3-デオキシアントシアニンはコケ、シダ、植物の限られた種に存在する希なアントシアニン色素である。イワタバコ科植物のシンニンギア（Sinningia cardinalis、ブラジル原産）は花弁に大量の3-デオキシアントシアニン(アピゲニニジン-5グルコシド、ルテオリニジン-5グルコシド)を蓄積することが報告されている。我々はシンニンギア花弁から3-デオキシアントシアニジンに対する配糖化酵素（遺伝子）を単離し、解析を進めている。UGT88ファミリーをターゲットとしたデジェネレートPCRにより、5つの候補遺伝子(ScUGT1～5)を単離した。系統樹解析及び発現解析により、3つの遺伝子に絞り込むことができた。さらに、無細胞翻訳系による組換えタンパク質を用いた酵素活性解析から、ScUGT5において3-デオキシアントシアニジンの5位の配糖化活性を有することが確認された。大腸菌で発現させたHisタグ融合タンパク質を用いてScUGT5酵素諸性質の解析を行った。ScUGT5はUDP-グルコース存在下で3-デオキシアントシアニジンに対する配糖化活性を示したが、3-ヒドロキシアントシアニジンやフラボン、フラボノールなどに対しては活性を示さなかった。また、ScUGT5はアピゲニニジンよりルテオリニジンに対して高い基質特異性を示した。現在、モデル植物を用いて本遺伝子による花色改変を目指して研究を進めている。

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植物色素やストレス防護物質として機能するフラボノイド化合物は、最も解析の進んでいる植物生産性二次代謝産物の一つである。これまでの知見から、フラボノイドの主要生合成経路は広範な植物種間で保存されていることが分かっている。モデル植物シロイヌナズナでは、アントシアニンやプロアントシアニジンなどのフラボノイドを合成するための一連の酵素遺伝子に加えて、フラボノイドが最終蓄積場所である液胞へ輸送される機構についても解析が進められている。これらフラボノイド輸送因子については、シロイヌナズナの種皮で特異的に蓄積するプロアントシアニジンに関して解析が進められており、プロアントシアニジントランスポーターをコードするTT12、P3A型ATPaseをコードするAHA10、GST様タンパク質をコードするTT19などがこれまでに同定されている。今回、これらのタンパク質がプロアントシアニジンやアントシアニンの蓄積に与える影響について、変異体を用いた遺伝学的解析を行ったのでその結果を中心に報告する。

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植物の亜硝酸還元酵素(NiR)と亜硫酸還元酵素(SiR)は、アミノ酸配列や補欠分子族などの構造的共通点を多くもち、機能的にもよく似た特徴をもつ。両者は基質である亜硝酸と亜硫酸に対する選択性により区別できるが、その差が生じる理由は明らかになっていない。シアニディオシゾンのゲノムには、2個のSiR相同遺伝子(CmSiRA, CmSiRB)が存在するが、NiR相同遺伝子は存在しない。一般的にSiRは弱いNiR活性を持つことに加え、CmSiRB遺伝子はゲノム上で硝酸還元酵素と硝酸トランスポーター遺伝子に挟まれて存在することから、CmSiRBはNiRとして働く有力な候補である。そこで、CmSiRBの組換えタンパク質を作製し、酵素学的特徴を調べた。CmSiRBは亜硝酸に対し比較的高い触媒中心活性を示した。K_m値はラン藻NiRに比べ有意に高く、親和性が低いことが示された。一方、亜硫酸に対して極端に低い触媒中心活性を示した。K_m値は非常に低く、親和性が高いことが示された。この結果から、CmSiRBは一般的なSiRと同様の基質親和性を持ちながら、亜硝酸還元活性が強化され、亜硫酸還元活性が弱められた特殊なSiRと考えられる。

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植物は無機硫黄である硫酸イオンを硫黄源として用いて多様な有機硫黄化合物を合成する硫黄同化系を有する。硫黄同化系の第一反応は、ATPスルフリラーゼによる硫酸イオンのアデノシン5’-ホスホ硫酸への変換である。シロイヌナズナのゲノムにはATPスルフリラーゼをコードする遺伝子が4つ存在する(ATPS1、ATPS2、ATPS3、ATPS4)。野生型シロイヌナズナに各ATPS遺伝子とGFPコード領域をつないだ融合遺伝子を導入したところ、ATPS1、ATPS3およびATPS4はプラスチドに特異的に局在するが、ATPS2は細胞質とプラスチドの両方に局在することが示された。また、各ATPSの遺伝子破壊株の粗抽出液についてATPスルフリラーゼ活性を測定したところ、atps1変異体のATPスルフリラーゼ活性が野生型植物と比較して最も顕著に低下していた。一方、各遺伝子破壊株の細胞質画分におけるATPスルフリラーゼ活性を測定したところ、atps2変異体でのみ顕著に活性が低下した。以上の結果から、シロイヌナズナにおいて硫酸イオンのAPSへの活性化反応はプラスチド局在型のATPS1が主要な役割を担うこと、ATPS2はプラスチドだけでなく細胞質にも局在することで細胞質におけるAPSの供給を担うことが示唆された。

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翻訳開始因子eIF6は真核生物に広く保存されたリボソーム大サブユニット生成に関与する生存に不可欠な因子である。前回、eIF6遺伝子が酵母や動物では1コピーであるのに対して、イネとシロイヌナズナのゲノム上では2コピー（Os-eIF6;1とOs-eIF6;2及びAt-eIF6;1とAt-eIF6;2）存在していること、At-eIF6;1は生存に必須な遺伝子であるがAt-eIF6;2は必須ではないこと、硝酸アンモニウムの添加はOs-eIF6;2の発現のみを選択的にかつ一過的に上昇させたことを報告した。今回、At-eIF6;1遺伝子を含むゲノムDNA断片（転写開始点より上流約0.7 kbの位置から翻訳終止コドンまでの約2.5 kb）を用いてAt-eIF6;1との融合タンパク質としてGUSを発現させることにより、At-eIF6;1遺伝子の発現部位の解析を行った。その結果、At-eIF6;1遺伝子の発現は、発生中の胚、芽生え、雄しべ等、分裂が盛んな部位で強いことが判明した。この結果は、At-eIF6;1が胚発生に必須であることと一致した。現在、異なる発現制御を受けるイネとシロイヌナズナの2コピーのeIF6遺伝子が異なる生理的機能を担っている可能性を検討するため、GST-eIF6融合タンパク質を用いたLC/MS解析により相互作用するタンパク質を検討しており、その結果も合わせて報告する予定である。

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マメ科植物は、根粒を着生して根粒菌と共生する。根粒細胞内部に共生する根粒菌は、大気中の分子状窒素をアンモニアへと固定し、マメ科植物に供給している。窒素固定反応は、大きなエネルギーを必要とする反応であり、根粒菌はマメ科植物から供給される光合成産物を基質とした酸素呼吸により、必要なエネルギーを生み出している。
レグヘモグロビン(leghemoglobin, Lb)は、根粒中に特異的に存在し、根粒菌の呼吸に必要な酸素を供給しつつ、ニトロゲナーゼが失活しない程度に酸素分圧を維持する。Lbは、
Lb²⁺、Lb³⁺、Lb⁴⁺の三つの酸化状態をとりうるが、多くは酸素分子と結合した状態(Lb²⁺)で存在していると考えられている。Lb²⁺は、根粒菌の呼吸に必要な酸素を供給するため、酸素と解離してLb³⁺となる。Lb³⁺が再び酸素と結合するためには、二価へ還元される必要がある。このヘモグロビンのリサイクルを可能としているのが、ヘモグロビン(Hb)還元酵素である。根粒内部におけるHb還元酵素の活性は、窒素固定活性にも影響を及ぼす重要な要素と考えられる。本研究では、ミヤコグサとその根粒菌の共生系を材料として、Hb還元酵素遺伝子の発現特性を解析した。

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食虫植物は痩せた土地に生育し、葉が特殊な形状をした捕虫器官で昆虫などの小動物を捕らえ、分解、吸収することにより必要な養分を得ている。食虫植物の一種であるウツボカズラ(Nepenthes)はつぼ状の捕虫器を有し、それで昆虫などの獲物を捕える。捕虫器内には液体が満たされており、そこにはアスパラギン酸プロテアーゼ(ネペンテシンIおよびII)やキチナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ、タウマチン様タンパク質などが含まれている(Hatano & Hamada, 2008)。それらは獲物の分解と捕虫器溶液中でのバクテリアの増殖抑制に関わっていると考えられた。我々はNepenthes alataの捕虫器溶液に含まれるクラスIVキチナーゼ(NaCHIT1)の役割を明らかにするために、NaCHIT1遺伝子のサザン解析および発現解析、ならびに大腸菌由来組み換えNaCHIT1を用いた酵素活性の測定をおこなった。NaCHIT1遺伝子はシングルローカス遺伝子と考えられ、NaCHIT1mRNAは捕虫器の発達とともに発現量が増加してくることが明らかになった。組み換えNaCHIT1を用いて活性測定をおこなったところ、キチンオリゴ糖に対する加水分解活性が見られた。
Hatano, N. & Hamada, T. (2008) J. Proteome Res. 7, 809-816.

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シロイヌナズナのmicroRNA・miR398はCuZn-SOD mRNAをdown-regulateし、ストレス応答や銅代謝で重要な役割を演じている。Yamasakiら(2007)は、銅欠乏下では、up-regulated miR398により葉緑体CuZn-SODの生成が抑制され、代替的に葉緑体Fe-SODが誘導されることを報告している。我々は先に、キレータ・トリエンチン(TET)を与えたトウモロコシで、CuZn-SOD活性が増加することを見いだした。今回は、この誘導機構の解明を目的として、TET処理トウモロコシおよびイネのCuZn-SOD遺伝子発現を検討した。TETと構造類似のポリアミン・スペルミジンはトウモロコシのSODを誘導せず、またEDTAも誘導しないことから、トウモロコシCuZn-SODの誘導はCuに特異的なTETのキレータとしての効果である。TET処理(1-10 mM、24-48h)により、明および暗条件下でトウモロコシSOD活性は増加したが、イネでは増加せず、この時の光合成活性に対するTETの影響をクロロフィル蛍光で検討した結果、1 mM TETの場合、明条件下のほうが光合成活性が幾分低くなった。SOD誘導は暗条件下の方がより大きいことから、活性酸素の関与は否定できる。これらにより、C4とC3植物でmicroRNAを介したSODの制御機構は異なることが示唆された。

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植物Lipoxygenase (LOX)は、不飽和脂肪酸の酸化反応を担う酵素である。LOX反応を初発として生合成される代謝産物は、ジャスモン酸などの植物病害応答に関与する生理活性物質に変換されることから、病害応答においてLOXは重要な機能を果たしていると考えられている。本研究では、コケ植物におけるLOXの生理機能を明らかにすることを目的としてゼニゴケ(Marchantia polymorpha L.)よりLOX遺伝子と相同性を示す遺伝子の単離を行ない、その機能を調べた。これまでにESTライブラリーより独立した3つのLOX相同遺伝子の部分配列を取得し、5’-,3’-RACE法により全長と予想される塩基配列を明らかにした。各遺伝子は2,868、 2,958、 2,868 bpからなり、それぞれMpLOX1、MpLOX2、MpLOX3と命名した。MpLOX3については大腸菌による組換えタンパク質を作出し、MpLOX3と基質脂肪酸との反応生成物をLC/MS/MSにより検出した。その結果MpLOX3はエイコサペンタエン酸や、アラキドン酸との反応性が高いことが分かった。またMpLOX3との反応生成物には基質脂肪酸の15位の炭素原子に酸素を添加した生成物が顕著に認められたことからMpLOX3が15-LOX活性を有することが明らかとなった。本研究は、生研センター異分野融合研究事業によるものである。

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Flowers are unique in unusually high level of certain lipids, such as phosphatidic acid (PA) and phosphoinositides, which play critical roles in plant signal transduction. The importance of lipids in flower development is further suggested by a plenty of examples in which knock-out of lipid-related genes shows abnormal phenotypes in flower development or reproductive processes. In Arabidopsis, however, lipid metabolism in flowers is largely unknown mainly because flowers are too tiny to harvest in bulk according to the developmental stages. To explore the function of lipids in Arabidopsis reproductive process, we performed developmental stage-specific glycerolipid profiling together with expression profiling on lipid biosynthetic genes using a system to synchronize flower development. The results revealed dramatic changes in lipid composition and expression of relevant genes. This comprehensive dataset provides a new platform to investigate function of lipids during plant reproductive processes.

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植物ホルモンのジャスモン酸(JA)をはじめとして,リノレン酸由来の生理活性物質であるオキシリピン類が様々なストレス応答物質として独自の機能を持つ事が明らかにされている．オキシリピン類は陸上植物に広く存在し，少なくとも7つの生合成経路が存在する事，植物ホルモンのJA生合成では，植物種によって触媒作用の位置特異性が異なる二つの酵素，lipoxygenase (LOX)およびallene oxide synthase（AOS）が働く事が知られている．JAの生合成は13位特異的な反応で触媒されるが，触媒酵素の基質認識メカニズムついては不明な点が多い．すなわち9位，13位の各認識部位について特異性が高い場合と両方を認識する場合がある．
シロイヌナズナには基質特異性が異なるLOXが6個存在するものの，AOSはたった1つであることが明らかにされている．近年シロイヌナズナのAOSも9位と13位の両方を認識する事が示唆された．そこでトマトやジャガイモで9-LOX反応産物を基質として触媒反応を行う酵素と同様の機能がシロイヌナズナのAOSに存在する可能性が示唆された．そこで植物内における9-AOSの酵素機能について検証を行った．

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スルホキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）は、葉緑体のチラコイド膜を構成する硫黄を含む糖脂質である。最近の研究により、シロイヌナズナの葉緑体内でグルコース-1-リン酸(G1P）からUDP-グルコースを生成する酵素UDP-グルコースピロホスホリラーゼ（UGP3）がSQDGの生合成に必須であることが分かった。緑藻クラミドモナスのUGP3ホモログ欠損変異体はリン欠乏、硫黄欠乏では野生株に比べて急速に枯死するが、それらを同時に欠乏させると野生株と変化がないという表現型が報告されている。そこで我々は、シロイヌナズナのUGP3過剰発現変異体を作製し、栄養欠乏条件下における生育と脂質組成を、野生株およびUGP3欠損株と比較した。その結果、有意な差が見られなかったことから、栄養欠乏条件下におけるUGP3の役割が高等植物と緑藻において異なることがわかった。また、葉緑体内のG1Pはデンプン生合成に必須であり、その供給を担うホスホグルコースイソメラーゼの欠損体pgiではデンプンの蓄積がほとんど見られない。そこで、同じG1Pを基質とするSQDG生合成への影響を調べるため、このpgi変異体の脂質組成を解析したが、野生株に比べて大きな変化は見られなかった。このことから、葉緑体内のSQDG生合成は、デンプン生合成とは異なるG1Pプールを利用していることがわかった。

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植物の葉緑体チラコイド膜を構成する糖脂質は、モノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)、ジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)、スルホキノボシルジアシルグリセロール(SQDG)の3つであるが、このうち、SQDGはUDP-スルホキノボース合成酵素(SQD1)とSQDG合成酵素(SQD2)によって生成される。近年、ホウレンソウにおいてフェレドキシン依存型グルタミン酸合成酵素(Fd-GOGAT)とSQD1が安定複合体を形成していることがわかり、スルホ糖脂質代謝と窒素同化との相互調節の可能性が示唆された。そこで我々は、Fd-GOGATを欠損したglu1とglu2両変異体における脂質解析及びSQDG生合成に関わる遺伝子の発現解析を行った。その結果、glu1、glu2では、通常生育条件下におけるSQDGの相対含量が野生型に比べて有意に減少していることがわかった。また、遺伝子発現解析の結果、glu2ではSQDG合成に関わる遺伝子群の発現が減少していたが、glu1では変化が見られなかった。さらに、glu1、glu2ともにAPS還元酵素遺伝子の発現減少が見られた。これらの結果から、Fd-GOGATとSQD1との相互作用が直接的にSQDG合成に影響している可能性と、Fd-GOGATの欠損がもたらす遺伝子発現変化によってSQDG生合成が負に制御されている可能性が示唆された。

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ホスファチジルグリセロール（PG）は生体膜を構成するリン脂質の一つである。植物において、PGはプラスチド、ミトコンドリアと小胞体で合成され、シロイヌナズナでは、PG合成に関与するPGリン酸合成酵素をコードする遺伝子としてPGP1と PGP2が同定されている。PGP1 はプラスチドとミトコンドリア、PGP2 は小胞体に局在すると考えられている。pgp1変異体は正常な葉緑体を形成することができないが、ミトコンドリアは正常である。ミトコンドリアが正常である理由としては、小胞体でPGP2依存的に合成されるPGがミトコンドリアへ輸送されているためであると推測されている。本研究では、PGP2の機能を解析するためにpgp2変異体を取得し解析を行った。
新たに取得したpgp2-1変異体を解析したところ、通常の条件下では成長の遅延などの表現型は見られなかったので、pgp1 pgp2-1二重変異体の作出を試みた。しかし、二重変異体を分離することはできなかった。その原因を探るためにPGP1/pgp1 pgp2-1/pgp2-1を自家受粉させて得られた胚を解析したところ、二重変異体は胚発生を途中の段階で停止することが示唆された。また、PGP1のプロモーターGUS解析を行ったところ、維管束、孔辺細胞、若い葉のトライコームの根元の細胞などで強い染色が見られた。

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phosphatidate phosphatase(PAP)はphosphatidic acid (PA) を脱リン酸化し、diacylglycerol(DAG)を生成する酵素である。DAGは糖脂質、リン脂質、中性脂質の共通の基質となるためにPAPは脂質代謝において非常に重要であると考えられている。我々はこれまでに、膜局在型PAPであるlipid phosphate phosphatases (LPP) (Nakamura et al. (2007) J Biol Chem)に続き、シロイヌナズナの2つのPAP、phosphatidate phosphohydrolase 1, phosphatidate phosphohydrolase 2(PAH1,PAH2)を単離し、pah1pah2二重変異体を用いた解析の結果を報告してきた。これらの解析により、この二つのPAPが共にサイトゾルに存在することなどを明らかにし、通常生育時のガラクト脂質合成において真核型経路で重要な役割を果たしてること、さらにリン欠乏時における膜脂質転換において不可欠な働きをしていることを示した(Nakamura et al. 2009 PNAS)。
今回この二つの可溶性PAPが貯蔵脂質合成経路に及ぼす影響を調べたので、その結果を報告する。

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酸性リン脂質ホスファチジルセリン（PS）は、シロイヌナズナの葉や根ではプラスチド外脂質の1.9%および5.9%しか含まれていないが、花序においては20.6%を占める主要膜脂質である。我々はシロイヌナズナのPS合成酵素AtPSS1が根や葯および成熟胚に比較的高いレベルで発現し、ER膜および核膜に局在し、in vitroでホスファチジルエタノールアミン（PE）をPSに変換する活性をもつこと、また、atpss1変異は花粉の発達を部分的に阻害することを明らかにしている。
今回、葯におけるPSの生理的役割を解明するために、Lactadherin のPS結合モチーフと蛍光タンパクを結合させたPS バイオセンサーLactC2-eGFP (Yeung et al., 2008)を形質転換シロイヌナズナで発現させ、PSの細胞内局在を調べた。花粉発達の早期段階であるテトラド期ではLactC2-eGFPは核膜に局在したが、花粉小胞子では核に局在せず、ミトコンドリア様のオルガネラに局在を示した。以上の結果は、PSの局在が核からミトコンドリアに移行することが花粉の発達にとって重要であることを示唆している。

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高等植物の葉緑体とシアノバクテリアは共に、モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）を主要膜構成成分としているが、MGDGの合成経路は両者で異なる。高等植物ではMGDG合成酵素が、シアノバクテリアではモノグルコシルジアシルグリセロール（MGlcDG）合成酵素が、それぞれのMGDG合成経路を担っている。
緑藻クラミドモナスは、植物型MGDG合成酵素（MGD）とシアノバクテリア型MGlcDG合成酵素（MGlcD）の両遺伝子のホモログを有するが、クラミドモナス膜画分ではUDP－ガラクトースを基質とした高等植物型のMGDG合成が行われていることが分かった。そこで我々は、クラミドモナスのMGD遺伝子（CrMGD）を単離し、大腸菌で発現させたリコンビナント酵素の生化学的解析を行い、キュウリMGD（CsMGD）の酵素特性と比較した。
CrMGD、CsMGD共に、至適pHが7.5付近であり、MgCl₂、CaCl₂の添加によりMGDG合成活性が増加し、またCuCl₂、ZnCl₂の存在下では活性が阻害された。一方、CsMGDではホスファチジン酸による活性化が見られたが、CrMGDでは見られなかった。これらの結果より、CrMGDの活性制御が高等植物MGDのそれとは異なる可能性が示唆された。

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飢餓状態において誘導される分解系として、オートファジーが知られる。我々は、タバコ培養細胞BY-2株に、チトクロームb5と赤色蛍光タンパク質の融合体、Cyt b5-RFPを発現させ、Cyt b5-RFPの蛍光分布の変化及び切断を指標とすることで、オートファジーによる分解の定量的解析を進めてきた。しかし、この実験系では、オートファジー誘導前と後に合成されたタンパク質の区別が不可能であり、オートファジー誘導機構についての詳細な解析が進められない。そこで我々は、蛍光波長変換タンパク質である‘kikume’に注目した。このタンパク質は360～410nmの光の照射により、その蛍光を緑色から赤色に変化させる。この性質を用いて、kikumeとチトクロームb5の融合体、Cyt b5-kikumeを用いたオートファジーの定量系を確立した。これまで、この系を用いて、細胞がリン酸飢餓状態初期においては新規のタンパク質合成を行なうこと、そしてリン酸飢餓状態の細胞では、飢餓前（オートファジー誘導前）から存在したタンパク質と共に新規に合成されたタンパク質もオートファジーにより分解されることを見出した。現在、この系を用いて栄養応答性のオートファジー分解系の詳細な解析を進めている。

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シナプトタグミンは、エキソサイトーシスにおけるカルシウム依存的な細胞膜－小胞融合を制御するカルシウムセンサーである。シナプトタグミンは、N末端側に膜貫通ドメインを1つ、C末端側に並列した2つのカルシウム結合ドメイン（C₂AとC₂B）を持つ。本報告では、シロイヌナズナのシナプトタグミンSYT1の細胞膜への局在が並列したC₂A-C₂Bドメインによって調節されていることを示す。生化学的な解析結果は、SYT1が細胞膜に埋め込まれており、2つのカルシウム結合ドメインが細胞質側に配向していることを示唆していた。シロイヌナズナの本葉から単離したプロトプラストでGFPを付加したSYT1のトランケートシリーズを一過的に発現させたところ、並列したC₂A-C₂Bドメインを持つもののみが細胞膜に局在した。シロイヌナズナの3つのSYT1ホモログ（SYT2, SYT4, SYT5）とSYT1のC₂Bドメインのアミノ酸配列を比較したところ、SYT1とSYT2のC₂Bドメインでは保存されたカルシウム結合モチーフが欠失していた。このSYT1の欠失部位をSYT5のアミノ酸配列に置換した変異体は細胞膜ではなく内膜系に局在しており、SYT5の細胞内局在と類似していた。以上の結果から、SYT1の細胞膜への局在は、植物シナプトタグミンで起った分子進化においてSYT1の機能的分化に必須であったと考えられる。

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果実の食味を決定づける主要因は甘みと酸みであり，両者の好ましいバランスが果実の食味には重要である．果実は有機酸を液胞に高濃度に蓄積しているが，液胞へと有機酸を運ぶトランスポーターは同定されていない。本研究では，かずさDNA研究所のトマト完全長cDNAデータベース (KaFTom) に見出した，シロイヌナズナの液胞膜有機酸トランスポーター遺伝子AttDT (Arabidopsis thaliana tonoplast dicarboxilate transporter) のオルソログSltDT1の機能解析を行い，果実への有機酸蓄積への関与を検討している．SltDT1とGFPの融合タンパク質をタマネギ表皮細胞で一過的に発現させたところ，液胞膜に局在した．定量的PCRによるSltDT1の発現解析の結果から，SltDT1が全身で発現していることが確認された．シロイヌナズナではAttDTにパラログが存在しないことから，SltDT1がトマトにおいて唯一あるいは主要な機能を担うtDTファミリーの遺伝子として，果実を含めた全身で機能しているものと考えられた．果実特異的な2A11プロモーター下でSltDT1を過剰発現させた形質転換トマトを複数系統作出できたため，それらの果実形質の解析結果も併せて報告したい．

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トランスゴルジネットワーク(TGN)以降の、蛋白質と多糖の細胞外への輸送は分泌小胞によって担われている。分泌小胞の性質、挙動については、一部の動物細胞ではよく解析されているものの、植物細胞ではその詳細は明らかになっていない。 Secretory Carrier Membrane Protein2 (SCAMP2)は分泌小胞の構成要素の一つとして知られており、我々は、タバコ培養細胞BY-2株を用いてこの蛋白質の細胞内での存在様式を解析し、我々がSecretory Vesicle Cluster (SVC)と名付けた分泌小胞が塊状に集合した構造体に局在することを報告してきた。SVCは、ゴルジ体以降の分泌に関与しているオルガネラで、ペクチンや分泌性蛋白質を含み、細胞膜、細胞板と融合する。また、SVC様構造はタバコ根の分裂組織の細胞、シロイヌナズナ子葉表皮細胞、イネ培養細胞においても観察され、高等植物で広く利用されている分泌経路の一つを担っていると考えられる。
そこで我々は、SVCの形成機構を探るために、SCAMP2-YFPを指標として、複数の密度勾配遠心を組み合わせてタバコ培養細胞BY-2株からSVCに富む画分を調製する条件を見出した。現在、その画分に含まれる蛋白質の同定を進めている。

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ヒャクニチソウ培養細胞木部分化誘導系から単離されたxylogenはアラビノガラクタンタンパク質(AGP)、脂質転移タンパク質(nsLTP)のドメインを持ち、GPIアンカーによって膜に繋留される構造を持つ。xylogenは維管束組織で特徴的な分布をすることが明らかになっているが、この分布にGPIアンカーが関与する可能性が考えられた。ヒャクニチソウxylogenに相同な遺伝子はシロイヌナズナゲノム中にも存在し、その中でもAtXYP2は維管束特異的に発現しヒャクニチソウxylogenと機能的相同性が高いと予測される。そこで、AtXYP2プロモーター下でAtXYP2::GFP融合タンパク質を発現させた蛍光局在解析により、AtXYP2タンパク質の細胞内での挙動を明らかにすることを試みた。その結果、AtXYP2は木部および前形成層領域で発現し、根端付近と伸長領域とで異なる細胞内局在のパターンを示した。根端付近の細胞においては、細胞膜および点状の細胞内オルガネラに局在し、特に細胞分裂期に細胞板に強い蛍光が観察された。細胞内輸送阻害剤および変異体を用いた解析により、この局在は既知の植物の小胞輸送系とは異なる特徴を持つことが示唆された。これらの結果をもとに、AtXYP2における極性輸送の仕組みを考察する。

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真核細胞内の物質輸送を担う輸送小胞のうち、COPII被覆小胞は小胞体(ER)からゴルジ体へ向かう順方向の輸送を司っており、その被覆は低分子量GTPase,Sar1と2種類のタンパク質複合体(Sec23/Sec24, Sec13/Sec31)からなる。これらの複合体のうちSec23/Sec24はヘテロニ量体を形成し、ER膜上で積荷の選択や認識に関わっている。また、Sec13/Sec31はヘテロ四量体を形成し、積荷の濃縮と膜の湾曲に関与している。これまで、当研究室ではシロイヌナズナの気孔形態に異常を示す変異体からSec31のホモログ(ATSEC31A)が単離された。また、この遺伝子破壊株は葯の裂開が起きず雄性不稔を示した。そこで、本研究では別の構成因子であるSec23とSec24のホモログの解析を行っている。データベースの検索より、シロイヌナズナにはSec23のホモログが7つ、Sec24のホモログが3つ存在することが示唆された。我々は、これらのSec23のホモログをそれぞれATSEC23A、ATSEC23B、ATSEC23C、ATSEC23D、ATSEC23E、ATSEC23F、ATSEC23Gとし、同様にSec24ホモログについてもATSEC24A、ATSEC24B、ATSEC24Cと名づけた。ここでは、それぞれの細胞内局在、発現部位や破壊株による機能解析の結果を報告する。

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花粉管伸長において、花粉管の先端部分への膜成分や細胞壁成分の極性を持った小胞輸送が重要であることが知られている。一方、SNAREタンパク質は、小胞輸送において輸送小胞と標的膜との融合時に融合の特異性を決定する働きをしている。そこで、今回、我々は花粉管伸長時におけるSNAREの局在と膜動態について以下のような解析を行った。細胞膜に局在しているQa-SNAREのうち、花粉特異的に発現しているSYP124,125,131にGFPを融合させた遺伝子組み換え植物を作成し、局在を観察した。この結果、成熟花粉において各SYPは花粉粒内に散在していた。しかし、伸長している花粉管において、GFP-SYP124、125は花粉管先端に強く局在している一方、GFP-SYP131は花粉管全体に局在した。この事から、GFP-SYPは発芽前後に局在が劇的に変化すると考えられた。この局在変化をより詳細に観察する為に、顕微鏡観察下でマイクロマニュピレーターを用いて、GFP-SYP125を発現している植物の花粉を柱頭の乳頭細胞に受粉させ、給水から発芽までのGFP-SYP125の動態を連続的に観察した。この結果、発芽直前にGFP-SYP125が発芽孔に集中し、細胞質に散在したSYPが発芽した花粉管に急激に集まっていく様子を捉えた。また、本発表では花粉発達段階におけるGFP-SYPの局在についても報告する。

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我々は，イネ胚乳に有用タンパク質やペプチドを蓄積した組換え米の開発を進めている．しかし，導入産物によっては，種子が粉質化，白濁化といった死米様表現型を呈してしまうことが分かった．このような種子では，BiP等の小胞体シャペロン遺伝子の発現が上昇しており，異種タンパク質発現による小胞体ストレスが原因であろうと考えた．植物の小胞体ストレス応答の分子機構には不明な点が多いが，近年，シロイヌナズナにおいて膜貫通型のbZIP転写因子が，その制御の一環を担っていることが明らかにされた．そこで，イネゲノム中に存在する89のbZIP型転写因子から，膜貫通領域を有すると推定されるものを3つ同定した．OsbZIP39はbZIPドメインに続いて膜貫通領域を有していた．膜貫通領域以降を欠失させたタンパク質（OsbZIP39ΔC）とGFPの融合タンパク質は，イネプロトプラストにおいて核に局在した．OsbZIP39ΔCは一過性発現によりBiPプロモーターを活性化した．また，ユビキチンプロモーター制御下でOsbZIP39ΔCを過剰発現させた形質転換体では，小胞体ストレス誘導剤処理なしに，BiPタンパク質が高発現していた．以上の結果から，OsbZIP39は小胞体ストレス応答に関わる転写因子であると考えた．

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葉緑体DNAとタンパク質との高次複合体である葉緑体核(核様体)は遺伝情報の保存、複製、分配、転写といった葉緑体ゲノムの機能的場として存在している。近年、アフィニティークロマトグラフィーを含めた方法を用い、シロイヌナズナ葉緑体よりtranscriptionally active chromosomes (TAC)が単離され、その中に存在するタンパク質(pTACタンパク質)がMS解析で同定された(Pfalz et al.2006)。我々は蘚類ヒメツリガネゴケを用いてペプチドグリカン合成系遺伝子が葉緑体分裂に関与することを明らかにしている。pTACの内の一つ、pTAC5はペプチドグリカン結合ドメインを持つと予測されたため、この遺伝子について解析を進めることにした。pTAC5はヒメツリガネゴケゲノム中では単一遺伝子であり、また藻類のゲノム配列からは相同遺伝子が見いだせなかった。遺伝子産物の細胞内局在を明らかにするために、ヒメツリガネゴケでpTAC5全長-GFP融合タンパク質を一過的に発現させたところ、葉緑体中に存在する粒子状のGFP蛍光が観察された。現在、pTAC5の遺伝子破壊ラインを作成中であり、その結果も合わせて報告する。

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Botryococcus brauniiは炭化水素を合成する淡水性の緑藻である。現在のところB.brauniiは一属一種に分類されている。しかし、C23-33のアルカジエンやアルカトリエン等の脂肪酸合成系に由来する炭化水素を持つRaceA、テルペノイド合成系に由来するC31-34のbotryococceneを持つRaceB、lycopadieneと呼ばれるテトラテルペンを持つRaceLの3種類に分類することができる。本研究では、テルペノイド系炭化水素を合成するBOT-70株の炭化水素生合成に関与する遺伝子群を解析し、テルペノイド由来の炭化水素生合成に関与する遺伝子を明らかにすることを目的とした。まず、炭化水素合成能が高い時期のBOT-70株（RaceB）とSI-30株（RaceA）の転写産物を比較し、BOT-70株に特異的に発現している遺伝子断片を単離した。その中からRaceBの炭化水素を合成する他の株でも普遍的に発現している遺伝子を特定し、これらの候補遺伝子の中から炭化水素合成に関与すると予測される遺伝子をスクリーニングした。得られた遺伝子群を解析し、Botryococcus brauniiの炭化水素合成系への関与について考察した。

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イネの細胞膜型アクアポリンOsPIPは11種類存在し、アミノ酸配列により1群と2群に分類される。我々はこれまでに、イネにおけるOsPIPの遺伝子発現量を調べたところ、1群が2群より高い値を示した。一方、アフリカツメガエル卵母細胞にOsPIPを発現させて行った水透過性測定実験では、1群の水透過性は低く、2群の値の1/7程度であった。しかし、1群と2群を共発現させると水透過活性は上昇した。そこで、OsPIPのタンパク質発現を確認するためアフリカツメガエル卵母細胞にOsPIP-GFP融合タンパク質を発現させ、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、OsPIP1 -GFPは細胞膜における蛍光強度が、OsPIP 2-GFPの蛍光強度より低いことがわかった。上記の実験結果から、OsPIP1群タンパク質の水透過活性がもともと低いのか、あるいは、OsPIP1群タンパク質の水透過活性はあるが、細胞膜における局在量が低い可能性が考えられる。1群と2群の共発現によって水透過性が増加したのは、1群がより多く細胞膜に局在した可能性がある。そこで、OsPIP1群の細胞内局在の動態を調べるため、OsPIP1群- DsRed融合タンパク質発現系を用いて調べ、さらに免疫電顕による観察を行った。その結果、OsPIP1群タンパク質は細胞膜以外にも局在することが観察された。

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アクアポリンは植物の水輸送を担う重要な膜タンパク質である。植物の根のアクアポリン遺伝子発現量は日周変動する。この日周変動は明暗日周によって作り出されるサーカディアンリズムに起因すると考えられてきた。しかし本研究では、光自体ではなく光照射により地上部からの蒸散要求が増加することが日周変動の主要因ではないかという新仮説を立て、その検証を試みた。12時間明期・12時間暗期で生育させたイネの根のアクアポリン遺伝子発現量は暗期に低く明期に高い日周変動を示したが、そのリズムの振幅はアクアポリンのメンバーにより異なった。OsPIP2;1とOsPIP2;2は、明期開始2時間後に最大値、暗期開始数時間後に最低値をもつ緩やかな日周変動を示した。一方、根特異的に存在するアクアポリンOsPIP2;4とOsPIP2;5は似たような日周変動のパターンを持つものの、明期開始1から4時間後の間に一過的に非常に激しく発現量が増減し、大きなピークを示した。12時間暗期の後にさらに暗期を追加した場合、あるいは光照射下でも加湿して蒸散を阻害した場合にはこのような発現の強い誘導は見られなかった。これらの結果から、光照射による蒸散の開始がOsPIP2;4とOsPIP2;5で見られるような遺伝子発現の一過的な上昇を引き起こす要因である可能性が示唆された。

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アクアポリンは動植物、微生物を含め生体膜に存在する主要なタンパク質のひとつであり、水の透過孔（水チャネル）を形成し、生物体内の水の流れ、細胞の浸透圧調節などに重要な役割を果たしている。
私たちは、イネの穎花の葯におけるアクアポリン遺伝子OsPIP1および2群の発現について調べた。葯では花粉母細胞は減数分裂、4分子期、小胞子期（前期と後期）を経て成熟花粉となる。やがて葯は裂開して花粉は飛散し、柱頭への受粉にいたる。本研究では、花粉細胞の発達過程の時間軸にそったOsPIP1および2群の発現変化と局在について調べた。特に、2群に較べて明瞭な水透過活性を確認できない1群の1つであるOsPIP1;3は、葯腔内に空気が出現する2～3細胞期に発現量が増加した。この時期の葯について、免疫電顕によるOsPIP1;3の局在を観察したところ、花粉の細胞膜の内側近傍に分布が観察されたが、細胞膜上には明確に確認することができなかった。また、葯腔内の中層細胞（花粉細胞側に面している）においても、同様に細胞膜の内側近傍にOsPIP1;3の局在が観察された。冷温等のストレスを与えた葯では、OsPIP1;3の分布の増加が見られた。

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原形質膜型アクアポリン(Plasma membrane Intrinsic Protein: PIP)は、原形質膜を介した植物の水輸送の中枢を担うタンパク質である。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた水輸送活性解析において、概して、単独では水輸送活性を示さないオオムギ(Hordeum vulgare)のHvPIP1型は、HvPIP2型とヘテロマーを形成することで、水輸送に関与している事が明らかとなってきている。
HvPIP2;1と、5種のHvPIP1型それぞれの共発現解析を行った結果、HvPIP1;3を除く全ての1型が、HvPIP2;1の水輸送活性を増強する事が判明した。HvPIP1型のアミノ酸配列を比較したところ、HvPIP1;3以外の全ての1型で保存されているアミノ酸が、N末端付近に2ヶ所存在した。HvPIP1;3内のそれらの部位に相当するアミノ酸 (His-18, Phe-43)に、単独、もしくは重複で点変異を施し、他の1型で保存されているArgとLeuに変換した変異HvPIP1;3を用いて、HvPIP2;1との共発現解析を行うと、いずれの点変異型HvPIP1;3も顕著にHvPIP2;1の水輸送活性を増強させた。HvPIP1;2, HvPIP1;4の相当するアミノ酸にも各変異を加えその効果を検証し、ヘテロマー形成分子機構について議論する。（生研センター基盤研究推進事業による）

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高等植物の原形質膜局在型アクアポリンはPIP1とPIP2の2種類に分類できる。これらPIP2とPIP1はアフリカツメガエル卵母細胞の機能発現系で同時に発現させるとそれぞれ単独で発現させた場合より大きな活性を示すことが知られていて、この現象はアクアポリンの活性調節機構の一つである可能性が指摘されている。PIP1およびPIP2の活性中心に変異を導入し失活させた変異体を用い、正常のものとの共発現を解析した。単独で発現させても大きな水輸送活性のあるPIP2は、失活させたPIP1変異体との共発現で更に大きな水輸送活性を示した。単独で発現させると活性を示さないHvPIP1;2は、失活させたPIP2変異体と共発現させると大きな水輸送活性を示した。タンパク質相補法を使って単量体の結合を調べると、PIP1とPIP2はヘテロマーを形成していた。PIP2単独の場合はPIP2ホモマーの形成は確認できたが、PIP1単独でのホモマーの形成は確認できなかった。現在、原形質膜・小胞体膜を単離してPIP1モノマーの存在状態を確認している。その結果も合わせて報告する。この研究は生研センター基盤研究推進事業によって実施された。

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H⁺-ピロホスファターゼ（H⁺-PPase）は、液胞膜に局在するプロトンポンプであり、植物ではH⁺-ATPaseとともに液胞の酸性化機能を担っている。H⁺-PPaseは細胞質のピロリン酸を消去して高分子合成を促進し、プロトンを液胞内へ輸送する2つの機能を持つため、高分子合成の盛んな若い細胞、あるいは酸素が不足しATP生産能力の低下した状況ではH⁺-PPaseの役割が大きくなると予想される。そこで、研究対象として、深水条件という酸素が不足した環境で著しい節間伸長を示す浮イネを用いることとした。
浮イネに深水処理を行い、節間下部でのプトロンポンプおよびアクアポリンの量の変化を、mRNAおよびタンパク質レベルで測定し、深水処理をしない浮イネと比較した。その結果、深水条件ではH⁺-ATPaseよりもH⁺-PPaseの方が優先的に合成され、その量も、細胞伸長による液胞の増大に伴い供給されることが分かった。また、液胞膜型アクアポリンTIPでは、水透過活性の高い2つの分子種において、深水処理によりmRNA量、タンパク量ともに著しく増加することが確認できた。したがって、これらの分子が液胞の増大ひいては細胞伸長を支えることが示唆された。その他にも、機能未知の多くのアクアポリンが深水処理により明確な変化を示し、深水処理の程度や日数による違いも観察された。

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H⁺-pyrophosphatase (H⁺-PPase; EC 3.6.1.1) は核酸やタンパク質、セルロースなど高分子合成反応の副産物であるピロリン酸の加水分解に共役してH⁺を輸送するプロトンポンプである。植物においてはI型H⁺-PPaseが液胞膜に多量に存在し、V-ATPaseと共に液胞の酸性化に寄与している。しかし、組織免疫染色において組織によっては細胞膜にも一部存在し、アポプラストの酸性化によりオーキシンの輸送に間接的に関わっているという報告もなされており、分化した細胞各々での局在性や環境に対する応答性などを精査する必要がある。当研究ではシロイヌナズナH⁺-PPaseであるAtVHP1/AVP1において、細胞質側に配向しているループにsGFPをつないだコンストラクトを作成し、own promoter下で植物に形質転換させた。VHP1-sGFPは液胞膜と共に、バルブ状構造と思われる液胞内の動的な小胞に存在していることが明瞭に観察された。組織局在では、植物体全体に蛍光が認められたが、特に根端、維管束、花粉、吸水種子において強い蛍光が見られ、高分子合成反応が盛んな組織において特に活発であるというこれまでの報告と一致した。現在、様々な組織や条件における細胞内局在や発現量の違いを解析中であり、破壊株vhp1の表現型と併せてH⁺-PPaseの生理的役割について議論したい。

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アクアポリンは水や多様な小分子を輸送する膜タンパク質である。特に、細胞膜型アクアポリンであるPIPは、細胞内の水ホメオスタシスに重要な役割を果たしていると考えられる。これまでに、PIPsが様々な環境ストレスに応答して発現や局在を変化させるという報告がされている。本研究では、植物の高温適応に関連して、高温条件下のPIPsの転写レベルの変化ならびにタンパク質量の変化を解析した。
シロイヌナズナの13種のPIP遺伝子について発現を解析したところ、温度が30℃を越すと、幼植物のシュートでも根でも、PIP2;3のみが劇的に発現上昇した。この上昇は一過的で、同じ温度に維持しても数時間後には元の発現レベルに戻り、温度を下げた場合もmRNA量は低下した。さらにこの現象は、連続光照射下でも同様な一過的発現上昇がみられたことから、日周や明暗ではなく、温度に依存した応答であると判断される。また、PIP2sのタンパク質量も転写レベルでの変化と同様に高温で誘導され、次第に低下した。このことから、高温で誘導されるPIP2;3は転写レベルがそのままタンパク質蓄積量に反映することが示唆される。この一過的なPIP2;3の増大は、植物の生理的な高温適応に関与していると推測される。

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植物の水輸送は、光環境によって調節される。多くの植物のアクアポリンの遺伝子発現が光条件の影響を受けること、根の水透過性がアクアポリンの発現と相関して日周変動することから、その輸送調節の一端はアクアポリンが担っていると考えられている。シロイヌナズナの根では、暗順応処理によりアクアポリン遺伝子の転写産物量が増加する。中でも、液胞膜アクアポリンTIP2;2遺伝子は、暗処理による誘導性が高く、フィトクロムAによる制御を受けていることが示唆されているが、その光応答の仕組みの詳細も機能も明らかになっていない。そこで、TIP2;2の光応答メカニズムやその機能を調べるために、TIP2;2 promoter-TIP2;2-GFP遺伝子導入植物を作製し、まずその局在を解析した。その結果、TIP2;2-GFPの蛍光は根の発達の進んだ領域で観察された。発達の進んだ領域では、皮層と内皮で最も発現量が多く、表皮細胞や根毛などでも発現していたが、根端分裂組織や側根原基などでは発現が観察されなかった。また植物を暗順応させると、GFPの蛍光が劇的に明るくなったことから、mRNAの変化と同様にTIP2;2タンパク質量も暗所で増加することが示唆された。この暗順応処理によるTIP2;2の増加は、暗所において液胞膜上のチャネルを介した水やその他の溶質の輸送の必要性が増すことを意味しているのかもしれない。

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植物は主要な窒素源である硝酸イオンを硝酸イオン能動輸送体(NRT)を介して取り入れている。NRTはABC型NRT、NRT1、NRT2の3つに大別することができる。NRT2は植物のNRT活性で中心的な役割を果たしているが、大半のNRT2は補助的なタンパク質であるNAR2がないと硝酸イオン輸送活性を示さない。ヒメツリガネゴケは8つのNRT2分子種と3つのNAR2分子種をもっている。8分子種のNRT2のうちNRT2;1、NRT2;2、NRT2;4は基質親和性が高く、これらに比べてNRT2;3は基質親和性が低いことが分かっているが、NAR2についてこのような機能分化があるかどうかは不明である。そこで我々はNAR2の機能を解析するために、Nar2;1からNar2;3までそれぞれ破壊株を作製しそれらの表現型を解析することを試みた。今回Nar2;1とNar2;2については単独あるいは二重の変異株を取得できたが、いずれの株も硝酸イオンを含む培地で正常に生育した。一方、再三の試みにも関わらず、Nar2;3のノックアウト株は取得できなかった。この結果は、ヒメツリガネゴケにおいてNAR2;3が必須のNAR2タンパク質であることを示唆するものである。現在、得られたNar2変異株の性質の詳細な分析によって各NAR2の機能の解明を試みている。

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植物の核tRNA遺伝子の中で、tRNA^TyrとtRNA^Met-eをコードする核遺伝子のみがイントロンにより分断されている。tRNAイントロンのスプライシングは3種類の酵素が協調して行う（エンドヌクレーゼ (Sen)によるイントロンの切断、tRNAリガーゼ (RL) によるエキソン同士の連結、そして2’-フォスフォトランスフェラーゼ (Pt)による2’-リン酸基の除去）。これら3種の酵素はGFPを指標とした融合タンパク質の発現から核に共通して局在する。興味深いことに、RLとPtはそのN末端側にオルガネラへの移行シグナルが予測され、これらのGFP融合タンパク質は葉緑体への移行も同時に観察された。葉緑体の前駆体tRNAイントロンはセルフスプライシング型であり、核tRNAスプライシングとはその分子機構は大きく異なる。RLは少なくとも葉緑体では本来のスプライシング機能以外の役割を担っていると推察される。植物RLの葉緑体での機能を解明するために、RL内のリガーゼドメインの保存されたアミノ酸残基に置換を導入した、変異RLをコードする遺伝子を構築し、葉緑体で過剰発現させるための遺伝子カセットを植物発現ベクターに組み込んだ。現在形質転換体の作出を進めている。その成長分化に与える影響、ストレス感受性、葉緑体内でのRNA修復機能などを指標としてRLの機能解析を行う予定である。

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スミレは古来より紫花地丁と呼ばれる漢方薬として用いられてきた。これはスミレ属の中のノジスミレやコスミレ、アカネスミレおよびスミレなどの全草を乾燥させたものであり、解毒や消腫、静熱など様々な効果が知られている。我々は、これまで日本産スミレが含有するアントシアニンやフラボノイドを指標とした化学分類やアレロパシーの研究を行ってきた。スミレ属のアントシアニンやフラボノイドには共通性があり、またこれらは種により特徴的な分布が認められる。一方、漢方における紫花地丁は異なるスミレ数種を同一視しているが、これらの機能性成分であるフラボノイドの調査はノジスミレにおいてvicenin-2やisoorientinの報告があるのみで、他種における詳細なフラボノイド調査は行われていない。そこで、紫花地丁に用いられる代表的なスミレ3種（ノジスミレ、コスミレ、アカネスミレ）について、そのフラボノイド成分のより詳細な分析とそれぞれの機能について調査した結果、コスミレからwogonin配糖体を主要フラボノイドとして見いだした。

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植物では、乾燥ストレスによって細胞内のアブシシン酸（ABA）濃度が上昇し、乾燥ストレス応答に関わる遺伝子群の発現が誘導されると考えられている。ABA存在下では、ABA受容体であるPYR／PYL／RCARファミリータンパク質がグループA プロテインホスファターゼ2C（PP2C）と複合体を形成し、これによってPP2Cによる負の制御が解除されSnRK2プロテインキナーゼが活性化される。サブグループIIIのSnRK2プロテインキナーゼはAREB／ABFなどの多くの転写因子を正に制御し、また、AREB／ABF転写因子（AREB1／ABF2、AREB2／ABF4およびABF3）はABA応答（ABRE）配列を介して多数のABA／乾燥ストレス応答性遺伝子の発現を制御していることを示してきた。本研究では、シロイヌナズナとイネを用いてAREB-SnRK2経路が乾燥ストレス応答において果たしている役割を解析した。BiFC法を用いたタンパク質間相互作用解析やT-DNA 挿入変異体を用いた網羅的遺伝子発現解析などを通して、AREB-SnRK2経路が乾燥ストレス時のABAシグナル伝達系において中心的な役割を果たしていることを示した。また、乾燥ストレス時のABAシグナル伝達系においてAREB-SnRK2経路が制御していると考えられる遺伝子発現ネットワークについてもあわせて考察する。

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植物は、ストレス応答や形態形成においてNADPH oxidaseを活性化し活性酸素種（ROS）を積極的に生成するが、その制御機構は不明な点が多い。我々は、植物NADPH oxidaseの酵素本体rbohをヒトHEK293T細胞で発現させる異種発現系を構築し、シロイヌナズナAtrbohDの活性制御機構を明らかにした(Ogasawara et al. 2008)。イネの病害抵抗性に重要な役割を持つイネOsrbohB の制御には低分子量Gタンパク質OsRac1等の関与が示唆されている (Wong et al. 2007)が、活性発現の分子機構は未解明である。OsrbohBを発現させたHEK293T細胞に、Ca²⁺イオノフォアを処理すると、一過的なROS生成活性が観察された。種々の部位特異的突然変異体を解析した結果、Ca²⁺の結合が予想される2つのEF-hand領域のうち、最初のEF-hand領域がCa²⁺を介した活性化に重要であることを明らかにした。一方，プロテインホスファターゼ阻害剤カリクリンA処理により持続的なROS生成活性が観察され，カリクリンAとCa²⁺イオノフォアの連続処理により相乗的な活性化が見られた。以上からOsrbohBのROS生成活性は，EF-hand領域へのCa²⁺結合及びタンパク質リン酸化により相乗的に活性化されることが明らかとなった。

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我々はラン藻Synechocystis sp. PCC 6803のヒスチジンキナーゼを、変異株ライブラリーを作製して機能解析を行ってきた。しかしこの方法では、染色体上の野生型遺伝子を変異型遺伝子に完全に置き換えることのできないヒスチジンキナーゼは解析できなかった。そのうちのひとつHik2について、そのシグナル検知ドメインと、リン酸欠乏応答性ヒスチジンキナーゼSphSのキナーゼドメインとを融合させたキメラセンサーを発現させることで、Hik2の機能解析を試みた。Hik2はN末端側にGAFドメインを持ち、全てのラン藻ゲノムに保存される重要なヒスチジンキナーゼである。キメラ遺伝子は染色体上のsphSコード領域と置き換え、sphSプロモーターから発現させた。Hik2のシグナル検知ドメインがSphSのキナーゼドメインを活性化すると発現されるアルカリフォスファターゼ（AP）の活性を指標に評価した。
キメラセンサーを導入した株は、通常培養条件において低いAP活性が見られた。NaClにより塩ストレスを与えると濃度依存的にAP活性の誘導が見られたが、強光、高浸透圧、酸化ストレスなどでは誘導されなかった。この応答性は、GAFドメインに保存されたアミノ酸残基の置換により失われた。以上の結果から、Hik2はGAFドメインで塩ストレスに応答することが示された。

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一般にヒスチジンキナーゼ（Hik）はN末端側のシグナルインプットドメイン（SID）でシグナルを検知し、C末端側のトランスミッタードメインでシグナルを伝達する。ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803は高塩濃度・低温等、様々なストレスに応答するHik（Hik33）を持つが、そのシグナル検知の分子機構は未解明である。Hik33はSIDに二つの膜貫通ドメイン、ペリプラズム領域、HAMPドメイン、およびPASドメインという複数のサブドメインを含む。これらサブドメインのシグナル検知における機能を解明するため、Hik33のSIDをリン酸欠乏応答性Hik（SphS）のC末端側と融合したキメラHikをSphS欠損株で発現させた。このキメラHikはHik33が応答する塩ストレス条件に応答し、SphS下流のアルカリフォスファターゼ遺伝子phoAの発現を制御した。キメラHikのSIDに含まれるHAMPドメインとPASドメインを両方欠損させると、調べたいずれの条件でもphoAを発現できなくなったことから、この欠損はキナーゼ活性を失わせてしまうものだったと考えられた。しかし、HAMPドメインのみの欠損はキナーゼ活性を維持し、また塩ストレス条件でのphoAの発現制御がみられた事から、HAMPドメインはHik33の塩ストレス検知には影響しないことが示唆された。

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固着性である植物は生息地に対応して他個体との競争を勝ち抜くために、外部環境から受容する刺激と遺伝情報に基づき発動する発生プログラムを統合して環境に対応するという優れた柔軟性を進化の過程において獲得してきた。我々は、植物の優れた環境適応である自在な伸長成長に着目し、この過程を理解するための要として生合成系と情報伝達系を内包するGAフィードバック制御機構を捉え、分子レベルでの解析に取り組んでいる。
これまでに、GA内生量情報がカルシウム依存性タンパク質キナーゼ・CDPK1によりGA生合成系酵素遺伝子の発現を司る転写活性化因子・RSGに伝達される事を明かとしてきた。 CDPK1はGA内生量上昇によりリン酸化を受ける。 GAフィードバック制御の情報伝達に於けるこのリン酸化の意味を探るため、GAにより誘導されるCDPK1のリン酸部位の同定を質量分析により試みた。又、in vitroリン酸化アッセイからCDPK1の自己リン酸化能を明かとしている。点変異を導入したリコンビナントタンパク質を用いたin vitroリン酸化反応から、自己リン酸化される部位、S259とS429を同定した。これまでに、S259のリン酸化はRSGのリン酸化には必要であるが自己リン酸化には必要ではない事、S429のリン酸化が14-3-3との結合に必須である事等の解明に成功した。

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CO₂は濃度依存的に気孔の開閉を誘導する環境因子であり、低CO₂条件下では気孔は開口し､蒸散量が上昇し､葉面温度が低下する。このような植物のCO₂感知のメカニズムを調べるために、現在、CO₂濃度依存的な葉温変化に異常をきたすシロイヌナズナ突然変異体のスクリーニングを行っている。 ht2 (high leaf temperature 2) は、低CO₂条件下で高温を示す変異株として単離され、CO₂濃度変化に伴う気孔の応答性が低下していることが確認された。さらにht2は種子の発芽、気孔閉鎖においてABA高感受性であることが明らかとなった。つまり、HT2は孔辺細胞においてCO₂, ABA両シグナルの下流で機能を持つと考えられる。マッピングの結果、HT2遺伝子は機能未知のタンパクをコードしており、ht2変異はナンセンス変異であった。Promoter-GUS解析の結果、HT2は地上部、根いずれの組織においても発現が確認され、特に維管束において発現が顕著であることが明らかとなった。また、RT-PCRにより葉肉細胞、孔辺細胞のどちらにおいても発現していることがわかった。また、細胞内局在を調べたところ細胞質ゾルに局在することが明らかとなった。HT2がこれまでに単離されたCO₂感受性変異体HT1、SLAC1とどう関わるのかについても議論したい。

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プロテインホスファターゼ1（PP1）は真核生物に高度に保存されたタンパク質であり、細胞内において触媒サブユニット（PP1c）と多種の調節サブユニットからなるホロ酵素を形成し、多様な反応に関与する。ホロ酵素としての触媒活性、細胞内局在、基質特異性はPP1cに結合する調節サブユニットの性質により規定されるが、植物における調節サブユニットは一つも同定されていない。本研究ではPP1c結合タンパク質の探索を行い、シロイヌナズナのPP1調節サブユニットとしてInhibitor-3（Inh3）を単離した。Inh3はPP1cの認識に必要なRVxFモチーフを介してPP1cと結合し、PP1cの活性を阻害した。GFP融合Inh3とmCherry融合PP1cをソラマメ孔辺細胞に一過的に共発現させたところ、両者は細胞質と核で共局在した。INH3のT-DNA挿入変異体では、球状胚で発生が停止し胚致死変異の表現型を示した。inh3変異体に野生型のINH3遺伝子を形質転換すると胚致死変異は相補されたが、RVxFモチーフ内のアミノ酸置換によりPP1cとの結合能を欠損させた変異型INH3では相補されなかった。さらにRNAiによりINH3の発現を抑制させた形質転換体では種子形成が阻害された。以上の結果からInh3はPP1調節サブユニットとして機能し、シロイヌナズナの初期胚発生に必須の因子であることが示唆された。

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PCaP1 (plasma membrane associated cation-binding protein-1)はシロイヌナズナの新規タンパク質であり、リジンやグルタミン酸に富み、膜貫通領域を持たずN-ミリストイル化を介して細胞膜に結合している。Ca²⁺、 Cu²⁺、PtdInsPs、 CaM/Ca²⁺ との結合能を持つ (Nagasaki et al. 2008a, b)。遺伝子破壊株pcap1では過剰な銅や病原菌エリシター処理で生育が低下する。本研究ではPCaP1の細胞内局在とその動態を解明するため、PCaP1-GFP融合分子をシロイヌナズナに発現させた。PCaP1は花粉、根端以外の全ての細胞の細胞膜に局在しており、上記のストレス下でもPCaP1の局在は変化せず、安定的に細胞膜に存在していた。PCaP1はどの細胞においても細胞膜に均一に発現していたが、孔辺細胞においては内側には蛍光が見られず外側にのみ観察された。この偏在に注目し野生株とpcap1で気孔開度を測定したところ、暗条件においてpcap1では気孔が閉じにくくなる現象が見られた。pcap1株は乾燥ストレスにも感受性であると推測され検討中である。以上、PCaP1は細胞膜に安定に結合しており、PtdInsPs や CaM/Ca²⁺と相互作用することで細胞内のシグナル伝達に関与していると考えられる。

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植物の芽生えは一方向からの青色光照射によって光源方向に屈曲しながら成長する、いわゆる光屈性を示す。シロイヌナズナやイネの突然変異体を用いた分子遺伝学的研究によって、NPH3 とよばれるアダプター様タンパク質が光屈性を誘導するシグナル伝達に必須の働きをすることが明らかになっている。NPH3 は暗条件下においてリン酸化されており、青色光照射下では光屈性を誘導する青色光受容体 phot1 依存的に脱リン酸化される。NPH3 の光に応答したリン酸化状態の変化は、NPH3の機能に重要な影響を与えると予想されるが、これまでその詳細は明らかになっていない。我々は、NPH3 リン酸化状態の変化が光屈性に与える影響、及びphot1 による NPH3 脱リン酸化制御機構の解明を目的として、NPH3リン酸化に働くタンパク質キナーゼの探索を行った。リン酸化NPH3特異的認識抗体を大腸菌発現スクリーニングに適用することにより、我々はNPH3をリン酸化しうるキナーゼ候補の同定に成功した。本キナーゼは大腸菌内及び in vitro において、NPH3をリン酸化しうる能力を示した。

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高等植物では、葉緑体の発達が阻害されると、葉緑体機能(特に光合成機能)に関わる核コードの遺伝子群の転写が強く抑制される。この調節にはプラスチドから核へのレトログレードシグナル（プラスチドシグナル）が関わることが示唆されている。また、このシグナル伝達系変異体の多くがテトラピロール合成に関わる遺伝子をコードするため、テトラピロール合成中間体がシグナルであるとの説も提唱されているが、その実体は明らかではない。そのため、テトラピロール合成系変異体を網羅的に解析し、プラスチドシグナルとの関わりを再検討した。その結果、プロトポルフィリンIXより前の初期段階に関わる遺伝子を欠損してもプラスチドシグナルは正常に機能することが分かった。一方、Fe-ブランチの反応に関わるhy1やhy2変異体（ヘムオキシゲナーゼおよびフィトクロモビリン合成酵素）でもプラスチドシグナルに異常が見られるが、その原因はこれらの変異体でヘムが蓄積し、その結果ALA合成が抑制されるためと説明されてきた。しかし、上で述べたようにテトラピロール合成初期段階の抑制では説明が出来ない。そこで、Fe-ブランチの代謝系を改変した形質転換体や、ビリベルジンの投与、およびフィトクロム多重変異体を用いた詳細な解析を行った。さらに、FOXハンティング系統を用いた新規プラスチドシグナル伝達系変異体スクリーニングについても報告を行う。

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Phytochrome(PHY)は、イネの唯一の赤/遠赤色光受容体である。イネには、PHYA、B、Cの3種類が存在する。イネPHYの欠損突然変異体間の比較から、形態形成、開花などにおいて、PHY分子種間の役割の違いが示唆されている。特定のPHYによって制御されている遺伝子を特定することを目的にマイクロアレイ解析を行った。今回は、以前、報告したイネフィトクロム欠損突然変異体の暗所芽生えに赤/遠赤色光をパルス照射したマイクロアレイのデータのWAD法(Kadata, Nakai, Shimizu, 2008)による再解析を行った。結果は、おおまかには以前の解析での結果を確認するものだったが、WAD法によって、より特異性の高い選抜が行えた。赤色光、遠赤色光で発現変動する遺伝子は共通性が高かった。残念ながら、PHYA、PHYB特異的な遺伝子は特定できなかった。しかし、PHYAとPHYCの両方を欠損した突然変異体で、赤色光による発現変動が抑えられる一群の遺伝子を同定できた。RT-PCRによる解析で、これらの遺伝子には、光照射後、短時間で発現が一過的誘導(抑制)される遺伝子が多く含まれていた。また、これらの遺伝子は、赤色光を連続照射した際にも一過的発現をすることを確認した。選抜されてきた遺伝子群には、ジャスモン酸応答遺伝子を含むストレス耐性関連の遺伝子が多く含まれた。

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