ブラシノステロイド（BR）は、植物の生長調節に必須の植物成長ホルモンである。これまでに我々は、様々な光条件下で生育したイネの内生BR量を測定した結果、白色光または青色光下で生育したイネの茎葉部において、特にtyphasterol、castasteroneといった6-オキソ系のBR量が顕著に増加していることを見いだした。一方、赤色光、近赤外光下では、暗黒条件下とほぼ同程度の内生量であった。また、根では、光条件の変化によるBR内生量の明瞭な増減は認められなかった。そこで、茎葉部でのBR生合成遺伝子発現に対する光の影響を明らかにするために、リアルタイムPCR法を用いて、詳細な遺伝子発現解析を行った。その結果、青色光および白色光条件下では、C-6酸化酵素をコードしているP450の一種であるCYP85A1遺伝子の発現が、暗黒条件下と比較して顕著に増加していることが明らかとなった。一方、赤色光、近赤外光では、このような発現量の増加は認められなかった。以上の結果から、白色光下で生育したイネ茎葉部での内生BR量の増加は、主に青色光成分によってCYP85A1遺伝子の発現が誘導された結果、C-6酸化過程が促進されたものと考えられる。

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我々は、植物を低窒素条件下でアブシジン酸（ABA）を処理するとクロロフィル含量が高いレベルで維持されることを報告してきた。クロロフィル含量はクロロフィルの合成と分解により調節されることから、低窒素条件下でのクロロフィル生合成と分解に関わる遺伝子の発現量に対するABAの影響を調べた。クロロフィル生合成に関わるいずれの遺伝子も無処理区と比較してABA処理区において発現量が増加した。一方、クロロフィル分解に関わる遺伝子は、無処理区と比較してABA処理区において発現量が減少していた。また、クロロフィルは葉緑体のチラコイド膜のタンパク質と結合して複合体を形成していることから、低窒素条件下においてクロロフィルa/b結合タンパク質の遺伝子発現量を調べたところ、無処理区では日数の経過とともに発現量が減少していたが、ABA 10^-5 M処理区では発現量の減少は認められなかった。電子顕微鏡を用いて葉緑体構造を観察したところ、無処理区ではチラコイド膜の配列の乱れが見られたが、ABA処理区ではその構造が維持されていた。以上の結果から、低窒素条件下で生育させたキュウリにおいてはABAによりクロロフィル生合成が促進されるとともにクロロフィル分解が抑制されることによりクロロフィル含量が高く維持されることが示唆された。また、クロロフィルが葉緑体中で結合タンパク質と結合し、安定に保持されている可能性が示唆された。

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サイトカイニンは植物の発生や生長段階のさまざまな過程の制御に関わる植物ホルモンである。活性型サイトカイニンであるトランスゼアチン(tZ)の生合成経路では、まず前駆体としてヌクレオチド体が合成されたのち、リボースリン酸がはずれtZになることで活性をもつ。リボースリン酸をはずす活性化経路には脱リン酸および脱リボースからなる二段階経路と、脱リン酸リボースを一段階の反応でおこなう直接経路の二つの経路が知られている。しかしながら二つの経路の生理的役割の違いは明らかにされていない。本研究では直接経路に関与するLONELY GUY (LOG)ファミリー遺伝子の機能欠損変異体を解析することによりサイトカイニン活性化経路の生理機能の解明を試みた。シロイヌナズナにはLOGファミリー遺伝子(AtLOG1-5, 7, 8)が7つ存在する。これらのT-DNA挿入変異体を同定し、さまざまな多重変異体を作出したうえで表現型の変化を観察した。結果、各単変異体では野生型と比べ表現型に違いが見られないもののlog2log7, log3log4log7などの多重変異体はサイトカイニンに依存した側根数の減少が抑制された。log3log4log7では花茎の成長が野生型に比べ遅延するなどの違いが見られた。現在AtLOG1,2,3,4,7五重変異体を作出し表現型観察および安定同位体標識化合物を用いたトレーサー実験を進めている。

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植物の発生から栄養生長、花芽分化から種子形成にいたる様々な局面で植物ホルモンは情報分子として重要な役割を演じている。個々のホルモンは情報伝達系を介し遺伝子発現を制御するとともに、他のホルモンとの量的バランスによる相互制御により、多様な作用を可能にしている。我々は半自動固相抽出法とUPLC-タンデム四重極質量分析器（UPLC-ESI-qMS/MS）、さらにカルボン酸修飾試薬ブロモコリンを利用することで、活性型分子種を含むサイトカイニン23種、IAAとそのアミノ酸縮合体を含むオーキシン7種、アブシジン酸、ジベレリン12種の計43分子種を同じ植物試料（新鮮重量10mg ～ 100 mg）から、180 サンプルの測定を同時に行なう方法を確立している。この方法により複数のホルモン内生量の動態を一度に把握することが可能になった。イネの各器官における内生ホルモン量を解析し、各ホルモンの蓄積分布を明らかにした。さらにジベレリン情報伝達系遺伝子変異体におけるホルモン解析とマイクロアレイ解析を行なったところ、ジベレリン以外のホルモン内生量の変化とそれに関わる代謝系遺伝子の発現変動が明らかになった。今後この方法を利用することで、複数のホルモン代謝系および情報伝達系の相互制御のしくみに関する有益な情報が得られるものと期待される。現在イネのホルモン内生量を支配する遺伝子座をQTL解析により探索している。

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アグロバクテリウムが植物に感染するとTiプラスミド上のT-DNA領域が宿主細胞の核ゲノムに組み込まれる。T-DNA領域にはサイトカイニン(CK)合成酵素(Tmr)やオーキシン合成酵素がコードされており、両ホルモンの過剰生産により細胞の腫瘍化が誘導される。これまでに我々は宿主細胞内で発現したTmrがプラスチドに移行し、HMBDPを専らの基質としてトランスゼアチン(tZ)型CKを直接合成することを明らかにした[PNAS (2005) 102: 9972]。しかしTmrが植物とは異なるCK合成経路を駆動する意味についてはよく理解されていない。そこで本研究ではTmrと、Tiプラスミド上にもう一つ存在するTmrホモログ(Tzs)の生化学的な比較解析を行なった。TmrとTzsはin vitroではDMAPP, HMBDPに対する基質親和性はほぼ同じであったが、DEX誘導型過剰発現シロイヌナズナ株を用いた実験では、TmrはHMBDPを優先的に利用していた。プラスチド移行シグナルを付加したTzs (TP-Tzs)の過剰発現株では、iP型、tZ型CKともに過剰に蓄積した。このことからTmrはプラスチド内で優先的にHMBDPを利用できる何らかの機能を有していることが示唆された。現在T-DNA上のTmrをTzs, TP-Tzsに置換した組換えアグロバクテリウムの腫瘍形成能力について比較検討を行っている。

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植物ホルモンの一つであるエチレンは，植物の生育において多面的な作用を引き起こす。しかしながら，エチレンが細胞に及ぼす影響については不明な点が多い。そこで，発育段階初期のキュウリを用いてエチレンが及ぼす影響について解析を行った。具体的には，子葉の葉身が2cm展開したキュウリに対して，3種類の濃度（0．014mM，0．07mM，0．35mM）のエテホン処理を行った。その結果，0．35mMのエテホン処理区では，対照区と比べて，子葉の上偏成長だけでなく，小さな本葉が次々と展開する現象が認められた。また，いずれの処理区においても，子葉表面に存在するトライコーム周辺の表皮細胞の肥大と核DNA量の増加が認められた。さらに，エテホンを処理した子葉では，トルイジンブルーOはトライコーム周辺の肥大した表皮細胞を特異的に染色することが明らかとなった。0．35mMのエテホン処理により次々と展開した本葉では，対照区と比べて，葉面積が小さく，かつ，表皮細胞の細胞数が有意に少ないことが判明した。以上の結果は，エチレンは，細胞分裂を終えた組織（子葉）においては，一部の細胞（トライコーム周辺の表皮細胞）の肥大，核内倍加，およびポリフェノール化合物の蓄積を促進する一方で，茎頂分裂組織（本葉）においては，細胞分裂を抑制することを示唆している。

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シロイヌナズナAux/IAA遺伝子族の一つであるMSG2/IAA19は胚軸屈性反応のマスター遺伝子と考えられ、黄化芽生え胚軸でよく発現しており、また根では中心柱と、根端領域の原生木部と後生木部に特異的な発現が観察される。今回IAA19の発現を調節している因子を探すことを目的として、IAA19プロモーターGFPラインにEMS処理を行い、M1種子から1系統ずつM2種子を収穫し、暗所芽生えのGFPシグナルの変化を指標に突然変異体のスクリーニングを行なった。約1000系統を調べたところ、GFPシグナルが変化している系統がおよそ3割得られ、それら変異体候補の半分は様々な表現型異常を示した。GFPシグナルが減少していた系統であるF10は根毛形成が異常で、野生型では根全体に根毛が形成されるが、F10の根ではほとんど生えない。しかし、その後の成長は野生型と変わらず成体での異常は特に観察されなかった。また、F10でのIAA19発現をReal-time PCR法で調べたところF10のIAA19 mRNAレベルは、野生型の約2割に減少していた。F10のマッピング解析を行なったところ、5番染色体に強い連鎖が観察された。今後、このスクリーニングで得られた変異体候補を順次マッピング解析して原因遺伝子を特定することで、IAA19の発現調節機構を明らかにしたい。

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Small Acidic Protein 1 (SMAP1)は、合成オーキシン2,4-Dの応答機構に関わる遺伝子である。SMAP1がコードするタンパク質はフェニルアラニンとアスパラギン酸に富む領域(F/D領域)を持ち、類似したタンパク質をコードする遺伝子は、動植物において広く保存されている。これまでにF/D領域がSMAP1の機能に必要であること、また、SMAP1-GFPとCOP9 signalosome (CSN)が結合することを報告している。そこでSMAP1とCSN間の結合をさらに詳細に調べるために、大腸菌で発現させて精製したSMAP1のGST融合タンパク質 [GST-SMAP1 (全長)、GST-SMAP1ΔF/D (F/D領域欠失)、GST-F/D (F/D領域のみ)およびGST (コントロール)]を、aar1(SMAP1欠失変異体)の総タンパク質と混合しプルダウンを行い、Western法を用いてCSNとの結合を調査した。その結果、GST-SMAP1およびGST-F/D でCSNとの結合がみられた。以上の結果から、大腸菌で発現したSMAP1でもCSNとの結合が再現できること、また、その結合にはF/D領域が必要かつ十分であることが示された。

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RecQ helicases are involved in the process of DNA replication, recombination and repair. Arabidopsis genome contains seven RecQ like genes. Recently, Hartung et al reported RecQl4A and RecQl4B knockout mutant in Arabidopsis. AtRecQl4A mutant showed enhanced frequency of homologous recombination compare with that of wild type. In contrast, AtRecQl4B mutant showed reduced frequency of HR. Furthermore, AtRecQl4A mutant showed sensitivity to DNA damaging agents, but AtRecQl4B mutant did not. In monocotyledon model plant, rice had been reported to have seven RecQ homologues. Interestingly, in contrast to Arabidopsis, rice has a single RecQl4-like gene. We cloned the full length OsRecQl4 cDNA, which is 3.5 kb in length and encodes an open reading frame of 1174 amino acid. It has a HRDC (Helicase and RNase D C-terminal) domain, which shows function of dissolution of double Holliday junctions (Wu L. et al. 2005). In addition, we characterized T-DNA and Tos17 insertion mutant of RecQl4 in rice.

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多くの植物細胞は生長過程においてDNA複製と細胞分裂が交互に起きる細胞分裂周期を経た後、細胞分裂を伴わずDNA複製のみ起こる核内倍加周期へと移行する。こうした移行は細胞が最終的な分化や伸長生長を開始する時期に起きることが知られ、植物の生長を制御する重要な過程であるが、この移行過程がどのように制御されているかは分かっていない。最近、我々は核に局在するHIGH PLOIDY2 (HPY2)というSUMO (Small ubiquitin-like modifier) E3 ligaseがシロイナズナのメリステムにおいて核内倍加周期への移行を抑制していることを解明した。SUMOはE3 ligaseを通じて種々の基質タンパクと結合しその機能を調節する。また、HPY2はメリステムにおいて発現しており、この機能が失われたhpy2変異体では細胞分裂周期の活性が低く、メリステム細胞が通常よりも早く核内倍加周期に移行してしまうため、メリステムが維持されず植物体全体が極度に矮小化してしまう。さらには、HPY2の機能はメリステムパターン形成に関与する転写因子PLETHORA1 (PLT1)及びPLT2の制御下にあることから、オーキシン-PLTによる細胞周期の転換及びメリステムの維持過程においてHPY2によるSUMO 修飾制御が重要な役割を持つことが明らかとなった。

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植物細胞の増殖にはオーキシンが必須だが、増殖にオーキシンを必要としなくなる現象が古くから知られており、馴化（habituation）と呼ばれている。馴化の分子機構は、未だ明らかではない。我々は、以前タバコ懸濁培養細胞BY-2および、BY-2細胞から誘導された馴化細胞2B-13の細胞外ろ液中に存在する細胞分裂因子（cell division factor : CDF）を報告した。BY-2細胞は増殖にオーキシンを必要とし、オーキシン欠損培地中では増殖を停止するが、CDF添加により細胞分裂を再開する。CDFはオーキシンによらず細胞分裂を誘導できるため、その解析は馴化の分子機構の解明につながると考えられる。今回、我々はBY-2細胞の細胞抽出液からCDFの精製を試みたので報告する。このCDFは細胞ろ液中のCDFと同じく糖ペプチドで、分子サイズの異なる因子が2つ存在していた。これら2つの因子は電気的性質も異なっていた。また、細胞植継ぎ後の細胞分裂率と細胞中のCDF量の関係を解析したところ、CDFは植継ぎ後1日目からすでに検出され、4日目にはほとんど検出されなかった。細胞分裂率がピークになる2日目より前からCDFが検出され、さらに、オーキシン飢餓状態のBY-2細胞からはCDFが検出されなかったことから、BY-2細胞はオーキシンの存在下でCDFを作り、CDFにより細胞分裂が誘導されると考えられる。

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単細胞紅藻Cyanidioschzon merolae(シゾン)において、暗所でG1期に同調した細胞に光を照射すると、まずオルガネラDNA複製(ODR)が起こり、その後に核DNA複製(NDR)が誘導される。この際、ODRを特異的に阻害するとNDRも同時に阻害されることから、ODRはNDRの誘導に必須であることが判る。我々のこれまでの研究で、色素体で合成されるMg-Protoporphyrin IXがODR後に細胞内に蓄積し、それに依存してCDKAが活性化されることでNDRが誘導されることが明らかになっている^{1, 2}。一方、光によりODRが活性化される分子機構については全く不明のままである。最近我々は、CDKの活性を広く阻害する薬剤(Roscovitine)を用いた解析から、未知のCDK複合体がODR開始に必須であることを見出した。本研究では光によるODR活性に関わるCDK複合体を同定するために、DNA合成期における各種のCDKとCyclinの発現について解析を行ったので報告する。
¹ Kobayashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106:803-807 (2009)
² Kanesaki et al. Plant Signal. Behav. in press (2009)

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DNAチェックポイントとは、ゲノム上のダメージや複製フォークの進行の阻害といったゲノム上の問題を感知し、直ちに細胞周期を停止させる仕組みである。このチェックポイント機構が機能しなければ、ゲノムが正確に複製される前に細胞分裂が生じてしまうため、ゲノムの欠損や転移などといった染色体異常が生じ、細胞を正常に維持出来なくなる。植物は固着性生活を営んでおり、そのゲノムは常に紫外線などのダメージにさらされている。この事からも植物にとってDNAチェックポイントは大変重要であると考えられる。そこで本研究では植物のDNAチェックポイント機構に関与する遺伝子として新たに単離された転写因子SOG1に注目し、植物がもつ独自のチェックポイント機構を解析する事を目的としている。シロイヌナズナではガンマ線の照射によって100以上の遺伝子発現が誘導されることが報告されているが、驚くべき事にその遺伝子誘導のほとんどがSOG1に依存していた。さらにSOG1はガンマ線照射後の細胞周期の停止の維持やゲノムの安定性に重要であることも明らかになった。またSOG1の発現部位が茎頂分裂組織や根端分裂組織、そして側根原基といった分裂組織に特化していたことなどからも、SOG1は活発に分裂している細胞がDNAダメージを受けた場合、そのシグナルを下流に伝達する過程において重要でかつ中心的な役割を担っている転写因子であると考えられる。

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植物細胞内のDNAは常に損傷の危険に曝されており、DNA損傷に対する応答は植物の生存に必須である。生物は細胞周期を厳密に制御することで、DNA複製前あるいは細胞分裂前に損傷DNAを修復する時間を確保し、正確なDNA複製を可能にしているが、植物でも同様の機構が働いているかは明らかにされていない。
シロイヌナズナでは細胞周期の進行に中心的な役割を果たすサイクリン依存性キナーゼが2タイプ（CDKA, CDKB）存在する。このうちCDKBは細胞周期依存的な発現パターンを示し、S期後期～M期に特異的な機能を持つ植物特異的なCDKであると考えられている。CDKBはさらにCDKB1とCDKB2に細分されるが、特にCDKB2に関しての知見は未だ乏しい。
これまでに我々は、CDKB2がDNA二重鎖切断に応答してタンパク質分解を受けることを明らかにした。また、シロイヌナズナ植物体の根端および培養細胞を用いた細胞の観察から、DNA二重鎖切断に応答してDNAの核内倍加(エンドサイクル)が起こることが示唆された。そこで、CDKB2の発現抑制がエンドサイクルを誘導するかどうかを明らかにするために、シロイヌナズナ培養細胞を用いてCDKB1またはCDKB2のノックダウン系統を作成し、DNAの倍数性解析を進めている。また、CDKB2のタンパク質分解を制御する上流の制御因子についても解析しているので合わせて報告する。

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細胞周期の過程で、遺伝情報が正確に2つの娘細胞に分配されるためにはDNA損傷による変異が細胞分裂前に修復されることが必要だが、植物のDNA損傷に対する応答機構は未解明の部分が多い。我々は、シロイヌナズナでDNA二本鎖切断によってB2型サイクリン依存性キナーゼ（CDKB2）が分解されG2期からM期への移行が阻害されると同時に、DNAを複製するS期のみが繰り返されDNAが倍加し続けるエンドサイクルに移行することを明らかにしてきた。
CDKB2 の第一エキソンには75アミノ酸がコードされており、その中の46～59番目のアミノ酸配列がタンパク質分解の指標となるPEST配列と考えられている。今回CDKB2 の第一エキソンの一部を欠損あるいはアミノ酸置換を導入したレポーターラインを作製した。その結果46～75番目のアミノ酸を欠損させるとゼオシン処理時のタンパク質分解が抑制されたが、PEST配列にアミノ酸置換を導入したものではタンパク質分解が正常に起こることが確認された。よって、CDKB2のタンパク質分解はPEST配列ではなく、60～75番目のアミノ酸に依存していることが明らかになった。
またDNAの倍数性レベルに異常を示す変異体を用いてDNA損傷感受性試験を行った。それらの結果からDNAの倍数性とDNA損傷に対する耐性の関連性を明らかにし、エンドサイクルへ移行する生理的意義を考察したい。

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オーキシンは植物の形態形成に重要なホルモンであり、オーキシン濃度と細胞増殖から分化への移行には密接な関連性が見られる。植物細胞が分化する過程では、通常の細胞周期から、DNAの核内倍加が起こるエンドサイクルに移行することが知られている。エンドサイクルへの移行には、細胞周期制御因子であるサイクリン依存性キナーゼ（CDK）の活性制御が重要であることが示唆されている。
シロイヌナズナの細胞周期を中心的に制御しているCDKにはA型（CDKA）およびB型（CDKB）があり、CDKBはさらにB1型（CDKB1）とB2型（CDKB2）に細分される。我々の最近の研究結果より、細胞周期のG2/M期に特異的に発現するCDKB2の発現制御がエンドサイクルへの移行にも重要な役割をもっていることが示唆されていることから、CDKB2の量的制御が分化の過程でのエンドサイクルへの移行にも重要なのではないかと考えられた。そこでオーキシン競合阻害剤によりCDKB2のGUSレポーター系統を処理したところ、CDKB2が転写レベルよりも早いタイミングでタンパク質分解系により制御されていることが明らかとなった。最近、CDKB2の発現制御にSUMO E3 ligaseであるHIGH PLOIDY2による安定化が関与している可能性も示唆されたため、CDKB2の分解と安定化の両側面から詳細な解析を行っている。

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イネ（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）の染色体DNA中の複製フォークを標識し検出した。植物材料であるイネ懸濁培養細胞は7日ごとに継代して維持した。細胞がもっとも活発に増殖する時期、すなわちS期にある細胞が最も多い時期である植え継ぎ後5日目の細胞にブロモデオキシウリジンを与え、複製中のDNAをパルス標識した。次に、簡便な方法で核を単離した。スライドガラス上で核から染色体DNAを抽出し伸展させた。そして、抗ブロモデオキシウリジン抗体と蛍光標識した二次抗体を用いて標識された部位を検出した。この結果、蛍光顕微鏡下で複製フォークを観察することができた。さらに、レプリコンサイズを測定することができた。今後は、これらの結果をもとにして、イネを含む高等植物では未知の領域である染色体DNAの複製開始点をクローニングし、染色体上の位置を特定することを目指す。

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翻訳後修飾SUMO化は真核生物における成長の制御に関わっているが、植物における役割はあまり分かっていない。我々はこれまでにSUMO E3リガーゼSIZ1の変異株がdwarf様表現型を示し、この表現型がサリチル酸蓄積とリンクしていることを明らかにしてきた。本発表ではSIZ1が細胞分裂及び細胞伸長に関わっており、これら細胞成長もサリチル酸の蓄積の制御によるものであることを示す。siz1植物はdwarf様の表現型を示すが、これは細胞分裂及び細胞伸長の減少に依るものであった。siz1植物はサリチル酸を蓄積しているが、サリチル酸濃度を減少させるためnahGを導入した植物(siz1 nahG)では細胞分裂、伸長が回復し、植物成長も回復した。サリチル酸による細胞伸長を制御する候補遺伝子として細胞壁構築、再編に関わるXTH遺伝子に注目してその発現量を調べた。すると、XTH8及びXTH31の発現量がサリチル酸蓄積変異株siz1では減少し、サリチル酸濃度を低下させたsiz1 nahGでは発現量が回復していた。これらの結果から、XTH8及びXTH31がサリチル酸による細胞伸長制御に関わる遺伝子である可能性が示唆された。

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ペリディニン含有渦鞭毛藻は、二次共生により葉緑体を紅藻から獲得したアルベオラータの一分類群である。渦鞭毛藻の葉緑体ゲノムは、他の藻類や植物のような単一の環状染色体としてではなく、ごく限られた数の遺伝子が一つずつ小さな環状分子“ミニサークル“上に存在している。例えば渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseのpsbAは全長1041塩基であり、20塩基の逆方向反復配列を含む残りの”非コード領域“と共に5.7kbのミニサークル構造をもつ。我々は、このA. tamarenseのミニサークルゲノムに、通常型psbAとともに低頻度だが存在する4種類のpsbAバリアントを発見した。これらpsbAバリアントは奇妙な構造をもち、通常型遺伝子のコード配列の全長（若しくはほぼ全長）を保持するにもかかわらず、挿入や転位などの構造変異のためにタンパクの全長をコードできない。一般に他の藻類や植物では、葉緑体ゲノム上の遺伝子は1種類でありヘテロプラズミーは不安定である。しかし渦鞭毛藻のバリアントは淘汰されることなく、培養条件下で3年間維持されていた。ミニサークル構造、転写、RNA編集等の特徴について、4種類のpsbAバリアントが通常型psbAと高い類似性を示したことから、機能未知ではあるが細胞内で何らかの役割を担っていることが示唆される。

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葉緑体成立の過程で、共生体ゲノムから核ゲノムへの大規模な遺伝子転移が起きたと考えられており、葉緑体で機能するタンパク質遺伝子の大多数は核にコードされている。これらのタンパク質のN末端には、葉緑体への輸送シグナルとして機能するトランジットペプチド（以下TPとする）が存在する。いくつかのTPは、特定の構造を形成しないランダムコイル構造であることが示されている。また、ランダムコイル構造はバクテリアの細胞内では安定に存在できないことが知られている。
葉緑体成立の過程の多くは不明であるが、真核細胞の細胞質でランダムコイル構造が安定して存在できることが、TPの獲得を促したという仮説を我々は立て、その実験的実証を試みた。分解を回避するためのタグをN末に付加した形でRbcSのTP－GFP融合タンパク質を大腸菌で産生させた。N末のタグを切除後、大腸菌細胞粗抽出液と混合するとTP部分が速やかに分解された。さらに、この分解反応はo-phenanthrolineによって阻害されたことから、メタロプロテアーゼが分解に関与している可能性が示された。この結果は、TPを分解するプロテアーゼがバクテリアに存在することを示す。TPの獲得に先立って、そのようなプロテアーゼ活性が真核細胞の細胞質中からは失われたと予測される。

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葉緑体特異的リボソームタンパク質Plastid Specific Ribosomal Protein (PSRP)のなかで、PSRP-1類似タンパク質は多くのバクテリアにも存在している。また大腸菌のPSRP-1類似タンパク質HPFおよびYfiAはダイマーリボソーム形成と翻訳抑制に関わっている。
我々は葉緑体のPSRP-1に機能が近いと考えられるシアノバクテリアのPSRP-1類似タンパク質による翻訳制御を明らかにするために、Synechocystis sp. PCC 6803のpsrp-1破壊株および過剰発現株を作成し、生育を比較した。その結果、液体培養では明暗条件や温度条件に関わらず、野生株、破壊株、過剰発現株の生育に有意な差は現れなかったが、野生株と破壊株の競合培養を行った結果、30℃の液体培養では継代を繰り返すと、徐々にPSRP-1破壊株が優勢的に生育した。よって30℃の液体培養ではPSRP-1が生育をわずかに抑制していると考えられる。一方、固体培養では逆に破壊株の生育が抑制され、特に高温ストレス条件では顕著に破壊株の生育が抑制された。このことは固体培地に起因するストレスによってPSRP-1が機能し、ストレス耐性を得ていると考えられる。またリボソーム構成を解析した結果、固体培地や熱ストレス下ではPSRP-1依存的にダイマーリボソームが形成されていることがわかった。

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葉緑体DNAは、葉緑体内で多くのタンパク質とともに核様体と呼ばれる複合体を形成している。成熟した葉緑体内では、核様体は数十の顆粒状として観察されるが、葉緑体の発達過程や分裂時にその形態は大きく変化することが知られている。葉緑体分裂時における核様体の形態変化は、葉緑体DNAの分配と関係があると推測されるが、核様体の形態変化のメカニズムや関連因子の知見はない。核様体の形態変化の理解のためには、まず核様体を形作る因子の理解が重要であるが、ほとんど分かっていないというのが現状である。そこで、本研究では核様体の形態変化の研究の基盤を整えるために、核様体を形作る因子の同定を行った。（1）紅色植物と緑色植物に共通して存在する葉緑体プロテオームを推定し、それらをコードする遺伝子破壊株の中から、核様体の形態が異常になった変異体を探索することで核様体タンパク質の同定を試みた。（2）単離したシロイヌナズナ葉緑体から調製した核様体を、核様体の形態が保持出来なくなる2M NaClを含んだ溶液で処理した。この2M NaCl処理で核様体から遊離したタンパク質が核様体を形作る因子の候補と考え、核様体から遊離したタンパク質をLC/MS/MSで同定した。それぞれの実験で同定されたタンパク質に関して、DNA結合能や凝集能、葉緑体内局在などを調べているので、合わせて報告する。

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界面活性剤存在下でシロイヌナズナ葉から核を単離すると、核膜が分解されているにもかかわらずヘキストで染色されるDNA領域が保持されている。DNA領域は紡錘形をしており、生体内における形を反映している。我々は、DNA領域が保持される機構に興味を持ち研究を進めている。
DNA領域の保持に関わる因子として核膜の裏打ち構造を疑い、その主要成分と考えられているLITTLE NUCLEI 1(LINC1)タンパク質の遺伝子破壊株から脱膜単離核を調製した。LINC1遺伝子破壊株の核の形は、生体内ではWTと異なり球形に近いことが知られているが、脱膜単離核のDNA領域も球形に近い形で維持されていた。すなわち、LINC1は核およびDNA領域の形態維持に働いているが、DNA領域の保持そのものには異なる因子が働いていることが示唆された。次に、脱膜単離核を細胞骨格破壊剤で処理しても、DNA領域は保持されたままであったが、α-アミラーゼ処理によりDNA領域の離散が確認された。そこで、α-アミラーゼの標的が糖タンパク質あるいは糖質であると考え、脱膜単離核をN-結合型糖鎖切断酵素で処理したが、DNA領域は保持されたままであった。現在、各種酵素処理後の脱膜単離核の糖タンパク質を検出し、候補糖タンパク質を探索している。今後は質量分析により関与糖タンパク質の同定を試みる。

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シロイヌナズナにおいてホスファチジルエタノールアミン(PE)はCDP-エタノールアミン経路によって小胞体で合成される。CTP:ホスホリルエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ (PECT1; EC 2.7.7.14)はPEの生合成を律速し、ミトコンドリアの外膜表面に局在する。PECT1がミトコンドリアに局在する意義については不明である。今回PECT1のN末端領域の疎水性配列PECT1NがPECT1のミトコンドリアターゲティングに十分な機能をもっていた一方、PECT1-EYFPからPECT1N配列を除去したタンパクΔNPECT1-EYFPは核や細胞質へとターゲティングされた。pect1-6変異株におけるΔNPECT1-EYFPの発現は胚性致死の表現型を相補したので、PECT1のミトコンドリア局在はシロイヌナズナの胚発生には必須ではないことがわかった。transΔNPECT1-EYFP pect1-6変異株における低温感受性や花成、葯の発達の表現形について報告する。

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ミトコンドリアの形態・細胞内分布・分配の制御は、植物の成長と発生にとって必要不可欠である。我々はこれまで、進化的に保存されたミトコンドリア局在型GTPaseであるMIRO1がシロイヌナズナの胚発生に必要であることを示したが(Yamaoka & Leaver, Plant Cell 2008)、その作用機序は不明であった。そこで今回、シロイヌナズナの卵細胞および初期胚のミトコンドリアをGFPにより可視化した植物を作成した。二光子レーザー顕微鏡を用いた観察により、miro1変異体の卵細胞や初期胚においてミトコンドリアの異常な肥大化が生じ、それにより細胞分裂に伴うミトコンドリアの分配が不完全となることを明らかにした。このことから、MIRO1は胚発生においてミトコンドリアの形態と分配の制御に重要な役割を果たしていることを明らかにした。

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ミトコンドリアのDNAはタンパク質とともに三次元的に組織化されたミトコンドリア核様体として存在している。核様体内で、DNAは非常に効率よく圧縮されながらも、ゲノム機能を適切に発揮できるような様式で組織化されている。しかし、詳細な組織化の様相は明らかになっていない。本研究ではミトコンドリア核様体に細胞核クロマチンで見られるヌクレオソームのような基本構造が存在するかに注目し、ヌクレアーゼ感受性を指標に解析を進めた。タバコ培養細胞BY-2から単離したミトコンドリア核様体をmicrococcal nuclease (MNase)で処理すると、細胞核を処理した際にみられるのとよく似たDNAラダーが観察され、ミトコンドリア核様体にもヌクレオソームのような繰り返し構造が存在する可能性が示唆された。そこでSucrose密度勾配遠心によりミトコンドリア核様体のMNase断片を分離し、各フラクションのタンパク質の構成を分析した。最小サイズ（約75 bp）の断片を含むフラクションには、細胞核のヒストンとは異なる複数のタンパク質が含まれていることが明らかになった。このことから、タバコのミトコンドリア核様体では、細胞核とは異なる独自のタンパク質を利用して、細胞核ヌクレオソームのような繰り返し構造を形作っていることが示唆される。現在、電子顕微鏡を用いた核様体／MNase断片の微細構造の観察を進めている。

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ホウ素は高等植物の微量必須元素であり、その欠乏は植物の正常な生長や形態形成を著しく阻害する。細胞中のホウ素はその大部分が細胞壁に存在し、ペクチンを架橋することによって細胞壁の構造を安定化させている。ホウ素欠乏耐性を持つギンドロ培養細胞(1/20-B)ではペクチンメチルエステラーゼ遺伝子(paPME1)の発現、及びPME活性の上昇が観察され、PMEの働きによるペクチン間のカルシウム架橋の増加がホウ素架橋の減少を補っていると推測された。しかし、培養開始後2日目に見られる特徴的なPME活性の上昇に対応するpaPME1遺伝子の発現増加が見られなかったことから他のPME遺伝子の関与が考えられた。そこで、継代後2日目の1/20-B細胞からRT-PCRにより新たなPME遺伝子 (paPME2)を単離し、その発現パターンを調べてpaPME1との比較を試みた。paPME2はポプラのPME2と塩基配列の相同性が高い一方、paPME1とは約75%の相同性しかなかった。そのため培養2日目の活性上昇にはpaPME1ではなくpaPME2の誘導が関与している可能性が期待された。しかし、発現パターンはpaPME1とほぼ同じであったことから培養2日目の活性上昇には遺伝子の発現量ではなく転写後、もしくは翻訳後の調節機構が関与している可能性が考えられた。

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セルラーゼは植物細胞壁の主成分であるセルロースを分解する酵素であるが、ある種のセルラーゼはセルロース生合成に不可欠であることが知られている。我々は以前、菌体外にセルロースを排出する酢酸菌（Gluconacetobacter xylinum）BPR2001株のセルラーゼ欠損変異株F2-2が排出する繊維状物質は、野生株が分泌するセルロース繊維に比べ、極度にねじれていることを報告した。そこで、本研究では、この繊維状物質について検討した。まず、培養液を遠心して得た沈殿から菌体を除去するために、沈殿物を0.2 M NaOHで処理した後、蒸留水で洗浄し、最終的に得られたアルカリ不溶性物質を乾燥させて試料とした。電子顕微鏡観察から、この試料には極度にねじれた繊維が含まれることが分かった。この試料を13C NMR及びFT-IRで解析した結果、このアルカリ不溶性物質に結晶性の低いセルロースIIが含まれていることが分かった。F2-2株をセルラーゼの遺伝子により補完したF2-2(pSA-CMCase/k)株は、野生株と同様に培地表面にセルロースペリクルを合成した。このペリクルの13C NMR及びFT-IR解析では、セルロースは野生株と同じ結晶性の高いセルロースIであった。これらの結果は、セルラーゼが結晶化セルロースを増加させるようにセルロース生合成に関与していることを示唆する。

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To generate a transgenic rice plant suitable for efficient bioethanol production by the use of a cellulase gene, we examined effects of overexpression of the cellulase gene on rice development. A rice cellulase cDNA driven by the maize ubiquitin promoter was introduced into the rice genome. The transgenic plants showed overexpression of the cellulase gene, and a high cellulase activity was detected in their protein extracts. The transgenic plants showed various physiological and morphological abnormalities such as leaf colour change, division of leaves and sterility. These results suggest that constitutive overexpression of cellulase can be used for improvement of rice plants, but induced expression of cellulase will be necessary to avoid unsuitable effects on rice development.

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私達は、野生型種子が発芽できない高温（32℃～34℃）で発芽するシロイヌナズナの突然変異、trg1を単離・解析し、α-キシロシダーゼ遺伝子（XYL1）の機能喪失突然変異であることを見出した。TRG1/XYL1の過剰発現は28℃における発芽率を大きく低下させたことから、TRG1/XYL1は発芽を抑制する働きを持つと考えられる。α-キシロシダーゼは、細胞壁においてキシログルカンオリゴ糖の非還元末端からキシロース残基を除去することにより、その分解に関わることが示唆されている。trg1/xyl1では花の各器官が短くなり、発達した莢は野生型より短く、太くなった。また、果壁では細胞の並びと形に乱れが生じるなど、器官・細胞レベルで形態的な異常が認められた。そこで、種子、莢、葉からオリゴ糖を調製し、HPLCおよびMALDI/TOFMSで分析したところ、野生型には蓄積しないキシログルカンオリゴ糖分子種がtrg1/xyl1に蓄積していた。また、trg1/xyl1の花茎の粘性と弾性は、いずれも野生型より低いことが明らかとなった。これらの結果は、trg1/xyl1に蓄積したキシログルカンオリゴ糖は細胞壁を過剰にゆるめることにより、高温条件での発芽をもたらす可能性を示唆している。α-キシロシダーゼは、キシログルカンオリゴ糖の分解を介して、細胞壁の「ゆるみ」を正常に保つ働きを持つと考えられる。

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アラビノガラクタンは、植物細胞壁形成において重要なタンパク質糖鎖の1つである。アラビノガラクタンの基本構造は、基質タンパク質のハイドロキシプロリン残基にガラクトースがO-型結合したものであり、その非還元末端側にはβ-1,3-結合でガラクトースが重合している。このアラビノガラクタン合成のハイドロキシプロリン残基へのガラクトース転移を行う酵素であるハイドロキシプロリンO-ガラクトース転移酵素 (HGT) は、酵素活性測定系が未だ確立していない。そこで、HGTのin vitro酵素活性測定系を確立し、その諸性質について検討した。蛍光ラベルしたペプチドとシロイヌナズナ培養細胞T87株より抽出した粗酵素を用いて反応させ、HPLCおよびMALDI-TOF-MSによって検出することでHGTの活性を定量的に測定することができた。つぎに、HGTの諸性質について検討したところ、UDP-ガラクトース及びMn²⁺要求性であり、至適反応条件は、35度、pH7.0-8.0であった。細胞内局在をショ糖密度勾配遠心法によって解析したところ、HGTは主に小胞体に局在することが明らかになった。さらに、ペプチド基質特異性について検討したところ、HGTはペプチド中の唯一のハイドロキシプロリン残基にもガラクトースを付加することが明らかになった。

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TBK5はタバコ培養細胞BY-2で恒常的に発現する高等植物特異的キネシンである。先行研究（Goto and Asada, 2007）により、BY-2細胞のプロトプラスト内にTBK5と蛍光タンパク質GFPの融合タンパク質（以下、GFP-TBK5）を一過的に過剰発現させた場合、GFP-TBK5は放射状の微小管を生じる集合体を形成することが示されており、このことからTBK5が微小管の重合核形成や分布制御に働く可能性が考えられる。私たちは、TBK5の細胞内分布を探るため、GFP-TBK5の発現を誘導できる形質転換BY-2細胞株を作製し、細胞内におけるGFP-TBK5の局在を調べた。その結果、間期の細胞では、GFP-TBK5は核周辺や原形質糸中の微小管、表層微小管、プレプロフェーズバンド微小管と共局在することがわかった。また、分裂期の細胞では、GFP-TBK5は紡錘体やフラグモプラストの微小管と共局在することがわかった。ただし、少なくともフラグモプラストにおいては、GFP-TBK5は微小管に沿って均一には分布せず、マイナス端側に偏在していた。この分布様式はγ-チューブリンの分布様式に似ている。冒頭で述べた可能性をさらに検討するため、現在、RNA干渉により内在TBK5の発現を抑えたBY-2細胞に見られる異変を解析している。

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植物細胞における主な細胞骨格である微小管とアクチン繊維は、細胞質糸、プリプロフェーズバンド、フラグモプラストなどにおいて、近接して存在することから、両者の相互作用が核のポジショニングや細胞質分裂の制御に重要な役割を果たすことが予想される。高等植物は非常に多種類のキネシン様蛋白質を持つことが知られている。これらのうち、キネシン14のサブグループを構成するCH（calponin homology）ドメインを持つキネシン（KCHs）のいくつかが、微小管とアクチン繊維に結合することが報告されているが、これらの細胞内における機能の詳細は明らかではない。演者らは、タバコBY-2細胞からTBK1、TBK2、TBK9、TBK11の4種類のKCHsの全長cDNAをクローニングした。GFP融合蛋白質の細胞内分布をRFPチューブリンとの共発現により調べたところ、TBK9は細胞質糸やフラグモプラストにおいて繊維状の分布を示し、その一部は微小管に沿っていたが、TBK11は繊維状の分布は示さず核膜に分布した。現在、これらのGFP-KCHsのアクチン繊維との共局在を調べるために、RFP-AtFIM1との共発現株の作出を行っている。また、これらのGFP-KCHsの部分欠損蛋白質、モータードメインのrigor変異導入蛋白質の誘導発現による機能阻害実験を試みているので、その結果についても合わせて報告したい。

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エチレンによる細胞成長方向の変化(伸長成長阻害と肥大成長促進)のメカニズムを明らかにするために、暗所で生育させたアズキ芽生えをエチレンの前駆体である1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)で処理し、上胚軸の表層微小管の配向とγ-チューブリン複合体およびカタニン遺伝子の発現を解析した。ACCの濃度が増加するにつれて、上胚軸の伸長成長が阻害され、肥大成長が促進された。また、ACCにより細胞長軸に直交する微小管(横向きの微小管)を持つ細胞の割合は減少し、一方、細胞長軸と平行な微小管(縦向きの微小管)を持つ細胞が増加した。次に、微小管の形成に関与すると考えられているγ-チューブリン複合体(VaTUG、VaGCP3)の遺伝子発現を解析したところ、両遺伝子の発現は一過的に増加した。また、微小管の切断に関与すると考えられているカタニン(VaKTN1)の発現も一過的に増加した。以上の結果から、エチレンによるアズキ上胚軸の成長方向の変化は、表層微小管の配向が横向きから縦向きに変化することによって引き起こされることが示された。また、この表層微小管の配向変化には、γ-チューブリン複合体およびカタニンの一過的なレベル増加を介した微小管の形成と切断が関与していると考えられる。

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細胞周期のM期に入ると紡錘体が形成され、S期に複製されたDNAを二等分する。染色体が空間的に二分されるのはM期後期であり、この時期の染色体移動は動原体微小管の短縮（後期A）と紡錘体伸長（後期B）の2つのメカニズムから生じる。陸上植物の細胞においては、中心体が見られないことから、明視野観察や蛍光観察では後期Bの過程が不明確であった。また分裂頻度の高い細胞における後期Bの存在は不明であった。我々はこれまでに、タバコ培養細胞BY-2を用いて紡錘体長の測定法を確立し、BY-2細胞における後期紡錘体微小管の挙動について明らかにしてきた。本発表では微小管を可視化したシロイヌナズナ、ヒメツリガネゴケにおける後期紡錘体微小管の動態を解析し、BY-2細胞と比較した結果を報告する。後期紡錘体長の推移を測定した結果、シロイヌナズナ根端細胞とヒメツリガネゴケ原糸体のどちらでも後期紡錘体の伸長がみられた。この結果から、後期Bの存在が明らかとなった。そこでBY-2細胞及びシロイヌナズナ根端細胞、ヒメツリガネゴケ原糸体において算出した後期紡錘体の伸長率を比較した。BY-2細胞及びシロイヌナズナ根端細胞、ヒメツリガネゴケ原糸体における伸長率は、1.2～1.3と近い値を示した。以上の結果から、陸上植物の細胞における紡錘体伸長の役割について考察したい。

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タバコ種間雑種培養細胞GTH4は、培養温度を37℃から26℃にすると活性酸素種（ROS）の一過的増減を伴い致死する。他方、致死抑止型突然変異を起こしたGTH4S細胞にはROSの増減は認められない。我々はこれまで、GTH4の細胞死シグナルとしてH₂O₂が重要であり、過剰なO₂^－の発生がH₂O₂の細胞死効果を減じることを報告した。本報告では、O₂^－と反応してONOO^－を生成させることが知られているNOの役割を、ROSとの関係から明らかにする。GTH4細胞のNO量は、26℃に移した後6時間目にかけ増加したが、GTH4Sでは殆ど増加しなかった。他方、ROSは2～3時間目をピークに一過的増減をおこした。NOを発生させる試薬（SNP、SNAP）またはスカベンジャー（cPTIO）、さらにROSを発生させる試薬（メナジオン、キサンチン／キサンチン酸化酵素）を細胞に投与して以下のことを明らかにした。（1）NO量の増大はO₂^－とH₂O₂量を減少させ、細胞死を抑制する。（2）O₂^－量の増大はH₂O₂量を増加させるが、NO量を減少させ細胞死を抑制する。（3）細胞死はH₂O₂の単独処理により促進されるが、NOが共存するとその効果はさらに増大する。以上の結果から、NOとO₂^－の量比バランスのもとで決まるNOとH₂O₂とが協調的にGTH4の細胞死を制御することが明らかとなった。

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私達はアントシアニン含有細胞が植物の葉において気孔装置を中心とした特異的分布パターンを示すことを報告してきた。調査した26科55種の植物において同様の現象が観察されたことから，この分布パターンは普遍的であると考えられる。更に，ペルオキシダーゼ活性も気孔装置を中心とした分布を示すことや，アントシアニンをはじめ，フラボノイド類の活性酸素除去作用が広く知られることから，本研究ではこれらの分布パターンと細胞のpHの変化を示すパターンとの関連性について調べる為に，細胞レベルでのpH変化のイメージングを試みた。細胞レベルでのpH変化のイメージングに用いたHPTS (8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonate)はその発光量がpHに依存する蛍光色素で， 2種類の波長において励起され，両励起波長に対して同一の波長光を発する。従って，ratiometric法を用いてpHセンシングを行うことが可能である。また，HPTSは水に可溶かつ、安定性が高く、高発光量が得られる。HPTSのこれらの特徴を生かし、HPTSを植物表皮細胞に取り込ませ、顕微鏡下での植物表皮系におけるpHイメージングを行った。その結果，孔辺細胞を中心とした細胞群において特異的なpHの変化パターンが確認された。これらの結果をもとに，アントシアニンの分布パターンと細胞のpHの分布パターンの生理学的関連性について論ずる。

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我々は、全反射蛍光顕微鏡やビデオ顕微鏡を使った細胞の局所での分子や顆粒の挙動を観察するのと並行して、局所観察している時の細胞全体がどのような状態か観察できる “局所・大局同時並行タイムラプスシステム”の開発を行っている（http://www.jst.go.jp/sentan/saitaku/H20k.html）。プロトタイプ機を作製し、ムラサキツユクサおしべの毛の細胞分裂過程の細胞全体の様子と、分裂面挿入予定領域の細胞表層での構造変化を、並行して記録することに成功した。このシステムは、一つの顕微鏡に二つの光学系を装備し、光路を切り替えることで、対物レンズの交換無しに、高倍率での細胞の局所の記録（局所観察）と、低倍率での細胞全体の記録（大局観察）を同時並行的に行うシステムである。局所観察用の光路にはEMCCDカメラの前に拡大レンズを挿入し、可能な限り拡大した局所画像を取得するのに対し、大局観察は、共焦点レーザシステム・C1を用いて、広い領域をレーザ走査して広視野を獲得することで、6.5倍の倍率差をもたすことができた。更に、ステージのZ軸コントロールにより、焦点面の異なる領域を交互に観察することを可能にした。幾つかの材料について、蛍光と微分干渉を組み合わせた観察も行ったので、その結果についても紹介し、このシステムの現段階での問題点、将来の応用の可能性についても報告する。

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近年、植物のアスコルビン酸 (AsA) 生合成はD-マンノース/L-ガラクトース経路を主要経路とすることが明らかにされたが、生合成調節機構に関してはほとんど未解明の状況である。本研究はAsA生合成の分子機構解明を最終目的に、AsA応答遺伝子の探索と解析を行った。シロイヌナズナAsA欠乏変異体vtc2-1に対し、光条件下で5 mM L-ガラクトノ-1,4-ラクトン (L-GalL)を与え、AsAレベルが十分に増加した16時間後の葉からRNAを抽出し、マイクロアレーにより発現変動遺伝子を探索した。L-GalL未処理のコントロールに対して4倍以上に発現上昇を示した14遺伝子のうち、定量的PCRにより再現性が高かった2遺伝子、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(ASP)およびZnフィンガープロテイン、を選抜してさらに解析を進めた。両遺伝子ともL-GalLおよびAsAに対して顕著に発現レベルが増加すること、また葉中のAsAレベルの変動と相関して明暗応答性が観察された。ASP遺伝子の転写開始点から上流約2kbpの領域をクローン化し、ルシフェラーゼのルミノイメージングによりプロモーター活性を評価した。その結果、ASP遺伝子は、定量的PCRの結果を良く反映し、L-GalLおよびAsAに対して特に週齢の若い葉において顕著に発現誘導されることが示された。

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シロイヌナズナの種子成熟後期では、ソースから輸送されるショ糖炭素の多くは油脂に転換される。油脂貯蔵制御因子であるAP2型転写因子ASML1/WRI1は、プラスチド内での脂肪酸合成系遺伝子群を直接活性化するが、小胞体でのトリアシルグリセロール（TAG）合成に関わる遺伝子の発現には他の制御因子が関与する。TAG合成の制御因子を探索する目的で、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子（DGAT1）のプロモーターとLUCの融合遺伝子をシロイヌナズナに導入した。DGAT1p::LUC形質転換体ではLUC発光は登熟後期種子を含む果実の他に若い葉でも見られ、基本的にDGAT1 mRNAの発現パターンと類似していた。DGAT1p::LUC形質転換体に対してエンハンサーアクティベーションタギングを行い、葉でのLUC発光が上昇した株を選抜した。次世代でも強いLUC発光のみられた株の一つ（#14-3）では、エンハンサー挿入部位の近傍遺伝子と共に内在DGAT1の発現も上昇していた。エンハンサー近傍にはDGAT1と類似した種子での発現を示す遺伝子があり、DGAT1p::LUC形質転換植物に対して35Sプロモーターを用いて過剰発現体を作製したところ、LUC発光と内在DGAT1 mRNAの増加が見られ、この遺伝子が#14-3株でのDGAT1の発現活性化をもたらす原因遺伝子であると推定される。

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シロイヌナズナの種子成熟過程において、葉緑体で合成された脂肪酸からトリアシルグリセロール(TAG)を合成する代謝は小胞体で起こり、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）を始めとするTAG合成系の遺伝子は、種子特異的AP2型転写因子ASML1/WRI1の標的である脂肪酸合成系の遺伝子群よりも後期に強く発現する。TAG合成系遺伝子と類似の発現パターンを示す転写因子遺伝子を公開マイクロアレイデータから抽出した。それらのcDNAを35Sプロモーター下流に繋いだ発現プラスミドをDGAT1p：LUCレポーターと共にプロトプラスト一過性発現系に導入し、LUC発現を活性化しうるcDNAを探索したところ、DREBサブファミリーに属するAP2/ERF型転写因子A2が同定された。DGAT1プロモーターの転写開始点上流域約900 bpにはDREB結合配列として知られている配列が存在し、A2遺伝子のT-DNA挿入破壊株では開花後8日目の果実でのDGAT1 mRNAは野生型株に比べ約4割低下した。しかし、種子TAG含量に野生型株とA2破壊株の間で大きな違いはなかった。現在、A2近縁遺伝子との多重破壊株の解析や、これら遺伝子の破壊が他の油脂合成系遺伝子の発現に与える影響の解析を進めている。

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14-3-3タンパク質は、タンパク質間相互作用を媒介することや、標的タンパク質の幅広さが明らかになり注目を浴びている。本研究では、酵母ツーハイブリッド実験法で、ABAによる遺伝子発現を正に制御するAREB/ABF転写因子群（AREBs）と最も強い結合反応を示したシロイヌナズナのGF14λに着目し、シロイヌナズナの葉肉細胞を用いたBiFC法により相互作用を調べた。ダイマー形成実験では、GF14λのホモダイマーは観察できたが、GF14λと最も相同性が高いGF14κとのヘテロダイマーは観察することができなかった。またAREB1、AREB2、ABF3と14-3-3タンパク質との相互作用を調べた結果、GF14λはAREBsとの相互作用を観察することができたが、GF14κとAREBsとの相互作用は確認できなかった。続いてGF14λの外部リガンド部分に突然変異を導入しAREBsとの相互作用を調べたところ、突然変異GF14λとAREBsの相互作用は見られなくなった。以上の結果から、GF14λとAREBsとの相互作用の特異性は非常に高いこと、シロイヌナズナ葉肉細胞でのBiFC法が14-3-3タンパク質の相互作用を調べるために有効であることが示唆された。

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ターミネーターは遺伝子の3’末端領域に位置し、RNA polymeraseIIの転写終結およびmRNAの3’末端修飾（pre-mRNAの切断、poly(A)鎖付加）を行う。効率の良い転写終結は、発現量を増加させ、かつ下流へのリードスルーを減少させると考えられる。
我々がシロイヌナズナから単離したheat shock protein 18.2遺伝子のターミネーターは、一過性発現実験においてNOSターミネーターの数倍の発現を示した（2009年度 本大会報告）。この発現の増加はシロイヌナズナ形質転換体においても認められ、NOSターミネーターよりも高頻度に高い発現を示すT1植物が得られた。また発現量の増加に加えて発現部位への影響を調べるため、組織特異的発現を示すタバコADHプロモーターを用いた解析を行った。HSPターミネーターはNOSターミネーターと同様の発現パターンを示し、プロモーターの組織特異性に影響を与えないと考えられた。シロイヌナズナシングルコピー形質転換体を用いた解析では、HSPターミネーターと翻訳エンハンサー（タバコADH 5’-UTR）を組み合わせることにより、葉では100倍、根では250倍の発現増加が認められた。現在、HSPターミネーターのシス領域の限定を行っている。

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植物のゲノムシステムは、核、葉緑体、ミトコンドリアの三つのサブゲノムから構成されている。この三つのゲノムは、少なくとも現存の植物種では、互いに独立かつ安定に保たれていると考えられてきたが、最近のゲノム解析の結果から、これらのサブゲノムの間では、従来の予想を遙かに超える頻度でDNA断片の移動や組み換えが生じていることが明らかになった。このような植物ゲノムのもつ高い流動性は、植物のトランスクリプトームにどのような影響を与えているのだろうか？この問題を検討するために、私たちは、モデル植物を材料にして、ゲノム上の高密度転写開始点マッピング、遺伝子トラッピング実験、プロモーター機能の可塑性、等に関する包括的な解析を進めてきた。その結果、植物の核ゲノムに外来構造遺伝子が挿入されると、しばしば、その近傍に新規の転写開始点が生じることがわかってきた。本研究では、このような転写開始点の出現メカニズムを、クロマチン構造の視点から解析した。その結果、植物核に挿入されたコード領域は、その上流近傍のヌクレオソームでヒストン成分のバリアントへの入れ替えを誘導し、さらに、転写開始複合体のリクルートと転写開始点の出現を引き起こすことが観察された。これらの知見は、植物には、ゲノムDNAレベルでの変動をトランスクリプトームに反映させるための、まだ未同定の分子メカニズムがあることを示している。

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近年のゲノム解析技術の発達により種々の生物種でゲノム塩基配列が解読され、これを用いた形質発現調節機構の解明が進められている。その過程で、DNA配列の変化を伴うことなく、後天的な作用により変異が生じる機構が発見されてきた。DNAメチル化は、エピジェネティックな遺伝子発現制御機構の主要因として動植物を問わず広く知られており、これを介したエピジェネティクスな遺伝子発現制御機構は、種々の生物現象に関わることが示されている。
最近、ゲノムタイリングアレイあるいは高速シークエンサを用いた解析技術が開発され、転写様式、ゲノム修飾部位の網羅的探索が可能となりつつある。ゲノムタイリングアレイは、セントロメア等の高リピート領域を除く全ゲノム配列に対応するオリゴプローブを等間隔に基盤上に貼り付けた物で、遺伝子コード領域だけでなく、ゲノムのあらゆる部分からの転写産物を見ることが出来る。またゲノム断片を使った免疫沈降実験とタイリングアレイを組み合わせることで、DNAメチル化、ヒストン修飾等の網羅的検出が可能である。これらデータを統合することで、遺伝子発現制御に関わる様々なエピジェネティックな要因を明らかにすることが期待される。本演題では、現在我々が進めているゲノムタイリングアレイを用いた研究を通じて、植物におけるDNAメチル化を介した遺伝子発現制御機構に関する新たな知見を示したい。

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遺伝子サイレンシングは、機能未知遺伝子の機能解析にとって非常に有効な遺伝子発現制御技術である。高等植物では、二重鎖のRNAを細胞に導入することによって、そのRNAと相同性の高い目的遺伝子の発現が抑制される。これはRNA干渉（RNAi）とよばれ、広く遺伝子機能解析に利用されている。ホウライシダでは、目的遺伝子の一部をDNA断片として細胞に導入するとRNAiと同様に目的遺伝子の発現を抑制できる。この現象を我々はDNA干渉 (DNAi) と呼んでいる。今回、我々は葉緑体光定位運動に関わるNEO1/PHY3遺伝子を用いて、DNAiの遺伝子サイレンシング機構を解析した。DNAiを行ったシダでは、PHY3の遺伝子発現は抑制され、phy3依存の葉緑体光定位運動も制限された。また、この効果は次世代でも確認された。ところで、DNAのメチル化は世代を超えて保存される。そこで、メチル化したシトシンを特異的に切断するヌクレアーゼとメチル化シトシン感受性の制限酵素を用いたPCR解析を行ったところ、DNAiを行ったシダのPHY3遺伝子がメチル化されていた。また、次世代でもメチル化は確認された。したがって、DNAiによる遺伝子サイレンシングは目的遺伝子のメチル化を介して引き起こされ、次世代に引き継がれる可能性が高いことが示された。現在、Bisulfite sequencing法により、詳細な解析を行っている。

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私たちは器官再生に関して温度感受性を示すシロイヌナズナ変異体を用いて、分化全能性発現の分子機構の解析を行ってきた。変異体の中でもshoot redifferentiation defective 2（srd2）とroot initiation defective 1（rid1）は共通した特徴をもち、どちらも胚軸の脱分化や新たな分裂組織の形成が強い温度感受性を示す。これまでの解析により、SRD2が核内低分子RNA（snRNA）の転写活性化因子であり、胚軸脱分化の進行にはSRD2によるsnRNA蓄積量増大が必要であること、RID1はDEAH型RNAヘリカーゼをコードしていることを明らかにしている。
RID1は、出芽酵母でプレmRNAスプライシングに働くPrp22と、アミノ酸配列がよく似ている。このことから、RID1もスプライシングに関与すると考えられる。これは、SRD2に依存したsnRNAレベル上昇の役割が、スプライシング能力の増大にあることを示唆している。そこで、胚軸脱分化における選択的スプライシングパターンを調べたところ、いくつかの遺伝子でsrd2変異の影響が認められた。現在、スプライシングに対するsrd2変異、rid1変異の影響を網羅的に調べるためタイリングアレイ解析を行っており、その結果も合わせて、脱分化過程におけるスプライシング制御の役割を論じたい。

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我々はこれまでに、シロイヌナズナ セリン-アルギニンリッチ(SR)タンパク質の中で、動物の主要な選択的スプライシング制御因子ASF/SF2のホモログ,atSR30が強光に対して迅速に応答することを見いだした。したがって、強光ストレスに応答した選択的スプライシング制御に主要な役割を果たしていることが示唆された。そこで本研究では、atSR30のスプライセオソーム形成に果たす役割およびそれによる選択的スプライシング制御機構の解明を試みた。
酵母two-hybrid解析の結果、atSR30は他の複数のSRタンパク質と相互作用したことから、atSR30はそれらと共役してスプライセオソーム構成に関与することが示唆された。次に、atSR30遺伝子破壊株(KO-sr30)を用いたタイリングアレイ解析により、強光ストレス下でスプライシング効率を制御される遺伝子の同定を試みた。その結果、野生株と比較してKO-sr30株では65箇所のゲノム領域で発現量の変化が認められた。半定量的RT-PCRによるそれらゲノム領域に位置する遺伝子の発現解析の結果から、atSR30によりスプライシング効率もしくは転写レベルが制御される遺伝子を同定した。以上より、強光ストレス下においてatSR30は選択的スプライシング制御を介して様々な遺伝子の発現制御に機能していることが示唆された。

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タバコ葉緑体ゲノムには約80種のタンパク質がコードされ，それらは葉緑体遺伝子発現系により合成される．葉緑体mRNAの5'非翻訳領域(5'-UTR)には，大腸菌等のmRNAにみられるShine-Dalgarno(SD)様の配列がないものが多く，そのようなmRNAの翻訳は，mRNA上の特別なシス配列に結合するトランス因子により制御されていると考えられている．我々はこれまでにタバコ葉緑体由来のin vitro翻訳系等を用いて，葉緑体翻訳開始機構を解析してきた．本研究では，光合成関連遺伝子の翻訳制御に関わるmRNA 5'-UTR上のシス配列の解析を行った．光化学系複合体のサブユニットをコードするpsaAやpsbDなどのいくつかの葉緑体mRNAsにはSD様配列が存在する．5'-UTRへ変異導入し，in vitro翻訳系で解析したところ，これらのmRNA翻訳開始にはSD様配列が非常に重要な役割を果たしており，その領域を含む比較的短い5'-UTRがあれば効率よく翻訳が開始することが分かった．一方，ycf4やpsbAなどのSD様配列のないmRNAの5'-UTRを短くすると，その領域が開始コドンからかなり離れていても，これらの mRNAsの翻訳効率は著しく低下した．また，特定の領域への変異導入により翻訳開始効率が大きく影響を受けることが確認でき，その領域へのトランス因子の結合が示唆された．

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キクの桃色や赤紫色の舌状花弁には、シアニジン型アントシアニンが蓄積している。キクにはデルフィニジン骨格を合成する上で必須となるフラボノイド3',5'位水酸化酵素（F3'5'H）の活性が無いため、デルフィニジン型のアントシアニンが蓄積せず、紫や青色の花色を持つ品種は存在しない。そこで我々は、他の植物種由来のF3'5'Hをキクに導入し、デルフィニジン型アントシアニンを合成させることによる花色の改変を試みた。まず、パンジーのF3'5'Hを様々なプロモーターで過剰発現させるコンストラクトを作製してキクに遺伝子導入した。得られた形質転換体を解析した結果、デルフィニジン型アントシアニンの合成には、花弁特異的な発現を誘導するキクのフラバノン3位水酸化酵素遺伝子（CmF3H）のプロモーターと翻訳エンハンサー（NtADH-5'UTR）の組み合わせが適していることが判明した。次にCmF3Hプロモーターと翻訳エンハンサーで様々な植物種由来のF3'5'Hを発現させるコンストラクトを作製してキクへ導入した。その結果、カンパニュラ由来のF3'5'H遺伝子を発現させることで、花弁に含まれるアントシアニン色素の約75％がデルフィニジン型になり、花色が赤色から紫色に変化したキクが得られた。

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