Rar1 is a CHORD-containing gene and essential for Rgene-mediated resistance in plants. In addition to Rar1, small GTPase Rac family was also found to play an important role in disease resistance in rice. Immunoprecipitation (IP) assay indicated that OsRac1 and Rar1 existed in the same complex. To study the function and relationship between OsRac1 and OsRar1 in rice disease resistance we used OsRac1-RNAi and CA-OsRac1 transgenic plants for genetic analysis. Results of plant infection assays suggest that OsRar1 contributes to basal resistance, whereas lack of OsRar1did not alter Pi-a, Pi-b and Pi-z mediated resistance. OsRac1 and OsRar1 may function in parallel pathways, OsRar1 silencing impairs the basal resistance, however overexpressing CA-OsRac1 can compensate the loss of OsRar1 function. Yeast two hybrid assay indicated that OsRar1, OsSgt1 and HSP90 may form a scaffold of a big complex. OsRac1 may exist in this complex but not directly associate with the scaffold.

抄録全体を表示

我々の研究室では、イネにおける耐病性シグナル伝達経路を明らかにすることを目的としている。これまでに、低分子量Gタンパク質であるOsRac1が伝達経路の上流に位置し、NADPHオキシダーゼの活性、自発的細胞死を調節する分子スイッチとして機能していることを明らかにした。本研究は、イネの耐病性シグナル伝達経路をタンパク質レベルで明らかにすることを目的とした。
本研究では材料として野生型（品種：金南風）と活性型、不活性型OsRac1形質転換イネ培養細胞を用いた。それぞれの培養細胞から全タンパク質を抽出し、ニ次元電気泳動法により分離を行い、野生型―活性型OsRac1、野生型―不活性型OsRac1のスポット分離パターンを比較したところ、発現差異が認められたスポットが確認できた。それらのスポットをQ-tof型質量分析装置により解析した結果、防御応答や環境ストレス応答に関与するタンパク質、分子シャペロン等が同定された。さらに、防御応答時にOsRac1により発現が制御されるタンパク質を探索するため、それぞれの培養細胞にスフィンゴ脂質エリシター処理を行い、プロテオーム解析を行った。その結果、野生型へのエリシター処理により発現誘導されるタンパク質のほとんどは、エリシター未処理の活性型OsRac1培養細胞中で恒常的に発現誘導されていることがわかった。このことから、多くの防御応答タンパク質の発現制御にはOsRac1が深く関与していると考えられた。

抄録全体を表示

植物は病原菌の感染を認識すると、一過的な活性酸素の生成、防御応答遺伝子の発現誘導などの抵抗反応を示し自己防御する。この認識から抵抗反応の誘導までを結びつけるシグナル伝達経路について現在のところあまり良くわかっていない。本研究室ではこれまでに、低分子量Gタンパク質OsRac1が耐病性シグナル伝達経路の上流に位置し、NADPHオキシダーゼの活性化、リグニン合成、ファイトアレキシンの生成などを制御することを明らかにしてきた。本研究では、OsRac1がどのようなタンパク質と相互作用するかを調べることで、イネの耐病性シグナル伝達経路をタンパク質レベルで明らかにすることを目的とした。
本研究では材料として野生型（品種：金南風）、Mycタグを結合させた活性型OsRac1、不活性型OsRac1、膜局在配列に変異を入れた活性型OsRac1のイネ形質転換培養細胞を用いた。それぞれの培養細胞からタンパク質を抽出し、Myc抗体を用いて免疫沈降、SDS-PAGEを行なうことでOsRac1複合体を分離し、質量分析計によりタンパク質の同定を試みた。その結果、OsRac1複合体中に耐病性との関連が示唆されているHSP70が含まれていることが明らかになった。同定を進めている他の複合体タンパク質とあわせて報告する。

抄録全体を表示

高等植物が病原菌の感染に対して示す抵抗性反応の一つに活性酸素の生成がある。活性酸素は細胞壁の強化材料、抵抗性応答へのシグナルとして機能するほかに、試験管内では抗菌性を有する。これに対して病原菌がどのような防御策をとっているかについては知見が乏しい。我々はイネ（日本晴、抵抗性遺伝子Pi-a）培養細胞がいもち病菌胞子を接種することによって過酸化水素を生産すること、定法で調製した胞子懸濁液中に過酸化水素消去活性が存在することを見いだした（田部ら、本学会）。この消去活性はいもち病菌糸の培養濾液中にも存在した。この活性は100℃処理で消失し、電子受容体を必要としないことからカタラーゼ様の酵素によるものと考えられた。In gelアッセイにより、日本晴に非親和性、親和性いずれのレースの培養濾液からもカタラーゼ活性が検出された。現在この酵素の精製を試みている。

抄録全体を表示

近年、動植物の防御応答を誘導する共通的な機構として、微生物固有の分子パターン（Pathogen-Associated Molecular Pattern; PAMPs）認識に基づく防御応答が注目されている。細菌鞭毛成分のフラジェリンや糸状菌細胞壁を構成するキチン、βグルカン断片などは代表的なPAMPsと考えられ、その認識・応答機構に関する研究が進められている。
一方、動物の先天性免疫において細菌由来のPAMPsとしての役割が注目されているリポ多糖（LPS）に関しては、いくつかの双子葉植物において過敏感反応抑制その他の活性が報告されているものの、単子葉植物に対する作用に関しては報告が無い。本研究では植物病原菌を含む7種のグラム陰性細菌由来のLPSのイネ培養細胞に対する作用を調べ、これらがいずれも活性酸素応答や防御応答関連遺伝子の発現を誘導することを見出した。また、これらの防御応答はプログラム細胞死と考えられる顕著な細胞死を伴うことも観察された。これらの活性はLPSの糖部分を過ヨウ素酸酸化により分解すると完全に失われることから、活性にはLipidA以外の糖鎖部分が重要な寄与をしていることが示された。以上の結果はLPSが細胞死を伴う防御応答を誘導するgeneral elicitorとしての性格をもつことを示すものである。

抄録全体を表示

　トマト(Lycopersicon esculentum Mill.)の幼苗を熱ショックを与えることによって灰色かび病(Botrytis cinerea)に対する抵抗性が誘導されることを見いだし，その機構について解析を行った．幼苗を45℃の温湯に2分間浸漬し，24時間後の本葉第1ならびに第2葉を採取して密閉容器に入れ，トマト灰色かび病菌の胞子を接種し結果，無処理の葉では接種部分を中心として速やかに水浸状の病徴が拡大したが，熱ショック処理した葉では無病徴か病斑は極めて小さかった．この抵抗性は処理後，日数の経過とともに消失した．熱ショック処理後のトマト葉中のサリチル酸濃度をHPLCにより測定したところ，処理12時間後からサリチル酸が蓄積し始め，24時間後にピークに達したことから，サリチル酸がこの抵抗性の誘導に関与している可能性が示唆された．現在，サリチル酸の必要性ならびにPR遺伝子等の発現について検討中である．

抄録全体を表示

Pseudomonas cichorii(Pc)によるレタス腐敗病の発病にはレタス細胞の de novo でのタンパク質合成が必要である。レタスのリーフディスクにPcを接種すると、9-12時間をピークに細胞死が誘導された。各種阻害剤を用いた解析から、本細胞死には細胞内活性酸素、プロテインキナーゼ、プロテアーゼ、DNaseが関与することが示唆された。また、本細胞死の過程を組織化学的に解析すると、ヘテロクロマチンの凝集が確認された。さらに、水およびPcを接種したレタスから抽出したRNAを用いて均一化cDNA ライブラリーを作成しディファレンシャルディスプレイを行った。その結果、Translation initiation factor、protein kinase、hsp70、chitinase 等の遺伝子の発現が制御されることが明らかとなった。以上の結果から、レタス腐敗病の発病過程には，情報伝達・遺伝子発現・タンパク質合成を伴う、アポトーシス様の自己細胞死が関与することが示唆された。

抄録全体を表示

サリチル酸（SA）は病害抵抗性において重要なシグナル物質である。SAの生合成経路は、イソコリスミ酸を前駆体とする経路と安息香酸（BA）を前駆体とする経路の2つが考えられている。前者の経路では、イソコリスミ酸合成酵素をコードする遺伝子が同定されたが、後者の経路に関わる遺伝子はほとんど分かっていない。そこで我々は、BA経路に関わる遺伝子を探索することを目的として、アクチベーションタギングラインを用いて突然変異体をスクリーニングした。シロイヌナズナの野生株は、BA存在下と比較してSA存在下では著しく生育が阻害される。この性質を利用し、BA存在下でも著しく生育阻害を受ける変異体をスクリーニングし、benzoic acid hypersensitive (bah) 1変異体を単離した。bah1変異体は、BA存在下では生育阻害を受けたが、非存在下では正常に生育した。また、SAの蓄積に伴い誘導されるPR1遺伝子の発現を調べたところ、BA存在下において、野生株では発現は見られなかったが、bah1変異体ではmRNAが蓄積していた。これらの結果から、BA存在下のbah1変異体ではSAが蓄積している可能性が示唆された。本発表では、bah1変異体のSAの蓄積量を含め、その原因遺伝子についても報告したい。

抄録全体を表示

病原体の攻撃を受けた植物細胞では、病原菌由来のエリシター分子を認識すると、急激な活性酸素の生成が起こり、自発的な細胞死などの防御反応が誘導される。葉に壊死斑を形成する spl 変異体 (spl1～11) は、このような一連の反応に関わるシグナル経路に変異があると考えられている。これまでに各変異体より作成した培養細胞を用いて、エリシターで活性化される経路に変異があると推測される3つの変異体 (spl2, spl7, spl11) を選抜した。そこで、脱リン酸化反応の阻害剤であるカリクリンA (CA) 処理で誘導されるH₂O₂の生成を調べたところ、spl7では野生株やspl2、spl11に比べ多くのH₂O₂の生成が検出された。また、CAおよびエリシターそれぞれで活性化される経路の相関を調べた結果、CAはエリシター誘導性のH₂O₂の生成に対し相乗的に作用することが分かった。このことから、CAで活性化される経路はエリシターで活性化される経路の一部であり、spl7はCAが作用する脱リン酸化反応が関わる経路に関与すると考えられた。さらに、Ca²⁺のキレート剤であるEGTAが、H₂O₂の生成に与える影響を調べたところ、CA処理によるH₂O₂の生成量は、spl7においてのみ減少した。本発表では、H₂O₂生成に至るシグナル経路における、カルシウムイオンの関与についてこれらの知見をもとに考察する。

抄録全体を表示

アーバスキュラー菌根(AM)菌は 4 億年の太古より植物と共生関係を営んできた。AM 菌は地中に伸ばした外生菌糸により土壌中から低濃度のリン酸を吸収して植物に与え、その見返りに植物は AM 菌に光合成産物を与える。近年、AM 菌根特異的なリン酸トランスポーターをコードする植物遺伝子がジャガイモ、トマトおよびタルウマゴヤシから単離された。これら AM 菌根特異的な遺伝子についてさらに解析することで、分子進化学的に新たな知見を得ることができると期待される。私達は PCR クローニングにより、ミヤコグサ菌根から 3 つのリン酸トランスポーターcDNA (LjPT4, LjPT8 および LjPT16)をクローニングした。リアルタイム RT-PCR によりリン酸トランスポーターの発現解析を行ったところ、LjPT4 のみが菌根特異的に発現することが分かった。そこで、RNAi による LjPT4 のノックダウン形質転換体を作出して性状解析を行ったところ、リン酸濃度の低い生育環境下において AM 菌根を経由した植物のリン酸吸収量が減少していた。さらに、菌根菌の樹枝状体および嚢状体の数が減少し、逆に過敏感反応を示す植物細胞の数が増加していた。これらの結果から、LjPT4を介した十分なリン酸の取り込みが、菌根菌の発達を助長する一方で植物の防御応答関連の因子を抑制し、正常な共生を成立させるために欠かせないことが示唆された。

抄録全体を表示

酸性環境は重金属がイオンとして溶出しやすいため、酸性環境に適応した好酸性生物には、強い重金属耐性を持つものが多い。好酸性緑藻の、日本の宮城県・潟沼から単離した‹I›Chlamydomonas acidophila‹/I› KT-1とイタリアのピッシャレリ地方の湖沼から単離された‹I›Chlamydomonas acidophila‹/I› DVB238も高い重金属耐性を持つ。特に‹I›C. acidophila‹/I› DVB238の重金属ストレスに対する能力は高く、重金属の添加量で比較すると好中性藻類の‹I›Chlamydomonas reinhardtii‹/I›よりCdで66倍、Niで54倍の耐性を持っていた。重金属耐性株をファイトレメディエーションへ利用する為には、重金属蓄積能力が重要である。これら重金属耐性2株について、重金属蓄積性の試験（Cd、Ni）を行った。重金属添加量が30 μM Cd、300 μM Niでは、2株の蓄積量はほぼ同じだったが、‹I›C. acidophila‹/I› DVB238の方が高濃度(1,500 μM Cd、2,400 μM Ni）に耐え高い蓄積量を示した（13.7 μg Cd and 2.59 μg Ni per 10‹SUP›8‹/SUP› cells）。また、‹I›C. acidophila‹/I› DVB238では、Cd蓄積量の増加とともにタンパク質含有量も増加するという現象が見られた。そこで‹I›C. acidophila‹/I› DVB238の重金属蓄積機構に注目して、プロテオーム解析を試みた。

抄録全体を表示

　ホウ素は植物の必須元素であるが、過剰量のホウ素は植物の生育を阻害する。ホウ素の毒性機構を分子レベルで調べるために、酵母にホウ酸耐性を付与するシロイヌナズナ遺伝子の探索を行い、AtRBP47c'などのスプライシングへの関与が考えられる遺伝子を単離した。そこで、酵母においてスプライシングに対するホウ酸の影響をRT-PCR法により解析した。酵母ゲノム中のイントロンを持つ遺伝子の約1割にあたる20個の遺伝子について調べた結果、リボソームタンパク質をコードするRPL7Bのスプライシングがホウ酸により阻害されることを発見した。酵母ゲノム内にはRPL7AというRPL7Bのパラログが存在し、これらの二重破壊株は致死となることが知られている。スプライシング阻害を受けないRPL7Aを破壊した株ではホウ酸耐性が低下していたのに対し、スプライシング阻害を受けるRPL7Bを破壊した株ではホウ酸耐性に変化は見られなかった。すなわち、RPL7A破壊株ではホウ酸によるRPL7Bのスプライシング阻害の結果RPL7タンパク質量が低下し、生育が阻害されたと考えられる。また、ブランチポイントのコンセンサス配列内の塩基置換によってホウ酸によるスプライシング阻害の程度が異なることを見いだした。本研究は、ホウ酸毒性機構を初めて分子レベルで明らかにしたものである。

抄録全体を表示

これまでにイネ完全長cDNAプロジェクトによって32,000以上のcDNAクローンが得られている。cDNA配列をゲノムDNA配列(TIGR Pseudo ver2)にマッピングして、解析した結果、これらのうち1094クローンでは対応するゲノム配列が複数の染色体に分かれていた。これらからオルガネラゲノムに由来するものや実験上の副産物を除くと、681クローンで異なる遺伝子座からの転写産物がtrans-splicingによって結合されて生成したものである可能性が考えられた。そこでRT-PCRにより、その転写産物がtrans-splicingによるものかどうかの検定を試みた。その結果、これらのクローンの1つである AK100704では、完全長クローンとして報告されているものとは異なる部位で、異なる染色体由来の転写産物が結合した断片が検出された。また、これと同じ構造を有するRNA断片は葉、茎、根、穂などの様々な組織由来でも検出された。一方、これに対応するゲノム配列は第1染色体と第5染色体に分かれてコードされており、1つの遺伝子座に由来するものではないと考えられた。これらの結果からこの転写産物では、転写後のtrans-splicingが起こっている可能性が示唆された。

抄録全体を表示

レッドリーフレタスは、葉の先端から中央部分にかけて赤褐色の着色が見られる作物であるが、水耕で栽培するとアントシアニン色素が減少し、葉の着色が不足して商品価値の低下を招く場合がある。着色改善方法を検討したところ、青色光もしくは紫外線（UV-B）の夜間補光、水耕培養液の冷却、肥料養分のリン制限処理などで着色が促進されたが、これらのうち生長を損なうことなく着色促進を図れるのは夜間補光のみであった。アントシアニンの蓄積が促進される現象が認められるのは未成熟葉だけであり、成熟葉では十分な着色を得られなかった。そこで、アントシアニンの生合成を担う遺伝子群をクローニングして発現解析を行ったところ、未成熟葉でのみleucoanthocyanidin dioxygenase遺伝子（LDOX）の発現量が増加していた。一方、水耕培養液の冷却や肥料養分のリン制限処理では、LDOXの発現量は低レベルであった。以上のことから、夜間補光によるアントシアニンの蓄積反応と培養液冷却やリン制限処理による反応は異なったメカニズムによって調節されていることが示唆された。

抄録全体を表示

植物の根は、水分、重力、光、接触、温度などの化学的物理的環境因子を感知し、屈性を示すことが知られている。近年、エンドウマメ（Pisum sativum）を用いて、その根が高濃度の酸素に向かう、酸素屈性を示すことが明らかにされた。そこで筆者らは、低酸素に対する植物の分子応答機構を明らかにする目的で、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いた低酸素応答に対する簡便なスクリーニング法を開発したので報告する。
方法としては、シロイヌナズナ種子を低温処理後、GM培地に播種し、22℃連続光下で6日間生育させた幼植物を、酸素除去剤で低酸素状態に2日間置き、その表現型の変化を顕微鏡観察により調査した。
その結果、シロイヌナズナの根端付近で根毛が密集して形成され、さらに根毛伸長の増大が観察された。また、酸素濃度は酸素除去剤を入れてから1時間前後でおよそ2％に低下し、2日間持アすることがわかった。さらに、低酸素で誘導される根毛形成と、エチレン前駆体であるACCやACC合成酵素の阻害剤であるAVGを添加した時の根毛形成との相異を比較している。

抄録全体を表示

演者らは硫黄欠乏に対する植物の応答の全体像を明らかにすることを目的にトランスクリプトミクスとメタボロミクスの統合による解析を行っている。
シロイヌナズナ野生株を用いた硫黄欠乏応答に関するこれまでの研究で、硫黄欠乏に応答する遺伝子群の中にジャスモン酸生合成経路に関与する遺伝子およびジャスモン酸類に応答する遺伝子が複数存在することが明らかになっている。一方、ジャスモン酸応答遺伝子群の解明に向けた研究からは、ジャスモン酸によって硫黄同化系の遺伝子群の発現が誘導されるとの報告がある。これらの結果は、硫黄欠乏応答とジャスモン酸シグナルとの強い関連を示唆している。
ジャスモン酸生合成経路の遺伝子をノックアウトした変異株を硫黄欠乏ストレス条件下に置き、その遺伝子発現と代謝物の変化を網羅的に解析した。硫黄欠乏ストレス応答にはジャスモン酸シグナルが関与すると考えられる応答とそうでないものとがあり、その違いについて考察した結果を報告する。

抄録全体を表示

オオムギは、鉄欠乏条件下で多量のムギネ酸類を分泌し、その分泌パターンが日周性を示すことが知られている。オオムギのムギネ酸類分泌は、夜明けと共に開始され最大に達した後、数時間の間で減少し、再び基底状態にもどる。鉄欠乏のオオムギの根では、ムギネ酸顆粒と呼ばれる細胞内小胞の数の増加が認められる。さらに、夜明け前には、この顆粒が細胞の表層近くに密集していることから、この顆粒のムギネ酸分泌への関与が示唆されている。本研究では、鉄欠乏誘導性オオムギ根タンパク質の抗体を用いて、これらのタンパク質の組織局在、細胞内局在を解析し、ムギネ酸類分泌機構との関係を検討した。
　光顕免疫染色法によって、ムギネ酸類の前駆体であるニコチアナミンの合成酵素（NAS）、ムギネ酸類の水酸化反応を触媒するIDS3タンパク質が根の表層に局在していることが示された。さらに、免疫電顕法を用いてこれらの酵素の細胞内での局在を調べた。NASは、ムギネ酸顆粒の膜上に局在し、ニコチアナミンアミノ基転移酵素もNASと同様にムギネ酸顆粒に局在していた。一方、IDS3は、ムギネ酸顆粒の近傍の細胞質に存在していた。これらの結果から、ムギネ酸の合成から、根圏への分泌に至る過程のなかで、ムギネ酸顆粒が、ムギネ酸合成の場として、また、細胞の表層近くへのムギネ酸の輸送小胞として機能している可能性が示唆された。

抄録全体を表示

植物のオゾンに対する応答のモデル植物としてオゾン感受性タバコ系統Bel-W3とオゾン耐性系統Bel-Bが広く用いられているが、両系統間でオゾンに対する感受性の差が生じるメカニズムには未だ不明な点が多い。オゾンは活性酸素種の1種であり、容易に他の活性酸素種の生成を促すことから、オゾン感受性の差には活性酸素生成、または活性酸素消去能力の差が関与していると考えられる。そこで本研究では、Bel-B、Bel-W3両系統由来の懸濁培養細胞を調製し、様々な刺激により誘導されるスーパーオキシド等の活性酸素の生成および活性酸素消去能力を調べた。まず、スーパーオキシドの生成を誘導するサリチル酸（1 mM）、AlCl₃（1 mM）による処理を行い、ウミホタル由来化学発光試薬（CLA）を用いてスーパーオキシド生成の検出を試みた。その結果、Bel-W3において顕著なスーパーオキシドの生成が観察された。また、Bel-Bのスーパーオキシド生成は、Bel-W3と比較して1/5程度であった。次に、H₂O₂を基質としてBel-B細胞とBel-W3細胞のin vivoでのカタラーゼ活性をO₂電極を用いて調べた。その結果、Bel-B細胞ではBel-W3細胞の約2倍程度のO₂生成活性がみられた。また、若干ではあるがBel-W3細胞よりBel-B細胞の見かけ上のV_maxが大きく、K_mが小さかった。

抄録全体を表示

シロイヌナズナの下胚軸伸長はジベレリン(GA)や光によって制御されることが既に知られている．フィトクローム系では赤色光，遠赤色光，クリプトクロム系では青色光が関与する．しかしながら，その他の単色光，特に黄色光の影響はまだ明らかになっていない．本研究では，GAとウニコナゾールを単独もしくは併用添加した培地にシロイヌナズナの種子を播種し，様々な単色光照射下または暗黒下で培養し，下胚軸の成長を評価した．その結果，GAの単独添加培地では，下胚軸伸長は他の単色光照射下と比較して青色光で強く抑制された．また，黄色光下での下胚軸伸長は暗黒下とほぼ同程度であった．一方，GAとウニコナゾールの併用添加培地では，下胚軸伸長のGAによる伸長促進は，他の単色光と比較して黄色光で最も顕著であった．これらの結果から，下胚軸伸長におけるGAの感受性は光質に依存して変化することが示唆された．現在，ジベレリン合成酵素欠損変異体を用いて，GAに対する感受性の変化を他の単色光照射下で解析中である．

抄録全体を表示

植物のmitogen-activated protein kinases (MAPKs)は、様々なストレスによって活性化され、そのシグナルを下流に伝える重要な因子として広く知られている。今回、恒常的な全身獲得抵抗性を示し、ジャスモン酸シグナル非感受性になるArabidopsis mpk4 mutantの原因遺伝子AtMPK4のタバコオルソログ、NtMPK4を単離し、タバコにおける機能を解析した。
　NtMPK4はWIPKやSIPKと同様に、傷害により速やかに活性化された。NtMPK4の発現を抑制した形質転換タバコはmpk4と同様に矮性の表現型を示し、傷害応答性の塩基性PR-1遺伝子の傷害誘導性が減少していた。次にNtMPK4のエチレンやジャスモン酸シグナルへの関与を明らかにするために、両シグナルが拮抗的に働くといわれるオゾンを形質転換タバコに暴露した。一般的にエチレンシグナルはオゾン暴露による細胞死を誘導し、ジャスモン酸シグナルは逆にこの細胞死を抑制することが知られている。オゾン暴露の結果、NtMPK4発現を抑制した形質転換タバコはオゾンに対してより感受性になり、対照葉が変化を示さない条件下で葉に激しい壊死が誘導されたことから、NtMPK4がエチレンシグナルではなく、ジャスモン酸シグナルにおいて機能していることが示唆された。

抄録全体を表示

植物は光環境に応じた葉を形成する事が知られている。明所型のものは陽葉、暗所型のものは陰葉と呼ばれており、光合成特性、生理学的特性、さらには形態学的に両者に差がある事が数多く報告されている。その一方で、陽・陰葉の発生学的な解析はほとんど行われて来なかった。しかし近年になって、シロイヌナズナ、シロザ、タバコで、新しく作られる葉の発生が、既に展開している葉の光環境に依存して調節されている事が明らかになった（Lake et al. 2001、Yano and Terashima 2001、Thomas et al. 2004）。これらの事は成熟葉から葉原基への long-distance signaling が存在する事を示している。我々は、このシグナルが光合成産物の糖類であるという仮説を立て検証を行っている。60 μmol m^-2 s^-1 の光強度下で、糖濃度を変えた培地（0.5、1、1.5、2、3％ sucrose）で栽培したシロイヌナズナを材料とした。ロックウールなどで育てた場合、この光強度下では柵状組織を構成する細胞層数は約1層で葉の肥厚は起こらない。しかしながら、培地の糖濃度が2％を超えると細胞層数の増加ならびに葉の肥厚化が観察できた。これらの結果は、葉の発生運命を左右するシグナルが糖であるという仮説を支持するものである。また、phyB 変異体でも野生形と同様に糖濃度に依存した葉の肥厚が確認できた。発表ではこれらの結果に加え、その他の変異体（光受容体、糖応答変異体）の解析結果を報告する。

抄録全体を表示

われわれは、病原菌非存在下で細胞死を発現するシロイヌナズナの突然変異体をいくつか単離している。そのうちlen1変異体は、短日条件下において生長にともない、その葉において細胞死を発現した。しかし、長日条件下においては、細胞死の発現が抑制されていた。LEN1は、葉緑体に局在するシャペロニン、CPN60bをコードしているが、len1変異体における細胞死発現機構は不明のままである。また、lin2変異体は、葉緑体に局在するコプロポルフィリノーゲンIIIを欠損しており、長日条件下で顕著な細胞死を発現する。興味深いことに、len1lin2二重変異体においては、短日条件下における細胞死発現が抑制されていた。このことから、len1変異体の短日条件下における細胞死発現にはLIN2が必要であると考えられた。そこで、len1変異体の細胞死発現機構におけるテトラピロール合成経路の関与を調べるために、テトラピロール合成系に関与するいくつかの突然変異体とlen1変異体の二重変異体を作成し、細胞死について解析した。その結果、ある二重変異体においては、短日条件下における細胞死発現が抑制されていた。この結果から、len1変異体における細胞死発現機構について考察する。

抄録全体を表示

温度は種子の発芽を決定する重要な環境要因である。高温によるシロイヌナズナ種子発芽の阻害に関わる遺伝因子を網羅的に探索するため、アジレント社の22kオリゴマイクロアレイを用い、発芽の高温阻害を受ける34℃および高い発芽率を示す22℃で吸水した種子における遺伝子発現の様子を経時的に解析・比較した。発現変化は乾燥種子のレベルからの相対値で表し、有意に2倍以上の値を示した9,138遺伝子を解析の対象とした。22℃では吸水時間の経過とともに発現が変化した遺伝子の数および変化の幅が増大した。34℃では、22℃と比較して発現変化した遺伝子が少数となり、変化の幅も狭いことを明らかにした。遺伝子発現パターンの類似性を比較したところ、1）22℃6時間吸水、2）34℃6時間吸水、3）22℃12時間・24時間・36時間吸水、および、4）34℃12時間・24時間・36時間吸水の4つのクラスタに分類された。22℃で吸水させた種子では、24時間まで可視的な発芽が認められず、36時間以降で可視的な発芽（生理的な発芽の完了）が観察された。したがって、温度は吸水6時間までに遺伝子発現に影響を与えており、12時間以降では発芽の誘導あるいは阻害に関わる遺伝子の発現を誘導していると考えられた。

抄録全体を表示

　マメ科種子の子葉中に蓄積された貯蔵タンパク質は、吸水後に発現するプロテアーゼによって分解され、胚軸の成長に利用される。これまでに、イネやオオムギなどの単子葉類種子のアリューロン層におけるプロテアーゼの発現がジベレリン (GA) で活性化されることがよく知られている。そこで、インゲンマメ発芽子葉におけるプロテアーゼEP-C1の遺伝子発現への GAの関与を調べた。その結果、EP-C1遺伝子の発現はGAの生合成阻害剤であるプロヘキサジオンにより抑制され、GAの添加によってその発現量は回復した。したがって、EP-C1遺伝子の発現には、GAが中心的な役割を担っていると考えられた。GAのシグナル伝達にはDELLAタンパク質が関与することが知られているので、シロイヌナズナ種子の発芽に関与するDELLAタンパク質RGL2を強制的にインゲンマメ発芽子葉中で発現させた時のEP-C1遺伝子プロモーター活性への影響を調べた。パーティクルガンを用いた一過的発現系により解析した結果、RGL2を発現させるとEP-C1プロモーターの活性は抑制された。したがって、EP-C1遺伝子の発現は、DELLAタンパク質を介してGAにより制御されていると考えられた。

抄録全体を表示

穀物種子の発芽過程では、芽生えで合成されたジベレリン酸が胚乳組織を囲う糊粉層に作用して、貯蔵栄養分の分解利用に関わる加水分解酵素群の発現を促す。これら生理活性遺伝子の発現は、GAの作用により初動的に発現する転写調節因子であるGAMYBなどの、GA初期反応遺伝子の機能に支えられた二次的な反応であることが分かっている。GAによる遺伝子制御のリアルなしくみを知るため、初期反応遺伝子自体の発現機構を調べている。先の解析により初期反応遺伝子のGA応答性は、5'上流域に依存しないことを示した。様々な調節部位が遺伝子領域全体に散在しており、5'-UTRにあるlarge intronにはenhancer活性を検出している。Intron enhancerに関する知見は少ないが、Arabidopsisの花成を制御する重要なHox geneであるAG、FLCで詳細な報告がある。いずれの遺伝子でもintron enhancerがその発現特性を決めるが、特筆すべきことにlarge intronには、遺伝子領域をクロマチン構造の中に押し込め、静的な状態に保つ情報が存在するらしい。これらを踏まえると、GAが作用して最初に起こる核内イベントとは、クロマチン領域に拘束されている初期反応遺伝子の可動であると推定できる。特別なクロマチン構造の形成には多彩な遺伝子修飾が必要なことは周知である。そこで、ゲノムDNAのメチル化状態を把握するbisulfite sequence法を用いて、イネ発芽種子でのGA初期反応遺伝子のDNAメチル化状態の検出を試みた。

抄録全体を表示

FUS3は種子成熟過程を制御する主要な転写制御因子のひとつであり、種子貯蔵タンパク質等の種子特異的遺伝子の発現を調節している。FUS3による種子成熟過程の制御機構を明らかにするため、FUS3を誘導的に発現する形質転換植物を用いたマイクロアレイ解析を行った。FUS3の制御を受ける遺伝子はそのABA依存性や誘導キネティクスから異なる複数のグループに分類された。貯蔵タンパク質やオレオシン遺伝子ファミリーの個々のメンバーは、いくつかの異なるグループに属していた。このことは、これらの遺伝子のFUS3による制御にそれぞれ異なるメカニズムが働いていることを示唆する。例えば、12SグロブリンをコードするCRCのFUS3によるABA依存性の誘導は、他の12Sグロブリン遺伝子や2SアルブミンをコードするAt2S3のそれと比べて顕著な遅れがみられることからCRCの誘導には中間転写因子が介在すると予想される。マイクロアレイデータを検索したところ、FUS3による誘導を受ける転写制御因子が18個同定された。これらのうち、FUS3とABAによって特に顕著な発現の増大を示す転写因子に注目して、T87細胞を用いた共発現実験を行った。その結果、bZIP67およびbZIP12がCRCプロモーターを顕著に活性化することがわかった。両転写因子はFUS3によるCRCの誘導に関与する中間転写因子の有力な候補であると考えられる。

抄録全体を表示

種子の発芽過程では多くの遺伝子発現が誘導される。したがってこの機構では、遺伝子発現に関与する様々な転写調節因子が重要な機能を果たしているはずである。しかしながら、これまでに報告されている発芽種子のプロテオーム解析では、このような転写調節因子を検出した例は少ない。転写調節因子はその発現量が極めて微量であるため、存在比率の高いタンパク質の影響を受けて検出されにくいことが予想される。転写調節因子のようなDNAに親和性を持つタンパク質は、DNAアフィニティーカラムクロマトグラフィーで効率よく分画できる。そこで本研究では、発芽時に重要な役割を果たす転写調節因子を明らかにすることを目的として、イネ発芽種子の粗抽出液をDNAアフィニティーカラムクロマトグラフィーでPrefractionationし、吸水後に変動するタンパク質を二次元電気泳動で解析した。その結果、（i）42kDa （ p42 ）、40kDa ( p40 )、38kDa ( p38 )のDNA結合タンパク質が吸水3日目までに著しく減少すること、（ii）これら3つのタンパク質は胚以外の組織に存在していることが明らかになった。また、p42、p40、及びp38の急激な減少は、無胚半切種子を吸水させた場合にも観察されたことから、これらの減少には胚に由来する因子は関与しないことが示唆された。

抄録全体を表示

植物は、日々繰り返される明期と暗期をうまく利用し、概日リズムの調整、光合成の制御、光周性花成の誘導などに関連する様々な遺伝子の発現制御を行っている。我々は、光周性に敏感に反応する短日性植物のアサガオ（Pharbitis nil cv. Violet）を実験材料とし、暗処理により発現が誘導される遺伝子をスクリーニングした。今回は、cDNAサブトラクト法で得られた2種の遺伝子の発現解析の結果を報告する。それぞれの遺伝子は、シロイヌナズナのユビキチン 1，2および機能未知遺伝子とそれぞれ高い相同性を示した。これらの遺伝子の暗期における発現応答性について、アサガオの子葉を使い連続暗期での経時変化を調べた。両遺伝子とも暗処理によって発現が誘導され、暗処理開始後12～16時間に発現のピークがみられた。また、短日処理による花成誘導を打ち消すことが知られている、暗期開始8時間後の光照射（光中断処理）や暗期処理前の遠赤色光照射（end-of-day 遠赤色光処理）によって、暗期中の発現誘導が抑制されることが分かった。これらの2つの遺伝子の花成誘導における役割について論じる。

抄録全体を表示

MADS-boxタンパク質をコードする遺伝子AGL24は、シロイヌナズナの花成促成因子である。AGL24の発現は茎頂特異的に栄養成長から生殖成長の転換期にかけて上昇する。本研究では、シスエレメントを同定しAGL24の転写に関与する因子を予測することにより、その花成特異的発現の制御機構を解明することを目的としている。まず、様々な長さのAGL24プロモーター断片をGUS遺伝子と連結させ、シロイヌナズナに導入した。GUS遺伝子の発現を指標とし、組織化学的に発現部位を観察したところ、-850/-353のプロモーター断片中と第2イントロン中にAGL24の発現の時期・組織特異性に関与するシスエレメントが存在することが示唆された。第2イントロン中には、MADS-boxタンパク質の結合認識配列CArG-boxと予測される配列が存在することから、このCArG-box様配列に着目した解析を行った。その結果、このCArG-box様配列には、花成に関与するMADS-boxタンパク質AP1, SOC1, SVPが、in vitroで結合することが明らかとなり、AGL24が、MADS-boxタンパク質による発現制御を受けていることが示唆された。現在は、-850/-353のプロモーター断片中に存在するシスエレメントの探査を進めると共に、MADS-boxタンパク質のin vivoでの結合の有無を検証している。

抄録全体を表示

シロイヌナズナのMADS-box転写因子AGL24とSVPは、進化系統学的に非常に近縁であるにも関わらず、AGL24は花成促進に、SVPは花成抑制に働く。本研究では、AGL24とSVPの転写制御標的遺伝子を同定し、両者の遺伝子発現調節と花成制御との関連性を明らかにすることを目的とした。まず始めに、マイクロアレイを用いて、AGL24やSVPの変異体および過剰発現植物体の茎頂組織における遺伝子発現を、野生型の遺伝子発現と比較した。その結果、野生型と比較して2倍以上発現変動していた遺伝子は、AGL24過剰発現植物体で56個、SVP過剰発現植物体で171個、agl24で7個、svpで 3個であったが、そのほとんどが機能未知であった。このうち、AGL24とSVPの過剰発現植物体の両方で共通して発現が増加あるいは減少した遺伝子が33個存在した。これは、両者が過剰に存在することで非特異的に同じシス配列に結合し、本来の標的ではない遺伝子の発現に影響を及ぼしたことが考えられる。また、これらの植物体間で異なる発現変動の傾向を示したものはSOC1だけであった。SOC1は花成促進に働くMADS-box遺伝子で、その発現は、AGL24過剰発現植物体とsvpで増加し、SVP過剰発現植物体で減少していた。このことから、AGL24とSVPがSOC1の発現制御を通じて、花成を逆に制御している可能性が示唆される。

抄録全体を表示

シロイヌナズナのMADS-box遺伝子AGL24は花成促進に働く。興味深いことに、シロイヌナズナのSVPはAGL24と進化系統学的に非常に近縁であるにもかかわらず、花成抑制に働く。AGL24とSVPタンパク質はM、I、K、Cドメインから成り、とりわけDNA結合に働くと考えられるMドメインの配列相同性が高い。本研究では、AGL24とSVPによる花成制御の分子機構を明らかにするために、両者の機能特異性を決定するドメインの同定を行った。方法として、両者のドメインを相互に組み換えたキメラ遺伝子を導入した形質転換植物体を作成し、その解析を行った。まず、M、MI、MIKドメインをそれぞれ相互に入れ換えたキメラ遺伝子をCaMV 35Sプロモータにより発現するコンストラクトを作成し、野生型シロイヌナズナに導入した。その結果、35S::SVP-M/AGL24-IKC （SVPのMとAGL24のIKCのドメインキメラ）導入植物体は35S::AGL24導入植物体と同様に早咲き、35S::AGL24-M/SVP-IKC導入植物体は35S::SVP導入植物体と同様に遅咲きとなる傾向を示した。これらの結果は、IKCドメインが機能特異性の決定に重要であることを示している。このことから、両者の機能的差異はIKCドメインが関わる機能、すなわちタンパク質複合体の形成や転写活性化能などに起因することが示唆された。

抄録全体を表示

タンパク質能動的分解を担うユビキチン・プロテアソーム系は、様々な成長制御に関与することが明らかとなっている。F-boxタンパク質はユビキチンリガーゼ（E3）の1種であるSCF複合体（Skp1, Cullin, F-box）の構成因子である。シロイヌナズナのゲノム中には、SkpやCullinなどの分子種は数少ないのに対し、F-boxは少なくとも586種存在している（Kuroda et al. Plant Cell Physiol.43:1073-1085（2002））。すなわち、F-boxの多様性が標的分子の特異的認識の本質であると考えられる。
我々は、F-boxアンチセンスラインから花成が遅延する変異体(F-box related to late flowering 1: fbl1)を単離した。fbl1では、FTの発現が顕著に減少していた。また35S::FTとの二重形質転換体では、花成遅延が抑圧されることが明らかとなった。fbl1は、形態的特徴および発現解析から、自律促進経路や春化依存的促進経路には異常がなく、光周期依存経路に異常を生じている可能性が強く示唆された。光周期依存経路に関与する多くの分子種のタンパク質量は、周期的に増減していることが明らかとなっている。これには速やかなタンパク質の分解システムが必要であると考えられ、これについても議論したい。

抄録全体を表示

　我々は、リンゴの花芽形成機構を解明するために、シロイヌナズナのLEAFY遺伝子のリンゴでのオルトログであるAFL1, AFL2遺伝子の発現解析を行っている。それぞれの遺伝子の上流約2.5 kbをGUS遺伝子につなぎ、シロイヌナズナに導入した。AFL2プロモーターでは、ごく若い蕾にGUSの染色が観察されたが、AFL1では全く染まらなかった。また両者ともにロゼット葉、花茎葉の托葉が強く染色された。このことはAFL2が花芽形成に関与することを示唆した。さらにリンゴでの発現様式を明らかにするため、果樹研究所リンゴ研究部で開発された、わい性台木JM2(マルバカイドウx M. 9)を遺伝子導入体として用いた。一般にリンゴの形質転換効率は低いが、リンゴ研究部では形質転換効率の高いリンゴ種の探索を行い、JM2が特に高い形質転換効率を示すことを明らかにした。AFL2プロモーター+GUSを導入した転換体リンゴ(JM2)の作出を行った。アグロバクテリウム法で感染した葉片517枚を薬剤耐性培地で選抜し、耐性の植物体31個体を得た。このうち17個体でGUS染色が確認された。栄養成長期のAFL2の発現様式をこれらの転換体を用いて解析したので報告する。

抄録全体を表示

バーナリゼーションはDNA脱メチル化によるエピジェネティクス制御を受ける顕著な例である。光周的花成でも、シソではエピジェネティクス制御が関与する可能性を我々はすでに指摘した。シソの花成にDNA脱メチル化が関与するであろうと推測したのは、花成状態が長期間持続するというシソの特異な性質が、バーナリゼーションでの低温効果の持続性と類似するからであった。そこで、今回は、数種の植物を用いて、花成状態の持続特性とDNA脱メチル化による花成誘導との間に相関があるかどうかを検討した。
　花成研究の代表的な材料である4種の植物に対して誘導的光周処理を行った後、非誘導条件に移して、花成反応の推移を調べた。その結果、アサガオ、アオウキクサは栄養生長に戻り、ムシトリナデシコとオナモミは生殖生長を続けた。これらの種に5-azacytidine（azaC）を処理したところ、ムシトリナデシコだけが花成を誘導された。オナモミは花成状態が長く持続するが、azaCで花成は誘導されなかった。以上の結果から、長期にわたる花成状態の持続にDNA脱メチル化が関与するというモデルは常に成立するわけではないことが示唆された。花成状態が持続する種であっても、シソ・ムシトリナデシコとオナモミでは、花成制御機構が異なる可能性がある。rDNAスペーサ領域のサザン解析によるDNAメチル化度の検討を含めて、この点について議論する。

抄録全体を表示

植物の生殖成長過程での様々なストレスによって引き起こされる障害は、一般に種子稔性の低下（不稔）という形で現れることが知られている。しかしながら、その発生機構の分子メカニズムについては、多くの場合組織や時期に特異性があり、これまでに十分な解明はなされてない。そこで、私たちは生殖成長過程が栄養成長過程と比較的同調良く進行するオオムギを用いて、その高温障害の発生とタンパク質の発現変動について網羅的な解析を行っている。具体的には、はるな2条を用いて、その幼穂長が約2mmの生殖成長初期に高温（昼30℃／夜25℃）・16時間日長下に5日間さらすことで、その後適温に戻しても出穂はみられるが、花粉形成が阻害され、完全に雄性不稔となる実験系を用いて、解析を行った。そして、高温処理5日目とその後適温に戻して8日目の幼穂からタンパク質を抽出し、それぞれの対照区と1次元および2次元電気泳動ならびにMALDI-TOF MSを用いたペプチドマスフィンガープリンティング法により、高温処理によって発現量が変化したタンパク質を網羅的に解析した。その結果、高温処理区で発現量の変動があったスポットやピークを複数検出することができ、glycine-rich RNA-binding proteinをはじめとした幾つかのタンパク質も同定することができた。本発表では、これらの研究結果の詳細について報告する。

抄録全体を表示

植物の雄蕊形成過程は雌蕊形成や栄養成長過程よりも様々な環境ストレスに感受性が高く、雄性不稔となりやすいことが知られている。しかしながら、その分子機構については不明な点が多い。そこで、私たちは、生殖成長過程が比較的よく同調するオオムギを用いて、雄蕊形成過程における高温障害の実験系を確立し、その分子メカニズムの解明を行っている。これまで私たちは、高温ストレス（30℃（昼）／25℃（夜）5日間）に対し最も感受性が高いのはタペート層を含む葯壁や花粉母細胞の分化が起こる時期であることを特定した。この高温処理により、葯は途中まで発生・分化するが、それ以降は完全に停止し、花粉粒の全く形成されない雄性不稔となった。また、この時期は、多岐にわたる遺伝子群が顕著に発現上昇していたが、高温条件下では上昇がみられず、高温による組織特異的な転写活性の阻害が示された。さらに、高温処理期間を短縮し、常温に戻した後の転写のre-activationと稔性の間に正の相関を見出した。また、転写のinitiationに関わるRNA polymerase II 最大サブユニットCTD領域におけるセリン5番目のリン酸化レベルを調べたところ、高温条件下でリン酸化レベルが有意に増加することが明らかとなった。本発表では、葯の初期発生分化時期における高温障害の原因について時期および組織特異性を含めて議論したい。

抄録全体を表示

植物の発芽後の形態形成は茎頂と根端にあるメリステムの活性にゆだねられる。メリステムは一定の構造を保ち、細胞の供給源となる。シロイヌナズナのtebichee (teb)変異株は分裂組織の構造に異常をきたし、短い根、葉序や葉の形態の異常、そして花茎の帯化などの表現型を示す。TEB遺伝子はショウジョウバエで、DNA損傷の修復もしくは損傷に対する何らかの反応に関わると考えられているMUS308タンパク質のホモログをコードしていた。teb変異株ではDNA二本鎖切断に応答する遺伝子の発現が上昇しており、また、細胞周期のG2/M期で特異的に発現するcyclinB1::GUSを発現する細胞がメリステムにおいて増加していた。これらのことからteb変異株におけるメリステム構造の異常は細胞周期進行の異常と関係するのではないかと考えられた。
さらに、teb変異株とDNA複製進行チェックポイント機構にかかわるATRの欠損株atr-2の二重変異体を作製したところ、atr変異はteb変異株の表現型を亢進することが分かった。このことはTEB遺伝子がDNA複製の正常な進行に働いていることを示すとともに、TEBがチェックポイント機構にも関わっていることを示唆している。今後TEB遺伝子の詳細な機能解析により、DNA複製や細胞周期制御とメリステムや器官の構造との関わりが明らかになることが期待される。

抄録全体を表示

シロイヌナズナの可溶型ABCタンパク質遺伝子（AtGCN20-3）は根端でレポーター遺伝子が発現するラインの原因遺伝子として単離され、挿入変異株の解析から、この遺伝子が根の伸長を制御していることを明らかにした。AtGCN20-3と相互作用するシロイヌナズナGCN1遺伝子（AtGCN1）も根端で発現が見られ、さらに茎頂部・花器官でも発現していた。AtGCN1の挿入変異株は根の伸長が抑制されるだけでなく、不稔になることも報告してきた。これらAtGCN20-3, AtGCN1は酵母のアミノ酸欠乏時に働く遺伝子のオルソログであり、この系にはGCN2遺伝子・eIF2α遺伝子も関与している。そこでこれらの遺伝子発現を調べるために、GCN2遺伝子（AtGCN2）・eIF2α遺伝子（AteIF2α_II, AteIF2α_V）のプロモーターにGUS遺伝子をつないだコンストラクトを作製し、シロイヌナズナに導入した。その結果AtGCN2はAtGCN1と同様、根端・茎頂部・花器官で発現が見られた。またAteIF2α_IIの発現はAtGCN1, AtGCN2と同様の発現パターンを示したが、AteIF2α_Vは葉と花器官で発現しており、他の4つの遺伝子のパターンとは異なっていた。現在AtGCN20-3およびAtGCN1の挿入変異株と野生型植物から抽出したRNAを用いたアレイ解析も行っているので、その結果についてもあわせて報告したい。

抄録全体を表示

花芽形成に関与するMADS box遺伝子の中で、被子植物の典型的なB遺伝子は花弁と雄蘂で発現するが、例外的な発現様式を示す例も報告されている。一方、裸子植物のB遺伝子ホモログは雄花でのみ発現するとされ、他器官での微量発現を解析した例はこれまでない。私達は、スギ由来の2種類のB遺伝子ホモログ（CjMADS1、CjMADS2）が雄花特異的な発現を示すことをノーザンブロット解析により示した（1）。本研究では、これらの遺伝子についてRT-PCR解析を行い、より詳細な発現様式を検討した。その結果、両遺伝子は、自然着花する生長段階にあるスギだけではなく、人為的な花成誘導がなければ雌雄花が分化しない1年生挿し木苗の、葉でも発現することが示された。さらに、野外および雌雄花それぞれが優先的に分化する温度条件下で育成したスギの、雌雄花の分化初期段階にある葉での発現が検出された。雌花では、種子の形成が認められる時期に至るまで、恒常的に発現が認められた。これらの結果は、裸子植物のB遺伝子ホモログが、いわゆるB機能だけではなく、多様な機能を持つ可能性を示唆している。スギのB遺伝子ホモログの発現と雄花の形態形成に及ぼす温度の影響についても解析を行い、その結果もあわせて報告する。
（1）Fukui, M. et al. (2001) Plant Cell Physiol. 42: 566-575.

抄録全体を表示

LlM532はテッポウユリの減数分裂期花粉母細胞cDNAライブラリーから見いだされた葯と小胞子において高発現する遺伝子である。その翻訳産物は核移行シグナルとsigma-70 RNA-binding motifをもち、リボソーム生合成に関わるpre-rRNA processing factorである酵母Rpf2と高い相同性を有する。抗体染色およびタンパク質ゲルブロット解析の結果からLlM532タンパクは小胞子形成期初期に高発現する核あるいは核小体に局在するタンパクであることが示唆された。LlM532タンパクの核移行、細胞内局在はタマネギ表皮細胞におけるGFP::M532融合タンパクの一過的発現によっても確認された。シロイヌナズナのLlM532相同遺伝子であるAtM532も酵母Rpf2と高い相同性を示し、そのGFP融合タンパクの細胞内局在はLlM532タンパクと同様であり核小体への移行が観察された。AtM532遺伝子はシロイヌナズナゲノムに単一コピー存在し、そのmRNA発現はすべての組織で観察されたが生殖器官と根において比較的高かった。

抄録全体を表示

RDD1は植物の転写因子Dof遺伝子と有意な類似性を示し、イネにおいて恒常暗期条件下でも転写量が約24時間周期で変動する遺伝子の1つとして同定された。今回はRDD1の機能解析の結果について報告する。既知の概日リズム制御下遺伝子の発現調節への関与について調べるために、RDD1 cDNAを大量発現用プロモーター下流にセンス方向（S）もしくはアンチセンス方向（AS）につないで作出した形質転換イネ（Sイネ, ASイネ）を用いて発現解析を行った。解析の結果、光合成関連遺伝子Cab1RとrbcSの転写量の変動パターンが形質転換イネで変化していて、長日条件下と短日条件下では異なる変化を示すことがわかった。また、内在性RDD1 mRNAと相補的なRNAの存在が示されたことから、アンチセンスRNAがRDD1の発現調節に関与している可能性が考えられた。形質転換イネの草丈は野生型よりもやや低く、ASイネはS イネよりも低かった。出穂日はSイネと野生型がほぼ同じであったが、ASイネは平均で約10日の遅延がみられた。以上の結果から、RDD1は光合成関連遺伝子の転写量調節に関わる転写因子の1つであると推定され、光合成関連遺伝子の発現調節を介してイネの生長や出穂期に影響を与えているのかもしれない。

抄録全体を表示

概日時計を持つシアノバクテリア、Synechococcus elongatus PCC 7942は時計中枢遺伝子としてkaiABCを持つ。これまでの研究からkaiABCは自身の転写フィードバックループを介して、シアノバクテリアの全遺伝子に概日振動をあたえると推測されており、概日振動を示さない遺伝子は未だ見つかっていない。概日振動を示す遺伝子発現の波形は主に2種類の形に分類される。一つは、主観的昼と主観的夜で明確な発現のオン・オフを繰り返す高振幅型、一つは一定の発現レベルの上に緩やかな遺伝子発現振幅を示す低振幅型である。これらのプロモーター領域には振幅波形を決めるための特定のシス配列は存在しないため、転写の基本単位によって制御されることが示唆された。そこで現在、それぞれのプロモーター上で高振幅型と低振幅型をきめる領域を明らかにするため、両者のハイブリッドプロモーターを用いて解析を行っている。一方、マイクロアレイ実験の解析結果から、両者の遺伝子発現には明らかに異なる制御機構が存在することが分かり、両者の遺伝子群が遺伝子発現の異なる過程で発現振幅を獲得しているとこが示唆された。そこでこれらの情報をもとに、シアノバクテリアの概日時計の出力系における新たなモデルを提唱する。

抄録全体を表示

シアノバクテリアは概日時計をもつ最も単純な生物であり、我々はこれまでにSynechococcus elongatus PCC 7942を用いて、時計遺伝子群kaiABCの転写フィードバックを核とする概日モデルを提案してきた。シアノバクテリアにおける概日リズムの生理的な例としては単細胞の海洋性シアノバクテリアが、光合成活性と窒素固定活性を時間的に分離していることが知られている。しかし、S. elongatus PCC 7942は窒素固定を行わず、光合成独立栄養でのみ生育可能な単細胞性シアノバクテリアであり、このシアノバクテリアにおける概日リズムの生理的重要性はこれまでほとんど明らかにされていない。概日時計によるゲノムワイドな遺伝子発現を詳細に解析するため、定量性に優れた超高密度DNAマイクロアレイ（Affymetrix Gene Chip）を作製した。S. elongatus PCC 7942の連続培養52時間の経時的遺伝子発現をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。ゲノムワイドな概日的遺伝子発現解析から、シアノバクテリアにおける概日リズムの生理学的意義を考察した。

抄録全体を表示

　陸上植物は多様な概日リズムを示す。しかし、そのほとんどは被子植物において観察されたものであり、より原始的とされる裸子植物、シダ植物、コケ植物では、概日リズムの報告は非常にまれであった。我々は、蘚類の一種であり、遺伝子ターゲティングを適用できるヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を用いて、概日リズムの研究を始めた。現在までに、いくつかの概日発現遺伝子（clock-controlled genes; ccgs）を同定したが、それらは皆、連続暗条件下で減衰型のリズム発現を示すいっぽうで、連続明条件下でアリズミックであった。この特徴は、連続明条件下で多くの場合はっきりしたリズムを示す被子植物のccgsとは対照的である。ccgsのひとつLhcb遺伝子（クロロフィルa/b結合蛋白質をコードする）や、アラビドプシスの「時計遺伝子」のひとつCCA1遺伝子（myb様蛋白質をコードする）のコケ相同遺伝子についての、最近の解析結果について報告する。

抄録全体を表示

時計機構は植物が昼夜の変動や季節変化に適応するために重要である。シロイヌナズナの中心振動体の分子モデルとして、Myb型転写因子CCA1、LHYとPRR (Psudo Response Regulator) 因子であるPRR1/TOC1との間で形成される正と負の転写制御フィーッドバックループが提唱されている。しかし他のPRR因子（PRR9・PRR7・PRR5・PRR3）の単独変異も概日リズムや開花制御に影響を与えることから、これらPRR因子も時計機構に重要な働きをしているとことが示唆されている。そこで、各種二重欠損株(prr5-11/prr7-11, prr5-11/prr9-10,prr7-11/prr9-10など)を作成し、開花時期制御、胚軸伸長の光感受性、転写の概日リズムといった多面的表現型の解析を行った。その結果、どの二重変異体の解析結果からも、PRR5、PRR7、PRR9が互いに協調的あるいは相補的に機能していることが示唆された。例えば、prr5-11/prr7-11において各種時計制御遺伝子の転写を解析したところ、自由継続リズムにおける著しい周期の短縮や振幅の消失が見られるなど、時計機能の欠損を示す強い相乗的表現型が観察された。これら各種PRR二重欠損変異株の多面的表現型と中心振動体モデルを踏まえ、各PRR因子の時計機構における働きを考察する。

抄録全体を表示

モデル高等植物であるシロイヌナズナにおいて多くの時計関連因子が見いだされてきた。中でも、疑似レスポンスレギュレーターと呼ばれる一連のタンパク質因子APRRsは興味深いファミリー因子群である。なぜならば、シロイヌナズナの時計構成因子として同定されたTIMING OF CAB EXPRESSION1 (TOC1)がそのファミリーに含まれるからである。さらに、概日リズムと光シグナル情報伝達機構の関連性を分子レベルで理解するうえで、APRR1/TOC1だけでなく、他のAPRRファミリー因子も重要であることを示す証拠が蓄積している。今回、光シグナル及び概日時計により制御されるAPRR9プロモーターの調節シス領域の解析を行った。そのために、T-DNA挿入変異植物体の解析に加えて、シロイヌナズナ培養細胞（T87細胞）にAPRR9プロモーター::ルシフェラーゼ（LUC）融合遺伝子レポーターを導入して解析を行った。これらの解析から、APRR9プロモーター上流に少なくとも二つの別々の調節シス領域を同定した：L領域と名付けた光シグナル応答配列とR領域と名付けた概日リズム形成に必要な配列である。加えて、L領域を介したAPRR9の光誘導には、直接か間接かは別として、APRR1/TOC1が深く関わっていることが示唆された。

抄録全体を表示

黄化植物からの緑化過程は光形態形成の一環として制御されている。特にクロロフィル合成過程には光依存的に酸化ストレスを生じる中間体が含まれるので、その合成は巧妙に制御されているはずである。さもなければ光形態形成時に致死的な傷害が生じかねない。しかしそのような観点からのクロロフィル合成制御の分子機構はあまり理解されていない。最近これと関連して、フィトクロム結合性のbHLH型転写因子PIF1が黄化芽生えにおけるクロロフィル合成の負の制御因子であることがシロイヌナズナにおいて報告された。我々はこの報告に強い興味を持った。なぜならば、PIF1は我々が概日時計構成因子PRR1/TOC1と相互作用することを報告したbHLH因子群の一つであるPIL5と同一だからである。光形態形成における胚軸伸長が概日時計によって制御されていることや、クロロフィル結合タンパク(CAB)の発現が概日時計により制御されていることはよく知られた事実である。これらを総合して、我々はクロロフィル合成自体も概日リズム（時計関連因子）により制御されている可能性があると推定した。この可能性を検証するために、緑化過程で光感受性を示すpil5変異体を対照として、各種の時計関連因子(TOC1やCCA1など)の変異体や過剰発現体に関してクロロフィル合成制御の観点から解析することで上記の推定を強く支持する結果を得たので報告する。

抄録全体を表示

植物ゲノム研究はシロイヌナズナやイネで先行実施され、大きな成果があげられている。ゲノム情報は、トランスクリプトーム研究、プロテオーム研究、フェノーム研究に利用され、「ポストゲノム研究」が進められている。また、比較ゲノム研究も精力的に行われ、花成研究（長日性／短日性の比較）などで大きな成果が得られている。トマトは多種多様な二次代謝産物を大きな果実に蓄積し、今後の植物研究の主要テーマの1つ「メタボローム研究（二次代謝産物の網羅的解析）」にとって良好な研究対象である。この「果実」の発達過程は、さまざまな植物ホルモンの相互作用により協調制御される。情報伝達系のクロストークに関して、シロイヌナズナやイネとは異なる新知見が得られると考えられる。また、トマト（中性植物）は、シロイヌナズナやイネとは異なる光周期応答性をもち、花成や概日リズムに関して興味深い研究対象である。「ゲノム配列の決定」、「完全長cDNAやESTの解析」、「突然変異系統の作出・整備・解析」の3つは、モデル生物の研究スピードの飛躍的向上に必須である。我々は現在、トマト標準系統（Micro-Tom）のEMS突然変異系統の作出・整備を進めている。また、「花成や概日リズム」と「植物ホルモンと果実の発達」に焦点をあて、変異体スクリーニングの条件検討を開始している。本学会では、「整備状況」や「変異体のスクリーニング」の現状を紹介する。

抄録全体を表示

樹木は、地球上のバイオマスの大部分を占め、炭酸ガスの吸収、保水など地球環境に大きな役割を果たしている。また、産業上の重要性も高い。なかでもユーカリは製紙原料として最も利用される樹種の一つといえる。ユーカリはフトモモ科に属する樹木で、適応力が高く成長も速いため、寒冷地や 熱帯地域以外の地域で広く植林されている。我々は、樹木がもつ遺伝システムを解明し、品種改良に向けた基盤データを収集する目的で、ユーカリ（Eucalyptus camaldulensis）のゲノム配列決定を開始した。E. camaldulensisゲノムはサイズが約650 Mbであり、11本の染色体から構成される。ゲノム配列決定には、全ゲノムショットガン法とBAC末端配列分析法の組み合わせを適用し、クローンライブラリの構築とクローン末端配列データの蓄積をこれまでにおこなってきた。2004年11月現在、50万readsの塩基配列を蓄積した。今回、このデータを基に予備的な解析をおこない、その結果から、ゲノムの平均GC含量が約41％であること、高頻度に出現する反復配列がゲノムに存在することを明らかにした。今後は、ゲノム配列解析完了に向けて配列データの蓄積を進めるとともに、遺伝子単離や機能解析に向けて共同研究を含めたさまざまな可能性を探ってゆきたい。

抄録全体を表示

　ラン藻は、形態、運動能や窒素固定能など多様な生物学的な特徴を有し生育環境も多岐に渡る。古典的な形態による分類から150属1500種以上が存在すると考えられている。近年、世界中でラン藻のゲノムプロジェクトが進行しており、20種類以上のラン藻ゲノム配列が決定されつつあり、ゲノム解析のモデルとして適している。そこで、我々はタンパク質ドメインデーターベースのPfamにより系統プロファイルから遺伝子クラスタリング行い、各々の生物の生育環境や、生物学的特徴を指標として整理しなおすことにより生物学的な知見の抽出と機能未知遺伝子の機能推定を試みた。
　14種のラン藻ゲノム配列に対してPfam_lsによりhmmpfamサーチを行った。その結果、14種のラン藻に約2000種類のPfmaドメインが存在することが分かった。各Pfamドメインの種ごとの系統プロファイルから階層的クラスタリングを行った。その結果、外界や細胞内の環境変化の受容体として働くと考えられるドメイン（GAF, PAS, など）や信号伝達に関与するドメイン（二成分制御系）、また転写因子などは、種によってドメインの数が著しく異なるクラスターに分類された。これらのドメイン数の重複と種ごとの生育環境の違いの間に相関を見いだした。さらに、機能未知ドメインのなかに窒素固定能やヘテロシスト分化能に関連するものの存在を予測した。

抄録全体を表示