相同組換えは遺伝的多様性とゲノムの安定性に貢献する普遍的な機構である。RecAはほぼ全てのバクテリアに存在し、相同組換えにおいて極めて重要な役割を果たす組換えタンパク質である。このバクテリア型RecAタンパク質は植物の核ゲノムにも複数コードされており、葉緑体やミトコンドリアに移行することが明らかにされているが、その機能、役割に関しての知見は少ない。そこで我々は遺伝子ターゲッティングが可能なヒメツリガネゴケにRecAのオーソログを同定し（PpRecA1と命名）、その解析を行った。PpRecA1のN末端側とGFPの融合タンパク質はミトコンドリアに局在した。PprecA1は大腸菌のrecA遺伝子欠損によるDNA修復能の欠損を部分的に相補し、また、PprecA1の発現はDNA損傷剤処理により誘導されることから、PpRecA1は大腸菌RecAと類似した機能を持ち、DNA修復に関与することが示唆された。相同組換えによりPprecA1遺伝子を破壊した株を作成し野生株との比較を行ったところ、破壊株は生育遅延と形態異常を示すことが判明した。さらに解析を行った結果、PprecA1破壊株のミトコンドリアDNAは各所で高頻度に再編成を起こしていることが明らかになった。これらの結果は、PpRecA1がミトコンドリアゲノムの維持に貢献していることを示唆する。

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カルジオリピン(CL)は、真正細菌から動植物のミトコンドリアにまで広く存在する特徴的な構造をもったリン脂質である。ミトコンドリアにおいてCLは内膜や外膜と内膜の接触部位に特に多く含まれるといわれている。私たちは真核多細胞生物で初めてCL合成酵素遺伝子CLSを同定し、その遺伝子にT-DNAが挿入されたタグラインclsを解析することで、CLの機能を検討している。
cls/clsは胚発生が遅延するため、親株であるCLS/clsを良好に栽培しないと種子を得ることができない。また、発芽後も根を中心として顕著な生長抑制を呈する。そこで、CLを特異的に含むといわれるミトコンドリアの形態を変異体において観察した。YFPによる可視化では、葉緑体と同程度かそれ以上巨大化したものやくびれを持った長いものが細胞内を動きまわる様子が観察された。また、電子顕微鏡による詳細な観察では、発達したクリステ様の構造をもった巨大なミトコンドリアを確認することができた。このことから、興味深いことに、CLはその存在量の多いクリステの膜構造の維持よりも、分裂・融合などにより支えられるミトコンドリア全体の形態の維持に重要な役割を果たすと推測される。

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色素体は、細胞分化や環境変化に応答して葉緑体・有色体・白色体・アミロプラストなどへ分化する。アミロプラストは非光合成組織に存在し、デンプン合成に関わる色素体であるが、その分化機構の詳細についてはほとんど知見がない。タバコ培養細胞BY-2は通常オーキシン存在下で増殖するが、培地中のオーキシンをサイトカイニンに置換することでプロプラスチドからアミロプラストへ分化することが知られている。この分化の際に、核コードのADP-glucose pyrophosphatase（Agp）など、デンプン合成に関わる遺伝子の発現が誘導されることが示されているが、色素体遺伝子発現の関与については不明であった。
本研究ではまず、アミロプラスト分化における色素体遺伝子発現の変化をノーザン解析により検討したが、発現が変動する遺伝子は見いだされなかった。一方、分化誘導と同時に色素体の翻訳阻害剤スペクチノマイシンまたは転写阻害剤リファンピシンを添加すると、デンプン合成量の低下とともにアミロプラストへの分化が阻害された。さらにこの際、Agpなど核コードのデンプン合成に関わる遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが明らかになった。以上の結果は、色素体での正常な転写や翻訳が、未知のシグナルを介してアミロプラスト分化に必須である可能性を示唆している。

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葉緑体には、原始シアノバクテリアの細胞内共生に由来する独自のゲノムとその発現系が残されているが、共生後の進化の過程で多くの遺伝子が失われたとともに、環境応答などの制御系は核による支配を強く受けるようになった。単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeは、その葉緑体ゲノムや転写制御系の解析から共生当初により近い状態を反映していると考えられ、核によるものとは別の、葉緑体自律的な制御系が今なお残されていると予想される。そこで本研究では、葉緑体ゲノムにコードされた原核型転写因子Ycf27の解析を通じて、C. merolaeの葉緑体における光に応答した特徴的な転写制御システムの解明を目的とした。
これまでに、暗条件下で培養した細胞から単離した葉緑体に対して光照射を行った結果、ycf27、psbDの転写活性が特異的に上昇することがrun-on転写系により示された。この制御には、二成分制御系のレスポンスレギュレーターであるYcf27が関与することが予想されたが、その詳細については不明であった。上記と同様の光条件下におけるYcf27の結合についてクロマチン免疫沈降法を用いて調べた結果、Ycf27のこれらプロモーターへの結合は暗条件下で強く、光照射により弱まることが分かった。この結果は、葉緑体が自律的な光応答系を介して特定の遺伝子群の転写を制御していることを強く示唆している。

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植物細胞には核ゲノムの他に葉緑体、ミトコンドリアのゲノムが存在するが、細胞内の物質代謝や光合成を制御するためには、オルガネラゲノムにコードされた遺伝子の発現を協調的かつ時期特異的に調節することが必要である。単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（以下、シゾン）は、核、葉緑体、ミトコンドリアの全ゲノム配列が100%解読された唯一のモデル生物であり、核とオルガネラの分裂周期が同調しておこることから、オルガネラゲノムの細胞周期依存的な遺伝子発現解析に適した実験材料である。そこで我々はゲノム情報からオルガネラ遺伝子発現解析用のマイクロアレイを設計し、遺伝子発現プロファイルによる遺伝子機能分類と転写調節領域の推定をおこなった。相関クラスタリング解析の結果、遺伝子発現の細胞周期、明暗条件に対する依存性が明らかになり、またオルガネラゲノム上の転写ユニット、及び機能未同定遺伝子の機能推定もおこなうことができた。これらの結果から、特定の細胞内機能に関わる遺伝子群ごとに特異的な発現調節機構が存在する可能性が示唆された。また、シゾンにおける葉緑体遺伝子の発現制御には、核コードの4つのシグマ因子の関与が予想されているが、これらの因子の発現プロファイルから、核による葉緑体の機能制御についても考察する。

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ヘム合成は生物にとって様々な生理機能に関与する代謝機能であり、特に光合成生物にとっては光合成電子伝達鎖や集光色素の構成経路としての重要な役割を持つ。ヘムはテトラピロール生合成経路を経て最終的にフェロキラターゼ (FeCh) によって合成される。高等植物ではテトラピロール生合成は主に葉緑体で行われることが示唆されてきたが、FeChの酵素活性はミトコンドリアからも検出されることから、その細胞内局在は議論されてきた。
単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeは核、葉緑体、ミトコンドリアを一つずつ有する極めて単純な細胞をもち、真核細胞成立時の特徴を多く残した生物であることが示唆されている。我々はC. merolae におけるFeChの細胞内局在を明らかにすることを目的として、当研究室において開発されたC. merolaeへの一過的な遺伝子導入技術を用いてFeChの局在解析を行った。HAタグと融合させたFeChをC. merolae細胞に導入し、抗HA抗体で免疫染色後、蛍光観察した結果、ミトコンドリアからの蛍光が確認された。またFeChのアミノ酸配列に基づいた系統解析では、シゾンのFeChは緑色植物の葉緑体局在型FeChと異なるグループに分類された。これらの結果から光合成生物におけるFeChの細胞内局在と、その進化的意義について考察する。

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リボゾームDNA (rDNA) の転写は、リボゾーム合成に欠かす事の出来ない重要な反応であり、細胞周期や様々な外環境の変化に応じて厳密に制御されている。しかし、植物におけるrDNA 転写制御に関する知見は皆無に等しい。本研究では、単細胞紅藻 C. merolae を用い、3つのオルガネラ（核、葉緑体、ミトコンドリア）における統御的な rRNA 合成機構を明らかにする事を目的に、その第1段階として、基礎的な解析と実験系の確立を行ったので報告する。
酵母から哺乳類まで保存され、PolIを含む転写開始前複合体の形成に重要な機能を発揮する転写因子RRN3 が、核内の18S rDNAプロモーター上に結合している事をクロマチン免疫沈降 (ChIP) 法により明らかにした。その結合領域は、PolI結合領域と良く一致しており、RRN3の機能が植物においても保存されている事が示唆された。一方、葉緑体rrn16 転写に関わるRNAポリメラーゼσ因子をChIP法にて解析した結果、SIG1がrrn16 プロモーター上に特異的に結合しており、そのレベルは、新規rrn16 合成量と正の相関を示した。実験系の確立に関しては、今までに、3つのオルガネラにおける新規 rRNA 合成量を同時に検出可能な run-on 転写解析系と、細胞抽出液を用いたin vitro 転写解析系の確立に成功しており、これらを用いた解析結果も併せて報告したい。

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植物細胞の増殖において、核のDNA複製に先んじてオルガネラのDNA複製が行われる現象が広く知られている。このことから、それぞれのDNA複製のタイミングを調節する機構の存在を示唆されるが、その実体は未だ明らかになっていない。本研究では、オルガネラと核間のDNA複製の調節機構を明らかにすることを目的とし、単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）を用いて解析を行った。シゾンは核、葉緑体、ミトコンドリアが1つずつの単純な細胞構造をもち、明暗の刺激だけで高度の同調培養が可能である。まず同調培養したシゾンの核、オルガネラ遺伝子の特異的配列を用いたqPCRを行い、それぞれのDNA複製期を簡便に調べる系を確立した。これにより、シゾンにおいてもDNA複製はオルガネラでまず起こり、その後核DNAの複製が行われる事を確認した。次に種々の阻害剤の添加実験を行い、核のDNA複製にはオルガネラのDNA複製が必要であり、オルガネラDNA複製がG1/S 境界に対応するcyclin-CDKとは独立に起こることが判った。また、オルガネラDNA複製がシグナルとなってCDKが活性化され、核DNA複製が開始される事も明らかになった。以上の結果より、葉緑体、もしくはミトコンドリアから核へDNA複製を伝えるシグナルの存在が強く示唆されたため、現在シグナル伝達物質の同定を行っている。これらを踏まえたシゾンにおける核・オルガネラDNA複製の同調機構のモデルを提示する。

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Cyanidioschyzon merolae 10Dは核、ミトコンドリア、葉緑体が一つずつの極めて単純な細胞構造をもつ単細胞性紅藻である。我々は、この生物をモデルとした真核細胞の基本的構築に関する研究を進めるため、基盤となる形質転換技術の開発を進めており、今までに、外来遺伝子の導入が可能であることを示してきた。
今回我々は、C. merolaeの一過的遺伝子発現系の開発と条件検討を行なったので報告する。本研究では、微小管の構成タンパク質であるβ-tubulin遺伝子を用いて、DNA導入・発現の解析を行なった。まずβ-tubulin遺伝子を、大腸菌のプラスミドベクター上にクローン化し、C末端にヘマグルチン(HA)タグ配列を付加した。このプラスミドを、様々な条件で細胞に導入し、最も効率よくDNAが導入・発現する条件を、付加したHAタグを用いたウエスタン解析により検討した。細胞壁を持たないC. merolaeは、プロトプラストと同様の性質を持つと考えられた。20% ポリエチレングリコール(PEG)4000の条件でDNAを導入したところ、DNA導入後24時間の細胞で、HA-タグ融合β-tubulinの発現を確認した。さらにPEGの平均分子量と濃度について条件検討をした結果、30% PEG4000の条件で最も良いDNA導入効率が得られた。DNA導入後に蛍光抗体染色、顕微鏡観察を行ない、蛍光を発している細胞の数を計数した結果、この条件での形質転換効率は、2-10% （DAPIで染色された細胞の数に基づく）であった。

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オルガネラゲノムDNAにコードされる遺伝子は80～200種類と非常に少ない。しかしながらシロイヌナズナの葉緑体プロテオーム解析では約1200種類以上のタンパク質が検出されている。これらのタンパク質の多くはオルガネラの起源となった細胞内共生細菌から、核に転移したものであり、翻訳後に移行シグナル配列によってオルガネラへ輸送される。このような核コード遺伝子がオルガネラで機能するために、オルガネラへの移行シグナル配列を獲得する必要がある。しかし、その獲得機構の全体像はいまだ明らかではない。
前年度本大会で我々は、生物ゲノムにはオルガネラ移行シグナルとなりうる配列が多数潜在的にコードされていることを報告した。また最近、イネのあるタンパク質遺伝子の一部の配列が本来とは異なる読み枠で、葉緑体に移行する別のタンパク質遺伝子の移行シグナルとして利用されていることが報告された(Ueda et. al., 2006)。このことは、潜在的な移行シグナルが実際に利用されうること示唆する。潜在的な移行シグナルが利用されるためには、移行シグナルの下流に遺伝子が移り、融合タンパク質として翻訳される必要がある。このような過程を想定した上で、原核生物と真核生物のタンパク質配列の比較を行った。その結果に基づき、「原核生物と真核生物では翻訳開始機構が異なることが、潜在的な移行シグナルの利用につながった」という仮説を提唱する。

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植物オルガネラDNAは紫外線、呼吸や光合成反応の電子伝達系に由来する活性酸素による損傷を頻繁に受けていると考えられるが、植物オルガネラDNA損傷を修復する機構に関する知見は乏しい。DNA切断はバクテリアではRecAタンパク質を主体とする組換え修復系によって修復される。オルガネラの起源がバクテリアであることから植物オルガネラでも同様のバクテリア型組換え修復機構が存在すると予想し、当研究室では遺伝子ターゲッティングが容易なヒメツリガネゴケを用いて、その機構の解明を目指している。我々はヒメツリガネゴケにおいて大腸菌recGの相同遺伝子（PprecG:Physcomitrella patens recGと命名）を同定し、その解析を行った。RecGは大腸菌において組換え修復の後期過程で、ホリデイ構造の分岐点移動を担うヘリケースである。GFP融合法による細胞内局在解析から、PpRecGはミトコンドリアと葉緑体の両方に局在することが明らかになり、またPprecGの発現はDNA損傷剤処理によって誘導された。PprecGの遺伝子破壊株を作成し野生株との生育を比較したところ、生育の遅延と形態の異常が観察された。これらの結果から、細胞内におけるPpRecGの機能について考察する。

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タバコ培養細胞BY-2より単離されたTMBP200はXMAP215やMOR1/GEM1をメンバーとする真核生物に高度に保存されたMAPsファミリーのメンバーである。我々はTMBP200の機能ドメインを明らかにすることを目指して、様々なTMBP200の部分断片とGFPの融合タンパク質をBY-2細胞内で発現させることを試みている。これまでに、TMBP200の全長GFP::TMBPFL (1-2029 aa) は、細胞周期を通じて微小管上に分布し、N末端領域GFP::TMBPN1 (1-269 aa)とC末端領域GFP::TMBPC1 (1402-2029 aa)は、表層微小管には局在せず紡錘体とフラグモプラストに弱く付随することを報告した。今回は新たに、N末端欠損シリーズとしてGFP::TMBPN2-C1 (270-2029 aa)、GFP::TMBPN3-C1 (586-2029 aa)、GFP::TMBPN4-C1 (838-2029 aa)、GFP::TMBPN5-C1 (1101-2029 aa)とC末端欠損シリーズとして、GFP::TMBPΔPMBD (Putative MT-Binding Domain)(1-1787 aa)、GFP::TMBPN1-N5 (1-1401 aa)を発現する株をそれぞれ作出した。これらの融合タンパク質の細胞内分布を調べた結果から、TMBP200の微小管結合ドメインについて考察する。

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植物にとって、細胞内での葉緑体の位置を制御することは、光合成のためのCO₂の吸収効率や受光量を調節する際の重要なプロセスである。葉緑体の位置の決定にアクチン細胞骨格が関与することを示唆する結果がいくつかの植物で報告されているが、具体的な関与様式は不明である。我々は、葉緑体はアクチン繊維によって表層細胞質にアンカーされるという仮説をたて、ホウレンソウ葉肉細胞プロトプラストから、細胞膜の細胞質側を露出させた細胞膜ゴーストを調製し、解析を行ってきた。現在までに、アクチン脱重合剤であるラトランキュリンB処理や1 μM以上のCa²⁺処理によって細胞膜ゴースト上のアクチン繊維が断片化し、葉緑体の脱離が誘導されることが分かった。また、Ca²⁺処理の効果はカルモデュリン拮抗剤W7によって打ち消された。そこで、Ca²⁺-カルモデュリンに依存したアクチン脱重合活性を持つビリンの関与を想定し、解析を進めた。その結果、ホウレンソウ葉に120 kDaと135 kDaの2種類のビリン様タンパク質が存在し、細胞膜ゴースト上の葉緑体の周囲に局在していることが分かった。また、これらのタンパク質の葉肉細胞での局在が異なることを示唆する結果を得た。

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染色体は、極性を持つ微小管とそれに結合して微小管の動態を制御する各種微小管付随タンパク質から構成される有糸分裂紡錘体によって次世代の娘細胞へと分配される。動物細胞での研究から、分裂後期の染色体の移動は紡錘体微小管の動態を反映して二つの過程からなることが知られている。一つは動原体微小管が短縮することによって染色体が極方向へ移動する後期Aであり、もう一つは重複域微小管同士の押し離しと星状体微小管の引き離しによって両極が離れることにより染色体が移動する後期Bである。後期Aと後期Bは独立した機構であり、酵母や動物細胞における染色体分配への後期Bの寄与は染色体の移動距離に換算して40%以上である。一方で高等植物細胞では後期Bの過程の存在は定かでなかった。そこで我々は、高等植物細胞であるタバコ培養細胞BY-2を用いて微小管と染色体を可視化した形質転換細胞株BY-GTHRを作製し、後期の紡錘体伸長を測定した。その結果、紡錘体伸長による染色体移動への寄与が明確に示され、それは40%程度であることが明らかとなった。現在、紡錘体微小管の動態の生物種による多様性の成因を探るため、ヒメツリガネゴケを用いて後期紡錘体微小管の動態を定量し、BY-2細胞との比較解析を試みている。

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高等植物細胞は、主に細胞膜直下に存在する表層微小管と、それにより配向が制御されている細胞壁内のセルロース微繊維により、その形が形成され維持されていると考えられている。しかし、表層微小管によるセルロース微繊維沈着方向の制御機構については、いまだ不明な点が多い。これまでに我々は、タバコ培養細胞BY-2を用いたケミカルジェネティクス的アプローチにより、セルロース微繊維が表層微小管に平行に沈着することを阻害する新規阻害剤cobtorinを得た。本研究では、cobtorinがシロイヌナズナ植物体に及ぼす影響を調べた。その結果、胚軸及び根において、cobtorinは伸長を阻害しかつ細胞が膨れる形質を引き起こした。しかし、胚軸はcobtorinに対し高い感受性を示したが、根はより高い濃度でのみ軽微な形質を示し、感受性が異なることが分かった。また、cobtorinは地上部ではロゼット葉の形成や花序の伸長を阻害し、地下部では根毛や側根の形成を促進した。これらのことから、地上部と地下部では、cobtorinの標的因子の発現、構造ないし機能に差があることが推定された。これらの結果から、cobtorinの標的因子の役割について報告し考察する。

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キネシンモータータンパク質は様々な生物において細胞の先端成長及び細胞の形の決定に関与していることが知られている。シロイヌナズナゲノム中には 61 遺伝子のキネシン関連遺伝子が存在することが明らかになっているが、その多くは機能が明らかになっていない。我々はアルマジロリピートドメインを持つ植物特異的キネシン関連タンパク質 ARK1 がシロイヌナズナ根毛の先端成長に関与することを明らかにした。ark1 突然変異体根毛は波状、時に枝分かれの表現型を示し、内側の微小管はより重合して量及び長さが促進されていた。すなわちARK1は根毛内部の微小管量を限定する働きを持ち、これが根毛の先端成長を制御することが示唆された。ARK1 はARK2 及び ARK3 の二つのパラログ含む遺伝子ファミリーをシロイヌナズナゲノム中で形成しており、ARK2 が根の表皮細胞の形態形成に関与することを明らかにした。さらにARK タンパク質と結合する因子として NEK6 タンパク質リン酸化酵素を同定した。nek6 突然変異もまた、シロイヌナズナ表皮細胞の形態形成に多面的な影響を与えており、NEK6 が ARK キネシンに関連した微小管機能を介して細胞の形態形成に関与することが示唆された。

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微小管には付随するタンパク質が多数存在するが、その中でも特に微小管のプラス端に集積するタンパク質は＋TIPと呼ばれ、微小管の制御に大きな役割を果たしていることが知られている。＋TIPの1つであるEB1は酵母から動植物にいたる幅広い生物に存在し、他のタンパク質と機能的複合体を形成することで、微小管の配向や安定性に関与することが多くの実験より示されている。シロイヌナズナには3つのEB1ホモログ(AtEB1a, AtEB1b, AtEB1c)が存在するものの、その機能はいまだ解析されていない。
そこで本実験では植物におけるEB1の役割を明らかにすることとした。GUSレポーター遺伝子を用いた実験によりAtEB1aおよびAtEB1bは花粉において、またAtEB1cは分裂組織で強く発現することが確認された。次に微小管重合阻害剤であるオリザリンに対する感受性を調べたところ、AtEB1cの変異体だけが高感受性を示すことが明らかとなった。さらにAtEB1bとAtEB1cにGFPを融合したタンパク質をシロイヌナズナ植物体内で発現させ、局在性を調べた。その結果、AtEB1bは他の生物のもつEB1と同様に微小管のプラス端に集積した局在を示したが、AtEB1cは核局在を示した。以上の結果より、AtEB1cはAtEB1aおよびAtEB1bとは異なる機能を持つことが示唆された。

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Cortical microtubule arrays in plants are predicted to be regulated by reversible protein phosphorylation and the PHS1 protein phosphatase, which contains an active MAPK phosphatase catalytic domain, was implicated in this process. The phs1-1 mutation partially compromised catalytic activity of PHS1 in vitro, and here we show that transgenic plants expressing the inactivated version behind its own promoter display a severe isotropic cell expansion phenotype and substantially decreased levels of cortical microtubules in the root transition zone. We further evaluated the strong microtubule depolymerization effect of the inactive PHS1 in a set of transient assays. Null alleles of PHS1, however, do not show any microtubule related phenotype suggesting a functional overlap with other phosphatases. We explain the dominant effects of decreased PHS1 activity either as a formation of non-productive signaling complexes or as an effective competition for substrate with other functionally related phosphatases.

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植物細胞には動物細胞の中心体のような決まった微小管形成中心は存在しないが、微小管を形成し特徴的な微小管構造体を構築する。植物細胞にも動物細胞の微小管重合核に存在している分子は確認されているが、その構造や機能の知見は乏しい。我々は植物微小管重合核の機能や役割を明らかにするため、構成成分と考えられるシロイヌナズナ AtGCP2の機能解析を行った。局在解析からAtGCP2は重合核の成分であるγチューブリンとともに微小管に沿って局在することが見出された。一方、ノックアウト変異株の詳細な解析から、 AtGCP2は雌雄配偶子の形成や発達に重要であり、生存に必須の因子であることが示唆された。AtGCP2のアミノ酸置換変異株spiral3 (spr3)は、根の伸長領域における表層微小管束がやや左肩上がりに配向し、表皮細胞が右巻きにねじれ、根が右方向に向かって伸長する形質を示した。spr3変異型AtGCP2は重合核の他の成分と考えられるAtGCP3との相互作用が弱くなっていた。また、植物の表層微小管は、既存の微小管からほぼ一定の角度で分岐するように微小管を形成することが知られているが、spr3変異株では、この表層微小管形成角度に野生型との差が見られた。さらに、表層微小管マイナス端の動態の変化も観察された。これらの結果から、AtGCP2を含む植物微小管重合核は微小管形成や動態の制御を介して形態形成に重要な微小管束の配向に寄与していることが示唆された。

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酢酸菌（Gluconacetobacter xylinum）は菌体外へセルロースを合成するグラム陰性細菌である。本研究では、酢酸菌の細胞壁がセルロース合成にどのように関与しているかをネガティブ染色法を用いて調べた。野生株BPR2001株を1週間30℃においてフルクトースを含む培地で静置培養し、培地表面にセルロースペリクルを形成させた。このペリクルを含む培地を激しく撹拌することにより菌体を脱離させ、遠心分離により菌体を回収した。菌体を培地で適当な濃度に懸濁した後、電子顕微鏡用の銅製のメッシュ上で30℃、1時間培養し、1.5％酢酸ウラニルでネガティブ染色を行い、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果、セルロースが菌体から分泌され、さらに細胞壁側から収束してリボンが形成されていく各段階の菌体が観察された。次にBPR2001株をメッシュ上で培養する際、培地中にリゾチームを2mg/ml加え、細胞壁を破壊し、先ほどと同様に染色し電子顕微鏡で観察した。その結果、ある程度合成されたセルロースはリボンとして収束していたが、その幅は野生株に比べ太く、またほつれがみられるものも観察された。このことから、細胞膜上で合成されたセルロースが細胞壁を通過して分泌される際に、リボンの形成が進んでいくと考えられた。

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二次肥大成長を行う木本植物では、あて材と呼ばれる特殊な二次木部を形成することによって、屈曲による姿勢制御を行っている。広葉樹では、屈曲内側に引張あて材を形成し、その強い引張応力によって幹や枝を曲げる。典型的な引張あて材では、セルロースに富んだ細胞壁層であるG層を形成する。通常の木部と異なる強い引張応力は、G層で発生すると考えられている。我々はこれまでに、ポプラG層にキシログルカンが存在し、与えたキシログルカンを取り込む酵素活性があることを明らかにしてきた。本研究では、G層の形成機構や応力の発生機構に関与するタンパク質をとらえることを目的として、G層から抽出されるタンパク質の同定を試みた。ポプラからあて材組織を採取し、超音波処理によりG層を単離した。単離したG層から尿素/界面活性剤溶液を用いてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をトリプシンで分解し、得られたペプチド混合物をLC-MS/MSによる質量分析により解析した。データベース検索によりタンパク質の同定を行ったところ、セルロースシンターゼ（CesA）は2種類検出された。また、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（XET）は3種類のアイソザイムが検出された。

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ギンドロ ( Populus alba L.) 由来のエンド-1,4-β-グルカナーゼfamily9（セルラーゼ）遺伝子 PopCel1, PopCel2 はポプラの茎・葉・根などの成育過程において相補的な発現パターンを示すことを以前に報告した。これに対して、 PopCel1, PopCel2 プロモーターGUS形質転換ポプラおよびシロイヌナズナの解析から、孔辺細胞では共に発現する。シロイヌナズナ形質転換体を暗条件下で発芽させ、明条件に移すと孔辺細胞が誘導される。 PopCel1, PopCel2 プロモーターGUS活性は分裂前の孔辺母細胞では観察されず、1対の孔辺細胞に分裂した段階でのみ観察された。したがって、ポプラの PopCel1, PopCel2 は孔辺細胞において細胞の肥大成長に関わっていることが示唆された。

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植物の必須元素ホウ素は細胞壁に局在し、ペクチンのラムノガラクツロナンII（RG-II）領域に特異的に結合している。我々は、このホウ素RG-II複合体の機能を解析する手段としてRG-IIの構造変異株の作出を進めている。特にRG-IIの特異的構成糖である2-ケト-3-デオキシオクトン酸（KDO）に着目し、変異導入の基盤となる知見を得るために植物のKDO生合成経路について検討中である。
CTP:KDOシチジル酸転移酵素（CKS; EC 2.7.7.38）は、KDOをRG-II合成の直接の基質である糖ヌクレオチドCMP-KDOに変換する。シロイヌナズナはCKS遺伝子1コピーを有する（At1g53000; AtCKS）。この遺伝子のT-DNA挿入ラインではホモ接合体は得られなかった。この原因は変異型花粉が稔性を持たないためであった。ヘテロ株の成熟花粉の形態に異常は認められないので、変異型花粉が成熟以前に致死となるか、または花粉管の伸長が阻害されている可能性が考えられる。現在quartet変異株とのかけ合わせによる検討を進めている。
CKSの細胞内局在部位について検討するため、AtCKSとGFPの融合蛋白質をタバコBY-2細胞で発現させた。GFP蛍光の局在部位はMitotrackerによるシグナルと一致し、CKSがミトコンドリアに局在することが示唆された。

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P23kは発芽種子で高発現するイネ科作物特異的なタンパク質である。オオムギ種子でのP23kの発現解析により、我々はP23kが糖代謝に重要な役割を担っていると推測してきた。しかしながら、その仮説は種子のみの発現解析から得た知見をもとにしており、P23kの糖代謝における具体的な役割は不明である。そこで本研究ではP23kの機能解明に向けて、ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）によりオオムギの葉でP23kの発現抑制を行った。その結果、主葉脈の異常に起因する葉の非対称性と葉縁からの切れ目が観察された。P23k遺伝子の代わりにGFP遺伝子やPDS遺伝子を導入したコントロール個体では同様の形態変化が観察されなかったことから、得られた表現型はP23kの発現抑制に伴う結果であると判断した。また、統計学的な解析から、観察された形態異常は葉の物理的強度の低下に起因することが明らかとなった。これら植物体における物理的強度の低下は、二次壁形成に寄与する遺伝子の発現が抑制された典型的な表現形であることが知られており、P23kが二次壁形成に関係している可能性が示唆された。これを裏付けるように、二次壁形成が活発な維管束と厚壁組織でP23k局在が認められた。本発表では得られた結果を総合し、P23kの機能について考察する。

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真核生物において、核はDNA複製や遺伝子発現に関わっている。動物細胞と植物細胞からの核の単離法は確立されており、核の機能に関する研究が進んでいる。しかし、菌類においては現在までに核が単離・精製された例はない。そこで本研究では、直径約3.0 μmの大きな核を持ち、培養が容易である接合菌綱Basidiobolus属菌を用いて、核の単離・精製法を確立した。
高純度の核画分を得るための細胞分画の条件として、菌体の磨砕法、緩衝液の組成、遠心力などについて検討した。その結果、potato-dextrose液体培地で6日間培養したBasidiobolusをプロトプラスト化してからTritonX-100を含む緩衝液中で磨砕し、オープニングサイズ20 μmのふるいで濾過することで、大まかな細胞の破片などが少なくなることが明らかになった。さらに、濾液を50 % glycerolを含む緩衝液に載せ、1500×gで10分間遠心することで、 直径0.3 μm以上の粒子のうち 72 ± 2 %が核である高純度の核画分を、沈殿として得ることができた。
単離核を走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果、Basidiobolus属菌の核は丸く、大きさが1.5-3.0 μm と均一ではなく、表面に凹凸のある形態が確認できた。

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これまでに、葉の基部領域の観察から維管束分化・形成過程を時空間的な連続性を維持した状態で追跡できるイネを用いて、維管束形成機構の解析を進めてきた。昨年の本大会で、横走維管束の形成間隔が狭まり、その一部で過剰に分化して塊状になる突然変異体の原因遺伝子候補を単離しcommissural vein excessive1 (coe1)と名づけたことを報告した。今回は、昨年度同定したCOE1の機能解析を進めた結果を発表する。昨年度単離した点変異のcoe1-1に加え、新たなアリルcoe1-2を得た。coe1-2は挿入変異のノックアウト変異で、より強い表現型を示したが、基本的には同様の表現型を示した。この2つが基本的に同一の表現型を示したことから、膜受容体型キナーゼをコードしていると考えられるCOE1が横走維管束の形成間隔の決定に関与していることが明らかとなった。また、ホモロジー検索から、シロイヌナズナ中にも複数のイネのホモログ遺伝子が存在することが明らかとなった。そこで、これらのプロモーター領域にGUSを繋いだ遺伝子をもつトランスジェニック植物を作成した。その結果、これらのプロモーターは維管束特異的に発現することが明らかとなった。これらの結果と、さらに現在行っている機能解析の結果を加え、この受容体が維管束の分化起点決定にどう関わっているのか議論したい。

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植物細胞の分化過程におけるクロマチンの動態および遺伝子の発現変動に関する新たな知見を得るために、ヒャクニチソウ単離葉肉細胞培養系を用いて、管状要素への分化転換に対するDNA メチル化酵素阻害剤5-azacytidine（azaC）とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤TSA の影響を調べた。その結果、いずれの阻害剤を添加した場合でも、阻害剤の濃度および添加時期に依存的に管状要素への分化が阻害された。これにより、管状要素分化転換過程においてもエピジェネティックな発現制御機構が関与している可能性が示唆された。そこで、ヒャクニチソウジーンチップを用いて、阻害剤添加が遺伝子発現に与える影響を網羅的に調べた。その結果、azaC 添加から24 時間後に約400 遺伝子が、またTSA 添加から6 時間後に約500 遺伝子が、阻害剤未添加のコントロールと比較して5 倍以上の高レベルの発現を示した。本発表では、それぞれの阻害剤添加後の遺伝子発現パターンについて詳細に報告する。

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カルスは自然界で植物が傷を受けた時の癒傷組織としてみられる。in vitroにおいてもカルスは組織切片の切断面から生じることが多い。このためカルスは傷害応答による遺伝子発現で顕在化する植物細胞の一つの形態であると捉えられる。これまでカルス化にはオーキシンおよびサイトカイニンが深く関与していることが知られているものの、カルス化の分子機構はほとんど解明されていない。我々はこれまでに、植物細胞の脱分化の誘導、およびその維持に必須な遺伝子群を明らかにするため、シロイヌナズナ植物体と培養細胞での遺伝子発現の比較解析から、植物特異的な転写因子群であるAP2/ERFファミリーに属する遺伝子の発現が培養細胞で上昇していることを報告している。プロモーターリポーター解析等から、この遺伝子は傷害によって発現が促進することが観察された。この遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現した結果、T1植物体で茎頂、胚軸および根からカルスが生じた。このカルスは、植物ホルモンを含まない培地でも、カルス状態を保ちながら増殖し継代培養が可能であった。カルス化しない弱い表現型を示した過剰発現体のT2植物体では、野生株がカルス化しない低濃度のオーキシン処理でもカルス化した。胚軸を用いた実験から、過剰発現体ではサイトカイニンへの感受性が高まっていることが示された。この転写因子の機能とカルス化との関連について報告する。

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葉の最終形態は細胞の数と大きさによって決まると考えられる。したがって個々の細胞の分裂活性とサイズ変化を記述できれば、多様な葉の形態が説明できる。しかし離散的に起こる細胞分裂、細胞質または液胞体積の増大による伸長成長は、葉の発生過程において異所的かつ同時に起こるため、各成分の正確な記述が困難である。このため、特定の細胞分裂と伸長のパターンがどのような形状の葉を産むのかという問題は、現在でも未解決である。本研究はこの問題に対して逆のアプローチを取り、生物学的特性を盛り込んだモデルを構築して、最終的には葉の形状を説明できるような各パラメータを推定することを目的としている。
実際の柵状組織の並皮切片像から細胞の重心を求め、ボロノイ分割を行ったところ、分割線と実際の細胞壁の配置は非常に類似していた。この結果をふまえて、モデルは細胞の基本形状を円とし、その形状が周囲の細胞配置によって変化する設計にした。前大会ではこの考えを基に、細胞に伸長・分裂機能を組み込んだプログラムで細胞の位置と形状が変化していく様子を紹介した。今回紹介するのは細胞の伸長・分裂の制御を一次元から二次元へ拡張したモデルである。この拡張によって細胞の成長量を面積として与えることが可能になり、細胞の周長に応じた成長などが可能となった。発表では伸長と分裂のパラメータを変えたときに、全体の形状がどのように変化するのかを紹介する。

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スギ（Cryptomeria japonica D. Don）は、わが国の主要な造林樹種であり、日本人の生活に深くかかわってきた。遺伝子組換え技術による特定形質の付与は、より社会から求められる品種の作出を実現すると期待される。しかし、組換え体を野外に出すにあたり、導入遺伝子の同種野生植物への拡散が懸念されている。その媒体となるのが花粉であるが、花粉を作らなくすればその可能性は軽減される。さらにスギの雄性不稔化はスギ花粉症の緩和にもつながる。
シダレカンバ等いくつかの植物種において、花器官特異的な発現を司るプロモーターにRNase等の遺伝子をつないだ構築物を導入することによって雄性不稔個体の作出に成功したことが報告されている(Lannenpaa et al.,2005)。我々はスギにおいて同様の手法を試みるために、スギ雄花特異的に発現する遺伝子を単離した。雄花形成過程の異なる3時期（花粉分化初期、花粉四分子期、成熟花粉期）を選択しSuppression Subtractive Hybridization法をおこなった。その結果、成熟花粉期のライブラリーにはヒマワリにおいて葯特異的に発現する細胞壁タンパク質、SF18と高い相同性を示すクローン等が含まれていた。これら遺伝子の転写調節領域をTAIL-PCR法を用いて単離した。現在、雄花特異的な発現を司るシスエレメントの解析を進めている。
本研究の一部は農林水産省「遺伝子組換え生物の産業利用における安全性確保総合研究」の一環としておこなった。

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ラン藻のABC型HCO₃^-輸送体BCT1は無機炭素濃縮機構(CCM)の構成成分の1つである。BCT1をコードするcmpオペロンは、他のCCM関連遺伝子群と同様にCO₂欠乏に応答して転写が誘導される。我々は、以前にcmpオペロンの転写制御にLysR型転写制御因子CmpRが関与すること、cmpオペロンの上流領域に低CO₂に応答した転写誘導に必要な領域が存在することを明らかにした。本研究では、in vitroでCmpRがcmpオペロン上流領域に結合することを確認し、リブロース1,5-二リン酸(RuBP)と2-ホスホグリコール酸(2-PG)が結合を促進することを明らかにした。RuBPは、光合成細菌RhodobacterのCbbRの場合とは異なり1mM以上の比較的高い濃度で結合を促進し、2-PGは10μM以上の低濃度で結合を著しく促進した。一方、他の光合成細菌や化学合成細菌で結合促進効果が報告されている3-ホスホグリセリン酸(3-PGA)やNADPHはラン藻においては結合促進効果を持たなかった。3-PGA、2-PGはいずれもルビスコの触媒反応の生成物であるが、2-PGはRuBPとO₂の反応(オキシゲナーゼ反応)によってのみ生成する物質である。ラン藻のCO₂欠乏に応答したCCMの誘導にはO₂が必要であることから、CO₂欠乏条件下ではルビスコのオキシゲナーゼ活性によって生じる2-PGがCO₂欠乏のシグナルとして作用していることが示唆される。

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生物は、生育環境において栄養状態が変化した時、代謝系の切り換えを行うことで環境に適応する機構を備えている。Synechocystis sp. PCC 6803においては、窒素欠乏時に糖異化の遺伝子群の発現が誘導されることが報告されており、その制御機構には転写因子NtcA、RNAポリメラーゼのシグマ因子SigEを初めとする多数の因子が関与していることが示唆されている(Osanai et al., 2006)。今回我々は、窒素欠乏シグナルに応答した糖異化遺伝子群の転写活性化に関わる新たな因子rre37を同定し、ntcA、sigEとの関連についても解析を行ったので報告する。
Rre37は、窒素欠乏時にNtcA依存的に発現量が上昇する二成分制御系のレスポンスレギュレーターである。マイクロアレイ解析により、Rre37依存的に発現制御を受ける遺伝子群を調べた結果、Rre37は、gap1 (slr0884)、pfkA (sll1196)、glgX (slr1857)、glgP (slr1367)といった糖異化に関わる遺伝子群の転写を正に制御していることが明らかとなった。また、これらの遺伝子群はSigEによっても発現制御を受けるため、rre37、sigEの変異株を用いて遺伝学的にこれらの関係を調べたところ、Rre37とSigEはそれぞれ独立に糖異化遺伝子群の発現を制御していることが示唆された。

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これまでに我々は、シロイヌナズナより強光・高温ストレス応答性の熱ショック転写因子（HsfA2）を同定し、HsfA2がHSP、APX2、ガラクチノール合成酵素（GolS）などの標的遺伝子の発現を誘導することで、耐性能の獲得に寄与していることを明らかにした（Plant J., 2006）。本研究では、HsfA2を介した応答機構を解明するために、HsfA2による標的遺伝子の発現制御機構を詳細に解析した。これまでにHsfA2ノックアウト株において強光応答性の発現が著しく抑制されていたHSP18.1-CI、GolS1、BAGはHsfA2により直接制御されていることが示唆された。そこで、これらの遺伝子のプロモーター領域に存在するHsfA2の認識領域を決定するため、培養細胞を用いた一過的発現系によりルシフェラーゼアッセイを行なった。その結果、HsfA2による転写活性化はHSP、GolS1、BAGプロモーターのそれぞれ-137、-290、-92 bpからTATA boxまでの領域の欠損で著しく抑制された。この領域には複数の熱ショックエレメント（HSE）のコア配列が存在していた。さらなる解析の結果、HsfA2はTATA box近傍に2つ以上のHSEが存在することで標的遺伝子の発現を高いレベルで誘導できることが示唆された。現在、強光ストレス条件下におけるHsfA2の遺伝子発現機構をゲルシフト法を用いて解析している。

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CRES-T法は、機能重複した転写因子群に対しても優位に抑制効果を発揮し、効率的な遺伝子サイレンシングを可能にする転写抑制技法である。私たちは、この技法を用いた多数種の花きの形質改変を通じて、転写抑制効果の期待値や植物種間差など新たな植物種に本法を適用する際に必要な情報のほか、研究材料や育種素材を提供することを目的として研究を進めている。
キク及びトレニアにTCP3, AG, EIN3, AP1等多数のキメラリプレッサーを導入して行った解析から、本法を用いて花色や花形の改変、エチレン応答や開花時期の調節など実用性の高い形質付与が高次倍数体においても可能であることを示す一方で、半数以上の例ではシロイヌナズナでの知見から期待される表現型が現れない、あるいはこれらからは予想されなかった新たな形質を示すことを確認し、ネイティブプロモーターの使用等、材料や目的形質に合わせた最適化も必要であることを明らかにした。
本報告では、これまでに作出した形質転換植物の解析の具体例に加え、目的形質を効率的に選抜するバルククリーニング法の有効性、得られた形質と遺伝子機能情報の蓄積・共有を目的に構築したデータベースの利用などについても触れながら、転写因子の機能解析や分子育種における本法の有用性と適切な使用法を検討する。
なお、本研究は、「先端技術を活用した農林水産研究高度化事業」によるものである。

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メロンのエチレン合成系においてACC合成酵素2（CMeACS2）は、様々な刺激に対して応答する遺伝子と考えられている。CMeACS2の上流プロモーター領域にあるGCCGAC配列(DRE/CRT cis-acting element)に結合する転写因子（CMeERF1,CMeERF2,CMeDREB1）を酵母ワンハイブリッド法により単離し、これら転写因子の機能解析を行なってきた。本研究では、CMeERF1,CMeERF2,CMeDREB1を過剰発現した形質転換シロイヌナズナを用いin vivoにおけるこれら転写因子の機能解析を行った。また、CMeERF2と相同性が高いClassIV転写因子に見られるN末端共通配列の役割を調べた。
ERFは病害、DREBは低温・乾燥応答性遺伝子の発現に関与していることが知られているためストレス応答性遺伝子の発現を調べた。CMeERF2過剰発現株においてはCor15aが、 CMeDREB1過剰発現株ではRd29a,KIN1の発現が上昇した。また、いくつかのACS遺伝子及びACO遺伝子の発現が誘導された。これら転写因子は、ストレス応答に関与すると推測され、エチレン合成にも関与している可能性が示唆された。CMeERF2のN末端モチーフ解析では、モチーフの有無で転写活性化能に差がみられ、N末端配列が重要な働きを持っていることが示唆された。

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植物イソプレノイドは自身の生理機能調節のみならず、それを摂取する動物にとっても非常に重要である。イソプレノイドはイソペンテニル二リン酸(IPP)が連続的に縮重合した構造を基本骨格とする。植物細胞内には、細胞質中のメバロン酸経路と色素体中の非メバロン酸経路（MEP経路）という2つのIPP生合成経路が存在する。これらの生合成経路の酵素の発現は厳密に制御されているが、その詳細な機構は不明な点が多い。本研究では、シロイヌナズナにおけるMEP経路について、主に転写レベルにおける発現制御因子の解明を目的とする。
候補となる転写因子を選別するため、AtGeneExpressのアレイデータを基に、MEP経路の酵素遺伝子と発現パターンに相関性がある転写制御因子を選別した。MEP経路の各酵素遺伝子は光周期で発現変動を示すことから、そのパターンと同様な発現変動を示す転写因子を解析候補として絞り込み、それらの遺伝子挿入変異体におけるMEP経路遺伝子の発現を解析した。その結果、zinc finger型転写因子変異体において、MEP経路の律速酵素遺伝子の有意な発現上昇がみられ、それに対応したカロテノイド及びクロロフィルの蓄積量の上昇がみられた。また、別のzinc finger型転写因子変異体では、MEP経路の律速酵素遺伝子の発現抑制と代謝物の蓄積量の減少がみられた。これらによるMEP経路の制御機構が予想される。

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モデル植物であるシロイヌナズナにおいて転写制御因子は2000個前後存在することが予測されている。これらの大部分は転写活性化因子であると考えられてきたが、EARモチーフと名付けたモチーフが転写抑制活性を持つことを見出したことから、多くの転写因子が転写抑制因子として機能する可能性が示唆された。本研究では、まずシロイヌナズナにおいてEARモチーフを含む植物特異的なリプレッションドメインが存在する遺伝子を探索した。その結果シロイヌナズナでは約30000の遺伝子中、約1200遺伝子でこれらのモチーフをコードする領域が存在することがわかった。転写因子に限ると約2000個中、約250個の転写因子がこれらのモチーフを持っていた。このことから、リプレッションモチーフは統計的に有意に高頻度に転写因子に偏って存在しているといえる。また、リプレッションモチーフを持つ250の転写因子について、全ゲノムが解読された他の植物4種（イネ、ポプラ、ブドウ、ヒメツリガネゴケ）のオルソログにおいて、そのモチーフが保存されているかを調べた。その結果、約160の遺伝子においてシロイヌナズナ以外の2種以上で保存されていることがわかった。これらは実際に転写抑制因子である可能性が高いと思われ、現在順次確認実験を進めている。

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シロイヌナズナのHSI2 は、B3 DNA 結合ドメインに加えてC末端部に糖誘導性レポーター遺伝子の転写抑制に必要なEAR転写抑制モチーフを持つ。HSI2とその相同因子HSL1の単独の遺伝子破壊株は野生株と変わらない表現形を示す。しかし、交配によって得られる二重破壊株（KK変異株）種子は、発芽後4日目以降に培地の糖依存的にLEC遺伝子群や種子成熟期特異的遺伝子群を強く発現し、胚軸が肥大して大量の種子貯蔵タンパク質や油脂を貯蔵して約1週間後に生育を停止する。HSI2とHSL1は発芽後の胚発生プログラムの抑制やメリステム機能に重要な共通の役割を担うと推定され、その標的遺伝子と発現抑制機構に興味が持たれる。HSI2とHSL1遺伝子のプロモーターとGUSとの融合遺伝子の発現から、両者は胚を含む様々な組織で大部分がオーバーラップするように発現していることなどが明らかになった。KK変異株は発芽後1週間で成長が停止するため、HSI2とHSL1の詳細な機能解析は困難である。HSI2のDEX誘導型RNAiをhsl1破壊株に、またHSL1のDEX誘導型RNAiをhsi2破壊株に導入したところ、いずれの場合にも培地中のDEXに依存して胚軸が肥大して成長が停止、あるいは遅延する形質転換ラインが得られた。現在これらのDEX誘導型KK変異株を用いて解析を進めている。

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シロイヌナズナ種子の成熟過程で発現するAP2型転写因子ASML1/WRIは、プラスチド内での脂肪酸合成に関わる種々の遺伝子のプロモーターに結合して発現を活性化し、種子でのショ糖の油脂への転換促進に働くと推定される。脂肪酸合成に関わるPL-PK遺伝子のプロモーター中にある2カ所のASML1/WRI1結合配列(AW-BOX)に変異を導入すると、PL-PK:GUS融合遺伝子の登熟種子だけでなく植物体における発現もみられなくなり、AW-BOXはPL-PK遺伝子の転写活性化に不可欠のシス制御配列と考えられる。今回、ASML1/WRI1と類似した他のAP2 DNA結合ドメインを2つ持つ転写因子の解析を行った。ASML1/WRI1と最も相同性の高いWAT1は、ASML1/WRI1と同様にAW-BOX結合活性を有し、プロトプラストでの脂肪酸合成系遺伝子プロモーター制御下のレポーター遺伝子の発現をtrans-activationした。ASML1/WRI1に比べ、WAT1の発現は種子よりも栄養組織で高い。現在、プロモーター:GUS形質転換株を用いたASML1/WRI1とWAT1の発現特性の比較、WAT1遺伝子の破壊株や過剰発現株における脂肪酸合成系遺伝子の発現の解析を進めている。また、AP2型サブファミリー転写因子のAP2ドメインの構造類似性と結合するDNA配列との関連を解析している。

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葉緑体コードの光合成遺伝子は、バクテリア型のRNAポリメラーゼであるPEPによって転写される。標準的なPEPプロモーターは大腸菌のσ⁷⁰型プロモーターに似ており、保存された-35および-10配列を持つ。光化学系IIの反応中心タンパク質D2をコードするpsbD遺伝子の発現は、強光や乾燥、塩などのストレスによって特異的に誘導される。psbD光応答プロモーター（psbD LRP）は、ユニークなPEPプロモーターの一つで、転写開始点の40-60塩基対上流にAAG-boxを持ち、σ因子の一つSIG5によって特異的に認識される。本研究では、コケから裸子植物の代表的な植物種についてプロモーターマッピングを行い、psbD LRPの進化について検討した。その結果、AAG-boxを持つ高等植物型のpsbD LRPは裸子植物と被子植物で保存されているが、シダ植物はAAG-boxとは異なった上流シス配列を持つシダ型のpsbD LRPプロモーターを獲得していることが分かった。この2種のプロモーターは、いずれも翻訳開始点から約900bp上流に存在しており、共通祖先植物のプロモーターから独立に進化したと考えられる。興味深いことに、シダ植物と裸子植物では、psbD LRPからの転写は光応答性を示さなかった。psbD LRPの光応答性は、被子植物の進化過程で出現したと考えられる。

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シロイヌナズナ高親和性リン酸トランスポーターPHT1;1は、根においてリン酸吸収に重要な役割を果たしており、その遺伝子発現はリン酸への負の応答と強い根特異性が転写レベルで制御されている。本研究では、PHT1;1のリン酸への応答及び根特異的な発現を制御する分子機構を明らかにすることを目的とし、5’UTRを含むプロモーター領域の解析をおこなった。実験には、シロイヌナズナ植物体のほか、シロイヌナズナから効率的に毛状根を誘導する方法を利用した。5’UTRを含むプロモーター領域4kbの5’側から段階的に削ったプロモーターを作成し、GUS遺伝子と連結してシロイヌナズナ毛状根と植物体へ形質転換をしたところ、上流4kbから1kbの間でリン酸に対して負の応答を示した。この領域には、リン酸応答に関与する転写因子WRKY75の結合部位が3ヶ所存在しており、PHT1;1の発現に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、5’UTRを含むプロモーター領域を500bpまで削っても強い根特異的発現が観察されたが、5’UTRに存在するイントロンを除いたキメラプロモーターでは、発現が大きく減少することがわかった。この結果から、PHT1;1の強い根特異的な発現は、5’UTR中に存在するイントロンのエンハンサー効果によるものであることが示唆された。

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シロイヌナズナの多くの遺伝子は遺伝子ファミリーに含まれ、これらは主にゲノムの大きな重複もしくは局所的なタンデム重複によって生まれる。また、シロイヌナズナのゲノム中の約2%を占めるヘリトロンという最近発見されたトランスポゾンは互いに高い塩基配列の相同性を示す。これらの相同配列間の相同組換えはゲノム進化に寄与すると考えられている。我々は、DNAポリメラーゼとDNAヘリカーゼのドメインを持つシロイヌナズナのTEBICHI（TEB）タンパク質はDNA複製チェックポイントキナーゼのATRと協調して、重複遺伝子、特に、タンデム重複遺伝子の発現抑制に関わることを見いだした。マイクロアレイ解析により、tebもしくはteb atr二重変異体において多くのタンデム重複遺伝子が有為に上昇していた。また、葉の背腹性異常の解析より、tebやteb atrでは、ETTIN（ETT）, ARF4遺伝子の発現が上昇していることを見いだし、さらにETTの発現上昇にはETTの上流に挿入されているヘリトロンが関わっていることが示唆された。さらには、マイクロアレイ解析により、tebやteb atrではヘリトロン近傍遺伝子の発現が上昇する傾向にあることが示された。これらの結果より、TEBとATRはDNA複製中の相同組換えを通して、これらの遺伝子領域のクロマチン構造維持に働いているのではないかと考えられた。

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近年のトランスクリプトームの成果は、大量の低分子RNAの存在を明らかにした。植物からもsiRNAやmiRNA等の遺伝子発現制御に係わる低分子RNAの発見が相次いだが、低分子RNAの全体像を把握するには至っていない。本研究では、トランスクリプトームとは異なるアプローチで新規の低分子RNAを発見することを目指し、U snRNA遺伝子が共通に持つ転写シス配列に着目した。in silicoとin vitroを駆使し、イネから新規の低分子RNA (OsR17)を同定するに至った。この遺伝子座からは、Pol II とPol IIIによる転写が重複して行われている可能性を示唆する結果が得られており、何らかの遺伝子発現制御に係わっている可能性がある。

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イネにおいてはキチンオリゴマーやセレブロシドなどのエリシターによって様々な抵抗性反応が誘導されることが知られている。我々は、イネからキチンエリシター応答性のWRKY 型転写因子遺伝子として OsWRKY53 を単離し、OsWRKY53 を過剰発現させたイネ植物体が病原性いもち病菌に対して抵抗性を獲得することを明らかにしてきた。この結果は、OsWRKY53 がイネの病害抵抗性反応を引き起こす重要な分子スイッチであることを示唆するものであり、その発現制御機構はエリシター認識から病害抵抗性反応を引き起こすまでのシグナル伝達経路を理解する上で非常に興味深い。そこで我々は、レポータージーンとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いたトランジェントアッセイを行うことでOsWRKY53 のプロモーター解析を試みた。OsWRKY53 の翻訳開始点上流 2 kb について 5’ 側からのデリーションシリーズを作製し、それらをパーティクルガンによりイネ培養細胞に導入後、発現解析を行った結果、-500 bp と -250 bp の間にエリシター応答性シスエレメントが存在することが示された。この領域内には、WRKY 型転写因子の結合配列であり、エリシター応答性シスエレメントと考えられる W-box がタンデムに存在していた。現在これらの W-box に部位特異的変異を導入し、キチンエリシター応答性シスエレメントとして機能していることの確認を行っている。

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植物は病原菌の感染を認識し、ファイトアレキシンの生産を含む様々な抵抗性反応を誘導する。イネにおけるジテルペン型ファイトアレキシンの一種であるモミラクトン類生合成については、現在までにOsCPS4、OsKSL4、CYP99A2、CYP99A3、OsMASの5種の遺伝子が関与し、それらが4番染色体においてクラスターを形成していること、これらの遺伝子はキチンエリシター処理により同調的に発現誘導されることが示された。これらの5種の遺伝子うちOsKSL4については、前年度大会において、その発現を制御するbZIP型転写因子であるOsTGA1が同定されており、さらにOstga1変異体を用いたマイクロアレイ解析によりOsTGA1がOsKSL4以外のモミラクトン生合成酵素遺伝子の発現制御にも関与する可能性が示されている。今回は、OsTGA1過剰発現株を用い、OsTGA1の機能についてさらに解析を行った。OsTGA1過剰発現培養細胞におけるOsKSL4の発現解析、ファイトアレキシン定量を行ったところ、OsKSL4の恒常的発現が認められると同時に、モミラクトン類の蓄積も観察された。さらに他のモミラクトン類生合成酵素遺伝子についても恒常的発現が認められたことからOsTGA1がクラスター単位で、複数の遺伝子の発現を制御している可能性が示された。

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日本型イネにはプラスミド様の内在性2本鎖RNA（Endoranavirus）が存在する。本来、2本鎖RNA（dsRNA）は分子構造的にRNA干渉のトリガーとなるが、内在性dsRNAは全ての組織の細胞から一定コピー数で検出される。我々は内在性dsRNAのコピー数維持とRNA干渉との関係を解明する目的で、RNA干渉関連遺伝子であるRDR1-5、DCL2、DCL3aそれぞれのノックダウン系統における内在性dsRNAの有無を解析した。その結果RDR1-3、RDR5ノックダウン系統においては全ての個体から内在性dsRNAが検出された。一方、DCL3aノックダウン系統では少数の個体で脱落が観察され、さらにRDR4、DCL2ノックダウン株においては、内在性dsRNAは全ての個体から検出されなかった。そこで、内在性dsRNAが失われたRDR4、DCL2ノックダウン系統に対して、内在性dsRNAを有する野生型の日本晴イネを内在性dsRNAドナー株として用い、相反交雑による内在性dsRNA導入実験を行った。その結果、RDR4ノックダウン株のF1個体中では内在性dsRNAは通常通り安定に維持されていた。一方DCL2ノックダウン株のF1個体においては内在性dsRNAの脱落現象がみられた。これらの結果から内在性dsRNAのメンテナンス機構にDCL2が何らかの影響を与えていることが示唆された。

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RNAサイレンシングに関与する2本鎖RNA結合タンパク質としてDICERが良く知られている。シロイヌナズナではDICER遺伝子が4種類存在しており、そのタンパク質は異なる経路で働いていることが示されている。また、DICERは別の2本鎖RNA結合タンパク質と相互作用することが多くの生物種で見出されている。そこで、シロイヌナズナにおける2本鎖RNA結合モチーフを有するタンパク質(DCL1-4, HYL1/DRB1, DRB2, DRB4, DRB5)について生化学的な解析を行った。その結果、DCL1とHYL1/DRB1、DCL4とDRB4が特異的に結合することを見出した。また、免疫沈降法を利用した解析を行った結果から、DCL4とDRB4が実際に生体内で相互作用しており、複合体を形成することが示唆された。また、HA-tag融合DCLファミリー強制発現体を用いた実験によって、DCL4-DRB4に加えてDCL1-DRB4の結合が観察された。以上の結果から、植物においては複数存在するDICERとHYL1/DRBファミリーの特異的な結合を中心としたいくつかの複合体が存在し，それぞれがジーンサイレンシング現象において分業を担っている可能性が考えられた。また、現在、その他の2本鎖RNA結合タンパク質について免疫沈降法等を用いた解析を行っている。

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高等植物の葉緑体ゲノムでは、普遍的遺伝暗号の全61種が使われている。全61種のコドンを識別するには32種以上のtRNA種が必要であるが、葉緑体ゲノムには30種のtRNA遺伝子しか存在せず、そのうちの2種は重複しており、細胞質からRNA分子が輸入される証拠もないので、28種のtRNA種で全コドンに対応していると考えられる。従って、コドンの識別様式は、真性細菌や細胞質とは異なっていることが考えられる。メチオニンとトリプトファンを除く18種のアミノ酸には2～6種のコドンが対応し、同義コドンの使用頻度は植物種により異なる。我々はタバコ葉緑体より高効率in vitro翻訳系を開発した。この系はmRNAの翻訳速度を求めることができるので、この系をもとに同義コドン間の相対翻訳速度を測定する手法を確立した。この手法を用いて解析を行い、9種の同義コドンを調べ、翻訳効率と使用頻度は相関していないことを見出した。従って、外来遺伝子を高発現させるため、宿主のコドン使用頻度に合わせたコドン最適化なるものが行われるが、再考を要する。

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葉緑体は固有のゲノムと独自の遺伝子発現機構を持ち、葉緑体遺伝子の発現は主として翻訳段階で調節されている。葉緑体形質転換技術が確立されて以降、多くの研究者によって、葉緑体ゲノムに外来遺伝子を導入し、有用タンパク質を発現させる研究が進められている。しかし、導入した外来遺伝子が転写はされても翻訳されない場合が少なからず存在する。我々は、葉緑体で翻訳しなかった動物ウィルス遺伝子のタンパク質コード領域を改変することにより、葉緑体で翻訳させることに成功した。このことは、葉緑体mRNAの翻訳調節には5’非翻訳領域だけでなく、タンパク質コード領域も大きく関わっていることを示唆している。本研究では、葉緑体mRNAの翻訳調節におけるタンパク質コード領域の影響について、タバコ葉緑体psbA mRNAをモデルに、葉緑体in vitro翻訳系を用いて解析した。

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葉緑体では光合成電子伝達系の駆動と共役した ATP 合成が行われている．その役割を担う ATP 合成酵素は葉緑体と核の両ゲノムにコードされた複数のサブユニットから構成されており，それらの遺伝子は協調的に発現すると考えられている．このうち，β サブユニットをコードする atpB 遺伝子と ε サブユニットをコードする atpE 遺伝子は，葉緑体ゲノム上でオペロンを形成している．atpE は atpB のプロモーターから atpB と共転写されるが，atpB コード領域内に存在する atpE の独自のプロモーターからも単独で転写される．atpE mRNAからは SD 様配列に強く依存した翻訳が起こることが報告されているが，共転写された atpB-atpE mRNA から atpE が翻訳されるかは明らかになっていない．そこで我々はタバコ葉緑体由来の in vitro 翻訳系を用いて atpE の翻訳開始機構の解析を行った．その結果，atpB-atpE mRNA からも atpE が翻訳されることを確認した．次に，atpB-atpE mRNA からの atpE の翻訳開始に必要な mRNA 上の領域について解析した．その結果，SD 様配列以外にも atpE の翻訳開始に必要なシス領域があることが明らかになった．現在，この領域について詳細な解析を行っており，得られた結果について報告する．

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