我々は、シアノバクテリアを光照射下で熱処理するとブリーチングを起こし、菌体吸収スペクトルのフィコシアニン由来の吸収が減少することを明らかにした。このブリーチングは弱光下でも起こるが、低分子量熱ショックタンパク質(HspA)の構成的発現株では阻止された。しかし、そのメカニズムについては不明である。本研究では、このブリーチングのメカニズムと、HspAによるその抑制機構を明らかにすることを目的とした。
まず、ブリーチングを起こさないHspAを構成的に大量発現するSynechococcus ECT16-1株と、ブリーチングを起こすECT株（対照株）を熱処理後、細胞抽出液（可溶性タンパク質）をSDS-PAGEで解析したところ、後者ではフィコビソーム構成タンパクが著しく凝集したのに対し、ECT16-1株ではその凝集が抑制されていた。次に、精製フィコビリソームを過酸化水素存在下で熱処理すると、フィコシアニン由来の吸光度の減少とともにタンパクの凝集がみられた。精製HspAを加えることによりこの吸光度の減少やタンパクの凝集が阻止された。この結果は、ブリーチングがフィコビリソームタンパクの凝集によることを示し、さらにECT16-1株で見られたin vivoにおけるHspAによるブリーチングの抑制をin vitroで再現したものと考えられる。現在、HspAとフィコビリソームの相互作用の詳細を検討している。

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枯草菌などのgroESLやdnaKオペロンの転写調節はCIRCE配列へのHrcAリプレッサーの結合による通常温度での転写抑制と熱ショック温度におけるHrcAの不活性化による抑制解除によって説明される。我々は、Synechocystis sp. strain PCC 6803株のhrcA遺伝子を破壊するとCIRCE配列を転写開始点周辺にもつ2つのgroEL遺伝子の転写が通常の培養温度において脱抑制されることを明らかにした。しかしながら、この脱抑制は完全ではなく同一の転写開始点から熱ショックおよび光照射に応答した転写誘導がさらに起こった。hrcA遺伝子破壊株では、groEL転写産物蓄積量は暗所で減少し、熱ショックまたは光照射下に移行すると迅速かつ著しく増加した。これらの転写誘導はDCMUの添加により顕著に阻害されたことから、光合成電子伝達系の関与が示唆される。以上の結果は、HrcAに依存しない他の主要な調節機構の関与を示唆するものである。groEL遺伝子の上流調節領域の塩基配列を比較したところ、シアノバクテリアに特異的な保存配列が見いだされ、ゲルシフト解析によりDNA結合タンパク質の結合配列が同定された。これらの配列がgroEL遺伝子の転写調節に寄与するかどうか明らかにするためレポーター系の構築を行い、現在解析を行っている。

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ADP-riboseは有害なADPリボシル化を引き起こすため、その細胞内濃度はADP-ribose加水分解酵素（ADPRase）によって厳密に調節されている。Synechocystis sp. PCC 6803のゲノムにはADPRaseをコードする推定遺伝子が5つ存在し、ADP-riboseの濃度調節に機能分化があると予想される。各遺伝子からの組み換えタンパク質の酵素活性を測定したところ、Sll1054とSlr0920はADP-riboseを特異的に加水分解し、Slr1134はADP-ribose以外にNADHとFADも加水分解した。一方、Slr1690はほとんど活性を示さなかった。Slr1690はADPRaseに特徴的なNudixモチーフに複数の変異があり、この変異を保存されたアミノ酸に戻すと活性が増加した。したがって、Slr1690はADPRaseから由来していると考えられる。またクラスタリング解析から、Sll1054は細菌型のADPRase、残り4つは古細菌型のADPRaseから分子進化したことが示唆された。これらの遺伝子破壊株をADP-riboseを含む培地で生育させたところ、Δsll1054、Δslr0920は野生株に比べ著しく生育が阻害された。したがって、細胞内ではSll1054とSlr0920がADP-riboseの分解に主に貢献していると考えられる。

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　我々はSynechocystis sp. PCC 6803のフィトクロム様タンパク質遺伝子slr1212を破壊するとslr0228 (ftsH) を含む一群の遺伝子の暗所における転写量が低下することをこれまでに見いだしている。この後の解析により本破壊株において300から500 μmol m^-2s^-1の強光を12時間照射した後に観察されるカロテノイドの蓄積の割合が減少していることが明らかとなった。カロテノイドの蓄積には橙色 (615nm) および紫色 (395nm) の強光照射が有効であり、slr1212破壊株ではどちらの光条件下でもカロテノイドの蓄積は抑えられていた。また本破壊株に紫色強光を数日間照射すると細胞の退色が生じた。
　本ラン藻のゲノム上にはslr1212遺伝子の隣にAraCサブファミリーレスポンスレギュレーター遺伝子slr1213が存在しSlr1212の下流で転写制御を行うことが予想された。slr1212とslr1213の二重破壊株は強光照射によるカロテノイドの蓄積が回復したことから、Slr1213はカロテノイド蓄積には抑制的な因子として働きSlr1212はSlr1213の活性を抑制することが示唆された。カロテノイドの組成分析によりslr1212破壊株においてミクソール配糖体の蓄積量が低下していることが明らかとなった。

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　ゲノム塩基配列が判明した生物種の全カロテノイドの同定は、生合成経路の決定だけでなく、生理学や系統分類学などの研究にも重要である。シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120、Nostoc punctiforme PCC 73102などは主成分がβ-カロテン(40-60%, モル％)とエキネノン(20-40%)で、他にミクソール・フコシド、ケトミクソール・フコシド、カンタキサンチンが存在した（昨年本年会）。
　本研究では、ゲノムプロジェクトが既に最終段階に入っているAnabaena variabilis ATCC 29413の全カロテノイドを同定した。上記の種とは違いミクソール(5%)および4-ヒドロキシミクソール(2%)は配糖体を形成しておらず、他にβ-カロテン(51%)、エキネノン(20%)、カンタキサンチン(22%)があった。カロテノイド生合成においてβ-カロテン・ケト化酵素(CrtO/W)はβ-カロテンをエキネノンばかりでなくカンタキサンチンにもできる。β-カロテン水酸化酵素(CrtR)はβ-カロテンには作用せず、デオキシミクソールにのみ作用する。このように他のシアノバクテリアと同じ機能をもつ酵素が、種により基質特異性に差異があることが、カロテノイドの多様性を生じると考えられる。また本株は糖転移酵素の欠損のためカロテノイド配糖体を形成できないと考えられるが、他のシアノバクテリアでもその酵素の実体が捉えられていない。本株はカロテノイド配糖体の機能を研究する上で有用である。

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Gloeobacter violaceus PCC 7421は単細胞性シアノバクテリアで、16S rRNAの配列を用いた分子系統解析により、シアノバクテリアの中では早期に分岐した事が示されている。よって、本生物が始原的な性質を部分的に残している可能性が考えられた。我々は、カロテノイドに着目し、その組成と生合成系の酵素遺伝子について解析を行った。Gloeobacterでは主なカロテノイドはβ-カロテンであり、その他にオシロール・ジフコシドと少量のエキネノンが同定された。しかし、多くのシアノバクテリアに見出されるゼアキサンチンなどの他のカロテノイドは存在しなかった。ゲノム配列情報より、カロテノイド生合成経路に関わる酵素遺伝子を検索した結果、他のシアノバクテリアから高等植物までで保存されており、フィトエンからリコペンまでの不飽和化反応を連続的に触媒する2つの酵素の遺伝子（crtP, crtQ）がGloeobacterには見出されなかった。それに対して、4段階の反応を行う細菌型の不飽和化酵素であるcrtI様の遺伝子が1つ存在していた。フィトエンを蓄積する大腸菌での機能相補実験により、GloeobacterのCrtIにリコペン合成能があることが示された。これは、細菌型のフィトエン不飽和化酵素が酸素発生型光合成生物で機能している初めての例である。さらに、我々は2つのβ-カロテンケトラーゼ様遺伝子(crtO, crtW)の一方だけがエキネノン合成に関与することを見出したので合わせて報告する。

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　シアノバクテリアのカロテノイドは、生物種ごとに多様性があることがわかってきた。ゲノム塩基配列が判明しているAnabaena sp. PCC7120は、極性カロテノイドとしてミクソール・フコシドとケトミクソール・フコシド、非極性は、β-カロテン、エキネノン、カンタキサンチンを持つことを明らかにした（昨年度大会）。シアノバクテリアでカロテノイド生合成経路の解析が最も進んでいるSynechocystis sp. PCC6803と比較すると、配糖体に結合している糖が異なり、ゼアキサンチンを含まない点などがAnabaena、Nostoc属の特徴として挙げられる。
　本研究では、A. 7120について、既に機能が確認されているカロテノイド合成系の遺伝子との相同性から、遺伝子を推定し、破壊株を作成することにより、機能の同定を試みている。β-carotene ketolase (CrtWまたはCrtO)については、近縁種であるNostoc punctiforme PCC73102のcrtWと相同なalr3189、S. 6803のcrtOと相同なall3744の2つの推定遺伝子を得た。このうち、all3744の破壊株は、エキネノン、カンタキサンチンを含んでいなかったが、ケトミクソール・フコシドは野生株と同様に生成していた。したがって、A. 7120では、β-カロテンまたは配糖体のケト化を担う、少なくとも2種類のケト化酵素が存在することが示唆された。他の遺伝子についても破壊株の作成を試みている。

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バクテリアにはN末端のシステイン残基に特有の脂質修飾を受けるリポタンパク質という一群のタンパク質が存在する。このような脂質修飾のメカニズムおよびリポタンパク質の局在や機能は、大腸菌や枯草菌などを用いた研究から明らかにされつつあるが、バクテリアの中で重要な一群を占めるシアノバクテリアにおいてはその研究がほとんどなされていない。シアノバクテリアは外膜や細胞膜の他に多量のチラコイド膜を持つという特異なバクテリアであるため、膜の界面で働くリポタンパク質はシアノバクテリアにおいて光合成をはじめとする重要な機能に関わっていると考えられる。本研究において我々はシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803におけるリポタンパク質の脂質修飾に関わる遺伝子を全て同定し、シアノバクテリアにも脂質修飾の機構が存在することを示した。また、リポタンパク質のシグナル配列を用いたゲノムサーチにより、Synechocystis sp. PCC 6803において30-40種類のリポタンパク質の候補が存在することを推定した。さらに、光化学系IIのサブユニットのいくつかが脂質修飾を受けることを明らかにし、これらのサブユニットの光化学系II複合体へのアセンブリーに果たす脂質修飾の機能について考察した。

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これまでに、複数種のシアノバクテリアのRNAポリメラーゼ精製法が報告されているが、一様に多くのステップを必要とし煩雑である。今回我々は、Synechocystis sp. PCC6803のRNAポリメラーゼにHisタグを付加し、これを用いたシアノバクテリア細胞からのRNAポリメラーゼ簡易精製法を確立したので報告する。まず、β'サブユニット構造遺伝子(rpoC2)の3’末端及びその下流域を含む約1.5-kbpのDNA断片を大腸菌内にクローン化し、RpoC2のC末端にHisタグが付加されるよう配列を改変した。さらに、rpoC2下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入し、このプラスミドで野生株を形質転換し、染色体上のrpoC2遺伝子にHisタグ配列の付加された形質転換体を得た。この株では、全ての染色体上のrpoC2遺伝子が改変型に置換されており、増殖への影響も見られなかったことから、RpoC2へのHisタグ付加は細胞に大きな影響を及ぼさないと考えられる。変異株菌体を破砕した超遠心上清（20 mM Tris-Cl pH 8, 0.5 M NaCl, 5% glycerol）より、Niカラムを用いてHisタグ付加蛋白質を精製した。目的の蛋白質は20-50 mMイミダゾールで溶出し（収量：779 μg/1.9 g菌体）、抗RNAポリメラーゼ抗体を用いたウェスタン解析の結果、全サブユニット(β', β, γ, α, σ)を含んでいた。また、in vitro転写解析により、同精製酵素が大腸菌Eσ70コンセンサス型の-10及び-35配列を持つtacプロモーターを認識することを示した。

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葉緑体の遺伝子発現では、転写後のRNAレベルでの発現制御の比重が大きい。この過程では様々なRNA結合タンパク質（RNP）が関与していることや、一部のRNPはリン酸化されることでその機能がコントロールされることが明らかにされている。一方、シアノバクテリアの遺伝子発現でも転写後制御機構の存在が示唆されており、特に光条件によってmRNAの安定性が変わる遺伝子について報告がある。しかしながらシアノバクテリアでは転写後制御機構で機能を果たすRNPに関する知見は少ない。一般的にRNPはssDNAに強い親和性を持つことが知られている。そこで、Synechocystis sp.PCC6803からssDNA 結合タンパク質画分を調整し、光条件で変動するタンパク質と、プロテインキナーゼ活性についての解析を行った。その結果20kDaと30kDaのssDNA結合タンパク質が、暗条件と比較して明条件下で多量に検出された。また、18kDaと65kDaのプロテインキナーゼ活性も明条件下で著しく強くなり、このうち18kDaのプロテインキナーゼはNDPキナーゼであることが明らかになった。さらに、明条件のssDNA結合画分には暗条件では認められないリン酸化されていると考えられる40kDaと50kDaのタンパク質も検出された。現在これらのssDNA結合タンパク質の機能に関する研究をさらに進めている。

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クロロフィル（Chl）の生合成系は、グルタミン酸からプロトポルフィリンIXまでの段階をヘムの生合成系と共有し、Mg-キラターゼによるプロトポルフィリンIXへのMg²⁺イオンの挿入によってChl特有の生合成系Mg-ブランチへと分岐する。したがって、Mg-キラターゼは、光合成生物の主要なテトラピロールであるChlとヘムの供給分配の調節に重要な役割を持つと考えられている。完全暗所でも生育が可能なラン藻Plectonema boryanumを用いて、Mg-キラターゼのサブユニットの一つChlDをコードするchlD遺伝子の破壊を試みたところ、変異株A5101が単離された。A5101は一回組換え体であったが、暗所で生育したA5101は、著しく薄い異常な色調を呈し、細胞の吸収スペクトルからChlのみならずフィコビリ蛋白質の含量が著しく低下していることが推測された。暗所で生育したA5101の濁度当たりのChl含量は、野生株の12%まで低下していた。A5101は、暗所従属栄養条件下では野生株よりもやや良好な生育を示したが、明所における光独立栄養条件では、強光（150 μmol/m²/s）及び弱光（10 μmol/m²/s）いずれにおいても生育が認められなかった。現在、A5101細胞における光化学系とChl生合成系の動態について検討中である。

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　Synechocystis sp. PCC6803 は光独立栄養での生育も可能であるが、1日5分程度の光照射によりグルコースを炭素源とする従属栄養的生育が維持される。また、その従属栄養的生育を開始する前の光独立栄養的生育が完全暗所での増殖に強く関連する（日本植物学会年会、2001）。さらに、sll0018など、解糖系関連酵素をコードする複数の遺伝子で暗所での発現が抑えられ、光照射下で増加することを報告した（日本植物生理学会年会、2004）。
　そこで、解糖系関連酵素の活性と、グルコース及び光照射との関係を調べた。その結果、fructose-bisphosphate aldolase（FBA）の活性はグルコース添加により増加し、光照射によりさらに活性が増した。これは、増殖速度と高く相関する。また、前培養の光独立栄養条件で対数的に生育している細胞ではFBA活性が高く、暗所従属栄養条件に移してもグルコースを利用して増殖を続けることができた。これに対し、生育が進行して定常期に近づいた細胞のFBA活性は低下し、暗所従属栄養条件に移してもほとんど増殖ができなかった。
　さらに、SDS-PAGEにより、従属栄養的条件下で生育した細胞のタンパク質組成を調べたところ、1日5分間の光照射により、約30個のスポットに発現の誘導が観察された。このタンパク質をTOF-MSにかけ、約10個のタンパク質を同定した。

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シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803グループ2シグマ因子SigEは窒素欠乏時に転写誘導される事が知られている。Muro-Pastorらにより、sigE欠損ではType IIIグルタミンシンセターゼをコードするglnNの窒素欠乏時における誘導が減少することが明らかにされているが (Muro-Pastor et al., 2001)、その他のターゲットは発見されていない。我々はsigE欠損株を作製し、表現型を調べたところ、sigE欠損株は暗条件下(Heterotrophic condition)で生育しないことを発見した。マイクロアレイ解析の結果、解糖系、酸化的ペントースリン酸経路、グリコーゲン異化の酵素をコードする遺伝子群のmRNA量が、sigE欠損株で減少している事を見い出した。シアノバクテリアにおいて、酸化的ペントースリン酸経路の主要な酵素であるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(6PGD)を欠損した株はそれぞれHeterotrophic growthができないことが知られている。mRNA量に加え、sigE欠損株では、G6PDと6PGDの酵素活性も減少しており、これらがsigE欠損株におけるHeterotrophic growthの不全の一因と考えられる。また通常培養条件下において、グルコースの取込み速度が減少する、グリコーゲン含量が約1.8倍に増加するといった表現型も発見した。これらの結果より、SigEは糖の異化を包括的に、正に制御している事が明らかとなった。

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Synechocystis sp. PCC6803はグラム陰性細菌であり，細胞膜の外側にペプチドグリカン，外膜，surface layer（S-layer）から成る細胞表層構造をもつ。我々はこれまで多量のヘモリシン様タンパク質（HLP）がグルコース耐性株（GT）のS-layerに結合していることを明らかにしてきた。精製HLPは3量体でありCa²⁺を結合していることを示したが，HLPの生理的機能は不明である。今回，野生型（WT）とGTを，抗HLPポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングおよび免疫電子顕微鏡法により比較した。その結果，WTにはHLPが全く存在しないことが明らかになった。WTではHLPの発現が何らかのメカニズムによって抑制されているものと思われる。GTのHLPは，精製したものと同様に，S-layerにおいてCa²⁺を結合していることが示唆された。GTにおける細胞表層上の多量のCa²⁺の存在には何らかの生理的および（もしくは）生態的意義があるものと思われる。

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シアノバクテリアの多くは、2種類のNiFe型ヒドロゲナーゼ（取込み型ヒドロゲナーゼHupおよび双方向型ヒドロゲナーゼHox）を持っており、それらの活性中心はNi-Fe-Sクラスターである。NiFe型ヒドロゲーゼの成熟過程は複雑であり、一連のhyp（Hydrogenase pleiotropy）遺伝子産物による修飾を必要とする。hyp遺伝子産物の中でもHypFはcarbamoyl phosphateからNiFeクラスターに配位するCO、CNリガンドを合成し、成熟過程において中心的役割を担っている。われわれは、これまでに窒素固定型シアノバクテリアAnabaena sp. PCC7120株をもちいた光生物的水素生産の遺伝子工学的改良において、取込み型ヒドロゲナーゼHupの遺伝子破壊が有効であることを示した。本研究では、hypFの破壊も同様に窒素固定型シアノバクテリアによる光生物的水素生産性の向上に有効であるか否かを調べるために、Anabaena sp. PCC7120野生株とΔhupL株よりΔhypFおよび ΔhypF/ΔhupLを作製した。これら破壊株は野生株にくらべ5～8倍の水素生産効率を示した。この水素生産効率はΔhupL株と同程度である。これらの結果より、Anabaena sp. PCC7120株においてhypF破壊もニトロゲナーゼに基づく水素生産性の向上に有効であることが示された。

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種子を水平に置き発芽させたキュウリの芽ばえは、ペグと呼ばれる突起状組織を胚軸と根の境界 (Transition; TR) 領域の下側に形成する。われわれは、TR領域の上側の細胞が重力刺激に応答して、ペグ形成を誘導するオーキシンを排出することにより、ペグ形成を抑制すること示唆してきた。この分子機構を明らかにするため、本研究では、これまでに単離したCsPIN1 cDNAに加え、新たに5種のオーキシン排出キャリア遺伝子 (CsPIN2～6) cDNA をキュウリより単離し、これらの発現をNorthern hybridizationとin situ hybridizationにより解析した。その結果、発現の組織特異性から、キュウリのオーキシン排出キャリア遺伝子は、維管束とその周辺の組織で発現するCsPIN1～4、根の表皮・皮層で発現するCsPIN5、根の重力感受細胞であるコルメラ細胞で発現するCsPIN6の3つのカテゴリーに分類された。CsPIN1とCsPIN3～6はペグ形成時のTR領域においても発現が認められることから、今後、これらに注目して解析することにより、重力によるペグ形成面の制御を担うオーキシン輸送制御機構が明らかになるものと期待される。

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水平に発芽させたキュウリ芽ばえは発芽直後、根と胚軸の境界領域の下側面にペグと呼ばれる突起状の組織を形成する。これまでに我々は、オーキシンがペグ形成を誘導すること、および、重力に応答して境界領域で偏差的に分布したオーキシンがオーキシン誘導性遺伝子の偏差的発現を引き起こすことを示してきた。更に、ペグ形成におけるオーキシン誘導性遺伝子の転写を制御しうる因子としてCsARFとCsIAAに着目し、それらの遺伝子の発現解析から、CsARF2が、ペグ形成開始前ならびに開始初期にCsIAA1、CsIAA2と同じ組織で発現することを見いだした。そして、CsARF2がペグ形成に関わるオーキシン誘導性遺伝子の転写の活性化に関与し、オーキシン誘導性遺伝子の転写の活性化にはCsARF2とCsIAAの共発現が重要であると推測された。本研究では、プロトプラストを用いたトランジェントアッセイにより、CsARFならびにCsIAAのオーキシンによる転写制御における役割を検討した。その結果、CsARF2をエフェクターとして導入した処理区では、オーキシン誘導性プロモーターであるDR5の転写活性が増大し、CsARF2がアクチベーターとして機能することが示された。その他のCsARFならびにCsIAAの転写活性の結果を含めて、ペグ形成時のオーキシン誘導性遺伝子の偏差的な転写制御機構について考察する。

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我々は重力屈性の分子機構の理解を目指し、シロイヌナズナの花茎重力屈性変異体の解析を進めている。これまでに、地上部においては内皮細胞が重力感受を担い、この細胞に存在するデンプンを蓄積した色素体であるアミロプラストが重力方向に沈降することが重力感受に重要であることを示した。花茎の重力屈性能が低下した劣性変異体　sgr6 (shoot gravitropism 6) は正常なアミロプラストの沈降および光屈性を示す。SGR6は1703アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、予想される機能ドメインは蛋白質間相互作用に機能するとされる2カ所のHEAT repeatのみで、全体的にα-helixに富む。内皮細胞特異的なSCR プロモーターを用いてsgr6-1 変異体内でSGR6 を発現させたところ、重力屈性能の回復が見られた。これらの結果は、未知の機能を持つ新規タンパク質SGR6が、内皮細胞内における重力感受あるいはその後比較的早く起こるシグナル伝達に関与する可能性を示唆している。現在、この新規タンパク質の機能解析を進めている。

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植物は根や花茎や胚軸において、重力屈性や光屈性など外部の刺激に対する応答反応を示すことが知られているが、葉については十分な知見がない。私達はこれまでの解析から、植物体を正立状態で暗所に置くと葉が立ち上がり、上下逆の状態で暗所に置くと葉が反り返るという葉の重力応答を明らかにしてきた。また、5波長の単色光（450,520,630,670,730nm）を正立状態の葉に照射すると、赤色光（630,670nm）でのみ葉の立ち上がりが見られないことから、葉の重力応答は赤色光によって制御されている可能性が考えられた。　
　そこで、連続白色光下で育てたシロイヌナズナを用いて、白色光、赤色光（660nm）、暗所下での各光条件と、正立状態及び上下逆の状態との組み合わせで9時間静置し、その前後のロゼット葉（第1、2葉）の角度を測定し比較した。その結果、全ての光条件において上下逆の状態での葉の反り返り運動（重力応答）が認められたが、赤色光下の場合、正立状態での立ち上がりは見られなかった。これらの結果から、葉の動きは重力依存的な動きと、非依存的な動きとの足し合わせであることが示唆された。すなわち、赤色光は重力に応答した動きを制御しているのではなく、重力に非依存的な動きの抑制に関与していると考えられる。現在、葉の動きの変異体を単離し解析を行っているので、その結果についても報告する。

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イネ登熟期の高温は乳白米などのデンプン蓄積に関する登熟障害を引き起こす。我々は、この高温登熟障害の発生メカニズムの解明を目的として研究を進めている。今回は、6種類のイネ品種について、登熟期の高温処理による高温登熟障害の発生割合並びにα-アミラーゼおよびADP-Glucose分解酵素NPPaseの活性変動、タンパク発現変動、タンパクの酸化状態の変化を比較検討した結果について報告する。α-アミラーゼとNPPaseは比較的熱に強く、高温下においてデンプン蓄積に影響を与える可能性がある。開花後4,11,13日目でα-アミラーゼとNPPaseの酵素活性を比較したところ、高温登熟障害の発生割合が高い品種ほど活性が高いことが分かった。1次元 (SDS-PAGE) および2次元 (Reverse-IEF, SDS-PAGE) 電気泳動法でタンパク質を分離し、MALDI-TOF-MSを用いて網羅的に発現タンパク質を同定したところ、解糖系、活性酸素消去系、シャペロニンなどの発現が高温の影響を受けることが分かった。さらに、タンパクのカルボニル基に結合するビオチン誘導体biotinhydrazideを用いてタンパクの酸化状態を解析した結果、高温登熟障害の発生割合の高い品種では高温処理によって品種特異的にタンパク質が酸化されることが見いだされた。高温登熟障害の発生メカニズムに関与する要因について議論したい。

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分子シャペロンDnaJは、DnaKのパートナーとして主に蛋白質のフォールディングに関与している事が知られている。シアノバクテリアSynechococcus sp. PCC7942株では、DnaJは4つのホモログ (dnaJ1,J2,J3,J4) 、DnaKは3つのホモログ (dnaK1, K2, K3 ) が存在している。その中でdnaJ3(syc1531) はdnaK3(syc1530) とオペロンを形成しており、ともに必須遺伝子である。また、その両方がチラコイド膜に比較的多く表在している事を当研究室で見出している。この事から、DnaJ3とDnaK3はチラコイド膜に関連した特異的な機能を持つ事が示唆された。我々はこのDnaJ3蛋白質の機能的特異性を探るため、変異解析を行った。
まず、制限温度である42℃で生育できない温度感受性変異株として、193番目のPheがLeuに置換したF193L株を取得した。この温度感受性変異株から、複数の抑圧変異株を得る事ができ、このうち2株についてはRbp2 (syc2097) とPNPase (syc1666) に抑圧変異がマップされた。F193L株では、制限温度下でのdnaJ3のmRNAの蓄積やDnaJ3蛋白質量が変化しており、この変化が抑圧変異株では回復していた。これらの事を遺伝学的解析の結果と併せて、DnaJ3の必須機能及び抑圧変異の効果について考察する。

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ラン藻にはRRMタイプのRNA結合ドメインを1つもつRNA結合タンパク質(Rbp)ファミリーが存在している。Rbpは低温で蓄積すること、また細菌に普遍的に存在するCold Shock Protein (Csp)ファミリーをラン藻はもたないことから、RbpがCspに相当すると考えている。我々は単細胞性ラン藻Synechococcus PCC6301株から単離した2種類のrbp遺伝子（rbp1、rbp2）の発現と機能の解析を行い、rbp1は低温誘導性で低温下での生育に必須であることをこれまでに明らかにした。Synechococcus PCC6301の全ゲノム解析の結果、rbp3を見い出した。Rbp3タンパク質は142残基、Rbp1（107残基）とRbp2（99残基）よりもC末端領域が長い。3種のrbp遺伝子の発現制御の分子機構を明らかにするため、rbp遺伝子のプロモーター領域とバクテリアルシフェラーゼ遺伝子（luxAB）を融合させたレポーター株を作製した。rbp1とrbp3は低温下で発現誘導されるが、rbp2は誘導されないことを明らかにした。しかし、ノーザン解析の結果では低温下で発現誘導されるのはrbp1のみであった。また3種のrbp遺伝子発現は暗所で抑制されることを明らかにした。さらに、rbp1遺伝子の低温条件下における詳細な発現機構をレポーター解析で行ったのでその結果も報告する。

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イネの穂ばらみ期、とりわけ小胞子初期の冷温による花粉の発育障害は、東北日本において産業的にも非常に深刻なイネの冷害をもたらす。小胞子初期から小胞子中期にかけて、冷温に応答して、ジャスモン酸生合成遺伝子OPDAR1 (12-oxo-phytodienoic acid reductase 1)とタンパク質分解酵素に類似のドメインを持つ機能未知遺伝子Radc1 (Rice anther down-regulated by cool temperature 1) が顕著に発現レベルを低下させること、逆に、ポリアミン生合成遺伝子SAMDC1 (S-adenosylmethionine decarboxylase 1)が顕著に発現レベルを上昇させることが見いだされた。これら3つのイネ葯冷温ストレス応答遺伝子について、遺伝子のプロモーター配列（5'上流域およそ2 kbp）にレポーター遺伝子GUSを連結したコンストラクトをイネに導入し、遺伝子の葯における発現様式を確認した。本発表では、これらのイネ葯冷温ストレス応答遺伝子及び、ジャスモン酸、ポリアミンが冷温下の花粉形成機能の維持あるいは花粉発育障害発生機構において果たしている役割について考察する。

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植物のポリアミン含量と環境ストレスとの関連についてはすでに多くの報告がある。我々は独自に、発芽7日目のイネ幼苗（ゆきひかり）に対して、低温、塩、乾燥、浸透圧、冠水などの環境ストレス処理、並びにABA、ethephonなどの植物ホルモン処理を行い、ポリアミン含量の変化をHPLCを用いて調べた。その結果、環境ストレスの中では低温及び冠水によって、ポリアミンの一種プトレシンの含量が顕著に増加することを突き止めた。また、植物ホルモン処理では、ABAによってプトレシン含量が著しく上昇することが分かった。プトレシンの生合成には、アルギニン脱炭酸酵素（ADC）あるいはオルニチン脱炭酸酵素（ODC）が関与することはよく知られている。我々は、環境ストレスで誘導されるプトレシンの蓄積に関与する遺伝子を特定するため、RT－PCR法によってイネのADC遺伝子及び ODC遺伝子を単離し、その非翻訳領域を利用して作製した遺伝子特異的プローブを用いて発現解析を行った。その結果、ADC遺伝子は低温によってその発現が特異的に増大することが判明した。一方ODC遺伝子は冠水及びABA処理に対して応答し、その発現量が増加することが分かった。以上の結果から、イネ幼苗の低温ストレス処理によるプトレシン含量の増加においてはADC遺伝子が、冠水ストレスやABA処理によるプトレシン含量の増大ではODC遺伝子が、それぞれ主要な役割を果たすことがはじめて明らかになった。

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Freezing temperatures are major factors limiting the geographical locations suitable for growing crops, and periodically account for significant losses in plant productivity. In order to identify rice stress-inducible genes, recently transcriptome analysis was conducted and a number of genes were identified to have high expression level in response to various abiotic stresses, including cold stress. To identify a novel cis-acting element that function in cold stress-response in rice, we performed promoter analysis using promoter regions of five cold stress-inducible genes identified by rice microarray analysis. These promoter regions were fused to the GUS reporter gene and introduced into rice. We analysed these transgenic plants and identified a novel cis-acting element for cold-stress-response gene expression in rice. We found this element in the all five promoter regions. To assess the frequency of occurence of this sequence a homology search within the promoter regions of rice cold-stress inducible genes was conducted.

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Rice is a typical chilling sensitive plant. Cell suspension cultures of rice also suffer injuries at chilling temperatures. However, we found out that exogenous application of ABA at 25C induces freezing tolerance in rice cell cultures as well as in rice seedlings. We found more than 80 CBB-stainable proteins were newly expressed or increased in ABA treated cells using 2D electrophoresis. One of them was RAB24, thiol antioxidant. We cloned a homologue of RAB24 from bromegrass cells which increased freezing tolerance more drastically by exogenous ABA. We introduced the bromegrass RAB24 into rice plants using agrobacterium transformation. We determined physiological and morphological traits of the transgenic lines including some stress tolerance

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　越冬植物は、気温が低下するにつれて徐々に耐凍性を獲得（低温馴化）する。低温馴化の過程で多くの遺伝子が発現することがマイクロアレイなどの研究から明らかになりつつある。ブロムグラス培養細胞（Bromus inermis Leyss）は、低温処理やアブシジン酸（ABA）処理により高い耐凍性を獲得する。我々はブロムグラスの耐凍性機構を解明するために、低温処理やABA処理による遺伝子群の発現変化について解析している。前回大会では、低温で発現が上昇するキチナーゼ遺伝子（BiCHT1）について大腸菌の発現系を用いた活性の測定結果を報告した。
　今大会ではBiCHT1の様々な環境ストレス下での遺伝子発現について報告する。また、遺伝子産物の機能をさらに解析するために、BiCHT1遺伝子を過剰発現する形質転換細胞を解析した結果について報告する。

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低温ショックドメイン(CSD)タンパク質は大腸菌から高等動植物にまで広範囲に見出される．CSDタンパク質はCSDを介した核酸結合活性を持ち，翻訳または転写レベルでタンパク質発現を調節すると考えられる．大腸菌の低温ショックタンパク質(Csp)はRNAの安定高次構造を解除するRNAシャペロンとして機能する．コムギのCSDタンパク質WCSP1は低温処理により，mRNA，タンパク質レベルで蓄積し，核酸結合活性を持つ．大腸菌中ではE. coli csp変異を相補し，RNAシャペロン活性を示す．今回，分子 beaconシステムを用いた試験管内系を用いて，RNAシャペロン機能に必要な核酸融解活性の検出を行った．その結果，WCSP1はATP非依存的に，DNA二本鎖を一本鎖に解離する核酸融解活性を示した．試験管内系においてもWCSP1が低温時のRNAがとる安定高次構造を解除するRNAシャペロンとして機能することが示唆された．更に，WCSP1タンパク質のRNA結合モチーフの変異タンパク質を用いて核酸に対する結合，核酸融解活性を解析したところ，変異タンパク質は両活性ともに消失し，RNA結合モチーフがWCSP1の機能に必須であることが示された．WCSP1の細胞内局在性の解析結果についても併せて報告する

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　秋播きコムギは、高度な低温適応(cold acclimation)機構を有し、一般に10℃以下の低温環境に持続的にさらされることにより、耐凍性を獲得する。そこで、低温適応によって再構築された遺伝子発現パターンを網羅的に明らかとするために、マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を行った。
　高度耐凍性品種.Valuevskayaを供試材料とし、低温・短日処理(2/0.5℃, 400μmolm^-2s^-1, 10h日長)を7週間行い、低温適応期間中に展開した第5葉よりtotal RNAを抽出した。コントロールとして、常温で生育させた同一ステージの葉を用いた。22kコムギオリゴマイクロアレイ(21,939プローブ)を用い、Cy3及び Cy5ラベルによる2色法によりハイブリダイズを行った。解析対象とした15,679遺伝子中、発現量の比が2倍以上(P<0.01)と認められたものは2,435遺伝子であり、全体の15.5％の遺伝子発現が長期の低温適応の結果変動していることが明らかとなった。また、低温適応性が極めて低い春播き品種.ハルユタカについても同様の処理を行い、比較解析を行った結果、17,503遺伝子中1,571遺伝子（9.0%）が両品種間で差異を示した。その中に占める低温変動遺伝子数は、900（57.3%）であり、高度耐凍性の獲得・維持に関与する遺伝子発現が含まれると考えられた。

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Plants respond and adapt to abiotic stress to survive under stress conditions. Many genes that respond to drought and cold stress at transcriptional level have been described, but there are few reports on genes involved in the recovery process from abiotic stress. We have analyzed gene expression profiles of Arabidopsis in the process of dehydration stress and rehydration from dehydration stress using a 7k RAFL-cDNA microarray (Oono et al. 2003, Plant J). In this study, we analyzed gene expression profiles in the process of cold acclimation and deacclimation using the 7k RAFL-cDNA microarray and an Agilent 22k oligonucleotide array (submitted) and are studying functional analysis of several genes.
We analysed relationship between gene expression profiles and metabolic profiles in cold acclimation and deacclimation. We discuss roles of key genes involved in the biosynthesis of carbohydrates such as raffinose and maltose, and proline that have important roles in cold acclimation.

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植物の低温馴化は、シロイヌナズナ植物体を用いて多くの現象解明がなされている。しかし、植物体が複雑な構造を持つため、低温馴化機構で最も重要な変化を解析する事が困難な場合がある。そこで、我々は、シロイヌナズナ懸濁培養細胞を用いて細胞レベルで解析を行い、低温馴化素過程を解析する事を目的として研究を行っている。これまでの解析から、本培養細胞は低温馴化を2日行った誘導期の細胞でのみ-6℃から-10℃へ凍結耐性が増大する事が明らかとなった。低温誘導性遺伝子（cor15a、rd29A）の発現量も馴化後1日でピークとなった後2日以降急速に減少し、一過的な発現挙動を示す事も判明した。さらに、細胞内浸透濃度や糖含量は馴化後4～7日に上昇し、凍結耐性とは相関しない事が示された。従って、本培養細胞が示す低温への応答は様々な点で、植物体で知られている応答とは異なっている。以上の解析結果より、低温馴化2日までの凍結耐性の増大は細胞レベルにおける応答が、2日以降に植物体で見られる増大は植物体レベルでの応答が必要である、という仮説を立てた。この仮説の検証に向け、マイクロアレイを用いて低温馴化過程で変動する遺伝子を網羅的に解析した結果、培養細胞の凍結耐性変動と相関した挙動を示す遺伝子をいくつか確認した。現在、仮説検証に向け、プロテオーム解析を行いマイクロアレイ解析の結果と比較する事を試みている。

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筆者らはこれまで、低温馴化中に量的変化を伴う多数のシロイヌナズナ細胞膜タンパクを同定してきた(Kawamura　and　Uemura, 2003)。その中でも低温馴化初期に著しく増加するsynaptotagmin様タンパク質は、膜融合による細胞膜修復に深く関与する細胞膜タンパク質であることが知られている。動物細胞のみではあるが、これまで細胞膜損傷とその細胞膜修復機構について、盛んに研究が行われてきた。細胞膜修復には必ず細胞外にカルシウムが必要であり、また壊れた細胞膜を修復するために内膜小胞が使用される。さらに、細胞膜と小胞が融合するためにはSNAREsとsynaptotagmin familyが少なくとも必要であることも示されている。これまでの植物凍結傷害の研究では、細胞膜の傷害回避機構の観点からは研究されてきたが、細胞膜修復という観点からは全く報告がなかった。しかし動物分野での研究を考慮すると、凍結傷害による細胞膜損傷が迅速に修復されれば、生存可能であることは十分に予想される。シロイヌナズナ葉より単離したプロトプラストを用いて、凍結時において細胞外からカルシウムを取り除いて耐凍性試験を行ったところ、その凍結耐性は著しく低下した。従って、植物細胞の凍結耐性は、少なくとも細胞外カルシウムに大きく依存すると考えられる。（本研究は日本学術振興会の援助の下に行われた）

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我々は、酸性雪が越冬性植物に及ぼす影響を調べるため、冬小麦(Triticum aestivum L. cv. Chihokukomugi)緑葉の組織切片を用いて酸性条件下で耐凍性試験を行い、酸性雪ストレスによる越冬性植物の傷害発生機構の解析を進めてきた。これまでに冬小麦の緑葉を硫酸溶液(pH 2.0)の存在下で細胞外凍結させると融解後の生存率が著しく低下することを明らかにした。本研究では、気温の寒暖差の大きい初冬や初春に酸性融雪水中で植物が凍結融解される影響を見積もるため、冬小麦緑葉の切片を純水または硫酸溶液の存在下で平衡凍結融解を繰り返し行った。すると、硫酸溶液共存下では凍結融解を繰り返す度毎に緑葉の生存率は徐々に低下し、純水で処理したものに比べてより生存率が低下した。次に、冬小麦緑葉組織の凍結融解過程のどの段階で酸性化すると生存率が低下するかを調べるために、硫酸溶液を添加する時期を植氷前、融解時、融解後にそれぞれ設定して耐凍性試験を行い、緑葉組織の生存率への影響について評価した。その結果、細胞外凍結した冬小麦の緑葉組織では、融解時に酸性物質が存在することが傷害発生を助長させる要因となりうることが予想された。

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植物の病害防御機構の一つである全身獲得抵抗性(SAR)は、病原菌感染の刺激が全身へと伝達され、サリチル酸(SA)の蓄積を介して全身に誘導される。SARの誘導に及ぼす環境ストレスの影響を調べた結果、シロイヌナズナにおいて、SAR誘導経路上のSAの上流に作用する化合物BITおよびSAの下流に作用するBTHによるSARの誘導をABAが抑制することが明らかになった。したがって、ABAがSARの誘導経路上のSAの上流と下流の両方に作用しSARを抑制することが示された。次に、SAR誘導時のABA関連遺伝子の発現を定量的RT-PCRで解析した。BIT、BTH処理によりSARを誘導した場合には、一部のABA生合成遺伝子とABA応答性遺伝子の発現が抑制された。逆に、環境ストレス処理はSARマーカー遺伝子 (PR-1)の発現を抑制した。また、内生ABA量の少ないaao3突然変異株とABAの代謝酵素CYP707Aの過剰発現株では、BITのSAR誘導効果が増大していた。これらの結果により、ABAを介する環境ストレス応答とSARの間に新たなクロストークが存在することが明らかになった。

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ジャガイモ塊茎組織に疫病菌非親和性レース接種またはエリシター処理を施すと，1および9時間後をピークとするオキシダティブバーストが誘導される．このオキシダティブバーストには，植物のNADPH酸化酵素である rboh (respiratory burst oxidase homolog) が中心的役割を担っていると考えられている．ジャガイモ塊茎より抽出した原形質膜画分において活性酸素生成活性が認められることから，活性酸素生成酵素は原形質膜に局在すると考えられてきた．しかしながら，rbohの局在性を明確に報告した例はない．今回，ジャガイモのStrbohAおよびStrbohBに特異的な抗体を作製し，それぞれの局在性を調べたので報告する．ショ糖密度勾配遠心分離法によりジャガイモ塊茎ミクロソーム画分を分画し，免疫ブロット解析を行ったところ，StrbohA，StrbohB両タンパク質ともに原形質膜水チャネルと同じ分布様式を示した．さらに，NADPH依存性の活性酸素生成活性もまたStrbohと同じ分布様相を示し，その活性は好中球NADPH酸化酵素の阻害剤であるDPIにより顕著に抑制された．これらの結果から，StrbohAおよびStrbohBは原形質膜に局在し，オキシダティブバーストを制御することが示唆された．

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植物の免疫活性化は、防御関連遺伝子の発現のみならず細胞死を伴うことがある。この細胞死には、病原体の全身感染を抑制する働きがあり戦略的細胞死と考えられる。植物免疫機構全容解明のため、恒常的な細胞死形質を示すcad1（constitutively activated cell death 1）変異体を単離した。この変異体では、細胞死形質のみならず恒常的なPR (Pathogenesis related) 遺伝子の発現や植物免疫活性化に関わるサリチル酸の蓄積が観察された。また、実際にPseudomonas syringae pv tomato DC3000に対する抵抗性を獲得していることが示され、cad1変異体では、恒常的に植物免疫機構が活性化していることが明らかとなった。遺伝子単離の結果、この原因遺伝子CAD1は、動物の自然免疫で機能する補体やパーフォリンに見られるMACPF（Membrane attack complex and perforin）ドメインを含む新規タンパク質をコードしていた。遺伝学的な解析により、このCAD1遺伝子は、植物免疫活性化機構において、SAに依存したプログラム細胞死経路を制御することが示され、CAD1遺伝子は、植物免疫機構を負に制御する新規因子であると結論した。

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　病原菌の感染やエリシター処理によって誘導される防御応答において、抗菌タンパク質や抗菌性物質生合成系酵素などの直接抵抗性に関わる遺伝子に加え、シグナル伝達に関わる多くの遺伝子も発現が誘導されることが明らかになってきている。こうした知見をもとに、キチンオリゴ糖エリシター処理によってイネ培養細胞で発現が誘導される遺伝子をマイクロアレイにより解析したところ、細胞外ドメインにPRタンパク質の一種と相同性の高い構造をもつ受容体キナーゼをコードする遺伝子が見出された。本研究ではこの遺伝子の発現制御、コードするタンパク質の生化学的特性、防御応答における役割の解析を目的として実験を行った。
　本遺伝子はキチンオリゴ糖の構造・サイズに依存して発現が誘導された。また、タンパク合成阻害剤単独処理でも発現誘導が認められた。一方、タンパクキナーゼやホスファターゼ阻害剤、DPIなどでは影響を受けなかった。本遺伝子がコードするタンパク質はイネ培養細胞原形質膜に存在することが確認され、また、細胞内ドメインをGST融合体として発現させたものは強い自己リン酸化能を示した。キナーゼの活性中心と予測されるアミノ酸に変異を導入したものでは、自己リン酸化能はほとんど消失した。現在、RNAiによるノックダウンや過剰発現体の作出およびリガンドの探索を進めている。

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　Alternaria alternata 102よりタバコBY-2細胞に対して活性を示す糖質性エリシターを単離し、その部分構造が1,3-1,6-グルカンであることを昨年の年会で報告した。今回、詳細な構造の解析として、還元末端分析、NMRによるグリコシド結合様式の解析、およびMALDI-TOF/MSによる質量分析を行なった。その結果、本エリシター活性成分は、重合度8から17を主とするβ-1,3-1,6-グルカンオリゴ糖の混合物であることが明らかとなった。
　BY-2細胞において、グルカンエリシターによって誘導されるクラスIVキチナーゼは、SAおよびMeJA処理では誘導されない。そこで、エリシター応答シグナリングの解析を目的とし、マイクロアレイ解析によるグルカンエリシター応答遺伝子群の解析を行った。ラミナリン（β-1,3-グルカン）またはA. alternata培養上清より得られたβ-1,3-1,6-グルカンエリシターを含む糖質画分でBY-2を処理したところ、初期応答（1h）における、約300のグルカンエリシター誘導遺伝子群が認められた。この中で転写因子と推定される15遺伝子に着目し、2,4-D、ABA、BA、MeJA および SA初期応答遺伝子群のマイクロアレイ解析結果と比較したところ、グルカンエリシターに特異的に応答する14遺伝子を見出した。

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　病害抵抗性の解析における新たな実験系の構築を目的として，イネ培養細胞(Oryza sativa L. cv Nipponbare)に，親和性もしくは非親和性レースのいもち病菌(Magnaporthe grisea)胞子懸濁原液を直接接種し，イネ細胞から生成される活性酸素の消長，接種による遺伝子誘導，細胞死などについて両者に差異があるかを解析した．その結果，遺伝子誘導，細胞死については有意な差は認められなかったが，活性酸素については，非親和性胞子接種時の活性酸素レベルは，親和性胞子の接種時に比べ有意に高かった．しかし，遠心によって洗浄した胞子を接種すると，親和性胞子も非親和性胞子と同等の高レベルの活性酸素生成を誘導した．一方，親和性，非親和性いずれの胞子懸濁液由来の上清も過酸化水素を急速に消去した．100℃5分間の熱処理によってこの消去能がなくなることから，上清画分には，非親和性，親和性にかかわらず活性酸素を消去する酵素が含まれており，この酵素はイネ細胞といもち病菌が抵抗性になる組み合わせの時にイネによって産生される何らかの因子によって働きが阻害され活性酸素レベルが上がるというきわめて興味深い相互作用の機構が存在していることが示唆された．

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ジャスモン酸（JA）は植物の病傷害抵抗性を誘導する重要なシグナル物質である。JAはアレンオキシド合成酵素（AOS）、アレンオキシド環化酵素（AOC）、オキソフィトジエン酸還元酵素（OPR）を介するオクタデカノイド経路で合成される。本研究では、これらのオクタデカノイド経路に関わる酵素をコードすると考えられる遺伝子 (OsAOS, OsAOC, OsOPR1, OsOPR3) の発現を、RNAi法により抑制したイネ形質転換系統を作成した。OsAOS の発現を抑制した系統におけるJA含量は野生株の約62%まで低下していた。また、OsAOC の発現を抑制した系統では、JAは検出できないまで低下していた。一方、OsOPR1、OsOPR3 両遺伝子の発現を抑制した系統におけるJA含量は野生株の約3%まで低下していた。これらの系統は、植物の病傷害抵抗性反応におけるオクタデカノイド経路中間物質の役割を調べる上で有用だと考えられる。

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水生シダ，アカウキクサの葉の内腔（キャビティ）にはランソウが共生している．共生ランソウは空気中の窒素を固定しアンモニアの形で植物に供給，一方，植物はランソウが放出したアンモニアをGS/GOGATによって取り込むと考えられている．アカウキクサ キャビティにはhair cellと呼ばれる植物由来の細胞が突出しており，その形態的な特徴からアンモニアの取り込みに関与していると考えられているが直接的な証拠はない．本研究では，アカウキクサにおけるGSの局在を免疫電顕の手法を用いて調べることによって，ランソウが固定放出したアンモニアがどの様にしてアカウキクサに取り込まれるのか？　hair cellがどの様な役割を果たしているかを明らかにしようと試みた．結果は以下の通りであった．アカウキクサ葉肉細胞では，GSはそのほとんどがクロロプラストに認められ，細胞質にはほとんど認められなかった．一方，hair cellでは，クロロプラストだけでなく細胞質にも大量のGSが認められた．ランソウフリーのアカウキクサを作成し同様に調べたところ，葉肉細胞ではランソウを含むアカウキクサと差異は認められなかったが， hair cell ではクロロプラスト，細胞質ともに，ランソウを含むアカウキクサと比較して，著しく金粒子が少なかった．結果からアンモニアは，hair cell（恐らくhair cell細胞質GS）を介して取り込まれると推察された．

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　植物は病原菌や昆虫による病傷害ストレスを受けたとき、さまざまなシグナル伝達経路を介して抵抗性を獲得する。イネにおいて、ジャスモン酸（JA）は病傷害抵抗性の誘導に必要なシグナル物質の一つと考えられている。イネの抵抗性反応におけるJAの役割を明らかにするため、JA合成の出発物質であるリノレン酸（LA）合成酵素（葉緑体局在型ω-3デサチュラーゼ）の遺伝子（FAD7-1、FAD7-2）の発現をRNAi法により抑制させ、JAが欠損した形質転換イネを作製した。脂肪酸組成を調べた結果、野生株では60%以上あるLA含量が8%にまで低下した形質転換イネ（F7Ri）が得られた。さらに、傷処理によるJAの蓄積も野生株の10%にまで抑制されていた。傷害およびJA誘導性であるJAMyb遺伝子と、傷害のみで誘導されるOsMAPK5遺伝子を指標に、JAを介した傷害シグナル経路を調べた結果、F7Ri系統においては、OsMAPK5遺伝子の転写量は野生株と変わらなかったが、JAmyb遺伝子の転写量の蓄積は野生株よりも抑制されていた。これらの結果からF7RiにおけるJAシグナル経路は、充分に抑制されていることがわかった。現在、F7Riのいもち病菌に対する抵抗性についても調べており、その結果もあわせて報告する。

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To establish an efficient, high-throughput screening/evaluation method for mutants for defense signaling in A. thaliana, we first studied the ROS generation induced by chitin oligosaccharide elicitor in Arabidopsis. By using 96-well microtiter plates and young seedlings, we could analyze the ROS generation quite efficiently on a single plant base and also recover the plants for further cultivation and analyses. Chitin oligosaccharide elicitors induced ROS generation in a size and dose dependent manner as similar to those observed in cultured rice cells. Interestingly, ROS generation was mostly confined in the roots of the seedlings, whereas the expression of typical defense genes were observed in both roots and leaves of the chitin-treated seedlings. Pharamacological studies indicated the involvement of protein phosphorylation and NADPH-oxidase in the ROS generation. The advantage of the experimental system for dissecting plant defence signaling and screening of new mutants for chitin responsiveness will be discussed.

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マメ科植物において根粒形成の初期段階から発現する遺伝子をENOD（early nodulin）と呼ぶ。ENOD40はその一つであり、現在ではマメ科以外にもタバコやイネなどの非マメ科植物に広く存在していることがわかっているものの、その機能は未だに解明されていない。我々はミヤコグサ（Lotus japonicus）のENOD40について研究する過程でENOD40のアンチセンスRNA（asENOD40）の存在を示唆するデータを得た。そこで、Real Time RT-PCRを用いてasENOD40の発現量について調べた。その結果、asENOD40はセンスRNA（sENOD40）と比べ発現量は極めて少ないものの、根粒において発現量が上昇していることがわかった。また、根粒においてin situハイブリダイゼーションを行った結果、sENOD40は根粒維管束で強いシグナルが得られたのに対し、asENOD40は感染領域においてシグナルが得られており、この2つのRNAの局在は異なることがわかった。近年、真核生物において多くの内生のアンチセンスRNAが存在することが予測されており、アンチセンスRNAの発現動態やその機能について興味が持たれる。

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ミヤコグサ（Lotus japonicus）はマメ科のモデル植物として、盛んに形質転換が行われている。しかし、発現プロモーターとして一般的に用いられているCaMV35Sプロモーター（35S-P）はプロモーター活性が全体的に弱いことが示唆されていた。我々は新規発現プロモーター候補として、ミヤコグサのポリユビキチン遺伝子領域をクローニングした。ポリユビキチン遺伝子のORF直前にはイントロンが存在し、この構造は他の多くの植物種でも保存されていた。イネやシロイヌナズナの形質転換系ではイントロンの存在により、ポリユビキチンプロモーター（Pubi-P）の活性が増大することが知られていたので、Pubi-Pおよびイントロンを含むPubi-Pをβ-glucuronidase（GUS）遺伝子に結合した発現ベクターを作成した。毛状根形質転換法により、Pubi-Pの500 bp以内に発現に必要なcis配列が存在することが分かった。また、イントロンによるPubi-Pのプロモーター活性の増大は認められなかったが、Pubi-Pは35S-Pの約2倍の活性を示した。Agrobacterium tumefaciensを用いた形質転換では、T₀世代において、特に地上部でPubi-Pが35S-Pに対して高いGUS活性を示すことを確認している。

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マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定は、相互の複雑なシグナルのやり取りによって成立する。ミヤコグサはマメ科のモデルとしてゲノム解析が進行中であり、その情報を利用して根粒菌からのシグナル受容や根粒形成初期のシグナル伝達の鍵となるいくつかの遺伝子が単離されている。これらの成果は根粒形成と共生窒素固定の成立のメカニズムを明らかにする上で我々の理解を助けたが、この複雑な過程にはより多くの遺伝子が関わっていることが予想される。我々は、根粒形成時に発現量が変動する遺伝子を網羅的に探索することを目的として、serial analysis of gene expression (SAGE)法を用いて非感染根と根粒原基の比較を行った。この結果、根粒形成に伴って発現量が増加する転写因子を8種類見いだした。更に、河内らによるcDNAアレイを用いた解析[Kouchi et al. (2004) DNA Res. 11:263-274]により、根粒形成初期から窒素固定能を持つ後期の根粒で発現が誘導される14種類の転写因子が同定された。これらの転写因子の根粒形成における役割を明らかにするため、我々は毛状根形質転換系を用いた機能解析に着手したので、その経過と結果について報告する。

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マメ科モデル植物ミヤコグサから単離された共生変異系統crinkle（crk）は、感染糸の伸長が表皮細胞と皮層細胞最外層との境界で阻害され、有効根粒を形成しないHist-変異体である。またトライコームが縮れている、根毛基部が膨れる、莢が短いなどの多形質表現型も観察される。さらにcrkでは、未熟莢における未受精胚の分布割合が柱頭に対して遠位に位置するほど高くなり、花粉の発芽と花粉管伸長が阻害されていた。また、相互交配検定の結果から雄性配偶子に異常があることが明らかとなり、組織学的な解析から雄性配偶子の発達に異常をきたすことが判明した。したがってこの変異系統の原因遺伝子は、根粒形成のみならず植物発生に見られる極性伸長に深い関わりのあることが示唆された。現在この遺伝子の同定を行っている。ラフマッピングの結果、crk遺伝子は第5連鎖群に座乗していた。さらに、近傍分子マーカーを基点に作成されたBAC/TACコンティグについて、F2集団838個体における遺伝型解析からcrk座乗領域を約500kbにまで絞り込んだ。今回の発表ではcrk領域のマッピングデータを紹介する。

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トマトのTm-1はトマトモザイクウイルス（ToMV）の増殖を，過敏感細胞死を誘起せずに一細胞内で抑制するユニークな半優性の抵抗性遺伝子である．Tm-1は耕作種のトマトにも広く導入されているが，染色体上の組み換え頻度の低い領域に座乗していると考えられ，ポジショナルクローニングが成功していない．我々は，脱液胞化したタバコBY-2プロトプラストの抽出液（BYL）を用いた試験管内ToMV RNA翻訳複製系を確立した（Komoda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1863-1867 [2004]）．そこで，Tm-1トマトの脱液胞化プロトプラスト抽出液をBYLに加えて試験管内ToMV RNA翻訳複製反応を行ったところ， ToMV RNA複製の阻害が観察された．このときToMVの複製タンパク質は正常に蓄積していたことから，Tm-1はToMVの複製タンパク質がRNAを複製する段階を阻害することが示唆された．また，Tm-1活性を液体クロマトグラフィーにより分画し，その特性を調べたので報告する．

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　白葉枯病は東南アジアおよび日本の西南暖地でのイネの主要病害であり，多くの研究が国際的に行われている．白葉枯病に対する病害抵抗性には真性抵抗性と圃場抵抗性があり，真性抵抗性に関する研究では近年2種類の遺伝子( Xa21, Xa1 )が単離されているが，未だ圃場抵抗性に結びつく主要な遺伝子は単離されていない．
　「日本晴」は日本稲の中で白葉枯病に対する圃場抵抗性を持つ品種である．我々は「日本晴」ゲノム内のレトロトランスポゾン Tos17 を増殖させた突然変異集団（ミュータントパネル）に白葉枯病菌を接種することによって，白葉枯病に罹病性である系統を探索した．2年間で3,000系統の突然変異集団をスクリーニングした結果，白葉枯病に罹病性の突然変異体を20系統選抜できた．ゲノミックサザンによる各突然変異個体中の Tos17 の分布及び後世代への白葉枯病罹病性の遺伝を調査することによって，このうち2系統が Tos17 由来の突然変異であることを推定した．これらの白葉枯病罹病性系統からレトロトランスポゾンによって破壊された遺伝子を特定することによって，これまで未知であった白葉枯病圃場抵抗性のメカニズムに関わる新規遺伝子を単離し，その機能を解明することができると考えられる．

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LSD1 (Lesion Simulating Disease 1) is a negative regulator of oxidative stress-induced cell death involved in disease resistance. To clarify the function of LSD1 as a regulatory protein, we are focusing on the protein-protein interaction partners identified by yeast two-hybrid screening. One of those, AtbZIP10 specifically interacts with LSD1. Although AtbZIP10 has a potential NLS, these are co-localized in cytoplasm. However any change of AtbZIP10 distribution was not observed in lsd1. Using split YFP analyses, we could confirm the LSD1-AtbZIP10 interaction in planta. The abolishment of AtbZIP10 partially suppressed the lsd1-induced runaway cell death (lsd1-rcd). On the other hand, AtbZIP10 overexpression induced more lsd1-rcd. Similarly AtbZIP10 overexpressor demonstrated more resistance to both compatible and incompatible Peronospora Parasatica (P.p.), whereas enhanced susceptibility to incompatible P.p. was observed in atbzip10. Taken together, AtbZIP10 would regulate the target genes involved in the programmed cell death at the hypersensitive response in plant disease resistance.

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