歯科医学

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根尖性歯周炎の難治化には様々な要因が関与しているが,その真因が病巣での細菌の残存であることが,多くの研究により明らかになっている.我々はこれまでに,数回の根管治療後も細菌検査の結果が陰性にならず,疼痛,腫脹を繰り返す難治性根尖性歯周炎の病巣から分離されたRothia mucilaginosa(R.mucilaginosa)DY-18株を同定し,報告している.DY-18株の菌体表面を走査型電子顕微鏡で観察すると,菌体間に網目様構造物が存在する.本研究ではDY-18株の菌体外網目様構造物の化学組成を解析することを目的に精製と組成解析を試みた.DY-18株は,多糖結合性の蛍光色素Calcofluorを含む培地で培養すると,形成されたコロニーが蛍光反応を示した.このことからDY-18株は,exopolysaccharide(EPS)を産生することが示唆された.DY-18株の培養上清から得た精製網目様構造物を加水分解後,高速液体クロマトグラフィーで解析したところ,中性糖として主にgalactose,mannose,rhamnose,glucoseを,アミノ糖としてalucosamineとgalactosamineを含むことが明らかになった.また,試料中の菌体外DNAを紫外線スペクトル法で,uronic acidをcarbazole硫酸法で定量したところ,DNAをほとんど含有しておらず,uronic acidも検出限界値以下であった.これらのことからDY-18株が産生する菌体外マトリックスは主としてEPSからなり,中性糖とアミノ糖を含むことが明らかになった.細菌が形成するバイオフィルムは,環境抵抗因子として働くことが知られている.また,多くの疾患で,バイオフィルム形成菌と疾患の難治化の関連が報告されており,EPSを産生するR.mucilaginosaもバイオフィルムを形成することにより,宿主の免疫機構や治療の際の薬物の作用から逃れ,難治性根尖性歯周炎を引き起こしていると考えられる.

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口腔における慢性持続性感染症では,バイオフィルムを形成する細菌が原因となることがあり,バイオフィルム形成菌と病態との関連性についてはすでに明らかになっている.バイオフィルム形成の初期段階では,菌体がbioticやabioticな固相表面に付着できるかどうかが重要な因子となっている.Actinomyces属(特にActinomyces naeslundiiやActinomyces oris)は,デンタルプラーク形成におけるinitial colonizerとして重要な役割を担っていることが,最近分かってきた.本研究では,歯性膿瘍から分離した,exopolysaccharide(EPS)を持続的に高産生するバイオフィルム形成菌Actinomyces oris K20株(K20株)を用い,付着性に影響を与える遺伝子(群)を明らかにするために,K20株を対象にtransposon mutagenesisを行った.その結果,K20株よりもさらに付着性が増強し,強固なバイオフィルムを形成する1株(M5-7株)を得た.Transposon挿入変異遺伝子を解析した結果,1つのopen reading frame(ORF),K20_1782に変異が起きていることが明らかになった.このORFの機能予測を,BLAST解析,Pfam解析,およびconserved domain databaseに対するCD-Searchで行ったが,各々のデータベース上に登録されているものに有意に高い相同性を見出すことはできなかった.一方,PSI-BLAST解析によるタンパクファミリーの検索では,permeaseや膜タンパクとannotationされたcoding sequence(CDS)がみつかった.また,Phobius programによる膜貫通domainの検索結果では,8回膜貫通へリックス構造をもつことが推測された.K20_1782ORFの明確な機能は見出せなかったが,細胞膜に存在する膜タンパクとして機能している可能性が示唆された.

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