1 gene was induced by drought, high salinity and ABA. The ZFHD1 and NAC transcriptional activators co-operatively transactivated expression of the GUS reporter gene driven by the erd1 promoter in Arabidopsis T87 protoplasts. Yeast two-hybrid system detected interaction between ZFHD1 & NAC proteins.

抄録全体を表示

細胞膜は外界からのシグナルを受容する場と考えられ、それを構成しているリン脂質の1つホスファチジン酸(PA)は、外界からの種々のシグナルによって特異的に代謝されることが知られている。
我々はPAの生理機能を遺伝子レベルで理解する目的で、シロイヌナズナ種子を低温処理後、発芽過程12～48時間目のPA産生量を測定した。その結果、PAは、12時間で最も高く、その後減少していくこと、さらにABA存在下では、PAが顕著に蓄積していることを見出した。したがって種子における発芽過程ではABAのシグナルによりPAが産生し、このPAが代謝され減少することが、種子発芽を促進すると考えた。そこで、PAの分解酵素であるホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)に注目した。PAPはゲノムに4遺伝子存在しているので、発芽過程に機能しうるPAPを絞り込んだ。対応するノックアウト変異体(KO)を用いたABA感受性試験を行ったところ、PAP2-KOは発芽時にABA高感受性であり、ABA存在下での発芽過程で劇的にPAが蓄積していることを見出した。以上の結果からPAは発芽過程でABAのシグナルを伝達する機能を持ち、PAP2-KOにおけるPAの蓄積が発芽を阻害していると予想した。現在、PAP2-KOを用いたゲノム科学的解析および遺伝学的な解析を進めている。

抄録全体を表示

我々は、イネにコードされる10個のSnRK2ファミリーメンバー、SAPK1～10のすべてが高浸透圧ストレスによって速やかに活性化を受けること、ならびに、SAPK8, 9, 10はABAによっても活性化されること、さらにSAPKの高浸透圧ストレスおよびABAによる活性化はリン酸化を介して制御されていることを明らかにしてきた。今回、SAPKの構成的活性型変異体を作成する目的でkinase domainのactivation loopに対応する領域のセリンとスレオニンをアスパラギン酸に置換した種々の変異体を作成した。期待に反し、これらの変異体はすべて活性を失ったが、高浸透圧に応答したリン酸化を受けることに変化はなかった。このことは、高浸透圧ストレスおよびABAによるSAPKのリン酸化は自己リン酸化によるものではないことを示している。上流のSAPKリン酸化酵素キナーゼを同定する第一歩として、SAPKを基質としたin gelアッセイを行ったところ、いくつかのSAPKリン酸化活性を検出することができた。現在その詳細について解析を進めている。また、阻害剤を用いた上流因子の検討や、SAPKの標的基質に関する検討結果についても合わせて報告する予定である。

抄録全体を表示

我々はこれまでに澱粉合成の鍵酵素と言われているAGPase large subunit (AGPL)の発現が、イネカルス中で糖の添加によって上昇することを報告した。その一連の研究の中で、アブシジン酸(ABA)に対するAGPLの発現応答を調べたところ、ショ糖(Suc)と同時に処理した場合、Suc単独の場合よりも5倍程度発現量が増加することを見いだした。ABA単独では発現量に変化は見られず、この応答はSucと協調的であると推測された。ABAは糖シグナルと密接な関連があることで知られている。そこで、AGPLと同様に発現が誘導される遺伝子を網羅的に調べることで、澱粉合成初期の調節のメカニズムに迫れないかと考えた。今回は、遺伝子の発現量の微弱な増減を検知することが可能なcDNA-AFLP法を用いて、同条件下で発現量が増加する遺伝子の単離を試みた。検出された約一万本のバンドの解析から、SucまたはABA単独では発現量に変化がないものの、同時に処理した場合のみに増加したものが80個あった。その中にはRice Branching Enzyme 4、Sucrose Synthase 3、Hexose Transpoterといった、澱粉合成や糖代謝に関連する遺伝子が含まれていた。

抄録全体を表示

【目的】これまでに植物において、ストレス耐性や防御に関連する多くの遺伝子が選択的スプライシング機構による転写後発現調節を受けることが明らかになっている。シロイヌナズナにはスプライシング制御因子の一つであるSRタンパク質ホモログが19種類存在しており、それらのいくつかは植物特有のスプライシング機構の制御に関与していると予想される。そこで本研究では、植物のスプライシング制御機構を明らかにすることを目的としてシロイヌナズナSRタンパク質ファミリーの機能解析を試みた。
【方法・結果】種々のストレスに対する応答性をノーザンブロッティングにより検討した結果、いくつかのSRタンパク質（SR41.2、SR34/SR1、RS31.1、RSZ33、SC33.1、SC35.1、）が強光（1600 μE/m²/s）、パラコート（3 μM）および塩（250 mM）処理によって発現誘導された。特に、強光に対してSR41.2の発現が最も迅速に誘導された。SELEX法による解析の結果、SR41.2はGTTT繰り返し配列を認識することが明らかになった。現在、ストレス誘導性SRタンパク質を過剰/抑制発現させた形質転換シロイヌナズナを用いて、in vivoでのスプライシング解析および二次元電気泳動によりそれぞれのターゲット遺伝子の同定を試みている。

抄録全体を表示

　アフリカ・カラハリ砂漠の野生種スイカは、強光乾燥ストレスに対する耐性能力が高いC₃植物である。この葉組織において強光乾燥条件下で発現誘導される遺伝子をディファレンシャルディスプレイ法により探索し、動物のシトクロムb₅₆₁と配列相同性を有するCLCyb561-AのcDNAを単離した。またCLCyb561-Aと相同性を持つ、CLCyb561-BのcDNAをdegenerate PCR法により単離した。ノザン解析の結果、強光乾燥ストレスでCLCyb561-A遺伝子の発現が短期間に強く誘導されるのに対し、CLCyb561-B遺伝子の蓄積量は徐々に減少していた。しかしCLCyb561-Bタンパク質の蓄積量は、ストレス下で減少せず一定であることがウェスタン解析により明らかとなった。またGFP融合タンパク質を用いたところ、CLCyb561-A、Bは共に細胞膜に局在している事が示唆された。動物のシトクロムb₅₆₁は副腎小胞に局在する膜貫通タンパク質で、ノルアドレナリン生合成に必要な還元力を小胞内に伝達する。これらの結果から、CLCyb561が強光乾燥ストレス下において、細胞内の余剰な還元力を細胞外へ散逸している可能性が考えられた。この仮説を検証するために、スイカ葉から調製したプロトプラストに光を照射した際に、細胞外へ伝達される還元力の測定系の構築を試みている。

抄録全体を表示

アフリカ・カラハリ砂漠に自生する野生スイカは、乾燥強光耐性に優れるC3型植物である。その分子耐性機構を理解するため、EST解析により乾燥強光ストレス下での遺伝子発現を包括的に理解することを試みた。乾燥強光ストレス前、ストレス1日目、3日目の野生スイカの葉組織より3種類のcDNAライブラリーを構築し、これまでに合計で約4,900のEST配列を得た。それらは約2,900種のクラスターに分類され、そのうち約60%はアラビドプシスのゲノムに相同配列を有していた。各ライブラリーに高頻度で出現するESTの比較から、葉における遺伝子発現の大規模な変化が見られた。光化学系のサブユニットをコードする遺伝子群は、ストレス前の葉に由来するESTから高頻度で見られたが、乾燥強光ストレスにより顕著に出現頻度が減少していた。それに対し、ストレス葉に由来するESTのうち最も出現頻度が高いものは、60アミノ酸残基のタンパク質をコードし、植物3型のメタロチオネイン様タンパク質と高い配列相同性を有していた。そのEST出現頻度はストレス葉由来のESTの約5%を占めていた。ノザン解析により、この遺伝子の発現が乾燥強光ストレス下の葉において顕著に誘導されることが確認された。植物3型メタロチオネインの乾燥強光ストレス下における高誘導は報告例がなく、酸化ストレス耐性における役割を考えると興味深い。現在、さらに多種類のcDNAライブラリーを用い、EST配列情報の拡充を図っている。

抄録全体を表示

　プトレッシン，スペルミジン，スペルミンなどのポリアミン類は，様々な生理現象や発育過程に影響を及ぼす低分子の有機陽イオンであり，高浸透圧，塩，低酸素，低温，病原体感染など様々なストレス応答にも関与していることが知られている．近年の研究から，ポリアミン類の一つであるスペルミン(Spm)は，タバコ植物においてサリチル酸とは独立にPR（pathogenesis-related）タンパク質を誘導すること，さらにタバコモザイクウイルスに対する抵抗性を付与することが示され，病原体感染時のシグナル分子の一つと考えられている．そこで，我々はこのSpmの作用に着目して研究を行い，MAPキナーゼであるSIPK（salicylic acid-induced protein kinase）とWIPK（wound-induced protein kinase）を共に活性化することを示した．また，SpmによるMAPキナーゼの活性化はカルシウム依存的であり，抗酸化剤の前処理によって強く抑制された．我々の結果は，Spmが病原体に対する抵抗性や過敏感細胞死に関与しているシグナル分子であり，Spmシグナル伝達経路には活性酸素種とカルシウムが関与していることが示唆された．

抄録全体を表示

CO₂は濃度依存的に気孔の開閉を誘導する因子であり、例えば低CO₂条件下では気孔は開口し、蒸散量が上昇し、葉面温度が低下する。このような植物におけるCO₂感知のメカニズムを調べるために、CO₂濃度依存的な葉温変化に異常をきたしたアラビドプシス突然変異体を単離した。このうち野生株よりも高温を示す2つのht変異体(high leaf temperature mutant)について解析をおこなっている。ht1変異体はCO₂濃度の上昇に対し過敏な葉温変化を示し、ht2変異体はCO₂濃度変化にあまり依存せず常に高温を示す。実際、気孔コンダクタンスや気孔の開度を測定した結果、ht1およびht2変異体では低CO₂条件下でも気孔の開度が低いことが明らかとなった。現在、これらの変異体における表現型の更なる解析を行っている。

抄録全体を表示

ヒラドツツジ (Rhododendron mucronatum) は我が国において広く用いられている街路樹の一つである。二酸化窒素 (NO₂) でヒラドツツジを暴露し、暴露葉から抽出したタンパク質を二次元電気泳動法を用いて解析したところ、germin-like protein (GLP) のレベルが高まること (5-6倍) が示された。GLP は細胞外に分泌される植物に普遍的な糖タンパク質で，4つのサブファミリーからなる巨大なタンパク質ファミリーを形成している。GLP には酵素活性を有しているものや，ストレスによりその発現が誘導されるものが知られているが、その生理機能については未だ明らかでない。NO₂ 暴露により同定されたヒラドツツジの GLP はそのアミノ末端配列からサブファミリー3 に属すると推定される。
今回、このタンパク質の cDNA を得ることを目的として、そのアミノ末端配列をもとに作製したディジェネレートプライマーを用いて、GLP のクローニングを行った。その結果、2種類の全長 cDNA を得た。両者の推定アミノ酸配列は 77.7% の相同性を示したが、暴露葉から同定された GLP とは異なり、いずれもサブファミリー2に分類された。これらの GLP 遺伝子の NO₂ 暴露に対する転写応答を competitive RT-PCR 法により解析したところ、いずれの GLP も NO₂ 暴露により mRNA が 1000 倍誘導された。現在、NO₂ 暴露による GLP タンパク質レベルの変動について解析を行っている。

抄録全体を表示

The thermogenic spadix of homeothermic skunk cabbage, Symplocarpus foetidus, shows an inverse relationship between the levels of respiration and changes in the ambient air temperature. To clarify the molecular mechanism underlying respiration control in the spadix, mitochondrial respiratory activities mediated by alternative oxidase (AOX) and uncoupling proteins (UCPs) were analyzed. Pecoll-based centrifugation with crude mitochondria derived from the thermogenic spadix gave a distinct and respiratory active fraction that contains the cytochrome c oxidase, which suggested the successful purification of undamaged mitochondria. Interestingly, the purified mitochondria showed significant AOX and UCP activities, which were characterized by cyanide-resistant and SHAM-sensitive respirations, and FCCP-insensitive respirations, respectively. Because the major UCPs detected in the purified mitochondria were found to be a novel UCP isoform, termed UCPb, which lacks the conserved fifth transmembrane domain, two different mitochondrial reactions induced by AOX and UCPb seem to play an important role in the thermoregulation of the spadix.

抄録全体を表示

窒素栄養に対する呼吸系の応答については、呼吸と窒素濃度との相関を調べた研究以外は数少なく、その相関の背景にあるメカニズムも不明である。低窒素条件下では炭素と窒素のバランスがくずれ、葉にデンプンが蓄積し、光合成が阻害されうることが知られている。呼吸系は過剰の炭水化物を消費し、植物体内の炭素と窒素のバランスをとる働きがあると言われている。さらに呼吸鎖にあるATP合成とは共役しないシアン耐性経路（AOX）が過剰な炭水化物を効率良く消費すると考えられているが、AOXが炭水化物の消費系としてどの程度役立っているのかは分かっていない。現在、窒素栄養に対する呼吸系の応答を明らかにするために、ミトコンドリアを単離しやすく、生化学的実験の行いやすいホウレンソウの葉を用いて、（1）窒素条件による葉の呼吸速度の違い、（2）呼吸系酵素の量や最大活性、（3）酸素電極を用いた単離ミトコンドリアの呼吸電子伝達速度、（4）酸素安定同位体を利用したAOXのin vivo活性速度を調べている。本大会では、以上の解析の結果とそれに基づいた低窒素条件下における呼吸系の制御メカニズムや役割について報告する。

抄録全体を表示

根粒菌の感染によりマメ科植物の根に形成される根粒は、宿主植物によって着生の制御が行われている。これまでに、根粒着生の制御に関わる様々な物質の報告がなされており、中でも成長調節物質である植物ホルモンは、根粒様物質の誘導や根粒着生の制御を行うことが報告されている。ブラシノステロイドは植物の成長において様々な働きを行うだけではなく、近年では病害ストレス応答に関与し、病害抵抗反応をシステミックに誘導することが報告されている。今回、私達はブラシノステロイドの中でも最も強い生理活性を示すブラシノライドおよびブラシノライド合成阻害剤（ブラシナゾール）をダイズ野生株（エンレイ）および根粒超着生ミュータント（En6500）の地上部および地下部に処理し、根粒着生への影響を調べた。
ブラシノライドの地上部への処理により根粒超着生ミュータント（En6500）の根粒着生数は著しく抑制されたが、エンレイにおいては根粒着生の抑制は見られなかった。また、根の基部への注入においてもEn6500では根粒着生の遅延が確認されたが、エンレイでは根粒着生への影響はみられなかった。一方、ブラシノライド合成阻害剤であるブラシナゾールをエンレイの地上部および根の培地中に処理した結果、コントロール区と比較して、根粒着生数の増加が確認された。以上の結果から、ブラシノライドがダイズの根の発達および根粒着生の制御に関わることが示唆された。

抄録全体を表示

Some kinds of cyanobacteria have nitrogenase and fix nitrogen. Using the combination of PCR and shot-gun-sequencing methods, we identified the nif and nif-associated genes (nifJ, nifT, nifZ, nifV, nifP, nifB, fdxN, nifS, nifU, nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, nifW, hesA, hesB and fdx) of the unicellular nitrogen-fixing cyanobacterium Cyanothece sp. TU126. Except for nifJ, the nif and nif-associated genes were arranged in the 20-kb region of Cyanothece sp. TU126 genome. We did not obtain the nifY, nifM, nifF and nifQ that were identified as nif genes in Klebsiella pnecumonnie. When the nifHDK operon encoding nitrogenase subunits was driven by T7 promoter in Escherichia coli cells, the corresponding polypeptides were detected, suggesting that the nifHDK operon also expressed as a polycistronic manner in E. coli.
This work was partly supported by METI/NEDO.

抄録全体を表示

Two different types of glutamate synthase, Fd- and NADH-GOGAT, are present in a cyanobacteria Plectonema boryanum. Analysis of mutants lacking either GOGAT genes has indicated that Fd-GOGAT plays a major role in balancing of N and C photoassimilation. Here, we analyzed regulation of Fd-GOGAT in both protein and gene levels in terms of C/N balancing. After shifting the culture condition for C-assimilation from a low to high levels, the amount of Fd-GOGAT increased significantly in P. boryanum, while NADH-GOGAT was constant. No such response was found for other nitrogen assimilation enzyme, such as nitrite reductase. The same phenomena were observed in Synechocystis PCC6803. Using P. boryanum cells transformed with luciferase gene under regulation of Fd-GOGAT gene promoter, we observed a rapid up/down-regulation of the promoter in response to C-assimilation status. We are now analyzing this promoter activity in more details.

抄録全体を表示

高等植物において、イソクエン酸を2-オキソグルタル酸　(2-OG)　に変換する酵素には、NADP依存型とNAD依存型のイソクエン酸脱水素酵素　(ICDH、IDH)　の2種の分子種が存在する。2-OGは、呼吸基質となるだけでなく、グルタミン酸合成酵素　(GOGAT)　への炭素骨格を供給する分子であり、窒素代謝と炭素代謝の接点に位置している。
イネのICDHにはサイトソル型(ICDH1-1、ICDH1-2)、葉緑体型 (chroloplastic ICDH) 、ペルオキシソーム型(peroxysomal ICDH)の計4種類のアイソジーンが存在しており、各遺伝子の構造を解析した。また、推定される機能タンパク質領域のアミノ酸配列は、互いに高い相同性を示した。全ICDH活性は、葉身では完全展開直後に、穎果では開花後15日目に高い値を示した。一方、IDHには活性サブユニットIDHaと調節サブユニットIDHb、IDHcが存在しており、イネから各遺伝子を単離した。IDHa特異抗体を用いて免疫組織化学的手法を行った結果、IDHaタンパク質は葉身、穎果の維管束組織に主に局在していることがわかった。これらの結果より、ICDH、IDHともにGOGATへ2-OGを供給する可能性があることが示唆された。

抄録全体を表示

NADH型グルタミン酸脱水素酵素(GDH)はミトコンドリアに局在し、2-オキソグルタル酸とアンモニアからグルタミン酸を生成するアミノ化反応と、グルタミン酸を2-オキソグルタル酸とアンモニアに分解する脱アミノ化反応を、可逆的に触媒する。しかし、高等植物におけるGDHの生理機能は未だ不明であることから、本研究では、イネにおけるGDHの機能を解明することを目的とした。
一昨年に報告した2種のOsGDH cDNA（OsGDH1, OsGDH2改めOsGDH3）に加え、新たにOsGDH2 cDNAを単離した。RT-PCRの結果から、葉身、葉鞘、穎果、根において主にOsGDH1とOsGDH2が発現しており、OsGDH3は極めて発現量が低いことが示された。免疫組織学的解析の結果、NADH-GDHタンパク質は未成熟な各器官において篩部周辺に蓄積しており、ほとんど全ての細胞で検出されたcyt c oxidaseタンパク質とは異なる分布傾向を示した。また、ウエスタンブロット解析により、葉身の老化に伴うGDHタンパク質の蓄積量の大幅な増減は見られなかった。現在、NADH型グルタミン酸合成酵素タンパク質含量が増減した形質転換体におけるGDHの挙動を解析中である。

抄録全体を表示

　イネのサイトゾル型グルタミン合成酵素(GS)は、それぞれ地上部と地下部から単離された、GS1とGSrが知られていた。イネゲノムのデータベースより、新規サイトゾル型GSが見つかり、GS1;3と命名した。また、従来のGS1をGS1;1、GSrをGS1;2と命名した。
　RT-PCR解析を行ったところ、GS1;1、GS1;2 mRNAは、幼植物の根、葉鞘、未抽出葉身、完全展開葉身、老化葉身、開花後10日目の穎果全てに検出された。一方、GS1;3 mRNAは、穎果にのみ検出された。これらのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、GS1;1抗体は全てのGS1分子種を認識していると考えられる。NipponbareのGS1;1遺伝子にレトロトランスポゾンTos17が挿入された遺伝子破壊変異体を用いて、イムノブロット解析および免疫組織化学的解析を行った。その結果、幼植物の根と完全展開葉身では、GS1タンパク質含量はNipponbareと比較して大きく減少していたが、組織内分布には顕著な差は見られなかった。開花後3、11、14日目の穎果では、背部大維管束篩部周辺のシグナルが消失したが、他の細胞群ではNipponbareと同様であった。変異体で検出されたシグナルは、GS1;1以外の分子種である可能性が考えられる。現在、それぞれの分子種の組織内局在性の解析をプロモーターを用いて進めている。

抄録全体を表示

　大腸菌などの細菌では、細胞内の炭素と窒素のバランスを検知して窒素代謝系遺伝子群の発現制御や翻訳産物の機能を制御する機構が存在する。この機構における主要因子の一つとして、PIIタンパク質が挙げられる。近年、シロイヌナズナからPIIホモログ遺伝子(GLB1)が単離されたことから、高等植物においてもPII様タンパク質を介した窒素代謝系制御機構が存在する可能性が示唆されているが、その詳細はほとんど明らかにされていない。そこで、演者らは、イネにおけるPII様タンパク質を介した窒素代謝系の調節機構の存在を検証することを目的とし、イネよりPII様タンパク質をコードするGLB1を単離し、その発現特性の解析を行なった。イネの葉より、5’, 3’-RACE法にてOsGLB1 cDNAを単離した。得られたcDNA配列情報と、ゲノム情報とを比較したところ、OsGLB1遺伝子は、第5染色体上に座上し、その構造遺伝子は、7個のエキソンからなっていた。さらに、サザン解析並びにデータベース検索の結果から、OsGLB1は単一の遺伝子と推定された。また、OsGLB1推定アミノ酸配列は、シロイヌナズナと74.5%の相同性を示した。RT-PCR法による発現解析の結果、OsGLB1の転写産物は、イネの根、葉、頴果において、その蓄積が認められた。

抄録全体を表示

　大腸菌や窒素固定細菌では、GlnDが細胞内のグルタミン(Gln)と2-オキソグルタル酸の濃度比を検知し、二成分制御系を介した情報伝達により、グルタミン合成酵素遺伝子の発現を制御する機構が明らかにされている。一方、植物では、Glnによる遺伝子発現の応答は少しずつ明らかにされているが、Glnの検知機構に関する研究はほとんどない。イネに見出された複数のGlnDホモログは、アミノ酸結合ドメインであるACTドメイン[Aspartate kinase、Chorismate mutase及びTyrA(prephenate dehydrogenase)等に存在]のリピート配列（ACR）から成っており、我々は、そのうちOsACR3及びOsACR4について、これまで発現解析を行ってきた。本研究では、新たに単離されたGlnDホモログ遺伝子群の発現特性の解析を行った。
　イネゲノムデータベースへのBLAST検索の結果、新たに4種類のOsACR遺伝子が見出され、 そのうちOsACR2,5,6 cDNAをイネ完全展開葉身より単離した。イネ葉身におけるRT-PCR解析の結果から、各OsACR遺伝子の転写産物量は生育段階ごとに異なる挙動を示すことが示唆され、特にOsACR3遺伝子は転流窒素が著しく流入する若い葉身の維管束組織で主に発現していることが示唆された。また、OsACR3翻訳産物についての免疫電子顕微鏡解析及びGFP融合タンパク質の一過的発現解析から、OsACR3は核に局在することが示唆された。現在、これらイネGlnDホモログ遺伝子の、より詳細な発現特性の解析を行っている。

抄録全体を表示

グルタミン合成酵素(GS)は、NH₄⁺とグルタミン酸を基質とし、グルタミンの合成を触媒する。シロイヌナズナの根で発現する4つの細胞質型GS (GS1; GLN1;1、GLN1;2、GLN1;3、GLN1;4)の酵素特性を決定した。GLN1;1及びGLN1;4分子種は基質に対し高い親和性を示し、逆に、GLN1;2及びGLN1;3分子種は低い親和性を示した。GS1プロモーターGFP解析の結果から、無窒素処理により、NH₄⁺トランスポーター(AMT)と同調的に、高親和型GLN1;1が、根毛、表皮に特異的に発現することが明らかとなった。低窒素条件下における根の表皮細胞では、高親和型のAMTとGLN1;1分子種が、NH₄⁺の吸収、同化を協調的に行っていると考えられる。対照的に、NH₄⁺過剰条件下では、内鞘細胞で発現する低親和型GLN1;2 mRNAの急激な増加が観察された。GLN1;3は、比活性が高い低親和型GSであるが、高濃度のグルタミン酸により活性が著しく阻害され、さらに、NH₄⁺の供給により、mRNA蓄積量が減少した。以上の結果より、NH₄⁺過剰条件下では、維管束において、根内部のNH₄⁺濃度の上昇に適応した低親和型GS、GLN1;2、GLN1;3が制御されていると考えられる。

抄録全体を表示

アンモニウムイオンは，硝酸イオンと並んで植物が利用する重要な無機窒素栄養素であり，その取り込みにはアンモニウムトランスポーター（AMT）が機能する。イネのゲノムには3種類のOsAMT1遺伝子（OsAMT1;1-1;3）が存在し，それぞれ互いに異なる発現パターンを示すことを明らかとした(Sonoda et al. Plant Cell Physiol. 44: 726-734, 2003) 。本研究ではOsAMT1遺伝子群のさらに詳細な機能解明を目指した。グルタミン合成酵素反応の阻害剤を用いた実験の結果、OsAMT1遺伝子群の発現は基質であるアンモニウムイオンではなく内生のグルタミンによって制御されていることが示唆された。OsAMT1;1および1;2はグルタミンによって正の発現制御をうけていること，それに対してOsAM1;3は負の発現制御をうけていることが明らかとなった。一般に植物の窒素吸収機構は，細胞内グルタミンによって負に制御されることが知られているが，イネでは正に制御されるといった新規な窒素吸収機構を見出した。イネは主要な窒素源として有害なアンモニウムイオンを主に取り込むため，すみやかにグルタミンに代謝する必要がある。すなわちイネでは細胞内に蓄積できないアンモニウムイオンではなく，無害なグルタミンを指標としたNステータス認識機構が存在しているものと考えられた 。
またOsAMT1;2を植物体全体で過剰に発現させた形質転換イネを作出し解析しており，その結果も併せて報告する。

抄録全体を表示

   緑色硫黄細菌Chlorobium limicolaのアンテナ複合体「クロロゾーム」は、光エネルギーを捉えて、光反応中心にエネルギー伝達している光捕獲装置である。またその構造は、バクテリオクロロフィルc (BChl c)異性体混合物の高次会合体から成ることが知られている。我々は、菌体からBChl cを抽出して自己会合させたモデル系BChl c会合体について、固体NMRおよび電子吸収分光を用いて、基本的な累積構造が二量体で説明できることを示した。また、クロロゾームでも同様の累積構造であることを示唆するデータを得ている。
   固体NMR分光では数Åの近距離相互作用を、電子吸収分光では遷移双極子の遠距離相互作用を見ており、近距離から遠距離に至るまでの相互作用を統一的に検出することが出来ない。それに対して粉末X線回折法は、近距離から遠距離までの系中の繰り返し構造を反映した回折ピークが現れるので、この性質を用いることでマクロサイクルの相対的な位置関係、つまり二量体間の累積状況について検討することが出来る。また、モデル系BChl c会合体は二次元構造であり、クロロゾームはシリンダー状の螺旋構造であるという推測から、両者の明らかな違いを反映すると予想される。測定データに対するシミュレーションを行って得た両者の累積構造について報告する。

抄録全体を表示

緑色硫黄細菌Chlorobiaceaeは5属15種が知られている．Chlorobium tepidumは全カロテノイド，全ゲノム塩基配列，一部のカロテノイド合成遺伝子が同定された．クロロバクテンとγ-カロテンとその1,2-ジヒドロ体，OH-クロロバクテンとOH-γ-カロテンの配糖体C12:0エステルを持っている．C. phaeobacterioidesはイソレニエラテン，β-イソレニエラテンが主成分で，微量のOH-クロロバクテンとOH-γ-カロテンの配糖体C12:0エステルも持っていた．数％の7,8-ジヒドロ-β-カロテンはニューロスポレンの両側がβ末端基に環化したと考えられる．C. vibrioformeはクロロバクテンとγ-カロテンが主成分で，微量のOH-クロロバクテンとOH-γ-カロテンの配糖体C12:0エステルも持っていた．数％の7,8-ジヒドロ-γ-カロテンはニューロスポレンの片側がβ末端基に環化したと考えられる．C. limicolaはクロロバクテン，γ-カロテンだけでなく1,2-ジヒドロクロロバクテンや7,8-ジヒドロ-β-カロテンもあった．しかしカロテノイド配糖体エステルは見つからなかった．C. tepidumからCrtB, CrtP, CrtQ, CrtH, CrtC, CrtUが見つかったが，リコペン・シクラーゼ，糖転移酵素，C12:0脂肪酸転移酵素，1,2-飽和化酵素が必要であり，カロテノイドの多様性は基質特異性の違い，酵素の存在の有無によると考えられる．最近Chlorobiaceae内の分類が再編成された．

抄録全体を表示

Rba. sphaeroidesの野生株および変異株から共役二重結合数nの異なるカロテノイドであるヌロスポレン (n = 9) 、スフェロイデン (n = 10) 、スフェロイデノン (n = 11) が結合したLH2アンテナ複合体およびカロテノイドのないアンテナ複合体、さらにRps. acidophila (野生株) からロドピングルコシド (n = 11) を結合したアンテナ複合体も調製し、これらに赤色光 (λ>760) を照射してB₈₅₀およびB₈₀₀のバクテリオクロロフィルのブリーチングを見ることにより、それぞれのアンテナ複合体についてカロテノイドの光保護作用の効果を比較した。その結果、まずカロテノイドが結合しているものと結合していないものでは顕著な差が現れ、カロテノイドの光保護作用についてはヌロスポレンス<フェロイデン<スフェロイデノン<ロドピングルコシドの順となり、結合しているカロテノイドのnが大きくなる程、光保護作用も強くなる傾向があることを明らかにした。B₈₅₀およびB₈₀₀バクテリオクロロフィルのブリーチングの順番は同じであったが、B₈₀₀の方がブリーチングの変化がより大きく、nの大きいカロテノイドが結合している程、B₈₅₀の差が大きくなることがわかった。

抄録全体を表示

バクテリオクロロフィルaのみを含む溶液と、バクテリオクロロフィルaに4種類の共役二重結合数nの異なるカロテノイド (ヌロスポレン (n = 9), スフェロイデン (n = 10), リコペン (n = 11), アンヒドロロドビブリン (n = 12)) をそれぞれモル比1:1の割合で添加した混合溶液について光照射を行い、まずはバクテリオクロロフィル溶液と、バクテリオクロロフィルとカロテノイド混合溶液のQ_y吸収帯の光退色過程について比較を行った。その結果、バクテリオクロロフィルとカロテノイドの混合溶液の方が、バクテリオクロロフィル溶液よりQ_y吸収の退色が少なかった。これはカロテノイドの光保護作用によるものである。次にカロテノイドの種類によるQ_y吸収帯の光退色過程について比較を行った。その結果、カロテノイドの種類によって違いはなく、結果が完全に一致した。溶液中ではバクテリオクロロフィル分子とカロテノイド分子の衝突が起こったときに瞬間的にエネルギー伝達が起こるため、LH2のように光保護作用に共役二重結合数nの依存性が見られなかったものと考えられる。カロテノイドの相対濃度を増加させるとQ_y吸収の退色が少なくなった。このことは上の解釈を支持するものと考えられる。この先、二分子膜構造を持つリポソームなどを使用することにより分子同士を接近させ、そのときの共役二重結合数nの依存性について調べていく予定である。

抄録全体を表示

  Subpicosecond time-resolved absorption spectra were recorded, in visible and near-infrared regions, for the LH2 antenna complexes from Rhodobacter (Rba.) sphaeroides G1C, Rba. sphaeroides 2.4.1, Rhodospirillum (Rsp.) molischianum, and Rhodopseudomonas (Rsp.) acidophila. The efficiencies of carotenoid-to-bacteriochlorophyll singlet energy-transfer through the 1¹B_u⁺, 1¹B_u^-, and 2¹A_g^- channels in the LH2 complex were determined to be 48, 19 and 22% in Rba. sphaeroides G1C; 46, 18 and 20% in Rba. sphaeroides 2.4.1; 48, ∼2 and ∼1% in Rsp. molischianum; and 48, ∼2, ∼4% in Rps. acidophila. Sums of efficiencies in the four LH2 complexes, 88, 84, 51 and 54%, nicely correlate with the efficiencies that were determined by comparison of the absorption and fluorescence-excitation spectra, 92, 89, 53 and 56%. It was also found that the triplet 1³B_u (T₁) state of Car is generated rapidly from the 1¹B_u^- state in the four LH2 complexes, carrying energies of 10, 12, 17 and 16%.

抄録全体を表示

　Rhodospirillum rubrum G9 (カロテノイド欠損変異株) および S1 (野生株) のLH1アンテナ複合体に、5種類の共役二重結合数nの異なるカロテノイド、即ち (ヌロスポレン (n = 9), スフェロイデン (n = 10), リコペン (n = 11), アンヒドロロドビブリン (n = 12), スピリロキサンチン (n = 13) を再構成した。サブピコ秒時間分解吸収スペクトルを測定し、可視領域の特異値分解およびグローバルフィッティングを行った。さらに、近赤外領域のQ_y吸収の消失の時間変化も用いて、LH1のエネルギー伝達および三重項生成のカロテノイドの共役鎖長依存性を解明した。
　時間分解スペクトルの解析の結果、カロテノイドからバクテリオクロロフィルへのエネルギー伝達はnが大きくなるに従って遅くなっていた。それに対して三重項状態の生成は次第に速くなっていた。さらに、nが10から11に変化する際にエネルギー伝達に大きな変化が見られ、n = 11−13では1B_u^-, 2A_g^- 状態からバクテリオクロロフィルへの伝達が殆ど起こらなくなっている事が判った。1B_u⁺, 1B_u^-, 2A_g^- チャンネルを通じてのLH1のエネルギー伝達効率は、LH2で得られた分析結果とよく対応している (Rondonuwuらの発表を参照)。

抄録全体を表示

光合成細菌の光反応中心に結合した15シスカロテノイド(Car)は、過剰な光を受けて三重項状態になったスペシャルペアバクテリオクロロフィル(³BChl)をクエンチすることが知られている。我々のグループでは、光反応中心に結合した15シスCarは三重項状態で捩れていること、また溶液中では三重項状態におけるシスCarの緩和速度は異性化速度とほぼ同等であることを明らかにし、これらの実測値に基づいて、光反応中心内でのCarの構造変化がもたらす効率の良い三重項エネルギー散逸の仮説を提出していた。今回我々は、紅色光合成細菌Rb. sphaeroides 2.4.1の光反応中心の時間分解ESRスペクトルを20K～200Kの一連の温度で測定し、得られたデータマトリックスから特異値解析とグローバルフィッティングを用いて、³BChlの後に現れる2種類のCarのESRシグナルを抽出し、それぞれ基底状態と同様の構造を保ったCar(³Car(I))、構造変化したCar(³Car(II))と帰属した。50Kより低温では³BChl → ³Car(I) →　³Car(II) という単純なモデルでは実測値を説明できないため、スペシャルペアと二つのアクセサリーBChl間のエネルギーのやりとりと競争するそれぞれの緩和を考慮したモデルを用いたシミュレーションですべての温度における三重項エネルギー散逸のメカニズムを追跡した。

抄録全体を表示

クロロフィル（Chl）の生合成系は、グルタミン酸からプロトポルフィリンIX（Proto）までの段階をヘム生合成系と共有している。光合成細胞にとって、主要なテトラピロールであるChlとヘムの供給を適正に分配することはきわめて重要であるが、その分子機構は不明である。Mg-キラターゼは、Chl特有の合成系Mgブランチの最初の酵素であり、ProtoにMg²⁺を挿入する反応を触媒しており、Chlとヘムの分配機構に重要な役割を有していることが推定されている。完全暗所でも生育が可能なラン藻Plectonema boryanumは、遺伝子操作も容易であることから、他のラン藻では難しいと考えられるChl欠損株の単離が可能である。そこで、本ラン藻のMg-キラターゼのChlDサブユニット遺伝子chlDをクローニングし、その欠損株の単離を試みた。chlDをカナマイシン耐性遺伝子の挿入で破壊したプラスミドを電気穿孔法により細胞に導入し、暗所でスクリーニングすることにより形質転換体A5101を得た。サザン解析の結果、A5101は一回組換え体であり野生型chlDを有することが分かったが、Chl含量は野生株の約10%に低下し、明所で光合成的には生育できないという形質を示した。また、暗所での従属栄養的生育の世代時間が野生株よりも短かった。A5101の形質の解析結果をふまえて、ChlD蛋白質の機能について考察する。

抄録全体を表示

Synechocystis sp. PCC6803は光独立栄養的にも生育が可能であるが、グルコースを栄養源とする光従属栄養的生育は1日5分間の光照射により維持される。その原因を調べる過程で、牧田らは暗所に置いた細胞ではグルタミン酸のプールサイズが低下し、光の照射で上昇することを報告した（日本植物学会年会、2001）。このことから解糖系やTCA回路が暗所で失活し、光で活性化すると考えられた。そこで、解糖系の酵素をコードすると予想される遺伝子約15個について、その発現量と光照射の影響を調べた。sll0018やslr0884はNorthern hybridization で転写産物が確認できたが、sll0884はRT－PCR による転写産物の検出が必要なほど少量であった。そのうちsll0018など複数の遺伝子は暗所で発現が抑えられ、光照射下では増加した。また、sll0018はfructose-bisphosphate (FBP) aldolaseをコードしていることから、FBP aldolaseの活性を測定したところ、暗所に置いていた細胞での活性は光照射した細胞より低かった。これらの解析結果からSynechocystis sp. PCC6803で従属栄養的生育に光が必要な理由は暗所ではFBP aldolase の遺伝子発現が転写レベルで抑えられることにより、グルコース代謝が低下するためと思われた。

抄録全体を表示

シアノバクテリアにおける貯蔵多糖は、一般的にグリコーゲンと考えられてきた。この事を確認するために57種のシアノバクテリアについて調べた結果、典型的なシアノバクテリアのグリコーゲンとは異なる構造を持つ4種が見い出された。その1つ、Synechocystis aquatilis SI-2株について解析した。シアノバクテリア細胞から、アルコール抽出で多糖を調製し、イソアミラーゼによりα-1,6結合を切断した後、キャピラリ－電気泳動により、鎖長分布を調べた。その結果、典型的なシアノバクテリアグリコ－ゲンを持つSynechocystis sp. PCC6803で、DP（重合度）8以下の割合は、30 %以上なのに対し、S. aquatilisは15 %で、短鎖の割合が低く、またDP≥37の長鎖の割合は6803株では<1 %、イネ胚乳では7～8 %であるのに対し、S. aquatilisでは4.5 %で、長鎖の割合がイネ胚乳と6803株の中間であることが明らかとなった。アルカリに溶解した多糖を、Sephacryl S-1000により、分子サイズにもとづいて分画した結果、S. aquatilisの多糖の溶出ピークは、6803株のものよりも高分子側にあり、イネのアミロペクチンと同じ位置であった。さらにλmaxは530 nm付近で、明らかに一般的なシアノバクテリアのグリコーゲンとは異なっていた。また、S. aquatilisについて多糖代謝に関わる遺伝子のクロ－ン化を行ったところ、シアノバクテリアとしては例外的に3つの枝作り酵素遺伝子が同定された。

抄録全体を表示

植物のデンプン合成は、デンプン合成酵素、枝作り酵素（BE）、枝切り酵素のそれぞれ複数のアイソザイムが関与する複雑なシステムである。これら個々の酵素の機能を明らかにするため、私達はより簡素なポリグルカン代謝系を持つシアノバクテリア Synechococcus sp. PCC 7942 を宿主としたイネ遺伝子発現系の構築を行っている。イネ胚乳において、BEIIb、およびイソアミラーゼ-1（ISA-1）の欠損はアミロペクチンの構造、物性に顕著な影響をもたらす。本研究では、これらの遺伝子をそれぞれ Synechococcus の BE、ISA 変異株に導入し、貯蔵ポリグルカンの構造に及ぼす効果を解析した。
シアノバクテリア形質転換株からアルコール抽出した多糖についてα-1,6-結合切断後、キャピラリー電気泳動法により分画を行った。BE 欠損株では野生株に比べ重合度 DP ≥ 10 のグルカン鎖が増加したが、これにイネ BEIIb を導入した株では DP 7 - 8 の鎖が減少し、代わって短鎖（DP = 5）の割合が増大した。ISA 欠損株では短鎖（DP 2 - 3）の含量が増大したが、これにイネ ISA-1 を導入した株ではこの短鎖の割合が低下することが認められた。短鎖が減少する点で ISA-1 形質転換株の多糖構造は Synechocystis sp. PCC 6803 株の ISA 遺伝子（slr0237 および slr1857）を導入した形質転換株のものと類似していた。シアノバクテリア生体内でグリコーゲンを基質とした際のイネ酵素の作用について議論する。

抄録全体を表示

　Nudix hydrolaseは、(d)NTP、NADH、 ADP-riboseのようなヌクレオシド二リン酸誘導体(Nudix)を加水分解するタンパク質である。我々はラン藻Synechococcus sp. PCC 7002から新規なNudix hydrolaseをコードするnuhA遺伝子をクローニングし、NuhAがADP-riboseを特異的に加水分解すること、さらにnuhA遺伝子の破壊株が細胞凝集の表現型を示すことを昨年の本大会で報告した。
　NuhAはN末端側に触媒に必要なNudix domain、C末端側に機能未知のPfamB-3375 domainをもつ。PfamB-3375 domainをトランケートした変異タンパク質を作製した結果、ADP-riboseの加水分解に対する変異タンパク質のK_m値はNuhAに比べて約7倍増加していた。また、NuhAは六量体を形成するが、変異タンパク質は二量体を形成していた。したがって、このdomainが基質の結合と多量体形成に関与していることがわかった。
　nuhA破壊株は低CO₂条件下では凝集しながら生育した。同じ条件で野生株にADP-riboseを加えると細胞が凝集したことから、ADP-riboseの蓄積が細胞の凝集を引き起こしていると考えられる。一方、高CO₂条件下ではnuhA破壊株は細胞が凝集せず正常に生育した。したがって、CO₂の十分な供給によりADP-riboseの有害な影響が緩和されていることが示唆される。

抄録全体を表示

　我々はこれまでに、Agrobacterium rhizogenesのRiプラスミドにコードされているアグロピン合成酵素遺伝子（Ri-ags）の発現特性について、Ri-agsプロモーターとGUS構造遺伝子との融合遺伝子（Ri-Pags-GUS）を導入したタバコを用いて解析し、Ri-agsプロモーターが葉で傷害誘導性を示すことを明らかにした。この傷害誘導は、ジャスモン酸等の既知の傷害応答仲介物質及び新規タンパク合成を要求しないことから、Ri-agsプロモーターは新規信号伝達経路を介して傷害により一次的に誘導されることが示唆された。また、この傷害誘導がEGTAやLa³⁺により抑制されたことから、この信号伝達経路は細胞外Ca²⁺を必要とすることが示唆された。
　今回、我々はRi-ags傷害誘導におけるCa²⁺の関与について、各種阻害剤を用いて調査した。その結果、Gd³⁺による処理はLa³⁺と同様に傷害誘導を抑制したが、L型Ca²⁺チャネル阻害剤verapamilは傷害誘導を抑制しなかった。このことから、Ri-agsプロモーターの傷害誘導における信号伝達経路はverapamil非感受性Ca²⁺チャネルを介することが示唆される。また、カルモジュリンアンタゴニストであるW-7、trifluoperazine及びchlorpromazineはいずれも傷害誘導を抑制しなかったことから、この信号伝達経路はカルモジュリンを介さないことが示唆される。

抄録全体を表示

トリエン脂肪酸の生成酵素であるω-3脂肪酸不飽和化酵素をコードする FAD7 は、物理的傷害にともない局所組織におけるその発現が顕著に上昇する。われわれはこのような発現誘導が、FAD7 の転写活性の上昇と密接に連動していることを見出しており、FAD7 プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子 (FAD7-LUC) を導入した形質転換シロイヌナズナの系統確立を進めてきた。傷害ストレスに対する適応においては、トリエン脂肪酸を基質として合成されるジャスモン酸が、中枢的シグナル因子として機能していることが広く知られている。一方、ジャスモン酸に依存しない生理的応答も多数見出されており、傷害にともなう防御反応の発動には、少なくとも2つの独立したシグナル経路がかかわっているものと推察される。興味深いことに、傷害による FAD7 の発現誘導は、組織により異なったシグナル経路の支配を受けている。われわれはジャスモン酸に依存的、非依存的な両シグナル経路の分子的実体を解明するために、FAD7-LUC 導入植物を母株とした機能欠損突然変異体の単離を試みるとともに、既知の突然変異体やタグラインとの交配により、これらのシグナル経路を構成するタンパク質因子を同定することを目指している。本発表では FAD7-LUC 導入植物の系統確立に至るまでの経緯とともに、新規突然変異体やかけ合わせ系統の解析から得られた知見を報告する。

抄録全体を表示

WRK (Wound-induced Receptor-like protein Kinase)は傷処理によって転写産物が一過的に蓄積するロイシン・リッチ・リピート型レセプター様プロテインキナーゼである。我々は大腸菌で発現させた組換えタンパク質の解析から、WRKのキナーゼ部位が自己リン酸化活性を有することを報告している。
今回、WRKをGFPの融合タンパク質としてタバコ植物中で発現させることにより、WRKは細胞膜に局在していることが明らかになった。
さらに、RNAi法によってWRK発現を抑制させた形質転換タバコを作成したところ、basic PR-1やPI-IIなどの塩基性PR遺伝子の傷害による誘導が、対照タバコに比べ抑えられていることが明らかとなった。これらの形質転換タバコでは、防御関連MAPKであるSIPKやWIPKの傷による活性化も抑制されていた。しかし、これらのタバコにおいても、外部からジャスモン酸を与えた場合には塩基性PR遺伝子の誘導は明確に認められたことから、傷によるジャスモン酸の蓄積に差があることが予想された。実際、傷処理後のジャスモン酸の内生量をWRK発現抑制タバコで定量したところ、ジャスモン酸量が対照タバコの約1/2から1/3に減少していることがわかった。
以上の結果から、WRKはSIPKやWIPKの上流に位置し、ジャスモン酸など傷害シグナル物質の蓄積に影響を与えることによって、傷害のシグナル伝達に関与している可能性が示唆された。

抄録全体を表示

植物は外界から様々な環境ストレスにされており、その多くが植物内で活性酸素を生じさせることから酸化的ストレスに対する植物の応答機構の研究が重要視されている。植物の酸化的ストレスに対する研究は、比較的遅い反応（数時間～数日）に向いており、その初期反応についての知見は得られていない。本研究ではストレス源としてオゾンを用い、植物の酸化的ストレスに対する初期応答機構に関する解析を行った。シロイヌナズナを用いていくつかのオゾン誘導性遺伝子の発現を経時的に調べた結果、グルタチオン転移酵素（AtGST3）の発現がオゾン暴露1時間以内に高レベルに誘導された。さらにこの遺伝子の発現誘導はオゾン暴露後45分で見られることが明らかになった。これまでの研究でAtGST3遺伝子の比較的遅い発現はエチレンやサリチル酸によって制御されていることが知られている。しかし、変異体を用いた解析により本研究で見られた早い発現はエチレンやサリチル酸とは無関係に起こることが示された。一方、阻害剤を用いた解析からこの遺伝子の初期発現誘導はkinase及びCa²⁺により制御されてることが明らかになった。また、動物で知られているNrf2-Keap1遺伝子発現制御系に関与し、AtGST3遺伝子のプロモーター領域にあるARE (antioxidant responsive element)配列の植物における役割についても考察する。

抄録全体を表示

サリチル酸(SA)の合成経路には、フェニルアラニンを前駆体とする経路とイソコリスミ酸を前駆体とする経路があることが知られている。昨年私たちは、タバコを用いてオゾン(O₃)暴露時に生成するSAがどちらの経路で合成されるのかについて調べ、フェニルアラニンを前駆体としてSA合成が起こることを示した。また、タバコではO₃暴露時、エチレンがSAの合成を促進していることを発表した。
今回私たちは、O₃を暴露したシロイヌナズナで、エチレンとSAの関係性を調べた。まず、O₃暴露したシロイヌナズナのSA合成経路を知るため、イソコリスミ酸合成酵素が欠損した突然変異体sid2のO₃暴露時のSA蓄積量を調べた。野生型ではSA量が増加したのに対し、sid2では増加しなかったことから、シロイヌナズナではイソコリスミ酸を介した経路でSAが合成されることが明らかになった。エチレンシグナルが欠損した変異体etr1およびein2では野生型に比べSA蓄積量が増加したことから、シロイヌナズナではエチレンがETR1やEIN2を介してSA合成を負に制御していると考えられる。あるいは、etr1およびein2ではO₃暴露時のエチレン生成量が野生型よりも多かったことから、エチレンがETR1を経ない別のエチレンシグナル経路でSA合成を促進している可能性も考えられる。

_文字

抄録全体を表示

シロイヌナズナNADPH：2-アルケナールα,β-ヒドロゲナーゼ（ALH）は，過酸化脂質から生ずる2-アルケナール（活性アルデヒド）を還元・消去する。ALHはすでに報告した4-ヒドロキシノネナールなどの他に，9-keto-octadecadienoic acid や変異原性の強い4-oxo nonenalなどを基質として効率よく還元することを新たに見いだした。すなわちALHは過酸化脂質由来のアルケナール，アルケノンを広く解毒する。ALH遺伝子（At5g16970）をタバコに導入し過剰発現させた株は，メチルビオローゲン存在下での光酸素傷害に耐性を示すだけでなく，非存在下でも強光照射 (2000 μmol/m²/s, 6 h) に対し抵抗性を示した。これは (i) 酸化的ストレスで生ずる活性アルデヒドの消去と，(ii) 消去のための還元力消費による過剰光エネルギーの散逸，の両方の効果によると考えられた。

抄録全体を表示