種子発達は多くの遺伝子が関与する複雑な過程であって、胚形態形成、貯蔵物質蓄積、休眠性獲得といった異なる現象に関与する遺伝子群の発現が協調的に制御されている。アラビドプシスでは、これまでに種子発達を制御する転写制御因子としてLEC1、LEC2、FUS3およびABI3がクローン化されており、特にFUS3およびABI3は中期から後期胚発生において重要な役割を担うと考えられている。これらの制御因子は協同して種子発達過程における遺伝子発現を制御すると考えられているが、相互の関係や制御機構については充分に明らかにされていない。演者らは、FUS3およびABI3が制御する遺伝子発現の全体像を明らかにするため、これらの転写制御因子を異所的に過剰発現する形質転換植物体を用いてDNAマイクロアレイ解析を進めている。
　グルココルチコイド誘導性プロモーターを持つFUS3形質転換植物をDEXおよびABA処理することによりベクターのみを持つ形質転換体と比較して発現が有意に増加または減少した遺伝子は、約1万4千個のプローブ遺伝子中それぞれ数百個であった。発現が増加した遺伝子には、種子貯蔵タンパク質ならびにその蓄積に関与する遺伝子、脂質の合成・貯蔵に関与する遺伝子の他、種々のトランスポーター、ABA合成に関わる遺伝子、形態形成にかかわる転写制御因子等が含まれていた。

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SPKはデンプン生合成の初期の反応を触媒するsucrose synthaseをリン酸化することで、活性を制御することがわかっている。アンチセンスSPK形質転換体では、未熟種子での貯蔵デンプン生合成が阻害されショ糖が蓄積する。このことから、SPKの欠損が、胚形成、胚乳形成に異常を引き起こしているものと考えられる。このような形質異常を生じさせる原因遺伝子を明らかにするために、3系統のアンチセンスSPK形質転換体および野生型イネ（日本晴）それぞれの登熟初期の未熟種子より抽出した全RNAを用いて、マイクロアレイ解析を行った。この結果、3つのアンチセンス形質転換体すべてで、野生型に対して1/2以下あるいは2倍以上の発現量の変化を示した遺伝子は125種であった。これらのすべての遺伝子に関して、機能別に6個のグループに分類した。さらに、これらの6グループのそれぞれに属する遺伝子について、野生型イネの各ステージ（穂ばらみ期、登熟初期、開花後10日目）の発現量を調べ、アンチセンスSPK形質転換体の発現量との比較によるクラスタリングを行った。

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マメ科種子の子葉中に蓄積された貯蔵タンパク質は、吸水後に発現するプロテアーゼによって分解され、胚軸の成長に利用される。これまでに、イネやオオムギなどの単子葉類種子のアリューロン層におけるプロテアーゼの発現がジベレリン (GA) で活性化され、その活性化がアブシジン酸 (ABA) によって抑制されることがよく知られている。そこで、インゲンマメ種子発芽時における子葉でのプロテアーゼ遺伝子発現に GA 及び ABAが関与しているのかどうかを調べた。子葉中で発現することが明らかになっている7種類のシステインプロテアーゼ (EP-C1, CP1, CP2, CP3, CP4, LLP1, LLP2) の種子発芽過程における遺伝子発現をRNAブロット法により解析した。その結果、CP4を除く前述の遺伝子の発現は、吸水後に誘導された。また、これらの遺伝子発現はGAの生合成阻害剤であるプロヘキサジオン及びABAによりすべて抑制された。したがって、種子発芽時に子葉中で誘導されるプロテアーゼの遺伝子発現には、ABAとGAが中心的な役割を担っていると考えられた。また、発芽に関与することが知られているエチレンの影響についても調べたので、併せて報告する。

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Roles of seed coat on interspecific differences in germination behaviors were surveyed in seeds of a series of species of genus Dioscorea. Each species has specific distribution area from southern warm places to northern cold places in East Asia. Even in species of the southern warm places, their deeply dormant seeds were able to fully germinate if their seed coats were removed. Lanolin coating instead of removed seed coat had no effect on germination. No differences in density of intercellular spaces of seed coat among species were observed by SEM. The function of seed coat is likely to not be physical barrier for water and gases. Observations by a light microscope suggest that some cells in the four cell layers of seed coat undergo certain physiological process. Seed coat may cause interspecific differences of germination behaviors in relation to north-south distribution of species.

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We obtained a monoclonal antibody, mAb3-1-1, against caleosin which is an oil body protein in sesame seeds and has a molecular weight of 27 kd in a cultivated strain. Protease treatment of caleosin proteins by V₈ or trypsin showed that the epitope recognized by mA3-1-1 is a terminal region of caleosin proteins. Moreover, during germination process a peculiar disappearance of caleosin proteins was observed in a wild strain, Sesamum radiatum as well as in a cultivated strain, S. indicum. The mAb3-1-1 reacted with the caleosin of 27 kd in the cultivated strains, but reacted with 25 kd, 17 kd and 15 kd bands in the wild strains instead of 27 kd. It is conceivable that 17 kd and 15 kd bands are oleosin proteins in oil bodies. The relationship between caleosin and oleosin in sesame oil bodies will be discussed.

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イソプレノイド合成に関わる酢酸-メバロン酸経路(MVA経路)の鍵酵素3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoAレダクターゼ)は、動物では単一遺伝子であるのに対して、高等植物ではマルチジーンファミリーを構成し（シロイヌナズナ；2種、ジャガイモ；3種、トマト；4種など）、異なる遺伝子発現、翻訳後制御を受けている。さらに、高等植物では、イソプレノイド合成が細胞質のMVA経路に加え、プラスチドに非酢酸メバロン酸経路(MEP経路)があることがわかってきた。
私たちは、このような高等植物における特徴的なイソプレノイド合成系を理解する目的で、シロイヌナズナにおける二種のHMG-CoAレダクターゼ遺伝子(HMG1 , HMG2)のそれぞれのT-DNA挿入変異体 (hmg1-1, hmg1-2, hmg2-1)を取得し、解析を行った。その結果、hmg2-1の表現型は野生型と変わらなかった。一方、hmg1-1, hmg1-2は、ともに、1) 発芽初期における根の伸長抑制、本葉展開の遅滞、2) 著しい矮化、不稔、3) ロゼット葉、茎生葉、花茎の早期の老化といった表現型を示した。老化関連遺伝子の発現について検討したところ、幼植物を暗処理することによって、hmg1-1, hmg1-2のみで発現が誘導されることを見出した。現在、HMG1の遺伝子発現と老化との関係について、詳細に検討を行っている。

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高等植物のイソプレノイド化合物生合成経路にはメバロン酸経路と非メバロン酸経路の二つがある。ブラシノライドをはじめとするステロール類は細胞質のメバロン酸経路で合成される。メバロン酸経路における鍵酵素は3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase (HMGR)であり、本酵素は転写レベルおよび翻訳後レベルで制御されている。動物ではAMP-activated protein kinase (AMPK)がHMGRを不活性化し、脂質代謝を制御していることが知られている。しかし、植物ではin vivoでAMPK相同キナーゼのどの分子種がHMGRの活性制御に関与しているのかどうかは明らかではない。そこで我々はシロイヌナズナにおけるラットAMPK相同遺伝子であるAkin10, Akin11, Akin12の解析を通してHMGRの活性制御機構の解明を目指した。HMGR のC末端近くの合成ペプチドを基質に用いたリン酸化アッセイを行うと、Akin10, Akin11はこれをリン酸化したが、Akin12はリン酸化できなかった。またAkin10, Akin11, Akin12の器官別の発現を調べたところ、Akin10, Akin11は植物体全体で、Akin12は未熟鞘で発現していた。一方、HMG1は植物体全体で、HMG2は細胞増殖活性の高い領域で発現していることが知られている。これらの結果からAkin10, Akin11のどちらか、または両方がHMGRキナーゼとして機能しうることが示唆された。現在これらの遺伝子の挿入変異体の探索と解析を進めている。

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　イネgid2変異体は濃緑・幅広の葉を示す矮性変異体である。gid2変異体はジベレリン（GA）に対して非感受性であり、胚乳でのGA によるα-アミラーゼの誘導が起こらない。またgid2変異体では矮性にもかかわらず、活性型GAが野生型の150倍にも蓄積しており、GAシグナル伝達に異常を来した変異体であることが予想された。
　GID2の機能を明らかにするためポジショナルクローニング法を用いて原因遺伝子の単離を行った。その結果、gid2変異体の原因遺伝子はF-boxタンパク質をコードしている可能性が示唆された。GID2遺伝子候補領域を含む4.2Kbのゲノム断片を用いて相補性試験を行ったところ、この領域はgid2変異体の表現型を完全に相補した。またgid2変異体の2つのアリルについて塩基配列を決定したところ、これらのアリルはGID2に変異が起きていることが確認された。以上のことよりGID2はF-boxタンパク質をコードしていると結論した。
　これまでの研究より、GAシグナルの抑制因子であるSLR1はGA シグナル依存的分解をうけることが明らかとなっている。野生型ではGA処理によるSLR1タンパク質の分解が起こるのに対し、gid2変異体ではGA処理後もSLR1 タンパク質が蓄積していた。これらのことより、SLR1はGAシグナル依存的にSCF^GID2によって分解される可能性が示唆された。
　本研究の一部は生研機構基礎推進事業の支援で行った。

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SLENDER RICE1 (SLR1) 遺伝子は、イネ恒常的GA反応型徒長型変異体, slr1, の原因遺伝子であり、ArabidopsisにおけるGAレスポンスの抑制因子GAI/RGAのオルソローグである。これまでのSLR1タンパク質の機能解析の結果から、茎伸長をはじめとするGAレスポンスはGAのシグナルが核に局在するSLR1タンパク質を分解することによって引き起こされることが明らかにされている。
我々はこのGAレスポンスを司るGAシグナル依存的なSLR1タンパク質の分解機構を解析するために、gid1、gid2と名付けた2種類のGA非感受型矮性変異体を単離・同定した。最近、gid2変異体の原因遺伝子の単離に成功し、GID2遺伝子はユビキチンリガーゼ複合体（SCF複合体）の1因子であるFボックスタンパク質をコードしていることを明らかにした。このgid2変異体では、SLR1タンパク質のGA依存的な分解は観察されず多量なSLR1タンパク質が蓄積していた。さらに、gid2変異体において蓄積しているSLR1タンパク質はリン酸化型と非リン酸化型の2つの状態で存在することを明らかにした。これらの結果は、SLR1タンパク質はSCF^GID2複合体の標的分子であるとともに、SLR1タンパク質のリン酸化がSCF^GID2を介したタンパク質分解へと導くことを予想させる。
本研究の一部は、生研機構基礎推進事業の支援で行った。

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gid1は、ジベレリン (GA) 非感受性で極矮性を示す新しいイネの変異体である。マップベースクローニングにより原因遺伝子を単離したところ、GID1は、serine hydrolaseをコードしていることが明らかとなった。また、GID1は、GAシグナル伝達の抑制因子であるSLR1と直接作用することが示唆された。最近新たに、GA非感受性極矮性変異体、gid2の原因遺伝子を単離した結果、GID2が、Fボックス様タンパク質をコードし、SLR1の分解に関わっていることが推測された。そこで、今回は、GAシグナル伝達におけるGID1とGID2の関係について調べたので報告する。
gid1とgid2変異体に蓄積しているSLR1量を比較したところ、SLR1が抑制因子であり、gid1変異体のほうが矮性変異形質が強いにもかかわらず、その蓄積量は、gid1変異体のほうがはるかに少なかった。この結果および形質転換体の解析結果から、GID1は、GAシグナル依存的にSLR1に直接作用し、その抑制活性を変化させるものと考えられた。
本研究の一部は、生研機構基礎推進事業の支援で行った。

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種子の休眠と発芽は種々の内的、外的因子により制御される。ジベレリン（GA）と低温処理（暗所、4℃）はいずれもシロイヌナズナの種子発芽に促進的に働く。我々は、これまでに活性型GAの生合成最終段階を触媒するGA 3-oxidase をコードする遺伝子の発現調節を詳細に解析し、低温処理後に同酵素をコードする AtGA3ox1 遺伝子のmRNA量が顕著に増加することを明らかにした。さらに、主要な活性型GA であるGA4 の内生量も低温処理により増加した。低温処理後に増加するGAの役割を推定するため、マイクロアレイを用い、低温処理依存的にジベレリンに応答する遺伝子群の同定を試みた。その結果、以前に同定された「明所、22℃においてGA に応答する遺伝子群」に加えて、新たなGA応答性遺伝子群の存在が示唆された。一方、低温処理後のAtGA3ox1 のmRNA は、低温処理を行わない場合と比較してより広範な細胞で検出されたことから、温度条件により活性型GAの分布が変化すると予想される。以上の結果は、シロイヌナズナの種子発芽過程におけるジベレリンの生合成とその応答機構は、異なる環境条件下で質的に変化することを示唆している。

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ジベレリンは、種子の発芽、茎の伸長、花芽形成など植物の成長の多くの局面に作用する植物ホルモンである。従って、その内生量及び情報伝達は厳密な制御を受けていると考えられる。我々は活性型ジベレリンの合成を直接に触媒する酵素であるGA3酸化酵素に着目した。この酵素遺伝子の発現は内生ジベレリン量に応じてネガティブフィードバック制御を受ける。従ってこの制御機構を解析することで情報伝達系と合成系の協調による内生ジベレリン量制御のメカニズムを明らかにできると推定される。これまでにシロイヌナスナのGA3酸化酵素であるAtGA3ox1のプロモーター領域を用いた解析から、プロモーター上流800 bpから1000 bpまでの領域がネガティブフィードバックに必要であることが分かった。この領域は単独でもGA欠乏に伴った遺伝子の活性化を誘導できることから、この領域に結合して作用する転写因子が、ネガティブフィードバック制御の実行因子であると推定した。今回この200 bpの領域のうち50 bpの領域がネガティブフィードバックに必要なことが分かった。またこの領域を用いた酵母1-hybridスクリーニングにより、AT-hookモチーフをもつDNA結合タンパクを同定した。ゲルシフト解析により、このタンパクは配列特異的に当該の領域に結合した。現在はこのAT-hookタンパクの認識配列をより正確に同定すること、及び機能解析を行っている。

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　キュウリ、トマトの胚軸を用いた以前の我々の研究から、傷をつけた胚軸の皮層における組織癒合過程の細胞分裂にジベレリンが必要であること、また、このジベレリンの生産に子葉の存在が必須であることが示された。本研究では、胚軸における組織癒合に関わるジベレリンの実体解明を目的として、キュウリとトマトの芽生えにおけるジベレリン生合成酵素遺伝子の発現、および内生ジベレリンの解析を行った。
　RT-PCRを用いて、トマト芽生えにおいて主要に発現していると考えられるジベレリン生合成遺伝子Le20ox1、Le3ox2 の器官別発現を調べたところ、本葉未展開の植物体ではいずれの遺伝子のmRNA量も子葉でもっとも高かった。また、これらのmRNA量は植物体の生長とともに減少した。次に、播種後7日目のキュウリ芽生えから子葉を切除し、胚軸における内生ジベレリン量を子葉を保持したままの植物体と比較したところ、活性型ジベレリンであるGA₄、およびその前駆体が子葉を切除した場合に減少することが示された。以上の結果から、キュウリ、トマトの胚軸における内生ジベレリン量の調節には、子葉が関与している可能性が考えられる。

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イソペンテニルトランスフェラーゼ (isopentenyltransferase: IPT)はサイトカイニン生合成の初発反応を触媒する酵素である。シロイヌナズナでは7種の遺伝子（AtIPT1, AtIPT3-AtIPT8）からなる多重遺伝子族を構成している。サイトカイニン生合成調節機構を理解するためには、各IPT遺伝子産物の発現場所を詳細に明らかにすることが重要である。我々は昨年の本大会でAtIPT1, AtIPT3, AtIPT5がプラスチドに、AtIPT7はミトコンドリアに局在する可能性を示唆した。本年はさらなる細胞内局在性の解析と組織レベルでの局在部位についての結果を報告する。各AtIPT遺伝子の翻訳上流領域3～4kbとGFPの融合遺伝子を導入したシロイヌナズナの形質転換体を作製し、それらT3世代を用いて観察を行った。その結果、AtIPT1::GFPは根の伸長領域周辺の中心柱、AtIPT3::GFPおよびAtIPT7::GFP は篩部伴細胞、AtIPT5::GFPは側根形成に関与する内鞘細胞でその蛍光が観察された。また、RT-PCRの結果からAtIPT3は地下部および地上部で同程度の強さで発現しているのに対し、他の遺伝子は地下部で強い発現がみられた。以上の結果を踏まえ、各IPT遺伝子の機能について考察する。

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窒素は最も多量に必要とされる無機栄養素であり、植物の成長・分化に様々な影響を及ぼす。植物ホルモンは外界や内的な環境の変化を伝えるシグナルとして機能するが、窒素栄養状態による成長・分化の制御にサイトカイニンが関与していると考えられている。これはサイトカイニンレベルと窒素栄養状態との間に相関関係のあることが様々な植物において報告されているからである。我々はトウモロコシやアラビドプシスにおいて窒素飢餓状態からの回復過程でサイトカイニンレベルが増加することを明らかにしている。これらのことから、窒素栄養状態によりサイトカイニン代謝系が制御されていると考えられるが、これまでそのような研究はされていなかった。
サイトカイニンの生合成の律速酵素はイソペンテニルトランスフェラーゼであると考えられている。窒素栄養によるサイトカイニン代謝の制御機構を明らかにするため、real-time PCR法でアラビドプシスにおけるIPT遺伝子(AtIPT1、AtIPT3～8)の発現解析を行った。これらの遺伝子の中で窒素飢餓状態からの回復過程でAtIPT3遺伝子のmRNA量がサイトカイニンレベルと対応して増加していた。AtIPT3遺伝子プロモーター制御下にあるGFP遺伝子の発現も窒素に対し同様の応答を示したことは、転写段階での制御が存在することを示唆している。

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　植物ホルモンや浸透圧ストレスなどの刺激を植物が検知し、体内を伝達する際に、His-Aspリン酸リレー系が重要な役割を果たしていることが近年明らかにされつつある。His-Aspリン酸リレー系の構成因子の中で、情報の出力を担うレスポンスレギュレーター（RR）は、2つのタイプ（タイプA及びB）に分類されている。タイプA に属するRRの多くは、その転写がサイトカイニンによって誘導されるが、タイプBにみられるようなDNA結合に関与する領域を有さず、その具体的な機能の詳細は不明である。トウモロコシにおいて、タイプAに属するRRが6種類（ZmRR1,2,4,5,6,7）、タイプBに属するRRが3種類（ZmRR8,9,10）単離され、発現特性が明らかにされている。そこで我々は、タイプAのRRによって媒介される情報伝達系の一端を明らかにするために、ZmRR1と相互作用するタンパク質群を酵母Two-hybridの系を用いて単離・解析した。
　単離したタンパク質のうちの一つ（ZmHD1）は、金属イオン依存的なphosphohydrolase活性を担うHDドメインを含む、265 アミノ酸からなる機能未知のタンパク質であった。HDドメインを有するタンパク質は、バクテリア・古細菌・真核生物にわたって広く存在し、核酸代謝やシグナル伝達に関与していることが示されている。現在、ZmRR1 とZmHD1との相互作用の詳細な解析、ZmHD1の生化学的な性状解析を行っており、本発表で報告する予定である。

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rrd4は、根の再分化を指標形質として選抜した、シロイヌナズナ温度感受性変異体の1つである。その後の解析により、この変異体は脱分化や細胞増殖に関してサイトカイニン依存的な温度感受性を示すことがわかっている。脱分化・増殖に対するサイトカイニンの阻害作用は、通常きわめて高濃度で処理したときに観察されるが、rrd4変異体ではこのようなサイトカイニン副作用が低濃度域でも表面化するものと思われる。つまり、RRD4の本来の役割は、サイトカイニン副作用の抑圧にあると予想される。RRD4遺伝子の単離のために、まず精密染色体マッピングを行って、第1染色体上23 cMの位置、64 kbの範囲にRRD4遺伝子が存在することを突き止めた。次にこの領域内のCDSについて塩基配列を検討し、rrd4ゲノムのF20D23.23にアンバー変異を見出した。F20D23.23を含む野生型ゲノム断片をrrd4変異体に導入し、T2世代において、導入遺伝子の存在と制限温度下でのカルス形成能を調べたところ、これらが共分離していることが確認された。以上の結果から、RRD4遺伝子はF20D23.23に相当すると結論した。なお、このCDSは、マウスのTIP39（tuftelin-interacting protein）によく似たタンパク質をコードしている。

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水を分解し酸素を発生させる反応は、チラコイド膜ルーメン側の光化学系2酸化側に存在するマンガンクラスターで触媒される。この光合成水分解系の機能単位は、光化学系2反応中心タンパク質、CP47といったクロロフィルタンパク質、膜表在性タンパク質等の成分から構成されていると考えられているが、その最小の単位はまだ明らかになっていない。
そこで、ホウレンソウから単離した光化学系2標品を、界面活性剤であるスクロースモノラウレート(SML)で処理し、マンガンクラスターを欠いた光化学系2コア複合体(D1／D2／CP47／Cyt b559 ／Iタンパク質)を調製した。また、この過程でコア標品から遊離してきた、Lタンパク質などを含むSML抽出物をさらに精製し、数種のタンパク質を得た。SML抽出物に含まれるLタンパク質はQ_A活性の回復に関与していると考えられていることから、光化学系2コア複合体と低分子タンパク質との再構成を行った。電子伝達活性やMn²⁺のマンガン高親和性結合部位への結合能を測定した結果、この再構成により水分解系の酸化側あるいは還元側の回復がみられることが分かった。さらに、この標品を用いて、マンガンクラスターを再構築するために光活性化処理を行ったところ、ある程度の水分解能力の回復がみられた。

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　ラン藻及び植物の光化学系IIにおける水分解（酸素発生）反応の分子機構については、そのほとんどは未だ不明である。その解明のためには、基質水分子の反応の詳細を分子レベルで明らかにすることが重要である。我々はフーリエ変換赤外分光法（FTIR）による水分解系の構造と反応の解析を行い、閃光誘起S状態遷移の際の、蛋白質の反応を調べてきた。今回は、水のOH伸縮振動に焦点を当て、水分解系における水分子やその反応中間体の反応を、FTIR用いて直接検出することを試みた。
　Synechococcus elongatusの適度に水和したコア蛋白質を用い、各閃光誘起S状態遷移の際のFTIR差スペクトルを測定した。得られたスペクトルのOH伸縮振動領域には、一閃光で3617/3588cm^-1に微分形のバンドが、また、2,3,4閃光では、それぞれ、3634、3621、3612 cm^-1に負のバンドが観測された。これらのバンドはD₂O置換で~940cm^-1、H₂¹⁸O置換で~10cm^-1の低波数シフトを示し、Mnクラスターにカップルする水に由来するバンドであることが示された。また、各閃光照射におけるピーク位置の違いや、2-4閃光での負の強度は、特定の構造を持った基質水分子の反応を表していると考えられた。このように、FTIRは、光合成水分解反応の分子機構を調べるのに有用な手法であることが示された。

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パルス二重共鳴（PELDOR)法をPS2の電子伝達体の配置を決めるため3スピン系に応用した。トリス処理PS2の非ヘム鉄を亜鉛に置き換え、253Kで20秒光りを照射してチロシンZラジカルとQ_A^-をトラップして初めからあるチロシンDラジカルとの3スピン系でパルス二重共鳴（PELDOR)を行って得られたスピンエコー強度の第2πパルスをかける時間への依存性を3-スピン間の双極子相互作用に基づいて解析した。既知の距離Y_D-Q_A　38AとY_D-Y_Z　30Aを使用した解析からY_Z-Q_Aの距離 34Aを導いた。また同じ試料を200Kで光り照射して生じたY_D^・-Q_A^--Chl_Z⁺の3スピン系で同じ方法でY_D-Chl_Z　29Aを使用し、Q_A-Chl_Zの距離34Aを決定した。3スピン系の距離とこれまで2-スピン系のPELDORの距離とそのベクトルの方向から電子伝達体の3次元配置を導き、X-線解析結果と比較する。

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　高等植物PSIIでは表在性33 kDa蛋白は膜蛋白に直接結合できるが、23 kDa蛋白は33 kDa蛋白を介して、17 kDa蛋白は33, 23 kDa蛋白を介して結合することが知られている。一方、同タイプの表在性蛋白を持つ緑藻クラミドモナスPSIIでは、33 kDa蛋白のみならず 23, 17 kDa蛋白も単独で膜蛋白に結合できることを最近、我々は報告した (Suzuki et al. Plant Cell Physiol. in press)。本研究ではこの違いが何に起因するかを明らかにするために緑藻と高等植物間の表在性蛋白の相互置き換え再構成実験を行った。その結果、緑藻のみならず高等植物の23, 17 kDa蛋白は緑藻PSIIには単独で結合できるが、高等植物PSIIには単独では結合できないことが明らかになった。この事は、高等植物と緑藻における表在性蛋白の結合様式の違いはPSII膜蛋白の違いに起因していることを示している。さらに両タイプの表在性蛋白の種々の組み合わせの相互置き換え再構成実験の結果についても再結合による酸素発生の回復と合わせて報告する。

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　我々は、以前、ホウレン草の光化学系II(PSII)複合体を用いたin vitroの再構成実験により、PSIIサブユニットの一つPsbLタンパク質がpH 5.5以下でのPSIIのYz（第一電子供与体）からP680への電子移動に関与していることを報告した。本研究では、葉緑体形質転換法により、タバコのpsbL遺伝子欠失体 (psbL欠失体)を作出し、psbL欠失が葉の生育状況と PSIIの電子移動活性(PSII活性)に与える影響を調べた。
　psbL欠失体は光独立栄養的には生育しないが、スクロース存在下では生育する。植物体の頂端部近くの若い葉（頂端部から数えて第1、第2葉）では、PSII複合体（PsbL欠失）は存在し、PSIIの集光性クロロフィル結合タンパク質群（LHC2）も野生株と同程度に存在するにも関わらず、PAM測定から求めたPSIIの光電子移動活性は野生株の1/10程度であった。すなわち、アンテナクロロフィルにより吸収されたエネルギーはほとんど光化学反応中心P680には伝わっていない。さらに、葉の成長が進むにつれて葉（第3葉以下）の退色がはじまり、第5，6葉ではほとんど白色に近くなる。しかし、このような葉でもPSIIの光電子移動活性は若い葉と変わりなく、野生株の1/10程度は保持している。これらの結果とin vitroの再構成での結果に基づき、PSIIの電子移動調節におけるPsbLサブユニットの役割を検討する。

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光化学系IIルーメン側表在性33-kDaタンパク質は、すべての光合成器官に共通して存在し、光合成酸素発生に重要な働きを持つタンパク質である。シロイヌナズナにおいて、このタンパク質はpsbO、psbO2の2つの遺伝子によってコードされているが、これらの遺伝子産物は互いにきわめて高い相同性を有している。私達は、この2つの遺伝子の機能的関係を、psbO遺伝子に変異を持つシロイヌナズナの突然変異体、LE18-30株を用いて解析している。この突然変異体は顕著な光合成活性の低下を示し、psbO2遺伝子単独ではpsbO遺伝子の欠損を補えないことが明らかとなった。このことは、両遺伝子の発現もしくは機能に何らかの差異が存在する可能性を示唆していた。一方、SDS-PAGE、immunoblotにおいて、両タンパク質の分子量はほぼ等しいにもかかわらず、野生型では2本のシグナルが検出でき、突然変異体では1本のシグナルのみ検出されることが明らかとなった。つまり、PsbO、PsbO2タンパク質が生化学的性質において、わずかながら差異を持つことが明らかとなった。現在、PsbO、PsbO2タンパク質の大腸菌での発現と精製を行い、in vitro再構成実験などによる機能解析を進めている。

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光化学系II膜のルーメン側にあるMnクラスターは、水分解・酸素発生反応を触媒し、緑藻や高等植物ではOEC33、24、18と呼ばれる3種の膜表在性タンパク質によって囲まれている。OEC33はMnクラスターの構造維持に関与し、OEC24、18は酸素発生に必要なCa2+、Cl-の濃度調整に関与している。これら膜表在性タンパク質ついては長年機能解析されてきたが、まだ不明な点が多い。その機能を解明するためにはこれらタンパク質の立体構造を知ることが必要不可欠である。そのため、X線構造解析に用いる良質な結晶の作製が必要である。そこで本研究では、これら3種類のタンパク質のうち、まだ結晶化された報告がないOEC18についてホウレンソウから精製した。この精製したタンパク質を用いて結晶化を行った結果、長さ100μm程度の結晶を得ることが出来た。しかしこの結晶は厚みが薄く、各種結晶化条件を変更しても結晶の質はあまり改善されなかった。そこで次に種の違うトウモロコシのOEC18を大腸菌に大量発現精製した。　得られたサンプルを用いて結晶化を試み、いくつかの条件下で微結晶を得た。今後は更に結晶化条件の最適化を行い、X線構造解析に適した結晶を作り、構造を解析する予定である。さらにホウレンソウから精製したOEC33についても結晶化を行ったのでその結果をあわせて報告する。

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　近年、ラン藻由来の光化学系2複合体の立体構造解析が進展し、膜表在性タンパク質で構成される酸素発生系に関しても,その立体構造が明らかにされつつある。一方で高等植物、緑藻の光化学系2に特徴的に存在する膜表在性23-kDa, 16-kDaタンパク質 (OEC23, OEC16)に関してはその構造は全く未解明である。我々はこのうち、OEC23の3次元立体構造の同定を目指してその結晶化とX線解析を試みてきた。
　まず複数の植物に由来するOEC23タンパク質を大腸菌発現系で調製し、結晶化条件のスクリーニングを行った。結晶が生じたものに関してさらに結晶化条件の最適化を行った結果、最高で1.5ÅのX線回折能を持つ結晶の調製に成功した。さらに得られた結晶を用いて重原子置換結晶を調製し、大型放射光施設SPring-8において多波長異常分散法 (MAD)による位相決定を行った。今回、それらのデータを用いて、OEC23の立体構造の同定に2.0Åの分解能で成功したので報告する。

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　シトクロムb-559(cyt b-559)は光化学系II(PS II)を構成するコア蛋白質の一つである。PS II反応中心当たりのcyt b-559の数に関して永く論争されてきた。ある研究報告では1，別の報告では2，またその中間の値と一致が見られない。
　この研究で，我々は，まず初めに高熱ラン藻，Synecococcus vulcanus (S.v.)より高い酸素発生能を保持した光化学系IIを精製した試料(結晶化に用いたと同等の試料)を用いた。Chl aの濃度を基準にして，HPLC法によりS.v.の反応中心濃度(2個のpheo a当たり)および同一標品の還元－酸化差吸収スペクトルを波形分離処理して得られたスペクトルからcyt b-559の還元－酸化差分子吸光係数を求めた。この標品は反応中心当たりそれぞれ一個のcyt b-559とcyt cを含みX線結晶解析結果と一致した。
　さらに，ホウレンソウPS II中のcyt b-559の数も求めた。

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高等植物の光化学系II複合体に強光照射を行った場合には光阻害が起こり、その構成サブユニットは酸化的損傷を受ける。その結果、反応中心D1蛋白質が周囲のタンパク質と架橋することが知られている。還元側光阻害が起こり光化学系II複合体のストロマ側が損傷を受けた場合、D1蛋白質は反応中心D2蛋白質、アンテナクロロフィル結合蛋白質CP43、シトクロームb559のαサブユニットと架橋することが明らかになっており、これはD1蛋白質がそれぞれのサブユニットと近接していることを示している。一方、OEC33を取り除いた光化学系II複合体に光照射を行うと酸化側光阻害が起こり、D1蛋白質はCP43とのみ架橋する。この架橋はOEC33を保持しているかまたはOEC33を取り除いたあと再結合させた光化学系II複合体では起こらない。つまりD1蛋白質、CP43、OEC33は光化学系II複合体のルーメン側で近接しており、またOEC33は通常この架橋を防いでいると考えられる。以上の結果から高等植物の光化学系II複合体においてD1蛋白質とCP43はストロマ側・ルーメン側のいずれにおいても近接していると考えられ、これは近年報告されたシアノバクテリアの光化学系II複合体の結晶構造解析の結果と一致している。一方、高等植物の光化学系II複合体におけるOEC33の存在状態とその位置はシアノバクテリアの場合とは異なることが示唆された。

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光照射下では光化学系 II（PS II）反応中心の D1 タンパク質が選択的に損傷を受け PS II が解体され、新生 D1 タンパク質と他のタンパク質成分とから PS II が再構成される。この PS II の解体・再構成サイクルでは、PS II の 3 種類の表在性タンパク質は一旦 PS II から遊離した後、再構成された PS II に再結合すると考えられている。
ホウレンソウ PS II 膜標品に強光（4 mE m^-2 s^-1）を照射すると OEC33 は徐々に PS II から遊離し、3 時間で約 4 割が遊離した。SDS/urea-PAGE の後銀染色で検出すると、トリス処理で単離した OEC33 はシャープなバンドを形成したのに対し、強光照射下で遊離した OEC33 のバンドは高分子量側にテーリングしたことから、強光照射下で OEC33 の一部は損傷を受けることが示された。強光照射で遊離した OEC33 の urea/NaCl 処理 PS II への再結合を調べた実験で、シャープなバンドを形成する OEC33 成分のみが再結合することがわかった。スーパーオキシド除去剤あるいは金属キレート剤存在下で強光照射すると、OEC33 の遊離は影響を受けなかったが、損傷は大きく抑えられた。また OEC33 をヒドロキシルラジカルにさらすと強光照射と同様に損傷を受けることから、光照射下で生じたスーパーオキシドからヒドロキシルラジカルが生成し、これが遊離した OEC33 に損傷を与えることが示唆された。

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高等植物の光化学系II反応中心D1蛋白質は、暗条件で高温ストレス(30～40℃)を与えると、23kDaと10kDaの二つの断片を生じる。この切断は生じた断片のサイズから、還元側光阻害におけるD1タンパク質の一次分解に類似していると考えられる。そこで本研究では、ホウレンソウのチラコイド膜を用いて、高温下でのD1蛋白質の一次切断が起こる機構を詳しく調べ、還元側光阻害における一次切断と比較した。
プロテアーゼ阻害剤を用いた実験などから、高温下でのD1蛋白質の一次切断には膜表在性のセリンプロテアーゼが働き、その後の二次分解には膜内在性のプロテアーゼが作用していることが分った。これらの特徴は光化学系IIの還元側光阻害におけるD1蛋白質の一次切断および二次分解と共通しており、このことから、高温ストレスは還元側光阻害と同様の機構でD1蛋白質を一次切断する可能性が示唆された。
また、QB部位結合除草剤であるDCMU、Bromoxynil、Ioxynilを加えてチラコイドを熱処理(40℃、15分)したところ、23kDa断片の形成が著しく阻害された。この結果から、D1蛋白質の一次切断はDEループ上のQB部位の構造に強く依存しており、この構造が高温下で変化することがD1蛋白質の一次切断の原因であると考えられる。

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　昨年、50℃・30秒の熱処理で可逆的に熱失活した葉緑体・酸素発生系の光再活性化について報告し、さらに低い温度での熱失活が期待された。一方、光化学系・粒子では、塩素イオン要求性にすると45℃で酸素発生中心が熱失活出来ると報告されていたので（D. Nash, M.Miyao and N.Murata, Biochim. Biophys. Acta vol-807 (1985）127-133)、葉緑体も低調液で洗って塩素イオンを除くと、45℃で可逆的に熱失活し光再活性化出来るようになった。　この可逆的熱失活の部位が光化学系IIの酸素発生中心である事は、クロロフィル蛍光の立ち上がり現象（Fv-Fo）および酸素発生ヒル反応を測定して確認した。　この塩素イオン要求性葉緑体の熱失活は、塩素イオンとカルシウムイオンの添加で抑制・保護される興味ある特性を持つ事が分かったので報告する。

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　植物の葉緑体やラン藻のチラコイド膜は、光合成の初期過程が起こる場であり、主に膜を形成する脂質と、光合成装置としてのタンパク質複合体から構成される。光合成に果たす脂質の機能が徐々に明らかとなってきたが、中でもホスファチジルグリセロール（PG）は、チラコイド膜を形成する脂質の中で、唯一のリン脂質であり、その機能は興味深い。これまで、我々の研究室では、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803からPG合成欠損株を単離し、PGが光合成、特に光化学系II (PS II) において重要な機能を担うことを明らかにしてきた。
　本研究では、この変異株を用いて、PS II 複合体の形成におけるPGの機能について解析した。変異株ではチラコイド膜におけるPG含量の低下により、光合成装置の修復が損なわれ、容易に光合成の光阻害が生じた。この光阻害について分子レベルで解析を進めた結果、PG含量の低下に伴い、PS II複合体の二量体化が制限されることが分かった。PS II複合体の二量体化は、PGの添加により速やかに改善された。PS II複合体の単量体／二量体の変動は、光合成活性の変動とよく一致し、変異株に起こる光阻害の原因がPS II複合体の二量体化にあると推測される。これらの結果は、光合成装置の修復過程の一つと考えられるPS II複合体の二量体化に、PGが重要であることを示している。

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根頭がんしゅ病菌 (Agrobacterium tumefaciens) を接種したジャガイモ塊茎ディスクより，腫瘍形成過程において発現が抑制される遺伝子の一つとしてシトクロム P450と相同性を示すDNA断片が得られた。RACE法により得られた完全長cDNAの推定アミノ酸配列からCYP72A29と命名され、系統樹解析によりナス科植物にユニークであることが示された。塊茎ディスクにおいて、CYP72A29は傷処理により一過的な発現誘導を受けたのちに恒常的な発現を示すようになるが、根頭がんしゅ病菌野生株あるいはIAAを恒常的に生産する根頭がんしゅ病菌組換体の接種により、この発現は完全に抑制された。2,4-D処理によっても抑制されることから、CYP72A29の発現はオーキシンによる発現制御を受けると考えられた。発現の抑制は、エリシターであるアラキドン酸処理によっても認められた。以上の発現様式は、これまでに報告されているフェニルプロパノイド合成系やアルカロイド合成系などの2次代謝に関与する遺伝子と類似していた。RT-PCRにより発現部位を調べたところ、萌芽塊茎の芽において高い発現が見られたが、他の組織においてはほとんど認められなかった。

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　ある代謝経路の活性の変化とは、その経路を流れる化合物量、すなわち代謝フラックスの増減を意味している。ジャガイモ塊茎組織に傷害を与えると、フェニルプロパノイド経路の活性化がおこり、chlorogenic acid (CGA) が顕著に蓄積する。一方、同じくフェニルプロパノイド代謝産物の一つであるN-p-coumaroyloctopamine (p-CO)の含量は生合成酵素が活性化しているにも関わらず微量しか増加しない。本代謝制御の詳細を明らかにすることを目的として、これらの化合物の生合成フラックスの実測を試みた。
　ジャガイモ塊茎からディスクを作成し、24時間後に10mM L-phenyl-d₅-alanine 水溶液を処理した。経時的にディスクを回収し、抽出液中のCGAおよびp-COとその重水素ラベル体の含量をLC-MSで測定した。重水素ラベル体比の経時変化を表す式を、実測値に非線形回帰法で近似させ、CGAとp-COの生合成フラックスをそれぞれ 4.2 および 1.1 nmol / gFW/ h と求めることができた。以上より、生成したCGAはほとんどが蓄積するのに対し、同じオーダーのフラックスで生成しているp-COは速やかに代謝され、蓄積しないものと考えられた。

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【目的】植物は環境からの様々なストレスに対応しており、除草剤などの生体外異物を水酸化反応やグルタチオン抱合などの修飾反応を行って蓄積することが報告されている。細胞毒性の高いナフトール類を異物のモデル化合物としてタバコ細胞に投与すると、細胞死が起こらない濃度（500μM以下）では投与したナフトールが配糖化及びさらに修飾を受けて細胞内に蓄積され、それに伴い細胞内の配糖化活性が増大することをこれまでに明らかにした。そこで、植物における異物の代謝のモデルとして、このナフトールの代謝についてさらに検討を進めた。
【結果・考察】タバコ細胞内に蓄積されたナフトール代謝産物を分取HPLCで精製し、構造決定を行ったところ、代謝産物はグルコースの6位がマロニル化されたナフトールグルコシドであった。そこで、ナフトールグルコシドを基質としてタバコ細胞内のマロニル化活性を検討したところ、強いマロニル化活性が認められた。さらに、ナフトールをクララ及びムラサキの培養細胞に投与したところ、 いずれにおいても細胞内にマロニルグルコシドとして蓄積されることが明らかとなった。このことは、植物一般にこのような異物をマロニルグルコシドとして蓄積するシステムが存在していることを示唆している。現在、様々な化合物についてその蓄積形態の検討を進めている。

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我々は、ムラサキ培養細胞に見られるshikonin生合成能の変異を分子レベルで明らかにすることを目的として、shikonin生産株（Mp株）と非生産株（MpW株）のフェノール性代謝産物組成及びshikonin生合成に関与する酵素遺伝子の発現レベルを比較した。今回はさらに、FDD法を用いてMp株で強く発現している遺伝子として単離したLEPS-2についての解析結果も合わせて報告する。
Mp株とMpW株のフェノール性代謝産物を逆相HPLCで分離し、NMR及びMSを測定することにより同定した。Mp株の可溶性methanol画分では、shikonin誘導体をはじめ、rosmarinic acidやlithospermic acid、rabdosiin などのphenylpropanoid化合物が検出された。一方、MpW株では、lithospermic acid以外はこれらの化合物の含量は著しく低かった。しかしながら、shikonin生合成酵素遺伝子の発現レベルには株間で有意な差はなかった。
次に、FDD法によって単離したLEPS-2の遺伝子発現レベルとshikonin生産との関連を解析したところ、両者には強い正の相関性があった。さらに、LEPS-2タンパク質の細胞内局在性を調べた結果、LEPS-2は細胞壁のアポプラスト画分に存在していた。培養細胞でのshikoninの最終的な蓄積部位も細胞壁であり、本タンパク質はshikoninの細胞壁での放出、輸送、もしくは蓄積に関与しているものと推定している。

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芳香族化合物のプレニル化は、二次代謝産物や生体キノンの生合成にとって重要な反応である。我々はナフトキノンであるシコニンを生産するムラサキから、p-hydroxybenzoic acid (PHB) をゲラニル化する PHB: geranyltransferase の cDNA を2種クローニングした。両酵素とも極めて近似した組織特異的発現、ならびに環境応答性を示すとともに、geranyl diphosphate に強い特異性を示した。今回さらに詳細に解析した結果、両者の反応速度、Km 値には明確な差異が認められた。そこでこれらの違いを明確にすることを目的に、プレニルトランスフェラーゼ活性に必須な部位を特定すべく、真核細胞由来の prenyltransferase において保存性の高い領域、ならびに低い領域を選び、5種類の deletion clone を作製しその酵素活性を測定した。その結果、いずれのクローンにおいても酵素活性が著しく低下することを認めた。deletion による立体構造変化が考えられることより、現在ポイントミューテーションによる、活性に必須なアミノ酸残基の解析を行っている。

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ニコチン・アルカロイドの部分分子骨格はニコチン酸に由来し、一次代謝産物であるNADもニコチン酸から誘導される。しかし、高等植物ではその経路や出発物質について明確には判っていなかった。
我々は、ニコチン・アルカロイド生合成系に関わる遺伝子群の発現量が低下しているタバコ変異株とその野生株のmRNA発現をFDD法により解析した。その結果、変異株で発現量が低下している新たな遺伝子として、細菌類のニコチン酸生合成系に含まれるキノリン合成酵素(QS)のホモログを見出した。理研アラビドプシス完全長cDNAライブラリー内に、QSとニコチン酸生合成系に含まれる別の酵素、アスパラギン酸酸化酵素(AO)のホモログを見出し、それぞれの大腸菌欠損株でアラビドプシス由来のQSとAOホモログを発現させ、それらが大腸菌酵素の機能を補完する事を確認した。高等植物においてニコチン酸は、動物やカビ類の様にL-Trpから誘導される系ではなく、細菌類と同じくQSやAOによって触媒される系によってL-Aspから生合成されることを、これらの結果は強く示している。

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タバコ（Nicotiana tabacum）の主なアルカロイドであるニコチンは防御物質としての役割をもち、根で生合成され転流により葉で蓄積される。ニコチン含量は2つの遺伝子座（Nic1, Nic2 ）によって制御されている。ニコチン生合成に関して更なる知見を得るためにFDD法を用いて野生型と低ニコチン変異株（nic1nic2）の根における発現パターンの相違を観察した結果、変異株の根において発現量が低下している幾つかの新規遺伝子の単離に成功した。このうち2つの遺伝子（NtMATE1, NtMATE2）は12の推定膜貫通領域をもつ類似したタンパク質をコードし、 multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family のトランスポーターと相同性があった。植物において見出されているMATE familyの中では、プロアントシアニジンの液胞への蓄積に関与すると推定されているアラビドプシス TRANSPARENT TESTA12と非常に良く似ていた。これらタバコ遺伝子はニコチン生合成調節遺伝子NIC に厳しく制御されており、また根において特異的に発現していることが分かった。これらのトランスポーター様タンパク質は、ニコチンの輸送に関与していると考えられる。

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タバコが生産するニコチンは傷害に応答してその蓄積量が増加する。ニコチンをほとんど生産しないタバコnic変異株と野生型との遺伝子発現量の差から、いくつかの遺伝子が単離されている。そのうちの一つ、プトレシンN-メチルトランスフェラーゼ遺伝子(PMT)はニコチン生合成遺伝子の一つで、プトレシンにS-アデノシルメチオニンのメチル基を転移させる。傷害応答のシグナルにはジャスモン酸が関与しており、PMTについてもジャスモン酸応答性を示す。PMTプロモーターのジャスモン酸応答性を詳細に調べるために、PMTプロモーターのデリーションシリーズの作成および変異の導入を行い、ルシフェラーゼをレポーターとするコンストラクトを作成した。これらのコンストラクトをタバコBY-2細胞のプロトプラストにエレクトロポレーションで導入し、メチルジャスモン酸処理の有無による発現量の比較をdual luciferase assayにより行った。開始メチオニンの上流-172bpから-149bpまでの24bpを4コピータンデムにつなぎCaMV35Sの最小プロモーター(-46)につないだコンストラクトでメチルジャスモン酸に応答性を示すことが確認された。今回はPMTプロモーターの解析に加え、PMTと発現形式が非常によく似ているが機能未知の遺伝子A622のプロモーター解析についても合わせて発表する予定である。

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我々はニコチンを産生するタバコをモデル植物として，アルカロイド生合成制御の分子的基盤の解明を目指している。ニコチン生合成経路の酵素遺伝子は主に根部で発現し，その発現量はジャスモン酸（JA）により増大する。また，タバコ低ニコチンnic変異体を用いて，ニコチン生合成経路の酵素遺伝子の発現がNICによる正の調節を受けること，ニコチン生合成を制御するJAシグナル経路が病傷害応答JAシグナル経路と共通した経路部分とNICシグナル経路依存性を示すニコチン生合成特異的な経路部分から構成されていることを明らかにしてきた。一方，葉部でもNICシグナル経路が部分的に機能しており，JAで活性化されることが観察されている。この点に着目して，タバコ野生株とタバコ低ニコチンnic変異体間でMeJA処理した葉部におけるRNAレベルが異なる遺伝子を蛍光ディファレンシャルディスプレイ法で探索した。同定されたNIC依存性を示すJA初期応答遺伝子JEI1（Jasomonate Early Inducible 1）の葉部での発現は傷害初期応答性も示し，またエリシターやタンパク合成阻害剤による発現誘導も観察された。完全長cDNAを単離した結果， JEI1遺伝子はタンパク間相互作用ドメインが見い出される新規なタンパクをコードしていることが明らかとなった。

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ピリジンアルカロイドであるトリゴネリン（Tg）は，環境ストレスのシグナル，適合溶質，あるいは，葉の開閉運動にかかわるなど生理学的役割が報告されているが，この物質の生合成やその制御に関する研究は極めてすくない。コーヒーは，カフェインと共にTgを多量に蓄積する植物である。そこで，今回はコーヒー植物におけるTgの分布と，NADの分解で生じると思われるニコチンアミド(Nm)とニコチン酸(Na)からの生合成を検討した。Tg濃度は，コーヒー葉では若い時に高く，葉の伸展に伴い減少した。一方，果実では，成熟に伴い濃度が高まった。根におけるTg濃度は低かった。[¹⁴C]Nmと[¹⁴C]Naを組織に与えると，直ちにTgに放射能がとりこまれた。若いコーヒーの葉では，18時間後に，60％の放射能がTgに分布しており，残りは，NAD,　NADP,　NMN，CO2に見られた。Tgの合成は，緑色の果皮と種子で見られたが，生合成能は赤い成熟果実では低下した。これらの結果は，コーヒー植物では，Nm→Na→Tgの経路とNa,NmからNAD, NADPへのサルベージ経路があることが示された。一方，チャなどの植物では，Tg合成系はなく，Naグルコシドが生成することが生成された。

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　カフェインの生合成経路には3段階のメチル化反応が含まれる。キサンチン骨格のN-7位、N-3位の2回のメチル化の後テオブロミンが、さらにN-1位がメチル化されカフェインが合成される。チャ（Camellia sinensis）から我々が単離したカフェインシンターゼ（TCS1）は、最後の2段階、つまりN-3位とN-1位のメチル化を触媒するN-メチルトランスフェラーゼである。
　本研究では、広範な植物でのカフェインシンターゼの機能を比較するために、主としてテオブロミンを蓄積するカカオ（Theobroma cacao）からTCS相同遺伝子を単離し、その機能解析を行った。チャとコーヒーのカフェインシンターゼ（CS）やテオブロミンシンターゼ（TS）に保存されているS-アデノシルメチオニンの結合領域をもとに作成したプライマーを用いて、RACE法によりカカオの葉からTCS相同遺伝子BTS1を単離した。BTS1がコードするタンパク質の推定分子量は41kDaであり、今までに単離されているCSやTSとほぼ同じ値であった。TCS1およびコーヒーのCTS1とBTS1のアミノ酸配列の相同性はそれぞれ55％、35％であった。予想される基質を用いて大腸菌で発現させたBTS1のN-メチルトランスフェラーゼ活性を測定した結果、7-メチルキサンチンに対する活性が認められ、このタンパク質がテオブロミンシンターゼであることが示された。

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抗菌性イソキノリンアルカロイドであるベルベリンの生合成経路には13段階の反応が含まれ、そのうちの2段階はcytochrome P450（P450）によって触媒される。特に、メトキシフェノールの環化（メチレンジオキシ環形成）を行うP450反応はその反応機構や、有機合成の難しさから大変興味深い。今回、ベルベリンを高生産しているオウレン培養細胞から、メチレンジオキシ環形成反応を触媒するP450遺伝子の単離ならび同定に成功したので報告する。
植物、動物に共通するP450遺伝子の保存配列をもとにオウレン培養細胞cDNAライブラリーから2種のP450遺伝子のcDNAを単離した。その推定アミノ酸配列に基づく相同性解析から、これらは、P450命名委員会によりCYP80B2、CYP719と命名された。CYP80B2を酵母で発現させた結果、同遺伝子は、既にハナビシソウ（Eschscholzia californica）からクローニングされているCYP80B1同様、(S)-N-methylcoclaurine-3^'-hydroxylase反応を触媒することが明らかとなった。一方、CYP719を同様に酵母で発現した結果、(S)-terahydrocolumbamineを基質として、メチレンジオキシ環形成反応によって、(S)-tetrahydroberberineを生成することが明らかとなった。更なる解析によりCYP719の基質親和性、基質特異性が高いことが判明した。すなわち、CYP719はベルベリン生合成経路に特異的なP450であることが明らかとなった。

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Phototropin has two chromophoric domains named LOV1 and 2, each of which bears a FMN, in its N-terminal half. C-terminal half is a serine/threonine kinase. Absorption of photon initiates photochemical reactions of FMN that may induce conformational changes in the protein moieties responsible for the regulation of kinase activity. To investigate the details of the early photoreception process, we have started biophysical analyses using UV-visible absorption, FT-IR and CD spectra of the LOV domains. We have already reported that the thiol-flavin adduct but not thiolate-flavin (Schwartz et al., 2001) adduct is formed between C4a of the isoalloxazine ring of FMN and thiol of the only one cystein in the LOV. In the present paper, we will show the adduct formation induces significant conformational changes in the protein moieties of phototropin in contrast to the figure obtained by X-ray crystallography with little conformational change in them.

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　マメ科植物の葉（あるいは葉柄）の上下運動は、青色光によって制御されることが知られている。また、この運動は、葉枕に存在する運動細胞の体積の変化によって起こることが示されている。我々はマメ科のモデル植物であるミヤコグサから、青色光によって誘導される葉の開き（起床運動）が遅い突然変異体 lazinessを単離し、その制御機構の解明を試みている。laziness 突然変異体の就眠運動は野生型と同様であり、胚軸光屈性、葉緑体光定位運動、および胚軸伸長阻害といった、葉の起床運動以外の青色光応答反応も正常であった。現在、LAZINESS 遺伝子座のマッピングを行っている。
　また、葉の起床運動は既知の青色光受容体によって制御されている可能性もある。そこで、シロイヌナズナ青色光受容体、クリプトクロムおよびフォトトロピンの相同遺伝子をミヤコグサから単離した。これらのアンチセンス形質転換体の作出、およびシロイヌナズナ cry1cry2phot1phot2 四重変異体への遺伝子導入を行った。これらの青色光応答反応を観察することで、逆遺伝学的なミヤコグサ青色光受容体の機能解析も試みている。

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　シロイヌナズナのフォトトロピン（phot1, phot2）は、青色光に依存した光屈性、葉緑体の光定位運動、気孔開口の青色光受容体である。これらの青色光に依存した植物の応答反応には、細胞内のCa²⁺がセカンドメッセンジャーとして働いている可能性が示唆されている。我々は、青色光による細胞質Ca²⁺濃度変化とそれに対するフォトトロピンの関与を明らかにするために、Ca²⁺感受性発光タンパク質であるエクオリンの遺伝子を導入したシロイヌナズナ（野生型、phot1, phot2 突然変異体, phot1 phot2二重突然変異体）を作成し、以下の実験を行った。
　野生型のロゼット葉に0.1-250 μmol m^-2 s^-1の青色光をそれぞれ10秒間照射したところ、いずれの場合も細胞質Ca²⁺濃度上昇を反映した一過的なエクオリンの発光が観察された。この青色光に依存した細胞質Ca²⁺濃度上昇についてそれぞれの変異体を用いて解析したところ、phot1は0.1-50 μmol m^-2 s^-1で、phot2は1-250 μmol m^-2 s^-1で働いていることが分かった。青色光に依存したCa²⁺濃度上昇に対するphot1の貢献度は、phot2の有無によって影響を受けなかったことから、phot1とphot2はそれぞれ独立して働いていることが示唆された。本発表では、以上の結果に合わせて、Ca²⁺チャネルブロッカーなどの薬剤の影響についても報告する。

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アラビドプシス突然変異体の解析からフォトトロピンは光屈性，葉緑体定位運動，気孔開口反応の青色光受容体として機能することが明らかされてきた。アラビドプシスには2種類のフォトトロピン（phot1，phot2）が存在する。各々の分子はFMNを結合するLOVドメイン（LOV1，LOV2）とkinaseドメインを持っており，青色光受容反応あるいは情報伝達に必須の役割を担っていると考えられている。両方のフォトトロピンの機能を欠失した二重変異体ではこれら3つの青色光反応が見られなくなる。私達はin vivoでのphot1の気孔開口反応への関与を調べるため，フォトトロピンを欠損したアラビドプシス二重変異体をカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター下流にphot1遺伝子を繋いだコンストラクトにより形質転換し，導入された遺伝子の発現による青色依存の気孔開口反応の相補について検討を行った。緑葉及び黄化芽生えでの発現レベルは野生株と比較すると1％以下であったが，野生型phot1タンパク質を発現している形質転換体では気孔の青色光反応が確認された。この結果は，野生型phot1タンパク質が形質転換体で青色光受容体として機能し，またin vivoで気孔の青色光反応において必須であることを示している。現在PHOT1の機能を改変した遺伝子を導入した形質転換体を作成し，気孔の青色光反応におけるphot1 kinaseドメインの役割について検討中である。

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青色光は孔辺細胞の細胞膜H⁺-ATPaseを活性化して気孔開口を引き起こす。最近、私達は気孔開口の青色光受容体がphotであることをシロイヌナズナの変異体を用いて明らかにした。しかしながら、シロイヌナズナの孔辺細胞プロトプラスト(AtGCPs)を用いた青色光反応の解析は行なわれていない。本研究ではAtGCPsの大量調製法を確立し、AtGCPsにおける青色光反応について調べた。AtGCPsはロゼット葉表皮からセルラーゼ処理により単離し、Histopaque(比重1.077)により精製した。精製したプロトプラストは約98%が孔辺細胞であり、収量は約1,000枚の葉から約3.0 x 10⁶細胞(蛋白量約50 μg)であった。ウエスタン解析により細胞膜H⁺-ATPase、phot1、phot2がAtGCPsに発現していることを確認した。そこで、AtGCPsにおける青色光(100 μmol/m²/sec、30秒)によるH⁺放出反応を調べた。その結果、H⁺放出は青色光照射開始から2分で最大となり10分程度持続した。さらに、phot二重変異体のGCPsを用いて調べたところ、細胞膜H⁺-ATPaseは正常に発現しているが青色光によるH⁺放出反応は全く見られなかった。このことはphot1とphot2が青色光受容体として機能していることを示している。現在、青色光による細胞膜H⁺-ATPaseのリン酸化の解析を進めている。以上の結果はソラマメGCPsで得られた結果を追認するとともに、シロイヌナズナ変異株等を用いた気孔の青色光反応の生化学的解析が可能であることを示している。

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青色光は孔辺細胞の細胞膜H⁺-ATPaseのリン酸化により活性化し、気孔開口の直接の原因となるK⁺取り込みの駆動力を形成する。最近、我々は気孔開口の青色光受容体がphotであることをシロイヌナズナのphot変異体を用いて明らかにした。photはN末側にLOVドメイン、C末端にキナーゼドメインをもち、青色光により自己リン酸化することが知られている。しかしながら、孔辺細胞におけるphotの生化学的解析は行なわれていない。本研究ではソラマメ孔辺細胞におけるphotのリン酸化反応について調べた。ソラマメにはvfphot1とvfphot2 の少なくとも2つのアイソフォームが発現していた。32Pラベルした孔辺細胞プロトプラストを用いてvfphotのリン酸化状態を調べたところ、vfphotは青色光照射によりただちにリン酸化され、照射開始から約1分で最大となり照射後20分でもとのレベルまで脱リン酸化された。一方、細胞膜H⁺-ATPaseのリン酸化は約5分で最大となり、H⁺-ATPaseの活性化に先立ってvfphotがリン酸化されることが明らかとなった。また、vfphotとH⁺-ATPaseのリン酸化の青色光強度依存性は一致しており、キナーゼ阻害剤やブラビン蛋白質阻害剤に対する感受性も一致していた。以上の結果より、vfphotは気孔の青色光受容体として機能しており、vfphotのリン酸化は光受容の初期過程において重要な役割を果たしていることが示唆された。

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高等植物では、光屈性や葉緑体定位運動、気孔の開口などの光反応が青色光受容体フォトトロピンによって制御されることが知られている。我々は、フォトトロピン類似の遺伝子が単細胞緑藻であるクラミドモナスにも存在することを見出し、その遺伝子の同定に成功している。今回我々は、クラミドモナスのフォトトロピン（Crphot）が、系統的に大きく離れたシロイヌナズナでも機能するかどうかを調べた。そのために、Crphotを35Sプロモーターの制御下で、シロイヌナズナのphot1 phot2二重変異体内で発現させ、親株である突然変異体で見られる葉の湾曲の回復を指標としていくつかのラインを選別し、導入したCrphotのmRNA及びタンパク質の発現の解析を行った。この結果から、葉の形状の回復程度とCrphotの発現量には密接な関連があることを確認し、発現量に従ってこれらのラインを高・中・低発現ラインとして分類した。これらについて青色光による光屈性の実験を行ったところ、高発現ラインでは光屈性反応が見られた。また、葉緑体定位運動についても、高発現ラインでは弱青色光による集合反応と強青色光による忌避反応の両方が回復していることが示唆された。一方、中・低発現ラインではこのような現象は見られなかった。こうした結果から、系統的に大きく異なる植物種間においても共通のCrphot情報伝達経路が存在していることが示唆された。

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