PsbYタンパク質は、光化学系II（系II）複合体に結合していることが示されている膜タンパク質であるが、生理学的機能は依然不明である。また、これまでに報告されたいずれの結晶構造モデルにおいても、その結合位置は示されていない。本研究では、このPsbYタンパク質の機能分析を目的とし、ラン色細菌Synechocystis 6803野生株とPsbY欠失変異株との比較を行った。
増殖曲線、および細胞の酸素発生活性においては、野生株、変異株で大きな違いは見られなかった。そこで精製した系II複合体の酸素発生活性を測定したところ、野生株に比べ変異株で大きな低下が見られた。この精製系II複合体の電気泳動の結果、PsbU、PsbVが失われ、またPsbOおよびPsbQの結合量が減少していた。これらは系II複合体精製の段階で失われたと考えられる。PsbYを欠失させたことでPsbU、PsbVが非常に不安定になっていることが推察される。これは、PsbYの酸素発生および系II複合体の安定化との重要な関連性を強く示唆するものである。以上の結果は、これまでに発表されている『PsbYは、細胞においては系II複合体の機能には全く影響せず、ラン藻において必須なものではない』という報告とは対照的である。

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ラン色細菌光化学系II（系II）酸素発生系に結合しているPsbUは、植物の系IIのPsbPあるいはPsbQと機能的に相同であると考えられてきた。しかし、我々はラン色細菌の系IIにPsbP、PsbQを見出した[Thornton et al. (2004) Plant Cell 16, 2164]。よって、PsbUは植物のPsbP、PsbQとは異なる機能を有すると考えられる。そこで、Synechocystis 6803のpsbU欠失変異体(ΔPsbU)を作成し、PsbUの機能を分析した。本研究ではとくに酸素発生系と関わりの深いイオンとの関係を検証した。
ΔPsbUは、Ca²⁺欠乏下では野生株（WT）と同様に増殖したが、Cl^-欠乏下では増殖が著しく抑えられた。単離したチラコイド膜での酸素発生活性は、30mM Cl^-存在下に比べ、－Cl^-でWTでは約40%の活性低下が見られ、ΔPsbUでは活性がほとんど見られなかった。30mM NO₃^-存在下では、ΔPsbUチラコイド膜は30mM Cl^-存在下の60%の活性を示した。SO₄^2-は、WTでもΔPsbUでも、影響を示さなかった。チラコイド膜の酸素発生に対するこれら陰イオンの効果は、植物の場合とは大きく異なるものである。これらの結果を基に、PsbUは植物PsbPやPsbQとは異なり、Cl^-の結合には関与していないであろう、と結論づけた。

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In order to study the roles of lipids in PSII from Thermosynechococcus vulcanus, we used phospholipase A₂ (PLA₂) and lipase to treat PSII core complex and examined their effects on PSII structure and functions. The following results were obtained: 1. PLA₂-treatement decreased the content of PG by 70.6%, leading to a decrease of 40% in oxygen evolution. In contrast, lipase-treatment specifically decreased the content of monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) by 71.2% without affecting the contents of other lipids, resulting in a decrease of 16% in oxygen evolution. These indicated that PG was more important than MGDG in maintaining the PSII function. 2. PLA₂-treatment induced neither the dissociation of PSII dimer nor any loss of polypeptides from the PSII core complex. 3. Depletion of PG did not affect the water oxidation site, but caused a damage to the Q_B binding site, leading to an inhibition in the electron transfer from Q_A to Q_B.

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C₃植物であるホウレンソウの研究では、葉内の光環境に合わせてPSI/IIの量や活性が変化することが知られている。細胞の周辺環境に応じた変化は、C₄植物でも同様に起こると考えられる。NADP-ME型C₄植物であるエノコログサの葉および茎の切片を作成し、細胞ごとの蛍光スペクトルを高空間分解能顕微分光法によって常温および液体窒素温度で測定した。この装置は共焦点レーザー顕微鏡の検出部に分光器を配置したものであり、その空間分解能は0.3 μm、波長分解能は1 nmで、1細胞・1葉緑体ごとのin vivoスペクトル測定が可能である。また液体窒素温度に冷却することにより詳細にPSI、IIの蛍光スペクトルを解析できる。酵素処理で分離した細胞を測定するという従来の方法では分からなかった細胞ごとのゆらぎに関する情報がこの方法では得られ、細胞内、葉の表側・裏側、葉の先端・元、葉と茎、等様々な部位で蛍光スペクトルを測定し、PSI/IIの蛍光強度比の分布とそのゆらぎを得た。維管束鞘細胞と葉肉細胞は各々大きく異なったPSI/II比を示した。たとえば液体窒素温度では葉肉細胞は維管束鞘細胞の約6.6 倍PSIIの蛍光が強かった。これらのことから細胞の周辺環境とPSI・PSIIの量比についての関係を議論した。

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光化学系I(PSI)複合体は、光合成の初期反応である電子伝達反応の場であるチラコイド膜に存在する膜タンパク質複合体である。私達は、好熱・好酸性の原始的な紅藻であるCyanidioschyzon merolaeのPSI複合体の構造と機能を詳細に分析するため、PSI複合体を精製した。Blue Native電気泳動分析による推定分子量は、約400 kDaであった。これをさらに変性させ二次元目に展開することで、精製されたPSI複合体標品に集光性アンテナ複合体(LHC)Iが結合していることが確認された。また、現在までにPsaA, PsaB, PsaC, PsaE, PsaF, PsaLがサブユニットとして確認された。アンテナサイズは、反応中心あたり約200 Chlorophyllaで、高等植物のエンドウのPSI複合体よりも大きな値であった。また、反応中心あたり約36分子のzeaxanthinを結合していることが明らかとなった。violaxanthinとantheraxanthinは検出されなかったので、このzeaxanthinはキサントフィルサイクル以外の働きに関わっていると考えられる。また、C. merolaeのLHCIをコードしている遺伝子は一つしか同定されていない。これらことから、C. merolaeのPSI複合体は、高等植物とは異なるアンテナシステムを有していることが示唆された。

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電子伝達フラビン蛋白質（ETF）と電子伝達フラビン蛋白-ユビキノン酸化還元酵素（ETFQO）は多くの生物種で高度に保存されているタンパク質であり、真核生物ではミトコンドリアで機能する。動物において、ETFは少なくとも9種類のミトコンドリアマトリクスに局在するフラビン結合型脱水素酵素を再酸化する働きを持つ。ETFは受け取った電子をETFQOを介してミトコンドリア内膜のユビキノンに伝達する。このETFとETFQOによる電子伝達は、ETFにより再酸化される脱水素酵素の働きに必須であり、直鎖脂肪酸のβ酸化、ロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン等のアミノ酸分解経路、そしてコリン代謝に重要な働きを持つ。ヒトにおいては、ETFもしくはETFQOの機能障害により、先天性代謝異常症であるグルタル酸尿症II型を発症することが知られている。一方、植物におけるETF/ETFQO電子伝達の機能に関する知見は全くなかった。本研究は、高等植物におけるETF/ETFQO電子伝達の機能の解明を目的とし、シロイヌナズナを用いて、逆遺伝学の手法によりETFQOの機能解析を行ったので報告する。

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RuBisCOは8個のsmall subunit（SS）と8個のlarge subunit（LS）からなる16量体の酵素でカルビンサイクルの鍵酵素である。またSSは核コードでLSは葉緑体コードである。これまでに、構成的にrbcSの発現を抑制したタバコの解析からSS量が野生株の20％までに減少した場合、LS量も減少しSSとLSの量比が常に1：1となることが報告されている。昨年、我々はDEXAMETHASONE（DEX）により時期特異的にrbcS mRNA量を減少させたタバコについて報告した（第46回年会）。このタバコをDEXで処理し、SS量が野生株の0.5％まで減少したタバコの葉でLS量を調べた結果、過去の知見とは異なり野生株と比べて3～10％程度存在していた。また、この葉でのrbcL mRNAの蓄積量を調べるとともに、電子顕微鏡による葉緑体構造の観察を行ったので合わせて報告する。

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【目的】我々はこれまでに、ラン藻由来のFBP/SBPaseを葉緑体で発現させた形質転換タバコ (TpFS) は光合成能が上昇し、生育速度および乾燥重量が増加することを明らかにした。そこで光合成能増大および収量増大に関わる遺伝子群を網羅的に解析することを目的とし、本研究ではFBP/SBPaseをシロイヌナズナ葉緑体で発現させた形質転換植物(ApFS)を作出し、マイクロアレイ解析およびreal-time RT-PCR解析により発現に変動の見られる遺伝子群の探索を試みた。
【方法・結果】FBP/SBPaseの導入によりFBPase活性が野生株の3.3倍に増加したApFS-2の光合成速度は野生株の1.7倍に上昇していた。また、野生株に比べて生育が早く、9週齢における湿重量は野生株の1.7倍に増大していた。これらの結果から、シロイヌナズナにおいてもタバコと同様の表現型を示すことが明らかになった。そこで、生育に差が見られる直前（5週齢）の植物体の胚軸、ロゼッタ葉の幼葉、成葉の葉脚および生育に差が見られる7週齢の植物体のロゼッタ葉よりそれぞれの総RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ(22 K, Agilent)により解析を行った。現在、2.0倍近い増加が認められる15個の遺伝子発現量をreal-time RT-PCRにより詳細に検討している。

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イネ胚乳内のアミロペクチン合成に大きく関与する酵素の一つstarch branching enzyme（ BE ）には三種類のアイソザイム BEI、BEIIa、BEIIb が確認されており、それぞれ発現パターンが異なっている。今回各BE アイソザイムの機能と相互作用を解析するために、プロモーターにはglutelin （ GluB-1 ）を用いてRNAi（ RNA 干渉 ）法により個々のBE 遺伝子単独と複数のBE遺伝子を制御した形質転換体「BEI」、「BEIIa」、「BEIIb」、「BEI＋BEIIa」、「BEI＋BEIIb」、「BEIIa＋BEIIb」、「BEI＋BEIIa＋BEIIb」の作成を試みた。Native-PAGE によるBE活性測定とアミロペクチンの鎖長解析の結果、各形質転換体のBE 遺伝子には発現抑制が認められた。
得られた種子を用いて各BE アイソザイムの相互作用が及ぼすデンプン合成への影響を重点的に調べた。その結果、「BEI＋BEIIb」では単独で抑制した効果よりも顕著な相乗効果が種子の形態に認められた。即ち、「BEI」「BEIIa」では種子の形態にほとんど何も変化が無く、「BEIIb」では種子が白濁しやや小粒であるのに対し、T1世代（分離世代）の種子において、「BEI＋BEIIb」では重量が顕著に少ない扁平な白濁種子が約75％も出現した。この表現型は「BEIIa＋BEIIb」においても約30％現れた。以上の結果は、BEIIb抑制と他のBEアイソザイムの抑制が組み合わせることにより増幅されることが明らかになった。

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デンプン粒結合型スターチシンターゼI（GBSSI）はプラスチドにおいてデンプンのアミロース合成に関与する酵素である。我々はこれまでにライブラリーのスクリーニングによって得られたサツマイモGBSSI遺伝子のゲノミッククローンおよびcDNAクローンの塩基配列について報告を行っている。今回、6倍体であるサツマイモにおけるGBSSI遺伝子の多型性を調べるために、複数の異なるクローンについて解析を行った。今回解析を行ったのはORFを完全に含む5つのゲノミッククローンと2つのcDNAクローンであり、既報の塩基配列を含めて5種類のグループに分けられた。これらのORF領域の塩基配列の一致度は98.1%-98.9%であった。推測されるGBSSI成熟タンパクのアミノ酸配列も5種類存在し、アミノ酸配列の一致度は99.1%-99.6%であった。以上のことからサツマイモの個体内で機能するGBSSIタンパクはヘテロな集団であることが示唆される。さらにゲノミッククローンのイントロンを比較したところ、13個のイントロン全てについて長さに多型（1-89bpの違い）がみられた。現在ORFを完全に含まない部分長のクローンについての解析を行っている。

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種子登熟期の高温は、イネにおいて収量の低下および収穫物の品質低下をもたらす。高温条件(33/28℃)で登熟した米粒は、対照(25/20℃)と比較して外観が著しく乳白化し、千粒重が13%低下した。また、アミロース含量は対照区の17.2%に対して、高温区では12.1%と低下した。アミロペクチンについては、高温区においてDP6-18の短鎖が減少し、DP20-32の長鎖が増加した。そこで、高温が種子登熟代謝に及ぼす影響を明らかにするために、マイクロアレイ解析およびディファレンシャルスクリーニングを行い、高温応答性遺伝子を同定した。出穂後10日目の頴花において、高温処理によってheat shock proteinおよびα-amylase遺伝子の発現が誘導され、ADP-glucose pyrophosphorylase、GBSS-I、starch branching enzymeおよびprolamin遺伝子の発現が抑制されることが明らかとなった。以上のことから、高温登熟条件におけるアミロース含量の低下やアミロペクチンの側鎖構造の変化は、デンプン代謝系の遺伝子の発現が様々に影響を受けることによって生じていると示唆された。

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chlorophyllide a oxygenase(CAO)はクロロフィルaからクロロフィルbを合成する酵素であり、CAOは、蓄積制御，リンカー，触媒の機能をもつA,B,Cという3つのドメインからなっている。我々はこれまでの研究から、Cドメインがクロロフィルbを合成し、合成されたクロロフィルbが何らかの機構でフィードバック制御を行なった結果、CAOタンパク質が分解されると考えている。このフィードバック機構を明らかにするため、内生のCAOを欠失したシロイヌナズナ変異株でGFP-CAOの融合タンパク質を過剰発現させ、その株にEMSを用いて突然変異の導入を行なった。通常はGFP-CAOの融合タンパク質を過剰発現させてもフィードバック制御により蓄積せず、GFP蛍光を検出できない。しかし、CAOの制御因子に突然変異が起これば、GFP-CAOが蓄積しGFP蛍光が検出されると考え、GFP蛍光を示すものを検索した。その結果、子葉においてGFP蛍光が強い変異株を一株単離した。この変異株では子葉においてCAOタンパク質の蓄積が促進されること、本葉においてはCAOタンパク質の蓄積の促進は見らないこと、子葉を24時間の暗処理でGFP蛍光が強くなること、が明らかとなった。現在、この突然変異株の特徴と、突然変異導入部位の遺伝子の解析を進めている。

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フェオフォルビドaオキシゲナーゼ(PaO)は、フェオフォルビドaに酸素を添加してポルフィリン環を開環する反応を触媒する酵素で、クロロフィル分解の鍵酵素であると報告されている。PaOはAccelerated cell death 1（ACD1） 遺伝子にコードされていることから、PaOの発現が抑制され、その基質のフェオフォルビドaが蓄積すると、細胞死が誘導されると推測された。そこで我々は、アンチセンスRNA法でPaOの発現を抑制したシロイヌナズナ形質転換株（As-ACD1株）を用いて、細胞死の研究を行った。
As-ACD1株を暗処理すると、フェオフォルビドaが蓄積する。暗処理後のAs-ACD1株に光を照射すると葉は白化した。これは、励起されたフェオフォルビドaにより発生した一重項酸素が原因であると推測された。また、As-ACD1株を暗処理すると、その後光を照射しなくても葉で細胞死が誘導され、この場合には葉は白化せずに萎れることがわかった。これは蓄積したフェオフォルビドaが、一重項酸素の発生を伴わずに細胞死を誘導する事を示唆している。このような光を必要としない細胞死は、他のクロロフィル中間体が蓄積する変異株でも報告がない。我々は現在この光非依存的な細胞死について研究を行っており、本大会では電子顕微鏡による細胞構造の観察結果や、プログラム細胞死マーカー遺伝子の発現についても報告したい。

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緑色硫黄光合成細菌Chlorobium tepidumは膜外アンテナ系のクロロゾーム内の色素として、バクテリオクロロフィル（BChl）cを持っている。近年この菌におけるゲノム解析およびに分子遺伝学的手法によって、BChl cの生合成経路が明らかとなりつつある。この経路では、クロリン環のC-20位にメチル基を導入する酵素、BchU、がBChl cの合成に必須であることが分っている。しかし上記の解析のみでは、BchUが合成経路上のどの段階で働くかは不明である。本研究ではBchUの反応特性をin vitroで調べることにより、本酵素の生合成経路上での位置を解明することを試みた。精製したBchUを用いて、S-アデノシルメチオニンの存在下で数種類の人工基質（BChl d誘導体）に対する反応性の検討を行った。その結果、BchUは様々な基質に対して触媒活性を示したが、特にC-3位に1-ヒドロキシエチル基をもつ基質との反応性が最も高かった。したがって、BchUは合成経路上でクロリン環のC-3位の1-ヒドロキシエチル基を修飾する酵素BchFおよびBchVの下流で働いていると推測された。また、この反応特性は、既に決定しているBchUの立体構造からも支持される結果であった。現在、C-3位の1-ヒドロキシエチル基を認識すると考えられるアミノ酸残基に部位特異的変異を導入し、得られた変異タンパク質の活性を調べている。

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紅色細菌 Rhodobacter capsulatusのバクテリオクロロフィル (BChl) a合成経路では、クロロフィリドaのC-3位のビニル基が bchFにより水和化されヒドロキシエチル基に変換される。緑色硫黄細菌は鉄硫黄型の光化学反応中心を持ち、反応中心クロロフィルはBChl aのダイマー、初発電子受容体はクロロフィルa異性体である。また、アンテナ色素としてBChl cを持つ。解読されたC. tepidumのゲノム配列中にはbchFと高い相同性を持つ遺伝子が2種類（CT1421とCT1776）存在する。BryantらはBChl cのC-3位におけるR型とS型の光学異性体のうち、CT1421がR型、CT1776がS型の合成に関与するというモデルを提唱している。また、BChl aの合成においては、CT1421の寄与がはるかに大きいと主張している。今回、我々は、このモデルを検証するためにCT1421とCT1776を、それぞれR. capsulatusのbchF破壊株へ導入した。その結果、CT1421導入株は野生株と同じ色素組成を示したが、CT1776導入株はBChl a合成量がかなり減少しており、Bryantらのモデルを支持した。現在、CT1421、 CT1776さらにR. capsulatusのbchFをそれぞれシアノバクテリアSynechocystisに導入し、これらの株内に蓄積する色素組成を分析している。

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ラン藻をはじめ多くの光合成生物においてクロロフィル生合成系のプロトクロロフィリド（Pchlide）還元には、光依存型Pchlide還元酵素（LPOR）とニトロゲナーゼと類似した光非依存型Pchlide還元酵素（DPOR）という構造的にまったく異なる2つの酵素が併用されている。ラン藻Plectonema boryanumにおいてLPORが強光条件での生育に必須であることが示されているのに対して、DPORが多くの光合成生物においてLPORと併用されている生理学的意義については不明のままである。今回、P. boryanumのDPOR欠損株（chlL破壊株）を様々な光条件で培養し、DPORが必要とされる生育条件について検討した。暗所従属培養から強光（>200 μmol m^-2 s^-1）にシフトすると、DPOR欠損株に有意な生育遅延（約8 h）が起こった。さらに、16 h暗所-8 h強光という明暗周期で光合成的に生育させると、培養開始時のクロロフィル含量が同じであるにもかかわらずDPOR欠損株は、最初の明期において明確な生育遅延を示した。これらの結果は、DPORが強光適応の初期において重要な役割をもっていることを示唆している。DPORの光合成生物における分布とその生理学的意義について考察する。

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カロテノイド生合成においては、リコペン・シクラーゼによりリコペンがγ-カロテンを経てβ-カロテンになる。現在、互いに相同性のない3種類の酵素が知られている。（1）細菌CrtY、2種のシアノバクテリア（Synechococcus sp. PCC 7942, Prochlorococcus marinus）、植物CrtL, CrtL-bでは、互いに相同性のある酵素が働いている。（2）一部の細菌（Mycobacterium, Myxococcusなど）ではCrtYc, CrtYdのヘテロダイマーが、古細菌と菌類ではこの2種類のペプチドが結合した酵素が働いている。（3）緑色硫黄細菌（Chlorobium tepidum）では3番目の酵素CruAが機能しており、ゲノム解析されたシアノバクテリアにもcruAに相同性がある遺伝子が存在することが判った。
このcruA類似遺伝子の機能を検討した。Anabaena sp. PCC 7120のこの遺伝子の破壊株は、カロテノイド組成に変化がなかった（本大会、持丸、他）。Synechocystis sp. PCC 6803のこの遺伝子の破壊株は、分離できなかった。またSynechocystis 6803とGloeobacterのこの遺伝子を、リコペンをつくる大腸菌で発現させたが、β-カロテンは合成されなかった（Sandmann私信, Steiger et al. (2005) Arch. Microbiol.）。他にも海外でcruA類似遺伝子の機能解析を試みているようだが、未だに成功した報告がない。従ってシアノバクテリアには別の第4番目のリコペン・シクラーゼが存在する可能性が高いことが示唆された。

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シアノバクテリアのカロテノイドは、生物種ごとに多様性があることがわかってきた。ゲノム塩基配列が判明しているAnabaena sp. PCC 7120は、極性カロテノイドとしてミクソール・フコシドとケトミクソール・フコシド、非極性は、β-カロテン、エキネノン、カンタキサンチンを持つことを明らかにした（Takaichi et al. (2005) PCP）。さらに2種類のβ-carotene ketolase (CrtW, CrtO)が、基質を使い分けていることを見出した(Mochimaru et al. (2005) FEBS Lett.)。
本研究ではAnabaena 7120について、カロテノイド生合成系遺伝子の破壊株を作成することにより機能の同定を試みた。β-carotene hydrogenase (crtR, alr4009) を破壊すると、（ケト）ミクソール・フコシドが（ケト）デオキシミクソール・フコシドに変化したので、この酵素は（ケト）ミクソールの水酸化をしていることが判明した。ミクソール合成に関して、Synechocystis sp. PCC 6803で機能が確認されている3,4-desaturase (crtD, all5123)の破壊株はミクソール合成に影響しなかった。またSynechocystis 6803のfucose synthase破壊株はフコースを結合できないが、Anabaena 7120ではフコース以外の糖が結合しているようで分析中である。緑色硫黄細菌Chlorobium tepidumのlycopene cyclaseに相同性のあるcruA, alr0920破壊株のカロテノイド組成は、野生株と変わらなかった（本大会、高市、他）。

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光合成細菌Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificansのDMSO (dimetyl sulfoxide)呼吸系のdmsCBAオペロンの転写はニ成分制御系のDmsS/DmsRにより制御されている。一般にセンサーキナーゼはN末側から膜貫通ドメイン、PASドメイン、リン酸リレーに関与するドメインを持ち、細胞外領域が環境のシグナルを認識すると考えられているが、DmsSの膜貫通ドメインと予想される領域では、疎水性アミノ酸配列が短くペリプラズム側に露出していないことが推測された。このことからDmsSがDMSOそのものを感知していないことが予想された。そこで、DmsSのトポロジーを確認するため、膜結合に関与していると思われる6カ所の疎水性アミノ酸領域に注目し、その数を様々に変化させた7つのdmsS-lacZ融合遺伝子を作製した。これらの融合遺伝子を用いた解析からDmsSが細胞膜の細胞質側、または細胞質に局在するタンパク質であると推定された。
本研究ではDmsSのトポロジーとセンシング機能の解析を目的とし、上記の7種類の融合遺伝子を持つ光合成細菌をペリプラズム、細胞膜、細胞質に分画し、LacZ活性を測定した。疎水性領域が増えるにつれて活性の分布が細胞質から細胞膜に移ったことから、DmsSが細胞質に局在するのではなく、細胞膜に結合することが示された。また、DmsSの膜結合領域を部分的に除去しDmsA発現量を調べた結果、膜結合領域はセンシング機能に必要でC末端側が特に重要であることが示された。

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光合成生物においてカロテノイドは光捕集や光酸化障害防止などに働くが、その構造と機能の関係は十分には解明されていない。我々は紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusを用いて直鎖型カロテノイドの生体内における機能比較を行い、さらに環状カロテノイドと直鎖型カロテノイドの機能的な差違を調べるために、Β-カロテン蓄積株を作成した。今回さらに、多くの種類で機能的な差異を調べるため、Β-カロテン誘導体の蓄積株を作成した。
Β-カロテン蓄積株にParacoccus sp. N81106（Agrobacterium aurantiacum）のΒ-カロテン水酸化酵素（crtZ）、Β-カロテンケト化酵素（crtW）、を導入することで、ゼアキサンチン蓄積株、カンタキサンチン蓄積株、アスタキサンチン蓄積株を作成した。
色素分析の結果、培養条件によって最終産物の生産量は異なるものの、目的のカロテノイドを産生していることが確認できた。さらに、光合成色素タンパク複合体にもこれらの環状カロテノイドが結合していた。弱光下での生育速度が野生株とあまり変わらなかったことから、環状カロテノイドも捕集色素として機能していることが示唆された。一重項酸素耐性を調べた限りでは、いくつかの強い耐性を示す直鎖状カロテノイドの蓄積株に比べて環状カロテノイド蓄積株は特に強くはなかった。

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窒素固定細菌 Azotobacter vinelandii では、鉄硫黄クラスターのアッセンブリーに関与するいくつかの因子が同定されている。このうち、ニトロゲナーゼのアッセンブリーに関与すると考えられている NifU は、N 末側ドメイン、中央ドメイン、C 末側ドメインの3つのドメインから成る。また、NifU の N 末側ドメインと高い相同性を持つ IscU も存在する。緑色硫黄細菌 Chlorobium tepidum は鉄硫黄型反応中心を持つ嫌気性光合成細菌で、ニトロゲナーゼを持ち窒素固定能も有する。既に全配列の決定が完了した C. tepidum のゲノム上には iscU のホモログ CT1994 が存在するが、A. vinelandii の iscU とは異なり、nifU の N 末側ドメインに加えて中央ドメインも有する。また、CT1994 とは離れたゲノム上に存在する CT1786 は、A. vinelandii の nifU の C 末側ドメインのみを有する。今回、我々は C. tepidum における鉄硫黄クラスターアッセンブリー過程を明らかにするために、C. tepidum の CT1994 と CT1786、さらに CT1994 の2つの各ドメインを、それぞれ大腸菌で発現させ、その性質を調べた。精製した CT1994（IscU）はホモダイマーを形成し、吸収スペクトルの特徴や液体ヘリウム温度下での ESR 測定から、既に IscU 自身が [2Fe-2S] クラスターを結合していることが示唆された。

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好熱性紅色光合成細菌Thermochromatium tepidumから精製された光合成反応中心複合体reaction center complex (RC)をシリカメソ多孔体（folded-sheet silica mesoporous material=FSM）へ吸着させた。FSMに吸着したRCの量は光学的測定および、窒素吸着によって決定された。0.29、0.02 mg/mgFSMのRCがそれぞれ、内部の直径が7.9、2.7 nmのFSMに吸着した。溶液中のRCが60 ℃以上の加熱後に活性を失ったのに対し、FSMに吸着したRCの光化学活性は、60 ℃以上で10 minの加熱後でも保持されていた。また、FSMに吸着したRCでDCPIPの光還元を確認した。電極を用いて電気エネルギーとして取り出すこともできた。疎水性のシリカメソ多孔体の内部環境は膜タンパク質の新しい母体となり、シリカと膜タンパク質の付加化合物は新しい反応システムの構築に有効である。

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これまでフェロキラターゼ活性や細胞内でのヘム含量の測定は、主にアルカリ-ピリジンヘムクロム法などにより行われてきた。しかしこの方法は、ピリジンヘムクロムの吸光係数が低くことやピリジンが毒性を有することなど問題も多かった。植物ではヘムは葉緑体で生合成され細胞内の様々なオルガネラに輸送される。細胞内でのヘムの動態を解析するためには、ピリジンヘムクロム法に代わる安全かつ高感度なヘム定量系が必要である。そこで本研究では、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（HRP）のアポ蛋白質がヘムと結合することにより再構成されたペルオキシダーゼ活性を、ルミノールを用いた化学発光法を検出することで、高感度なヘムを測定系の開発を行った。
HRPとヘムの結合によるペルオキシダーゼ活性の再構成はインキュベーション開始30分後に飽和に達した。またルミノール添加後の化学発光は、反応開始後30分で安定な発光が見られた。化学発光値と添加したヘムの濃度には直線的な関係が得られ、検出限界濃度はおよそ10 pMであった。ヘム以外のポルフィリン類や金属ポルフィリン類は全くペルオキシダーゼ活性を上昇させなかった。またルミノールを酸化するFe²⁺の影響はヘムにより3桁以上低く、無視できるものであった。本方法を用いたテトラピロール結合蛋白質からのヘムの放出や、フェロキラターゼ活性の測定、また植物体やオルガネラにおけるヘム含量の測定などについて検討を行っている。

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テトラピロール生合成系において、グルタミン酸tRNA還元酵素(HEMA)とFe-キラターゼ(FC)のアイソフォーム、HEMA2とFC1は、主に根や胚軸などの非光合成組織で主に発現しているため、これらの組織におけるヘム生合成に機能していると考えられている。我々は、光合成組織においてHEMA2、FC1の発現が蛋白質合成阻害剤であるシクロヘキシミド処理により誘導されることを見出した。従って、光合成組織におけるHEMA2、FC1の発現は通常は抑制されており、ストレスなどの条件下で誘導を受けるのではないかと考え、HEMA2あるいはFC1 のプロモーターGUS融合遺伝子を導入したシロイヌナズナにストレス処理を試みた。その結果、傷害処理した葉の傷害部位の周辺部でのGUS活性の上昇が認められた。また、オゾン曝露処理により植物体全体でのGUS活性の誘導が認められた。以上の結果より、HEMA2、FC1の発現は、傷害やオゾン処理などの酸化ストレスにより誘導されることが示された。cDNAアレイ解析により、傷害処理した葉では、HEMA2、FC1の発現が処理後15分での急速な誘導を受けることが明らかとなった。また、活性酸素消去や細胞壁合成など、防御応答に関わるヘム蛋白質が誘導されることを見出した。従って、HEMA2、FC1が酸化ストレス時の防御応答に機能している可能性が考えられ、その機能について解析中である。

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Synechocystis PCC6803 では、FtsHプロテアーゼ(FtsH 2: slr0228) が強光や熱により損傷を受けたD1タンパク質の分解に関与していて、細胞の生育に不可欠なプロテアーゼである。非ストレス条件下 (30℃、光強度10uEm^-2s^-1) で育った細胞中には一定レベルのFtsHが存在しているが、ストレス条件下では損傷D1タンパク質を処理するためにより多くのFtsHが必要とされる可能性がある。
本研究では、Synechocystis PCC6803の野生株細胞に強光（1,000uEm^-2s^-1、2時間）・熱（42℃、2時間）ストレスを与えた時にFtsHのタンパク量が増加することを、DS9（タバコのFtsHホモログ）抗体を用いたウエスタン分析により示した。 熱ストレスではFtsHはコントロールに比べて約5％、光ストレスでは約40％増加した。また、細胞を低温(4℃、18時間)に置いた時にも、FtsH量の増加が見られた。FtsHの蓄積はその合成速度と分解速度に依存する。ここではFtsHの光・温度ストレス下での安定性についても調べた。

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植物は過剰な光エネルギーに対する防御機構を数多く備えている。これらの防御機構の中には、過剰還元力をミトコンドリアへ輸送し呼吸鎖で酸化する経路も含まれる。しかし、その経路の実際の葉内での貢献度や詳細なメカニズムは明らかになっていない。これまでの研究で、呼吸鎖の中でもATP合成と共役しないシアン耐性経路（AOX）が過剰還元力の散逸にとりわけ重要な働きを担っていることが示唆された（Yoshida et al. 2006）。そこで、この可能性を確かめるため、光阻害回避系の一部が欠損した突然変異株を用いて光ストレス下での呼吸系を調べた。もしAOXが光阻害回避系として機能しているならば、変異株でその欠損を補償するためにAOX量や活性が増加することが期待される。材料として、系Iサイクリックの突然変異株、D1タンパク分解酵素であるFtsH2を欠損した斑入り変異株のシロイヌナズナを用いた。これらの変異株は葉緑体内の主要な光防御機構を欠損しており、実際に強光処理によって野生株より顕著な光阻害が見られた。また、光阻害を受けていた変異株において、AOXに依存した呼吸速度が特異的に増加していた。この結果は、AOXが過剰還元力のシンクとして機能し、光阻害の緩和に貢献していることを示唆している。今後、タンパク量や活性状態など、より詳細にAOXの挙動を追っていく予定である。

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植物ミトコンドリアの呼吸鎖にあるalternative oxidase (AOX)はユビキノンから電子を受け取り、酸素を還元する酵素である。AOXを介する経路はH⁺の能動輸送を行わず、ATP産生と共役しないため、エネルギー的には無駄に見えるが、ストレス時など還元力が過剰な時には、その散逸系として働き、活性酸素生成の抑制やTCA回路の活性の維持に寄与していると考えられている。
Arabidopsis thalianaにはAOX1a-1d、AOX2が存在し(Thirkettle-Watts et al., 2003)、これらの発現パターンは、器官やストレスの種類によって異なる（Clifton et al., 2005）。ストレス処理によってAOXの発現誘導とAOX活性化が起こることは主に培養細胞を用いた系で明らかとされているが、これらをin vivoの生理的活性と結びつけた研究例はほとんどない。本研究では、A. thalianaにおいて、ストレスによるAOXの発現と活性化が、in vivoAOX活性、呼吸速度、成長にどのように影響を及ぼしているのかを評価する。ストレスとしては、緩やかな低温処理、強光処理を施す。それぞれのAOX mRNA発現とAOX量や活性化状態の変化を解析し、呼吸によるO₂消費速度および酸素安定同位体を用いたin vivoAOX活性を測定することで、ストレス下のAOXの役割を考察する。

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緑藻クラミドモナスは、CO₂欠乏条件下において炭酸同化を効率良く行うために無機炭素濃縮機構（carbon-concentrating mechanism; CCM）を発現し、細胞内の無機炭素濃度を積極的に上昇させることが知られている。しかし、光依存的なCO₂輸送体の実体は不明のままである。本研究ではクラミドモナスのCO₂取り込みの駆動メカニズムを明らかにするために、光合成阻害剤の影響と、光合成変異株のCO₂取り込み活性を解析した。低CO₂条件で生育させた野生株のCO₂取り込み活性と酸素発生活性（H ₂O-NaHCO₃）を0～2.5μM DCMU存在下で測定したところ、いずれの活性も0.2μM DCMUでコントロールの50%まで阻害された。DCMUの阻害効果が一次反応的であり、同じ濃度で両活性が同程度阻害されることから、CO₂取り込み活性は光合成電子伝達反応によって直接駆動されていると考えられる。一方、光化学系IIの蓄積量と活性が低下しているΔpsbI株のCO₂取り込み活性は野生株のおよそ40%まで低下していたが、Cytochrome b₆/f、光化学系Iの活性がそれぞれ低下しているΔycf7株、H730Q/H714Q株では、CO₂取り込み活性は野生株とほぼ同じであった。従ってクラミドモナスのCO₂取り込みは、NDHを介在した光化学系I循環的電子伝達反応によって駆動されるラン藻とは異なり、光化学系IIによって駆動されると推定された。その他の変異株や光合成阻害剤の影響の解析も、合わせて報告する。

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Chlamydomonas raudensis (UWO241)は，Lake Bonny（南極）より採取された単細胞緑藻である．南極ドライバレーに位置するLake Bonnyは塩湖であるため，UWO241株は耐低温性とともに耐塩性を有している．我々は、植物プランクトンの光合成機能に培地中のNaCl濃度が及ぼす影響を明らかにするために，耐塩性の低いChlamydomonas raudensis CCMP1619株，およびモデル緑藻であるChlamydomonas reinhardtiiを対照とし，UWO241株の光環境適応能力について調べた．UWO241株は淡水条件では，他の緑藻と同様，暗条件によるステート2誘導を示したが，生育環境に近い700mM NaCl条件下では暗条件においてもステート1に固定されたままであり，ステート遷移を示さなかった．その過程を詳しく調べてみると，NaClを添加直後は一時的にステート2に移行するが，その後ステート1に戻り固定されることがわかった．これらの結果より，培地中のNaCl濃度が，ステート遷移，更に光合成系の光環境適応様式に影響を与えると結論した．地球温暖化による極相においては，極地の氷の溶出に起因した周辺表層海水の塩濃度低下が予測されている．塩濃度変化が植物プランクトンの光環境適応能力に及ぼす影響について考察する．

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造礁サンゴは刺胞動物と褐虫藻の共生体である。この共生システムは熱帯・亜熱帯の貧栄養環境に適応した結果と考えられており、エネルギー獲得はホストサンゴによる捕食よりも光合成に強く依存している。そのため、光合成活性の低下や阻害はホストサンゴそのものの生育に影響を及ぼす。サンゴには共生藻以外にも様々な微生物が常在していることが報告されている。しかし、それらの微生物の生物学的機能や意義についてはよくわかっていない。今回、ラン藻Halomicronema sp.を塊状サンゴGoniastrea aspera骨格内に見いだしたので報告する。沖縄近海で採取した塊状サンゴの表面組織を除去し、骨格内より糸状形態のラン藻を分離培養した。単離されたラン藻の特徴は、1)直径約1μm、2)異質細胞を形成しない、3)光合成色素としてChl aのみを有するであった。16S rDNA解析の結果、高塩性の池の微生物マットから分離されたHaromicronema属の一種であることがわかった。Haromicronema sp.と宿主サンゴの生物学的相互作用について、共生関係の観点から考察する。

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冷温帯域に生育する落葉広葉樹であるブナは、その林相や更新状態が太平洋側と日本海側で大きく異なっている。この太平洋型および日本海型のブナ稚樹を、明所（相対照度40％、直射光が連続して1日数時間入射）と暗所（相対照度10％、直射光の入射はほとんどない）に移して生育させたところ、明所で生育させた日本海型ブナでのみ葉の色が黄色味を帯びる現象がみられた。これら太平洋型と日本海型ブナを8月に採取し、葉の光化学系特性を各処理間で比較した。明所・日本海型ではD1タンパク量が低下し、その結果Fv/FmやETRも低下した。また、in vivoでのP-700測定から、intersystem electron pool sizeが大きく、循環型電子伝達によるP-700の還元が遅かったが、明所・太平洋型ではETRも高く維持され、intersystem electron pool sizeが小さく、循環型電子伝達によるP-700の還元は速かった。さらに、チラコイドを抽出し蛍光誘導期現象を測定したところ、明所・太平洋型では系IIαセンターの割合を増加させることで強光環境下に順化するのに対し、日本海型ではその能力が弱いことが示された。これらの結果から陰樹であるブナは、光化学系の強光順化能の違いにより、太平洋型では強光環境下でも順化する高い能力を備えているが、日本海型では順化能が低く、継続して入射する太陽光により強光阻害が起き、葉の寿命も短くなっていたと考えられる。

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ラン藻は窒素含量が高く（C:N=5），その獲得と同化に多くのエネルギーを使っている．そのため窒素の過剰，欠乏や窒素源の変動に対する遺伝子発現の応答は，ラン藻の環境適応の中でも主要な位置を占めており，窒素の獲得や代謝に関与する数多くの遺伝子が転写制御因子NtcAによって窒素栄養条件に応答して制御されることが明らかにされている．さらに新規の窒素応答性の遺伝子を探索するために，我々はSynechococcus elongatus PCC7942と99.7％の相同性のあるSynechococcus elongatus PCC6301のDNAマイクロアレイを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行った．細胞をアンモニア培地で生育させ，硝酸を含む培地に移して20分後の遺伝子発現の変化を解析したところ，硝酸同化オペロン，シアナーゼオペロンやグルタミン合成酵素，アンモニア輸送体の遺伝子など既知の遺伝子群の発現上昇に加え，他にも多くの遺伝子の発現の誘導が観察された．さらに炭素代謝系の遺伝子群の多くが抑制された。これらの変化に対するNtcA遺伝子の寄与を調べた結果を合わせて報告する．

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植物は窒素源として主に硝酸イオンを利用している。我々は相同組み換えによる遺伝子機能解析が容易に行えるヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を材料として硝酸イオン輸送に関する研究を行っており、硝酸イオン能動輸送体の本体であるNRT2の遺伝子5つと、補助的な役割を果たすと考えられているNAR2の遺伝子3つを同定している。今回我々はヒメツリガネゴケゲノムデータベースからの検索を行い、新たに3個のNRT2遺伝子PpNRT2;6、PpNRT2;7、PpNRT2;8を同定した。これらのコードするタンパク質はN末端側親水性領域の一部を欠くという点でいずれもPpNRT2;5によく似ていた。しかし窒素による発現制御を解析した結果、これらの発現様式は硝酸イオンと亜硝酸イオンの添加によって迅速かつ強く誘導されるPpNRT2;5とは異なっていた。PpNRT2;6とPpNRT2;7はPpNRT2;1～PpNRT2;4と同様に硝酸イオンに対して時間的な二相性を持つ応答を示し、PpNRT2;8はPpNRT2;5とは逆に硝酸イオンまたは亜硝酸イオンによって発現量が低下した。また、硝酸イオン存在下の原糸体においてはPpNRT2;3の発現量が他のものと比べて圧倒的に多いことが明らかになり、PpNRT2;3が硝酸イオンの取り込みにおいて主要な役割を果たしていることが示唆された。

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The filamentous heterocystous cyanobacterium Anabaena variabilis harbors three genetically distinct nitrogenases. The conventional Mo-nitrogenase, encoded by nif1, expresses in the absence of a fixed nitrogen source when Mo is available. The V-nitrogenase encoded by vnf accumulates under Mo deficient condition in the presence of V, whereas, nif2 coding for another Mo-nitrogenase is expressed in vegetative cells only, under anaerobic condition. We report here the expression of the nif1 and vnf in heterocysts. Using reporter genes gfp and bfp, we have constructed 3 kinds of transcriptional fusion nif1-gfp-Ω, vnf-bfp-C.K3 and nif1-gfp-Ω-vnf-bfp-C.K3 in the shuttle vector pRL25C. The resulting vectors were transformed into the host cell with the help of conjugative plasmid RP4 by triparental mating method. The in situ expression of nif1 and vnf was detected by observing the over-expression of GFP and BFP under the regulation of a variety of environmental factors.

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近年、動物細胞だけでなく植物細胞においても一酸化窒素（NO）の生理作用が注目されてきている。これまでに植物においてNOは病害抵抗性獲得や気孔の開閉、花成誘導時期の制御等多岐の生理現象に関与する事が報告されているが、その分子機構はあまりよく分かっていない。我々は高等植物におけるNOの生理作用およびその分子機構解明に向けて、Deinococcus radiodurans由来のNO合成酵素（DrNOS）遺伝子を恒常的に過剰発現させたシロイヌナズナ(cDrNOS)を作製して研究を進めている。cDrNOS株はロゼッタ葉の小型化や花茎の伸長抑制、副花序の伸長時期の促進が見られた（第46回日本植物生理学会年会）。今回、マイクロアレイ解析によりcDrNOS株のロゼッタ葉における約25,000遺伝子の発現様式を調べ、野生株と比較したところ、432個の遺伝子（144個で増加、288個で減少）で発現量に顕著な変動が見られた。発現量の顕著な変動を示した遺伝子のNO初期応答性を調べるため、Aspergillus nidulans由来のエタノール応答プロモーターを用いてエタノール誘導で一過的にDrNOS遺伝子を過剰発現させるシロイヌナズナ(iDrNOS)を作製し、DrNOS遺伝子発現後の短時間における発現変動を現在解析している。そこで、iDrNOS株の特性とiDrNOS株におけるNO応答性遺伝子の発現様式について発表する。

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これまでに、圃場で生育したサツマイモの窒素集積量の最大30%程度が窒素固定に由来することを報告した。本報告では、サツマイモに感染しているエンドファイト窒素固定菌のnifH遺伝子をPCRにより増幅し、その塩基配列の解析を行った。
中央農業総合研究センター圃場で栽培したサツマイモより、葉、葉柄、茎、塊根を採取し、DNAおよびRNAを抽出した。2組のディジェネレートプライマーによるnested PCRによりnifH遺伝子断片を増幅し、既報の細菌のnifH遺伝子との相同性を検索した結果、葉柄のDNAからはBradyrhizobium japonicum、Paenibacillus azotofixans、茎のDNAからはAnabaena variabilis、Herbaspirillum seropedicae、Anabaena 7120、Nostoc commune、また塊根のDNAからはRhizobium leguminosarum、B.japonicumのnifH遺伝子と高い相同性を示す遺伝子断片が得られた。また茎ではBradyrhizobium sp. および未分離の窒素固定菌、塊根では未分離の窒素固定菌と高い相同性を示す遺伝子断片の発現が認められた。これらのことから、サツマイモ体内には複数の窒素固定細菌が感染しており、植物の各部位で菌の種類が異なることが示唆された。

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マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定は、相互の複雑なシグナルのやり取りによって成立する。ミヤコグサはマメ科のモデルとしてゲノム解析が進行中であり、その情報を利用して根粒菌からのシグナル受容や根粒形成初期のシグナル伝達の鍵となるいくつかの遺伝子が単離されている。しかしながら、根粒形成と共生窒素固定成立のメカニズムの全容は、未だ解明されていない。SAGE法 (Asamizu et al. 2005) やcDNAアレイ (Kouchi et al. 2004) による根粒形成過程のトランスクリプトーム解析により、根粒形成初期から窒素固定能を持つ後期の根粒で発現誘導される転写因子が20種類見出された。本研究では、これらの転写因子の根粒形成に果たす役割を調べるため、いくつかのアプローチにより機能解析を進めている。下流で発現制御を受ける遺伝子群を明らかにするため、毛状根形質転換により作出した転写因子過剰発現根粒を用いたアレイ実験が進行中である。また、ミヤコグサTILLING系統のスクリーニングを進めており、これまでに1種類の転写因子について根粒形成過程に異常を示す変異体が得られている。エチレンやジャスモン酸の根粒菌感染制御に関する役割が指摘されているが、本研究では7種類のAP2/ERFドメインを持つ転写因子に着目して、詳細な発現解析を進めている。

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我々はマイクロアレイ解析によって45個のRLKがシロイヌナズナの花粉/花粉管に発現している事を明らかにしてきた。単一遺伝子の遺伝子破壊株は強い表現型を示さなかったので、更なる遺伝子機能解析のために、姉妹遺伝子間でT-DNA挿入遺伝子破壊株をかけ合わせ、10組の2重遺伝子変異体を作成した。
これまでに、in vitroで野生株に対して花粉発芽率が0%近くまで減少する株が得られた。自家受精時の破壊遺伝子の分離比は異常ではなかったが、1鞘当たりの種子数は中央値を比較すると野生株の半分にまで減少しており、その減少は最初から10個までの花においてより顕著であった。柱頭により少数の花粉しか付かなかった時に花粉発芽伸長の阻害が促進されるのかもしれない。
他に、異常な分離比を示し、2重遺伝子破壊株が得られない株を得た。野生株の雌蕊に対し交雑実験を行ったところ破壊遺伝子は次世代に伝播されず、2重遺伝子破壊をもつ花粉は受精していない事が示唆された。これらの花粉の発芽率はin vitroで極端に減少する事はなかったが、種子数の減少は顕著であったことから受精に関係する遺伝子として重要な役割を担っていると示唆された。

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AtM532は27SrRNAを5.8SrRNA , 25SrRNAにprocessingする因子の一つとして知られている酵母rRNA-processing factor 2 ( Rpf2 ) と相同性を有する。タマネギ表皮細胞を用いた細胞内局在解析でEGFP::AtM532タンパクはRpf2と同様に主に核/核小体に局在することが確認された。遺伝子の発現解析からは転写が活発に行われている組織において高い発現がみられた。AtM532遺伝子のT-DNA挿入遺伝子破壊型形質転換体でT-DNA挿入ホモの個体は胚性致死となった。AtM532遺伝子アンチセンス形質転換体では形態異常が観察され、その表現型はタンパクレベルでのAtM532の減少と関連することが示された。さらに、AtM532遺伝子アンチセンス形質転換体では、野生株と比較すると5.8SrRNAおよび 25SrRNAの前駆体である27SrRNA蓄積量の顕著な増加がみられた。また、酵母two-hybrid法によりAtM532はリボソーム関連タンパク質と相互作用することが明らかとなった。以上の結果は、AtM532がpre-rRNA processing factorであることを強く示唆している。

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植物細胞は核ゲノム以外に細胞内共生に由来する色素体とミトコンドリアにゲノム (オルガネラゲノム)を持つ。オルガネラゲノムは、大半の植物種で雌性配偶子(胚珠)から遺伝する (母性遺伝する)が、両性遺伝する植物種も報告されている。高等植物の雄性配偶子(花粉)は、栄養細胞と雄原細胞から構成される。成熟花粉においてオルガネラDNAをDAPI染色により検出すると、両性遺伝型の雄原細胞にはドット状のシグナルが観察されるが、母性遺伝型の雄原細胞ではシグナルは観察されない。このように、母性遺伝型の花粉では、発生過程におけるオルガネラDNAの消失が細胞レベルで知られており、これがオルガネラDNA遺伝の重要な分子機構の1つであると考えられている。また、栄養細胞のオルガネラDNAも通常のDAPI染色では検出されないので、オルガネラDNA量は花粉において厳密にコントロールされているはずである。我々は、オルガネラの母性遺伝機構及びDNA代謝機構を分子レベルで明らかにする目的で、シロイヌナズナ(母性遺伝型)とタルウマゴヤシ(両性遺伝型)をモデル材料として花粉におけるオルガネラDNAの挙動に異常を示す変異体の単離を目指している。現在までに得られた花粉の観察結果、遺伝解析およびこれらの進展状況について報告する。

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樹木の分子育種において、花芽形成は重要なターゲットの1つである。花芽形成のコントロールや遺伝子組換え樹木の花粉飛散など改変すべき点が数多く残されている。私たちはユーカリの花芽形成の改変を目標とし、花芽形成時に発現する遺伝子の解析を進めている。はじめにユーカリのつぼみからRNAを単離し、このRNAからcDNAライブラリーを作製した。MADS-box遺伝子は花芽形成時に働く転写因子として多くの植物から単離・同定されている。cDNAライブラリーの配列解析からユーカリの花芽形成時には少なくとも14のMADS-box遺伝子が発現していることが確認された。今回はおしべの形成に関わる因子として、これらMADS-box遺伝子のなかからシロイヌナズナAgamous (AG)遺伝子に相同性の高い遺伝子を検索し、3つのAgamous相同性遺伝子を見出し、それぞれEAGL1, EAGL2, EAGL3と名付けた。これら遺伝子の発現は、EAGL1とEAGL2がつぼみで強く発現しているのに対し、EAGL3の発現はEAGL1, EAGL2に比べて弱いものであった。現在おしべが他の器官に変化した（花粉ができない）ユーカリの作出にむけて、RNAiによるこれら遺伝子の発現抑制を行うための遺伝子を構築している。今後はこれらの遺伝子をユーカリに導入し、その効果を調べたいと考えている。

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シロイヌナズナの花成はリノレン酸によって抑制される。低温（15℃）では、野生型植物(Col)は22℃での生育に比べリノレン酸の量が増加し遅咲きとなる。リノレン酸の合成酵素が欠損したfad3,fad7,fad8変異体は低温による花成の遅延が軽減されたことから、低温による花成の遅延はリノレン酸に起因することが考えられる。花成決定因子であるAP1を高発現させた35S-AP1植物は早咲きであるが、その表現型は低温で抑制され、さらにリノレン酸量を高めた35S-FAD3植物との交配によっても抑制されることからリノレン酸がAP1による花成の決定に直接影響することが考えられた。本研究ではap1変異体を用い花成の決定とリノレン酸との関連を調査した。Colを22℃で生育するとリノレン酸量が減少した後にAP1の発現の上昇が見られた。また、ap1変異体の中には野生型Colと比較して、低温よる花成の遅延を受けにくい変異体が認められた。以上からAP1分子にはリノレン酸と直接相互作用する部位があり、その相互作用によってAP1の機能が制御されることが考えられた。

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イネの日長経路を介したシグナル伝達経路において、 Hd3aは短日条件下で開花を誘導する遺伝子とされている。イネのゲノム中には、 Hd3a とアミノ酸で高い相同性を示すFT-L1 (71%), FT-L3 (83%)等の Hd3a様遺伝子が存在する。
これらの3遺伝子について、開花まで10日おきの発育段階別の発現解析を行った結果、短日条件下において、 Hd3a及びFT-L3 の発現は、生殖成長期に移行する開花30日前に上昇した。一方FT-L1は恒常的な発現がみられた。また Hd3a及びFT-L3 は葉身での発現がみられたのに対し、FT-L1は葉身及び葉鞘で発現がみられた。
RNAiを用いて、 Hd3a様遺伝子の機能解析を行ったところ、FT-L3 抑制系統の開花に要した日数は正常型と同様であったことから、開花に関与しない可能性が示唆された。しかし、 Hd3a抑制系統は正常型と比較し、開花が約30日遅延し、開花の30日前で、FT-L1とFT-L3 の著しい発現の上昇がみられた。以上のことから、 Hd3aが存在するときは、FT-L1やFT-L3 は開花制御に関与しないが、 Hd3aの機能が損なわれると、代交して開花制御を担う可能性が示唆された。現在、 Hd3aによるFT-L1とFT-L3 の制御関係についての研究を進めている。

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植物はさまざまな環境要因を感知し、繁殖するために開花を行う最適な時期を決定している。このうち、日長は植物が感知する主要な環境要因の一つに挙げられる。短日植物であるイネは、ある一定以上の長さの暗期を有する短日条件においてHd3a遺伝子の発現が上昇することにより開花が誘導されることがこれまでの報告により明らかにされている。本研究では、栽培イネ(Oryza sativa L.)における光周性開花経路の多様性の解析を行う目的で、栽培イネ64品種から構成されるイネコアコレクションを用いて、短日条件下におけるHd3a遺伝子の発現量および開花日数を調べた。この結果、Hd3a遺伝子の発現量と開花日数の間には負の相関が見られた。さらに、コアコレクションを用いて、短日条件下での『光中断』における反応の多様性についても調べた。光中断とは暗期の中央に短時間の光を与え連続暗期を中断する処理のことで、これまでに当研究室ではHd3a遺伝子の発現が抑制され開花遅延が生じることを明らかにしてきた。この結果、ほぼ全ての品種において光中断によるHd3a遺伝子の発現抑制が見られ、光中断による開花遅延は栽培イネにおいて普遍的な現象であることが示唆された。本研究では、イネコアコレクションを用いた実験から、栽培イネにおける光周性開花経路の分子機構の多様性について考察する。

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INDETERMINATE1（ID1）遺伝子は、トウモロコシの花成を制御する。ID1によりコードされるタンパク質（ID1）は4つのジンクフィンガーを持っており、転写因子と考えられる。我々は、ID1が4つのジンクフィンガーのうち2つ（2番目と3番目）で11塩基の結合配列に特異的に結合することを示した。また、ID1は、植物にのみ存在する遺伝子ファミリーを形成しており、ファミリー間ではジンクフィンガーを含む約200アミノ酸の領域（IDドメイン）が保存されていることを明らかにしている。
IDのファミリー遺伝子は、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシでそれぞれ16、15、13遺伝子確認されているが、そのファミリー間でIDドメインを比較すると、1番目と2番目のジンクフィンガーの間に、ID1には他のファミリーにはみられない25アミノ酸の挿入配列が存在している。
我々は、ID1の転写因子としての機能を明らかにするために、酵母を用いてID1の転写活性測定を行った。ID1の機能部位の解析とともに、ID1に特徴的な1番目と2番目のジンクフィンガーの間に存在する挿入配列が、何らかの機能を持つのかについても検討したので、その結果を報告する。

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ウキクサは長日型(Lemna gibba G3)・短日型(L.paucicostata 6746)の光周性を示す2種を同属内にもつ光周性の研究をする上で興味深い植物である。これまでに私たちはシロイヌナズナで光周性に密接に関係している時計関連遺伝子（CCA1/LHY、APRR、GI、ELF3）のホモログをウキクサから単離した。そこでこれらのホモログの機能解析を目指した。私たちはウキクサを用いた発光レポーター系による簡便な遺伝子発現解析法を確立した。パーティクルガンを用いた一過的な遺伝子導入により、シロイヌナズナの時計関連遺伝子CCA1とTOC1のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を繋げたレポーターコンストラクトをウキクサに導入したところ、連続明条件下で継続的なリズムをモニターすることが出来た。さらにウキクサから単離された時計関連遺伝子ホモログの過剰発現コンストラクトやRNAiコンストラクトをレポーターコンストラクトと混合して導入することにより、ホモログの機能解析が出来る系を開発した。これらの系を用いてウキクサの時計関連遺伝子ホモログが概日時計に与える影響を調査するとともに、シロイヌナズナでの機能と比較検討したのでこれを報告する。

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シアノバクテリアの概日時計はKaiA、KaiB、KaiCの3種類のタンパク質で構成されている。この振動体は転写とは独立に働いているが、転写制御システムは概日時計の影響を強く受けている。転写のシステムの時間的制御を明らかにするために、系統的で高時間分解能の遺伝子発現プロファイルを得ることを試みた。環境変化を含む様々な条件下で生細胞のまま個々の遺伝子発現変動時間スケールに注目して解析することを目的とする。Synechococcus elongatus PCC 7942のゲノムで予想されたORFの0.6-1.2kbp上流の領域を<プロモーター>として生物発光レポーターを作製した。レポーター株の生物発光は多検体自動生物発光測定装置（24チャンネルPM管）を用いて自動的に測定した。最初の段階としてゲノムの一領域（約130kb）に含まれる124のORF（全ゲノムの約5％）のレポーター株の解析を行った。さまざまな光・温度条件下でそれらの生物発光を解析した。また概日時計の転写に与える影響を観察するために野生型と概日時計欠損変異体との間で生物発光の変動様式を比較した。プロモーター活性の時間的な特徴及び分類について報告する。

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シアノバクテリアは、概日時計を持つ最も単純な生物である。時計タンパク質KaiA, KaiB, KaiCは、シアノバクテリアの時計機構に不可欠な機能を持つ。Synechococcus elongatus PCC 7942を利用した最近の解析から、KaiCのリン酸化がシアノバクテリアの概日時計の中心振動体であることが明らかになった。従って当然予想されるようにシアノバクテリアの時計機構の中枢であるkaiC 遺伝子の変異は、周期、位相、振幅などさまざまなリズム異常を引き起こす。シアノバクテリアではPCRエラーを利用してkaiC 上にランダムに点変異を導入し、それを生物発光で選別することができる。そこで、安定した24時間の概日振動を発生するメカニズム解明の手がかりとすることを目的とし、より多くのkaiC 変異体について、Kaiタンパク質間相互作用やkaiBC 発現レベル、温度や光照度の環境要因の効果等を解析した。約900クローンのkaiC 変異体を作製し比較した結果、変異体の表現型からKaiC上に周期長の決定に関与する領域があることが示唆された。また光照度、温度の変化による周期の変動や、暗パルスによる位相変位と変異部位の相関についても調べた。今回は時計の生理学的性質に影響を及ぼす多数の変異体の解析から示唆される点を報告するとともに、こうした変異がKaiCリン酸化サイクルに及ぼす影響を報告する。

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シロイヌナズナのオーキシン非感受性優性突然変異体massugu2（msg2）の原因遺伝子は、29個あるAux/IAA遺伝子のIAA19をコードしている。遺伝子族間の特異性を明らかにするために、分子系統樹でMSG2/IAA19とは異なるクレードに属し、かつ優性変異を持つaxr2/iaa7やslr/iaa14とMSG2プロモーター（pMSG2）の融合遺伝子をシロイヌナズナに導入し観察した。その結果、MSG2プロモーター特異的な制御とそれぞれのタンパク質特異的な形態変化の両方があることがわかった（武藤ら、2005年度年会）。興味あることに子葉を片方、又は両方欠失している個体がpMSG2:axr2とpMSG2:slrで3割出現した。これはmsg2-1やaxr2-1やslr-1優性突然変異体では見られない、新規の形態変化である。pMSG2:GUSが心臓型胚の子葉原基で発現することから、axr2やslrの異所発現が子葉形成に影響を及ぼしたと考えられる。このことは優性突然変異を持つmsg2-1タンパク質が子葉原基で発現しても、子葉形成に異常を起こさないメカニズムがあると考えられ、新しいAux/IAAタンパク質の役割が示唆される。現在、このメカニズムを明らかにするため、msg2-1種子にさらに突然変異誘導をかけたM₂種子で子葉を欠損する変異体をスクリーニング中である。

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高等植物の胚発生は、多くの遺伝子が時空間的に精密な発現制御を受けることによって引き起こされる。こうした胚発生関連遺伝子の発現制御については、トランス因子やシス配列などの転写因子に着目した研究が進められている。近年、動物における研究から、胚発生時にゲノムDNAのメチル化レベルが大きく変動し、DNAのメチル化を介した遺伝子発現制御機構が存在することが示唆されている。しかし、高等植物においては、DNAのメチル化と胚発生機構を関連づける知見は胚乳形成に関わるもの以外ほとんど報告されていない。
本研究では、シロイヌナズナを材料に用い、DNAのメチル化に関連する遺伝子の発現解析とその遺伝子破壊株における胚発生関連遺伝子の発現解析を通じて、DNAのメチル化が高等植物の胚発生制御に関与しているか否かの検討を行った。DDM1、CMT3、MET1、DRM をはじめとするDNAメチル化関連遺伝子の器官・組織別発現解析を行った。次いで、これらのDNAメチル化関連遺伝子の破壊株を用い、LEC1、ABI3、FUS3等の胚発生関連遺伝子の発現解析を行ったところ、一部遺伝子において野生型と異なる発現パターンを示すものが見い出された。これらの結果を示しつつ、DNAのメチル化と高等植物の胚発生の関連について考察する。

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