光化学系Iサイクリック電子伝達は、NADPHの蓄積なしにΔpHを形成しATPを合成する。しかし、発見以来、その生理的重要性ははっきりしなかった。本研究室では、シロイヌナズナの変異株の解析から、この電子伝達が光合成と葉緑体の光阻害回避の両方に必須であることを明らかにした。また、高等植物のサイクリック電子伝達においては、アンチイマイシンA感受性のフェレドキシンからプラストキノンへの電子伝達が関与するPGR5(PROTON GRADIENT REGULATION 5)タンパク質依存の経路が主要経路であると考えられている。しかし、低分子のチラコイド膜タンパク質であるPGR5の役割や詳細な電子伝達経路は明らかにされていない。本研究では、サイクリック電子伝達の機能が単子葉植物で作物であるイネにおいても保存されているかを検討した。イネにおいてもPGR5遺伝子は高度に保存されており、RNAi法によりノックダウン株を作製した。ノックダウン株はグロースチャンバーの環境で野生株同様の生育を示したが、光合成電子伝達とNPQの誘導は大きく影響を受けていた。シロイヌナズナ同様、イネにおいてもサイクリック電子伝達の重要性とPGR5タンパク質の機能は保存されていることが考えられる。

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クロロフィル蛍光法は光化学系2で吸収された光エネルギーのうち光合成電子伝達に利用されたエネルギーの割合（電子伝達の量子収率、Φ2）を簡単に算出する方法として、生理生態学分野で広く利用されている。クロロフィル蛍光測定において、吸収された光エネルギーのうち、電子伝達に利用されなかった部分（1-Φ2）は、蛍光パラメータNPQに相関した熱放散および、コアアンテナと反応中心でのクロロフィル脱励起にともなう熱放散として計算される。これらの光エネルギー分配の測定の多くは屋内栽培の植物体を用いた解析であるため、圃場レベルでの植物体におけるエネルギー利用を理解するには不十分である。そこで、我々は屋外で生育されたイネにおける、光化学系2に吸収された光エネルギー分配について、Hendrickson et al. (2004)のモデルに基づく定量化を試みた。梅雨明けの7月から穂の実る9月までの間、水田ほ場で栽培している日本晴植物体におけるクロロフィル蛍光解析を日の出から日の入りまで行うことにより光エネルギー利用及び熱放散の周日変化、一日単位でのエネルギー利用率を算出した。同時に、明反応制御機構のうち光阻害についての周日変化についても測定し、光阻害の誘導条件、および光阻害のエネルギー利用効率に与える影響について考察し、屋内実験との比較検証を行った。

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イネ（あきたこまち）では、幼苗全体を10°C前後の低温に1週間程度さらしても可視的な障害は起こらない。しかし地上部だけを10°Cの低温にさらし、地下部は25°Cに保っておくと、2、3日の低温処理中に葉の変色、脱色、枯死等の可視的障害が起こる（12h明期-12h暗期の場合）。暗黒条件でも低温処理後の光により障害が誘発される。この障害に先立ち、光の有無に関係なく24時間以内に光化学系IIと光化学系Iの間の電子伝達の遮断が起こり、光化学系Iの循環的電子伝達能力が失われることを明らかにしてきた。今回暗条件下で低温処理中の幼苗を用いてより詳細に比較検討したところ、地上部だけ1日以上低温処理した幼苗の葉では、光に関係なく光化学系IIのQ_AとQ_Bの間の電子伝達能が喪失することを確認した。そこに光が当てても光化学系Iへの電子伝達、光化学系Iの循環的電子伝達、チラコイド膜内外のプロトン濃度勾配の形成、光依存性のzeaxanthin濃度の上昇のいずれも起こらないことがわかった。根も葉も同時に低温処理した場合はこれらが起こることを考えると、高地温に特異的なこの低温障害での最初の障害はQ_AとQ_Bの間の電子伝達の遮断で、その結果熱放散能が喪失し、光照射下で活性酸素等により枯死等の可視的な障害を引き起こすものと考えられる。

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チオレドキシン(Trx)は、細菌から高等動植物までほぼ全ての生物の細胞に普遍的に存在する蛋白質である。Trxは、システイン残基のチオール基を介して、ジチオール・ジスルフィド交換反応により標的蛋白質中のジスルフィド結合を還元することで標的タンパク質の活性を調節する。二次元電気泳動法とチオレドキシンアフィニティークロマトグラフィー法により、これまでに多くの標的タンパク質の候補が挙げられてきたが、生化学的な確認まで行われたタンパク質は、まだ少ない。シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803のカルビン・ベンソン回路のPhosphoglycerate kinase(PGK)も、このようなTrxの標的タンパク質候補である(Pérez-Pérez, M. E, et al. (2006) Proteomics. Suppl 1:S186-195)。私たちは、組換体PGKを調製し、Trxによって活性調節を受けること、分子内のジスルフィド結合がTrxによって酸化還元制御を受けることを明らかにした。また、システイン残基をアラニン残基に置換した組換体の結果から、この制御に関わるシステインについても考察した。さらに、この制御が生理的条件で行われるかどうかを、生細胞を用いて調べた。以上の結果から、PGKがTrxによって制御される新規のチオール酵素であることを報告する。

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ステート遷移は、光合成電子伝達反応を駆動する光化学系I（PSI）と光化学系II（PSII）の間の励起エネルギー分配を調節する機構である。PSIの外縁部に存在するサブユニットの一つであるPsaLは、シロイヌナズナではステート遷移に関与すると報告されているが、機能の詳細は不明のままである。PsaLのステート遷移における役割を明らかにするために、我々は高等植物に比べてステート遷移活性の高い緑藻クラミドモナスからRNAiによるPSALノックダウン株（PsaL-RNAi株）を作製し、解析を行ってきた。PsaL-RNAi株の細胞を、ステート1および2の誘導条件下で培養し低温蛍光スペクトルを測定したところ、ステート1ではcw-15（コントロール株）と差が無かったが、ステート2ではPSIの蛍光収率が大きく低下していた。次に、ステート2条件で培養した細胞からチラコイド膜を単離し、ショ糖密度勾配遠心によってクロロフィルタンパク質を分離したところ、PsaL-RNAi株ではPSI-LHCI/II超分子複合体を含むA3’画分が著しく減少していた。これらの結果は、PsaLがステート遷移の、特にPSI-LHCI/II超複合体の形成において重要な役割を果たしていることを示している。現在、PsaLの生理学的役割について調べるために、様々な光条件におけるPsaL-RNAi株の生育を解析している。

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気孔開度制御に関わる環境要因の一つにCO₂があり、高CO₂では気孔が閉じ、低CO₂では気孔が開く。CO₂による気孔開度の制御機構を解析するために、環境制御下で葉片および剥離表皮の気孔の挙動を顕微鏡観察するためのシステムを構築した。システムの試料用チェンバーは、2個の真鍮ブロック（45 x 55 x 10 mm）を重ねたもので、両面はガラス張りである。恒温槽からの水をブロック内に循環させることで温度を厳密に制御できる。試料を載せた濾紙をブロックにはさみ、チェンバー外で緩衝液に浸すことで、試料の乾燥を防ぐとともに、剥離表皮のアポプラスト液組成制御も可能である。マスフローコントローラーによりチェンバーに流す気体の組成を、ペルチエ素子を用いたコンデンサで露点を自由に制御できる。試料の温度は熱電対で、チェンバー通過後の気体のCO₂濃度・露点は赤外線ガスアナライザでモニターする。顕微鏡ステージにチェンバーを置き、長作動距離の対物レンズを用いて観察する。この対物レンズ周りに取り付けた照射ムラの小さなリングライトガイドで試料を照射する。照射光の光質も可変である。CO₂による気孔開度制御に葉肉組織由来のシグナルの関与が示唆されているので、まずは斑入りツユクサの剥離表皮を葉肉組織に載せたときの気孔の挙動を観察している。このシステムを用いることでシグナルの生成条件・化学的性質が解明されると期待している。

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クロロフィルは光合成の中心的な役割を持つ分子である。一方、遊離クロロフィルやクロロフィルの合成や分解の中間体は、活性酸素を生成する危険な分子でもあるため、安全な分子へと変換される必要がある。このようなクロロフィル代謝経路を担う酵素のほとんどは、すでに単離、同定されている。しかし、クロロフィル分解の最初のステップであるクロロフィルb からクロロフィルa への転換のうち、7-ヒドロキシメチルクロロフィルa からクロロフィルa への反応を触媒する酵素は未だ同定されていなかった。
そこで私たちは、7-ヒドロキシメチルクロロフィルa を蓄積するシロイヌナズナの変異株の原因遺伝子産物の生化学的解析を行った。この原因遺伝子産物を大腸菌で発現させ、精製したものをサンプルとして用いた。解析の結果、このタンパク質はFAD及び鉄分子を保持していた。また、アミノ酸配列の解析から、このタンパク質は鉄-硫黄クラスターを持っていることが示唆された。さらに、この精製タンパク質を用いて酵素学的解析を行ったところ、フェレドキシンから受け取った還元力を利用して7-ヒドロキシメチルクロロフィルa をクロロフィルa へ転換する反応を触媒することが示された。このことから私たちは、この遺伝子産物が7-ヒドロキシメチルクロロフィルa 還元酵素であると結論付けた。

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植物はLHCIIの量を調節することで光合成のアンテナサイズを制御し、様々な光環境に適応している。LHCIIの分解の最初のステップは、クロロフィルb還元酵素によるクロロフィルbから7-ヒドロキシメチルクロロフィルaへの転換反応である。そのため、クロロフィルb還元酵素がアンテナサイズの調節と密接に関わっていることが考えられる。本研究では、LHCIIの減少が必要な強光に対する適応に焦点をあて、二種類のクロロフィルb還元酵素（NYC1、NOL）の役割を調べた。実験にはWT、nyc1変異体、nol変異体、nyc1/nol変異体を使用した。これらの植物に強光ストレスを与えると、WTとnol変異体ではLHCIIが分解され、クロロフィル量も減少した。また光合成活性は低下が見られたもののある程度保持され、アントシアニンの蓄積も見られた。これらの実験によりWTとnol変異体は強光に適応することが示された。しかし、nyc1変異体やnyc1/nol変異体では、LHCIIの分解が抑制され、光傷害によって枯死した葉が観察された。このようにnyc1変異体とnyc1/nol変異体は強光に適応出来ないことが明らかとなった。これらの結果から強光ストレス下ではNYC1が重要な役割を果たしていることがわかった。さらに強光に対する適応機構の解析を詳細に行ったので報告する。

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光合成生物には集光性アンテナ色素タンパク質複合体が存在し、生育環境に存在する様々な波長の光を吸収して、光誘起電子移動反応の起こる反応中心へと励起エネルギーを伝達する。酸素発生型光合成生物の中で最も始原的な藍藻は、光捕集アンテナ複合体としてフィコビリゾームを持つ。フィコビリゾームは、クロロフィルでは吸収できない可視領域の光を吸収し、クロロフィルにエネルギーを伝達する機能を持つ。
本研究では、様々な光環境下で培養した藍藻Arthrospira (Spirulina) platensisについて、ピコ秒時間分解蛍光分光法により励起緩和ダイナミクスの観測を行った。光環境の違いによって生じる光捕集過程やエネルギー移動過程（フィコビリゾーム内エネルギー移動、フィコビリン→クロロフィルエネルギー移動、クロロフィル間エネルギー移動）の変化について、藍藻A. platensisの光環境適応の観点から議論する。

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植物の強光適応機構の一つであるキサントフィルサイクルに関わるビオラキサンチン、アンテラキサンチン、ゼアキサンチンの3種の色素は、数時間から数日の強光照射への順化過程において、プールサイズ（3種の色素の総量）が増加することが知られている。光合成電子伝達鎖は強光条件下では還元型になり、これまでに、光化学系の反応中心タンパク質遺伝子はプラストキノンの酸化還元状態によって転写調節されていることが報告されている。このことから、電子伝達鎖の酸化還元状態が、キサントフィルサイクル色素のプールサイズの調節機構にも関与している可能性を考えた。そこで、シロイヌナズナ培養細胞に低濃度のDCMUを添加し、光合成電子伝達鎖を、光の強度に依存せずに酸化型に調節して、色素とその合成酵素の発現への影響を調べた。その結果、DCMUを添加した細胞は強光で培養したにも関わらず、プールサイズの増加が見られなかった。さらに、強光において転写量が増加する、キサントフィルサイクル色素を合成するβ―カロテンヒドロキシラーゼ（chy1、chy2、lut5）の転写量の増加が見られなかった。これらの結果より、キサントフィルサイクル色素のプールサイズの調節には、電子伝達鎖の酸化還元状態が関与している可能性が示された。現在、DBMIBを用いて、電子伝達鎖を還元型に調節し、プールサイズ及び色素合成酵素の発現について解析中である。

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高等植物には光化学系II (PSII) 酸素発生系の構成タンパク質であるPsbPに加えて、複数のPsbPパラログ (PsbP-likeタンパク質:PPL, PsbP-domainタンパク質: PPD) が存在する。このうち、PPL1タンパク質は、その配列からシアノバクテリアのPsbPホモログ (cyanoP) に最も近いホモログであると考えられる。これまでに我々のグループではシロイヌナズナppl1変異株を用いた解析により、PPL1が強光照射下においてPSII修復過程に関与する因子であることを明らかにした (Ishihara et al. 2007, Plant Physiol 145, 668-679)。しかしながら、PSII修復過程におけるPPL1の分子機能は明らかではない。今回、新たにPPL1の発現が抑制されたRNAi株 (ppl1i株) を作製し、その表現型を解析した結果、ppl1i株ではPPL1発現レベルに応じた強光感受性が示された。また、ショ糖密度勾配遠心法によりチラコイド膜タンパク質複合体を分離し、分画したサンプルをSDS-PAGE/Immunoblot により解析した結果、PPL1は比較的比重の重い画分で検出され、何らかの複合体と相互作用することが示唆された。現在、PPL1の発現抑制の影響とタンパク質相互作用の実態を明らかにすべく研究を進めている。

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光合成において過剰な光エネルギーは光化学系IIに障害をあたえ、光合成機能の低下を引き起こす。これを回避するため、光化学系IIでは障害をうけたD1タンパク質を直ちに分解／修復し、系全体の機能維持を行っている。これまでの研究から、光化学系II修復サイクルでのD1分解には、チラコイド膜に局在するATP依存型メタロプロテアーゼFtsHと幾つかのATP非依存型セリンプロテアーゼDegの関与が示されている。またFtsHはD1の末端部を認識してプロセッシブにD1を分解し、DegはD1の膜外に出ているループ部分を切断することが示唆されている。しかしながら、これらプロテアーゼが協調的に働くのか、個別にD1分解に寄与しているのかは未だ明らかにされていない。本研究では、FtsHとDegによるD1分解の詳細を明らかにするために、FtsH及びDegを欠損する変異体を用いて解析することとした。これまでにFtsHプロテアーゼ複合体を欠損したシロイヌナズナ変異体var2とチラコイド内腔側でD1切断に寄与するDEG5ならびにDEG8を欠損したdeg5 deg8をかけ合わせvar2 deg5 deg8三重変異体を作成しており、この三重変異体における解析結果を報告する。

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好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus vulcanus（57℃培養）から精製した光化学系II反応中心色素タンパク質複合体 (PSII) 2量体をナノメートルサイズの内径をもつ、シリカメソ多孔体SBA内部に吸着させ、シリカガラス内での光反応を実現した*。PSII 2量体は20nmの直径、70クロロフィル分子、756kDaの分子量をもつ。平均内径が23nmと15nmの2種のSBA23とSBA15に各々4.7mg と15mgのPSIIが吸着した。共焦点顕微鏡測定から、SBA23の内部と外側両方に, SBA15では外側のみにPSIIが吸着することが示された。PSII-SBA23共複合体は、溶液内のPSIIとほぼ同様の高い酸素発生活性を、室温間欠光照射（3min明6min暗）-フェイルパラベンゾキノン追加条件下で3時間以上、暗所40℃条件では2日以上にわたり示した。一方、PSII-SBA15の酸素発生比活性は低かった。これにより、シリカ細孔内に単分子的にとりこまれたPSIIが、水から電子を取り出し、酸素分子を放出し、フェニルパラベンゾキノン還元を安定、高能率に進め得ることが示された。この手法は人工光合成や光機能素子の新手法となりえる。異なる光反応性タンパク質複合体とシリカ細孔の組み合わせを議論する。
*Noji,T.ら Lungmuir (2010) 印刷中

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光化学系IIは強光に対して感受性が高く、容易に失活する。この現象は光阻害と呼ばれ、そのメカニズムに関して多くの仮説が立てられてきた。その大半は、強光下で発生する活性酸素（とくに一重項酸素）による光化学系IIの損傷を根拠とするものであった。しかし近年、光阻害を光損傷と修復という2つのプロセスに切り離して再検討され、従来の説とは異なる新たなメカニズムが提唱された。新たな説では、光損傷は活性酸素に依存せず、酸素発生系の光吸収と崩壊によるものであり、修復の過程が活性酸素によって阻害されることが示唆されている。
本研究では、新たな説を検証するため、一重項酸素の消去剤であるα-トコフェロールを欠損したSynechocystis sp. PCC 6803の変異株を用いて、光化学系IIの光阻害を解析した。この変異株では、光阻害が促進したが、クロラムフェニコール存在下における光損傷の速度はまったく影響を受けなかった。一方、修復速度は低下していた。さらに、修復に必要なD1タンパク質をはじめ、多くのタンパク質の新規合成が抑制されていた。これらの結果から、α-トコフェロールは、強光下でタンパク質合成を保護することによって修復を促進し、光化学系IIの光阻害を緩和していることが示唆される。したがって、一重項酸素はタンパク質合成を抑制し、光化学系IIの修復を阻害することが考えられる。

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渦鞭毛藻はサンゴ共生藻や赤潮藻として海洋生態系で重要な地位を占める酸素発生型光合成生物である．渦鞭毛藻の葉緑体は褐藻や珪藻などと同様に紅藻に由来すると言われているが，その葉緑体ゲノムは独自の進化を遂げている（一遺伝子ずつを搭載するミニサークル構造や核移行の進行）．我々はこれまでに，渦鞭毛藻の光化学系2複合体を構成するコアタンパク質の遺伝子(psbA, psbD)について詳細な解析を進め，ミニサークル構造や共存するバリアントの奇異な構造とその生成機構，転写産物においては多数のRNA編集部位の存在，などの実態を解明してきた．一方，塩基配列から推測された一次構造では，渦鞭毛藻に特異的な変異（アミノ酸置換や疎水度の変化）が見いだされ，その一部についてこれまで報告してきた．本発表では，他のサブユニットの配列解析の結果も含めて、渦鞭毛藻の光化学系2複合体の構造の特徴を検討した結果を報告する．

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緑藻クラミドモナスには光化学系1に結合するアンテナ複合体（LHCI）が9種類（Lha1-9）存在する。これは高等植物に見出された4種類より多く，多量のLHCIが光化学系1に結合する構造は十分に解明されていない。本研究ではこれまでに作製もしくは入手したLhca1-9に対する抗体を用いてLHC変異株（BF4）とクロロフィルb欠損株（ΔChlb）に蓄積するLHCの存在を詳細に解析し，LHCIの構造の解明を試みた。BF4株は黄緑色の細胞でLHCIをほとんど蓄積せず，Lhca5とLhca6だけが多少検出された。一方，ΔChlb株のLHCI蓄積は著しく少なかったが，生育時の光条件によりその組成は変化した。弱光下ではLhca2が少し検出され，通常の光照射下ではLhca9が正常に蓄積した。興味深いことに，これらの変異株ではLHC近傍に存在する光化学系1サブユニットの蓄積も大きく減少した。LHCIオリゴマーの両端に存在するPsaKとPsaGは，BF4と弱光下で生育させたΔChlbではほとんど検出されなかったが，通常の光照射下で生育させたΔChlbには蓄積した。一方，LHCIのルーメン側に結合するPsaNはいずれの場合でも大幅に減少した。以上の結果から，光化学系1複合体に結合するLHCIの構造について議論する。

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光化学系II(PS II）反応中心クロロフィルP680の酸化還元電位はおよそ+1.2 Vと高く、極めてユニークな存在である。 他と比べても光化学系I（PSI）反応中心P700や紅色細菌反応中心P870では+0.5 VとPSIIの酸化還元電位は非常に高い事が分かる。 P680+の高い酸化還元電位の理由を明らかにするために、PSII反応中心(PSII RC)を用いた研究がこれまでに様々行われている。CW-ENDOR法では、82 %の電子スピンが1つのChl上に非局在化しているという結果が得られている。 またFTIR法では電荷分布が2つのChl上に等しく非局在化しているという結果が報告されている。
今回の実験では2パルスESEEM法と3パルスESEEM法を用いてPSII RCのP680+の信号を得る事が出来た。解析結果から2.7と2.0 MHzの窒素核由来の超微細構造定数(hfc)を得ることができた。ESEEM法により得られたChl a+のhfcの値と比較すると70~85 %程度減少しているという結果が得られた。これはP680+の電子スピンは1つのChl上に70~85 %に非局在化していると意味する。ChlZ+の信号と比較し解析結果を報告する。

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光化学系II複合体(PSII)の構造はこれまで3.8-2.9 Å分解能で報告されてきたが、これらの分解能は、酸素発生を触媒しているMn4Caクラスターの詳細な構造を解明するには不十分であった。我々は、PSII結晶の質を改善し、その構造を分解能1.9 Åで解析することに成功した。その結果、電子密度マップから4つのMn, 1つのCa原子の位置を確定し、それらの金属原子をつないでいる酸素原子を5つ同定した。得られたMn4CaO5クラスターの構造は、ゆがんだイスのような形を取っており、3つのMn, 1つのCa原子と、4つの酸素原子がゆがんだキュバン構造を作りイスの腰かけ部となり、1つのMnと1つの酸素原子がキュバンから離れてイスの背もたれ部を形成している。背もたれ部にあるMn原子と、Ca原子にそれぞれ2つの水分子が結合しており、その一部が水分解反応の基質となることが示唆された。我々はさらに4つのMn, 1つのCa原子のすべての配位子を決定し、そのうち、すべてのMn原子は6配位であり、Caは7配位であることを明らかにした。これらの結果は、PSIIにおける水分解・酸素発生反応の機構を解明するのに重要な構造的基盤を提供するものである。

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KODA （9,10-ketol-octadecadienoic acid）は、アオウキクサの花成に関するストレス誘導性の生理活性物質として単離され、アサガオ品種ムラサキ(Pharbitis nil cv. Violet)にも花成促進効果がある。カーネーション、トルコギキョウ、リンゴなどにおいても同様の効果が報告されているが、KODAの作用機構は明らかではない。その理解は、花成機構を研究する上でも、またKODAの実用を考える上でも重要である。アサガオの芽生えに弱い花成を誘導する1回の12時間暗期の前後に100 μMのKODAを散布することにより花芽形成数は増加した。この花芽数の増加は、着蕾した節が下がったことによるものであった。花成のマーカー遺伝子の発現をRT-PCRにより調べた結果、子葉におけるPnFT (FLOWERING LOCUS T)には変化が無かったが、頂芽におけるPnAP1(APETALA1)の発現上昇が約2時間早まり、PnTFL1b(TERMINAL FLOWER 1b)の発現低下も同様の傾向を示した。以上の結果から、KODAはPnFTの転写より後からPnAP1の転写までの間で、花成を促進することが明らかになった。

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絶対的短日植物であるアサガオの品種ムラサキ（Pharbitis nil cv.Violet）は、光周性花成誘導研究のモデル植物であり、播種後7日目の子葉の段階で16時間の暗期を一回与えることにより花成を誘導できる。我々はアサガオの子葉において花成誘導暗期特異的に発現する遺伝子を網羅的に探索する中で、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において花成抑制及び光形態形成に関与するCONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1（COP1）と高い相同性を示す遺伝子を単離し、PnCOP1と名付けた。機能解析を目的とし、アサガオにおいてPnCOP1発現抑制体（PnCOP1-RNAi）を作出した。この発現抑制体では、一回の暗期処理での花芽形成数が減少し、これは花成ホルモン遺伝子であるPharbitis nil FLOWERING LOCUS T 1（PnFT1）mRNAの発現量の低下と相関があった。これらの結果から、PnCOP1はシロイヌナズナにおけるCOP1の知見とは対称的に花成促進作用を持つことが示唆された。PnCOP1の様々な日長条件下における発現パターンとlight-offシグナルによる発現制御から予想される、アサガオにおける光周性花成経路について考察する。

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フィトクロムは植物の主要な光受容体であり、生涯を通して機能する。フィトクロムはシグナル伝達時に細胞質から核へ移行し下流因子の発現を調節する。しかし、生長した植物におけるフィトクロムシグナルの詳細は明らかにされていない。花成に着目したスクリーニングにより、新規フィトクロム相互作用因子VOZ1 (Vascular plant One-Zinc finger1), VOZ2を単離同定した。VOZ1, VOZ2はphyB下流、FT上流で花成を促進する因子であり、重複した機能を持つ。機能的なVOZ細胞内局在を明らかにするため、核移行／搬出シグナルを融合したVOZをvoz1 voz2変異体に導入した。表現型解析の結果、核移行株でのみ、変異体の遅咲きが相補した。両株において導入遺伝子の発現解析を行ったところ、mRNAは両株共に検出されたのに対し、タンパク質蓄積は核移行株で著しく低下していた。さらに、プロテアソーム阻害剤を用いた解析から、核局在のVOZが積極的に分解されることが示唆された。これらより、VOZは核で機能し、シグナル伝達の過程で分解されると考えられる。また、花成経路におけるVOZの機能を明らかにするため、下流因子の解析を行った。その結果、春化経路で機能するFT抑制因子FLCの発現量がvoz1 voz2変異体で増加しており、VOZがFLCを介してFTの発現を制御していることが示唆された。

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花成はシロイヌナズナやイネ等でよく研究されているが，樹木ではほとんど知見がないのが現状である。本研究では，モデル樹木として知られるユーカリを用いて樹木における花成制御機構を解明することを目的とし，モデル植物で花成制御因子として知られるCO，FT遺伝子のホモログを単離し、それらの発現と機能を解析した。ユーカリゲノムのデータベースでのBLAST検索の結果，10個のCO及び4個のFTホモログの存在が明らかとなり，その中からシロイヌナズナのCO及びFTと相同性の高いEugCO1及びEugFT1，FT2，FT3をEucalyptus urograndisより単離した。次にこれらをシロイヌナズナの野生型や花成遅延変異体で強制的に発現させたところ，EugCO1とEugFT1はともに花成を促進した。また，EugCO1及びEugFT1の発現の日本の圃場における季節変動を調べた。その結果、EugCO1では際立った発現レベルの変動は見られなかったが、EugFT1の発現レベルは花芽形成が観察される6月に先立つ4月の葉において最も高く，9月の葉で最も低かった。この結果よりEugFT1の発現は花成と相関があることが示唆された。

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アサガオは貧栄養，低温，強光などのストレス要因に応答して花成を誘導される。ストレスによって花成を誘導された植物は正常な次世代を作る。このストレス応答花成は輸送可能な花成刺激によって誘導され，PALで生合成を調節されるサリチル酸（SA）が関与する。また，シロイヌナズナの花成経路統合遺伝子FTのホモログPnFTが関与する。今回は，異なるアサガオ品種に異なるストレス要因を負荷して，PAL活性をフェニルアラニンからt-桂皮酸への変換量として，SA内生量をLTQ-MSで，花成遺伝子の発現をRT-PCRで調べ，花成反応と対応させた。品種ムラサキは貧栄養ストレスで花成を誘導され，このときPAL活性は高まり，SA含量は増加し，PnFT2が発現した。PnFT1，花成経路統合遺伝子SOC1のホモログ，FT上流遺伝子のホモログPnCO，FLC，FCA，FRIの各ホモログ，PnFVEは発現しないか，発現量に変化がなかった。ムラサキは低温ストレスでも花成を誘導され，このとき，PnFT1，PnFT2の両方が発現したが，PnFT1の発現はわずかであった。品種テンダンは貧栄養ストレスでは花成を誘導されず，このときPnFT2は発現しなかった。テンダンは低温ストレスには応答して花成を誘導され，このときPnFT2発現が高まった。SOC1ホモログ，PnCOの発現量は常にストレスの有無で差がなかった。

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短日植物であるキクは花芽分化および花器官の発達に限界日長より短い日長が必要である。最近、FT/Hd3aタンパク質は花成ホルモン（フロリジェン）であることが提唱されている。我々はこれまでに二倍体野生ギク、キクタニギク（Chrysanthemum seticuspe f. boreale）よりFT/Hd3aと相同性を示すCsFTL1、 CsFTL2およびCsFTL3を同定した。花成が促進される短日条件の葉においてCsFTL1と CsFTL2の発現は低下する一方、CsFTL3の発現は上昇した。さらに、葉におけるCsFTL3の発現は光刺激と概日リズムによって制御されることが示唆された。CsFTL3を過剰発現するキク‘神馬’は野生型の花成が抑制される長日条件において花芽分化および花器官の発達がみられ、開花に至った。キクタニギクの中で約12時間の限界日長を持つNIFS-3系統と、約13時間の限界日長を持つMatsukawa系統におけるCsFTL3の葉での発現は、それぞれの限界日長以下の短日条件で有為に高かった。以上の結果からCsFTL3はキクにおいてフロリジェン様の機能を持ち、花成誘導日長条件において花芽分化および花器官の発達に重要な役割を果たしていることが示された。

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近縁野生種Aegilops geniculataあるいはAe. muticaの細胞質を持つ細胞質置換コムギ系統は、正常細胞質系統に比べて花成が遅延する。これは、異種細胞質のミトコンドリアゲノムの影響（ミトコンドリア・レトログレード・シグナル）により、花成関連遺伝子の作用が変化したためであると考えられる。コムギの花成は、低温要求性、日長反応性、純粋早晩性の複合作用で決定される。人工気象器を用いた栽培試験の結果、細胞質置換系統では、細胞質の影響により低温要求性が増大し、また、純粋早晩性も遅延していた。細胞質置換系統では、これらの要因により、葉数が増加し花成が遅延する。正常細胞質系統では、低温処理をしない場合、栄養成長から生殖成長へ移行する5葉期から、花成促進遺伝子VRN1およびWFTの発現がみられ、生殖成長期にかけて高い発現レベルが維持される。一方、細胞質置換系統では、両遺伝子の発現開始時期が遅れ、また、発現レベルが低くなる。ミトコンドリア・レトログレード・シグナルにより、VRN1およびWFT遺伝子の発現パターンが変化することが、細胞質置換系統における花成の遅延に関係すると考えられる。

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概日時計因子LHYとCCA1の機能を失ったシロイヌナズナlhy;cca1二重変異体では、光周期に応じて花成時期や器官伸長などに多様な変化が生じる。例えば、恒明条件下では、花成遅延ばかりでなく、葉柄長の短縮、葉の歪曲等の形質が見られる。我々は、植物がもつ「内因性の概日時計機構」と、生育環境における「明暗周期という外因性刺激」の有無が及ぼす光周性花成応答への影響に興味をもち、分子遺伝学的研究を進めている。lhy;cca1の恒明条件下での花成遅延形質を増強する変異体を7種（petanko 1-7: pta1-7）単離し、pta7の原因遺伝子が新規タンパク質をコードしていることを見出した。この新規タンパク質の機能推定のために、抑圧変異体の単離と酵母two-hybrid法による結合因子の探索を行なった。PTA7-interactor 1 (IF1)は、花成抑制因子FLCの遺伝子発現制御に関わる既知のタンパク質であり、IF2はシロイヌナズナとは異なる植物種で花成制御に関わることが知られる転写制御因子と高い相同性を有するタンパク質であった。また、IF3は新規タンパク質であり、IF3遺伝子はLHY/CCA1と共発現している。以上の結果は、LHY/CCA1-IF3-PTA7-IF1-FLC及びIF2が、概日時計による花成制御に関わることを示唆している。現在までに得られている知見について報告する。

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The transition to flowering is a crucial moment in a plant life cycle. To understand the molecular mechanisms for switching flowering time by different photoperiod in Arabidopsis, genetic and molecular analyses using elf3-1 have been performed. In a screen for late flowering, after mutagenesis by heavy ion beams of elf3-1, a novel mutant, suppressor of early flowering 3 7 (sel7) was identified. sel7;elf3-1 dramatically delayed flowering under continuous light compared to short-day. Molecular analyses indicated that SEL7 was most closely associated with the autonomous pathway. Indeed, mRNA level of a floral repressor FLC, which acts within this pathway was up-regulated in sel7;elf3-1, whereas those of FT and SOC1 was decreased. Combination of genetic mapping, sequencing and gene expression analysis of 53 candidate genes revealed that sel7 was a novel inversion mutation within the PAB3 gene. Although the enhancement in FLC mRNA level is likely to contribute to the sel7;elf3-1 phenotype, our data suggest that SEL7/PAB3 also promotes flowering independently of FLC.

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シロイヌナズナにおける概日時計の主要な構成因子であるLATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）と CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) の二重欠損変異体（lhy;cca1）は、恒明条件下において、花成遅延や胚軸長・葉柄長の短縮形質及び、顕著な濃緑色葉の形質を示す。我々はこれまでの研究により、LHYとCCA1による花成及び器官伸長制御の分子メカニズムを明らかにしてきた。しかし、lhy;cca1で見られるクロロフィル含量の変化については十分な知見は得られていない。本研究では、概日時計によるクロロフィル含量の制御メカニズムと生物学的意義の解明を目指した。
野生型は、1日における明期の長さに関わらず、クロロフィル含量及びa/b比がほぼ一定なのに対し、lhy;cca1では明期の長さに依存して、クロロフィルの含量とa/b比が共に変動することが明らかになった。我々は、この概日時計によるクロロフィルの制御に関して、関連する因子の探索と、分子遺伝学的解析を試みた。これらの結果から、概日時計を介したクロロフィルの量と質の制御について議論する。

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LHY and CCA1 play key roles in the control of circadian rhythms and flowering time in Arabidopsis. Flowering time is also regulated by both floral activators and repressors such as SVP, FLC and MAF1-5. During a process of characterization of i) lhy;cca1 obtained by crosses between lhy mutants (lhy-11, 12 and 13) in Ler and cca1-1 in Ws, we found increase of FLC, decrease of MAF3-5 and mis-splicing of MAF2 in lhy-11;cca1-1 (Ler/Ws), compared to controls. Similar phenotype was observed in lhy-21;cca1-11 (Ws) but not in lhy-12;cca1-101 (Ler). These suggest that LHY, CCA1 and an unidentified factor with a natural variation between Ler and Ws may play important roles in the control of MAF2-5 and FLC. pta7 enhanced the late flowering of lhy-12;cca1-101 under LL. Loss-of-function of a PTA7-interactor 1 (IF1) like gene (IFL1), is reported to show an opposite phenotype to that in lhy-11;cca1-1: decrease of FLC and increase of MAF2-5 expression. A region responsible for the phenotypic difference between lhy-12;ca1-101 (Ler) and lhy-21;cca1-11 (Ws) has been mapped. Possible roles of LHY, CCA1, IF1 and IFL1 in the control of expression of MAF2-5 and FLC will be discussed in this presentation.

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補償作用とは、植物の葉において何らかの要因によって細胞増殖能が低下すると、細胞数の減少を補うかのように細胞伸長が昂進し、葉に含まれる細胞が大型化する現象である。この現象を解明することによって、植物の器官サイズ制御機構について新たな知見が得られると期待される。我々はこれまでに、補償作用を示すシロイヌナズナ変異体を5系統単離し、解析してきた。今回はfugu2について報告する。マップベースクローニングの結果、FUGU2はクロマチンアセンブリファクター1の大サブユニットをコードするFASCIATA1 (FAS1)であることが明らかとなった。また、マイクロアレイ解析の結果、fas1変異体の葉原基では46遺伝子の発現が上昇していることが示された。さらに、これらのうち多くの遺伝子の発現が、DNA損傷応答時にも誘導されることが示唆されている。これらの結果から、fas1ではDNA損傷応答の結果として、細胞周期の停止およびエンドサイクルの昂進が起こり、異常な細胞肥大に至ると推測された。そこでDNA損傷応答の役割を遺伝学的に検証するために、fas1とDNA損傷応答に欠損のある変異体との二重変異体を作成した。その結果、atr変異によってfas1の細胞伸長が抑圧されることを見出した。現在さらなる解析を進行中であり、本発表ではそれらの結果をもとにDNA損傷応答の器官サイズ制御における役割について議論したい。

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一般的に被子植物の葉は、向背軸の極性に依存する機構で葉身が平面成長し、平たい形態を示す。一方、背軸面に相当する組織のみで葉身が構成される「単面葉」をもつ植物のなかには、平たい葉身を形成する種が多く存在しており、葉の向背軸極性に依存しない独自のメカニズムによって葉が平面成長できる仕組みが進化したと示唆される。我々は系統的に近縁な2種のイグサ属植物、平たい単面葉をもつ「コウガイゼキショウ」および断面が丸い単面葉をもつ「ハリコウガイゼキショウ」を用いた比較解析を行い、この課題に取り組んできた。本発表では、オーキシンが単面葉葉身の平面成長を制御する可能性を見出したので、報告する。
まず、コウガイゼキショウとハリコウガイゼキショウの葉原基では、オーキシン応答性遺伝子GH3が、明確に異なる発現パターンを示していた。また、コウガイゼキショウの芽生えに外因性オーキシンあるいはオーキシン輸送阻害剤を処理することで、オーキシンの分布パターンを乱した結果、葉身は平面成長性を失い、断面が丸い構造へと変化した。さらには、この平面成長の消失は、葉の中央-周縁極性分化に必要な因子の発現消失を伴った。したがって、内在性オーキシンが特定の分布パターンを形成することが、単面葉の初期の平面成長および葉の極性分化の促進に必要であり、平たい単面葉の形態形成に寄与することが示唆された。

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一般に被子植物の葉は向軸面と背軸面を持ち、このような葉を両面葉という。一方いくつかの単子葉植物は、単面葉という、葉身が背軸面だけで構成される葉を持つ。この単面葉の発生機構は、古くから古典形態学的研究の対象とされてきたものの、遺伝子レベルでの研究はこれまで全く手つかずであった。
我々は、単面葉の発生進化機構を解明するために、イグサ属のコウガイゼキショウ (Juncus prismatocarpus) を単面葉のモデル種とし、分子遺伝学的研究を進めている。今回我々は、単面葉の発生を制御する遺伝的機構を明らかにするために、コウガイゼキショウにおいて突然変異体を単離する系を構築し、変異体の大規模探索を行った。その結果、葉の向背軸極性に異常をしめす変異体を 7 系統単離することに成功した。これら変異体は、系統によって異常の程度に差が見られるものの、共通して葉鞘が向軸側化する表現型をしめし、最も強い系統は完全な向軸側化をしめした。しかしながら興味深いことに、向軸側化は葉鞘の部位に限定されており、最も強い系統においても葉身では向背軸の極性異常は観察されず、背軸側化したままであった。またこれら変異体は、節間や花器官においても興味深い表現型をしめした。本大会では、これら変異体の表現型解析や変異体における遺伝子発現解析を統合し、原因遺伝子機能、そして単面葉の発生機構について議論する。

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近年、複葉の形態形成に関して分子発生学的な知見が急速に蓄積し、複雑さの制御機構や、複葉形成に必須な因子の同定などが進んでいる。一方で、小葉がいつ・どこに形成されるのかといったパターニングに関しては、ほとんど理解が進んでいない。特に、小葉が形成される方向性には種によって多様性があり、トマトやミチタネツケバナなどの求基的なタイプと、エンドウやハナビシソウなどの求頂的なタイプが見られる。方向性決定機構については、葉の先端基部軸方向の成長勾配が決定要因ではないかという仮説が提唱されていたものの、十分に検討されていなかった。そこで我々は、まず葉原基の成長を経時的に観察して定量データを取得する実験系を確立し、この仮説を検討した。その結果、求頂的なタイプのハナビシソウが成長勾配仮説と矛盾しない成長パターンを示す一方で、求基的なタイプのジャガイモはこの仮説では説明できない成長パターンを示した。これを受けて我々は、成長勾配に加えて組織の未分化状態や組織分化のタイミングなど、複合的な要因によって小葉形成パターンが決まっている可能性を考え、詳細な組織学的解析や遺伝子発現解析などを進めている。さらに、レーザーアブレーション法を用いて発生を物理的に攪乱する実験を行い、小葉間の位置決定機構についても解析を進めており、これらを統合的に議論したい。

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リボゾーム関連因子は葉の形態形成と密接な関わりを持つ。シロイヌナズナのリボゾームタンパク質（r-protein）の欠損変異株は、葉が菱形に尖るという特徴的な表現型を示す。我々はr-protein遺伝子変異株の幾つかが、軽微な向軸側の欠損を示すasymmetric leaves1 (as1)/as2変異株の表現型を強く促進することを見いだした。これらの結果は、r-protein遺伝子は向背軸制御おける特有の役割を持つことを示唆する。しかしながら、r-protein遺伝子が向軸側因子の発現促進または背軸側因子の発現抑制のいずれに重要なのかは不明である。そこで、r-protein遺伝子が向背軸特異的に発現する株を作成し、r-protein遺伝子が葉の向軸側と背軸側のどちらで重要な役割を果たしているかを明らかにしようと試みた。まず、as2の背軸化の表現型を劇的に促進したrpl4dに着目し、RPL4Dに対して、裏側の発現に限定させるためのtasiR-ARFの標的配列、または表側の発現に限定させるためのmiR165/166の標的配列を接続した遺伝子を構築した。現在、これらの改変RPL4Dが背軸化したas2 rpl4d二重変異株の葉の表現型を相補できるかどうか解析を行っている。これらの解析を踏まえ、r-protein遺伝子を介した葉の背腹性制御機構に関して議論する。

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近年、リボソームが形態形成に果たす役割に注目が集まっている。シロイヌナズナでは約80種のリボソームタンパク質(r-protein)全てが小規模な遺伝子ファミリーによってコードされている。従って、リボソームタンパク質欠損変異株のごく一部を調べるだけでは、リボソームの発生制御機構について、十分な理解を得ることは難しい。我々は、独自に収集した葉の形態に関する突然変異株の中から多数の新規r-protein欠損変異株が見を見いだしてきた。これらの系統をまとめて解析することにより、葉肉細胞数の減少とasymmetric leaves1 (as1)/ as2変異株が示す葉の背腹性異常の促進という2つの表現型が、多くのr-protein欠損変異株に共通した表現型であることを明らかにした。これらの結果は、葉肉細胞の増殖、葉の背腹性制御に関して、リボソームそれ自体が重要な役割を持つことを示している。ところが、特定の表現型に強い影響を及ぼす例としてrpl4dが見いだされた。この変異株は葉の細胞増殖には大きな影響を及ぼさないが、as1/as2の背腹性異常を極めて強く促進する。従って、RPL4Dはリボソームの中でも特有の機能を担っていることが示唆される。RPL4Dが発生に果たす役割を明らかにするため、現在、遺伝学的、形態学的解析な解析に加え、遺伝子発現レベルでの解析を進めており、その結果について報告する。

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これまで演者らは、葉原基での細胞の増殖と伸長の協調的な制御を示してきた。一方、今回は、葉における細胞層間での増殖能の協調的な制御について発表する。葉の表皮と大部分の葉肉細胞はそれぞれ、茎頂分裂組織のL1およびL2層に由来する。これらの系譜間では、発生過程において細胞増殖能が協調的に制御されている。しかし、その分子機構はよく理解されていない。ANGUSTIFOLIA3 (AN3)は細胞増殖を正に制御する転写コアクチベーターをコードし、その発現は葉肉細胞で顕著にみられ、表皮では検出できない。しかし、an3変異体では、葉肉細胞のみならず表皮にも細胞増殖の欠損がみられる。これは、AN3もしくはその下流で働く因子により、表皮と葉肉細胞の細胞増殖が統合されている可能性を示唆する。
そこでan3-4背景に、PDF1およびCLV1プロモーター制御下でL1およびL2層特異的にAN3-GFPを発現する系統を作成し、葉の表現型を解析した。その結果、葉のサイズや形は、野生株と同等であった。また、表皮および葉肉細胞の細胞増殖能も野生株並に回復していた。興味深いことに、an3-4/pCLV1::AN3-GFPの葉を観察したところ、L1層に由来する細胞でもGFPシグナルが観察された。この結果から、AN3が葉肉細胞から表皮細胞へ細胞層を越えて移動し、異なる系譜間での細胞増殖を協調的に制御していると考えられる。

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高等植物の頂端分裂組織は、未分化状態を保ちながら分裂・増殖する細胞群であり、茎頂―根端軸方向への成長や器官原基の形成に必要な細胞を提供するという重要な役割を担っている。シロイヌナズナにおける分子遺伝学的解析から、茎頂分裂組織の領域決定には、細胞外ドメインに leucine-rich repeat (LRR)をもつ受容体 CLAVATA1(CLV1)や CLV2、膜結合型タンパク質キナーゼである SOL2/CRN、さらには分泌性のリガンドである CLV3 からなる細胞間情報伝達系が重要であると考えられている。
本研究では、化学合成 CLV3 ペプチドに対する耐性を指標にサプレッサースクリーニングを行い、CLV3 の下流で機能する新規因子として、LRR 型受容体様キナーゼをコードするRECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2 (RPK2 )を単離した。rpk2 変異体では他のclv 変異体同様、茎頂分裂組織の肥大化や花器官数の増大といった特徴的な表現型が観察され、さらに、遺伝学的、および生化学的解析の結果、RPK2 は既知の CLV3 受容体である CLV1、あるいは CLV2-SOL2/CRN 複合体とは独立に機能することが示された。以上の結果から、RPK2 は茎頂分裂組織において CLV3 のシグナルを伝達する第三の経路であることが示唆された。

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アラビドプシスの茎長分裂組織(SAM)においては、CLAVATA(CLV)経路が幹細胞集団のサイズ制御を行っている。そこでは、分泌型ペプチドリガンドとして機能するCLV3が、CLV1、 CLV2-SUPPRESSOR OF LLP1-2 (SOL2)/CORYNE (CRN)、RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2 (RPK2)/TOADSTOOL 2 (TOAD2)からなる3つの受容体キナーゼ複合体を介して転写因子WUSCHELの発現を負に制御している。本研究では、これら受容体キナーゼ群によって制御されうるリン酸化シグナリングのCLV経路への寄与に関して調査した。その結果、CLV1がCLV3依存的にリン酸化されること、またそのリン酸化状態がCLV1に結合しうる他のCLV受容体によって影響されていることを見いだした。さらに、各CLV受容体とMAPK活性との相関を調査した結果、CLV受容体群によってMAPK活性のバランスが適切に維持されることがSAMの恒常性維持に重要である可能性が示唆された。

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植物の形態形成には、細胞間の情報伝達が必須である。近年の解析から、12ないし13アミノ酸からなるCLE(CLV3/ESR-related)ペプチド類が、この情報伝達の主要因子としてクローズアップされてきた。CLEペプチドは、タンパク質のN端とC端でプロセスされ、さらに特定のプロリンが水酸化された後、その一部は糖鎖修飾を受ける。これらプロセシングと糖鎖修飾過程は、活性をもつCLEペプチド生産に必須であるが、その分子機構は不明のままである。そこで、我々はCLEペプチドのプロセシング機構を明らかにするために、SOL1に着目し研究を行った。sol1はCLE19過剰発現体の表現型を抑圧する変異体として単離されている。この表現型がCLE19特異的に表れるかどうかを調べるために、エストロゲン誘導系を用いた全長のCLE19、CLV3の過剰発現系を作成した。その結果、sol1突然変異はCLE19の過剰発現による表現型を抑制するもののCLV3の過剰発現の効果は抑制しなかった。一方で、化学合成したCLE19およびCLV3ペプチドを投与したときには、その効果をsol1は抑圧しなかった。これらの結果は、SOL1がCLE19のプロセシングに特異的に関与していることを示唆している。現在、SOL1のin vitro活性検出、細胞内局在について解析を進めており、これらを合わせて、SOL1の機能を考察する。

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植物にとって頂端分裂組織は、生涯新しい器官を作り続ける必須の組織であり、その性質およびサイズは、厳密な細胞間情報伝達経路によって制御されている。シロイヌナズナの茎頂分裂組織では、細胞間シグナル分子と考えられるCLAVATA3 (CLV3)ペプチドが、CLV1、CLV2、CRN、RPK2など複数の受容体を介して、そのサイズを負に制御している。また、CLV3とCLV3/ESR-related（CLE）遺伝子を過剰発現させた時や、CLEペプチド投与した場合でも、根端分裂組織が縮小し、根の伸長が阻害されることから、これらCLEペプチドを介した経路が根端分裂組織の発達をも制御していることが示唆されている。
今回、私達は頂端分裂組織の制御に関わる新たな因子を単離するため、clv2 突然変異体のエンハンサースクリーニングを行った。具体的には、CLEペプチド投与に対して強い耐性を示し、根の伸長阻害を起こさない、clv2 表現形を亢進する突然変異体を選抜した。続いて、ラフマッピングと次世代DNAシーケンサーによるゲノムリシークエンスを組み合わせた解析によって（山口ら、本大会発表参照）、エンハンサーのうち1つの原因遺伝子同定に成功した。この原因遺伝子は、情報伝達因子をコードしており、現在、CLV経路との関わりについて解析している。本発表では、これらの経過について報告する。

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rrd1、rrd2、rid4は、不定根形成を指標に単離したシロイヌナズナ温度感受性変異体の一グループで、基本的な細胞増殖に関わる現象全般に不完全な温度感受性を示す点と、制限温度下で帯化した側根を形成する点に特徴がある。責任遺伝子については、RRD1がポリA特異的リボヌクレアーゼ様タンパク質、RID4がペンタトリコペプチドリピート（PPR）タンパク質をコードすることが明らかになっている。
RRD1の分子機能として、mRNA分解の起点となる、ポリAの分解に関与することが推定される。この考えが正しければ、制限温度に曝されたrrd1変異体では標的mRNAが分解されずに、その量が増加するはずである。そこで今回、マイクロアレイ解析により、制限温度下で側根形成を誘導したときのmRNAの変動をrrd1と野生型とで比較してみた。その結果、rrd1変異体では、ミトコンドリア呼吸鎖関連遺伝子群のmRNA蓄積が著しく増大していることがわかった。
一方で変異体同士を掛け合わせる交配実験から、どの組み合わせの二重変異体でも合成胚致死となるなど、3つの遺伝子に密接な遺伝学的相互作用があることを示唆する結果が得られている。これより、RRD1がRRD2やRID4と協力して特定のmRNAの分解にはたらき、この分解制御が発生の進行に深く関わっているという可能性が考えられる。

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植物ホルモンは植物の生長や様々な環境ストレスへの応答に対して重要な役割を担っている。植物ホルモンの一種であるジャスモン酸(JA)は病傷害応答、老化の制御など様々な生理現象に関わっていることが分かっており、COI1を介した情報伝達の仕組みも明らかになりつつある。しかし、転写因子の発現から各代謝に至る情報伝達経路の詳細を示した例はいまだ少ないのが現状である。本研究では、JA応答性遺伝子群(JRG)の転写因子と共発現し、動物細胞における細胞増殖因子レセプターであるtransforming growth factor beta (TGF-β)レセプターと相同な領域を持つ新規ジャスモン酸応答性遺伝子CHJ (constitutively hypersensitive to jasmonate)を同定し、CHJがジャスモン酸情報伝達を負に制御していることを明らかにしたので報告する。変異体chjでは、野生株よりも低濃度で応答を示し、ジャスモン酸に対してhypersensitiveな表現型をもつことがわかった。JA処理時の遺伝子発現解析の結果、chjではJAとエチレン情報伝達の両方により制御を受ける抗菌性タンパク質ディフェンシン (PDF1.2)の発現に増加が見られた。これらの結果から、JAとエチレンのクロストークにおいて、CHJがJAからのシグナルを負に制御している可能性が示唆された。

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ジャスモン酸（JA）は傷害・病害など様々なストレスへの応答だけでなく老化や稔性など様々な発達過程に関わる植物ホルモンである。JAシグナル伝達は負の制御因子であるJAZタンパク質が転写活性化因子MYC2に結合することによって抑制されており、JAが受容体であるF-boxタンパク質COI1に結合するとJAZタンパク質が分解され、活性化されたMYC2により下流にシグナルが伝達される。coi1変異体は雄性不稔であるのに対しmyc2変異体は稔性をもつことから、MYC2以外にもCOI1の下流で機能する転写因子が存在すると考えられる。しかし、従来の変異体などを用いた解析ではそのような転写因子は同定されていない。我々は新規の転写抑制法であるCRES-T法を用いて、JAシグナルに関わる転写因子を網羅的に探索し、HR0729のCRES-T植物が根の伸長におけるJA非感受性に加えて、不稔形質を示すことを見出した。また、JA応答遺伝子の発現はHR0729のCRES-T植物では低下していた。さらにHR0729タンパク質が植物体内でJAZタンパク質と相互作用することを明らかにした。これらの結果からHR0729はJAシグナル伝達に関わる転写因子であることが示唆された。

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ジャスモン酸は成長の制御や、傷害・病害などのストレス応答に必須の植物ホルモンである。COI1はジャスモン酸情報伝達の中心的因子であり、ホルモンの結合に依存して、転写抑制因子と考えられるJAZタンパク質のユビキチン化とプロテアソームを介した分解を引き起こす。JAZファミリータンパク質はジャスモン酸応答性転写因子であるMYC2の転写抑制因子であり、JAZタンパク質の分解によって遊離したMYC2は、ジャスモン酸応答遺伝子群の発現を制御すると考えられている。
MYC2はJAZタンパク質と相互作用することが知られているが、JAZタンパク質と相互作用するその他の転写因子については知られていない。そこで、ジャスモン酸情報伝達系における新規の転写制御因子を得るために、我々はジャスモン酸応答性遺伝子群の共発現解析を行い、MYC2と共発現するbHLH型転写因子に着目し、INU1とした。INU1とJAZタンパク質の相互作用を酵母ツーハイブッド法により解析した結果、INU1とINU1に最も近いホモログが特定のJAZタンパク質と相互作用した。またmyc2、inu1、およびinu1ホモログの二重・三重・四重変異体の解析結果についても合わせて報告する。

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植物の受精が達成されるためには、めしべに受粉した花粉から伸びる花粉管が、標的の胚嚢へと正しくガイドされることが必須である。100年以上にわたるこの花粉管ガイダンス研究において、誘引物質さえあれば花粉管は胚嚢へと必ず誘引されるものと想定されてきた。当研究室では、胚嚢が胚珠組織に覆われていないトレニアを用いることで、培地中で花粉管を胚嚢へ誘引・受精させるためには、まず花柱組織の中を伸長し、さらに胚珠組織からの浸出成分を受けるという制御が必要であることがわかった。当研究室における先行研究から、第二段階制御を担う因子が見出された。花粉管に誘引物質への応答能を与える因子であることから、AMOR（Activation Molecule for response capability）と名付けられた。AMORは胚珠の2n組織から浸出し、熱安定性で、ヤリブ試薬によって沈殿画分に回収されるといった性質を持つことが示された。ヤリブ試薬は糖タンパク質であるアラビノガラクタンプロテイン（以下AGP）と特異的に結合し沈殿する。しかし、その分子的実体は依然として不明である。
今回、クロマトグラフィーによる効率的なAMORの精製法を確立し、他種のAGPやトレニアのいくつかの組織がAMOR様の活性を示すことが明らかになったことを報告する。さらに、応答能付与におけるAMORとAGPの関係性についても議論したい。

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植物は有機物合成に不可欠な2大栄養素である糖(C)と窒素(N)の細胞内バランスを感知・制御することで，環境に合わせた適切な個体の生長を行っている．これらCとNの代謝系はクロストークしているが，その詳しい制御機構は未だ解明されていない．
そこで我々はこのC/N応答制御機構の解明を目指し，高C/低Nストレス耐性変異体のスクリーニングを行った．その結果，cni2-D (carbon and nitrogen insensitive 2-D)変異体の単離に成功した．この変異体ではABI1 (ABA insensitive 1)の過剰発現が確認された．その後の解析によりABI1過剰発現体ではC/Nストレスに低感受性を示し，さらにabi1-2では高感受性を示した．これらのことからABI1はC/N応答制御に関与していることが示された．ABI1はアブシジン酸(ABA)シグナル伝達を負に制御するプロテインフォスファターゼ2Cとしてよく知られる．ABAは糖をはじめとする様々なストレス応答を制御する植物ホルモンであるが，C/Nストレスとの関係は知られていない．
本研究ではABAシグナリング各段階における変異体のC/N感受性を検証することで，両シグナル伝達経路の関係性を明らかにする．さらに様々なC/N条件におけるABI1発現量の検証などを通しABI1のC/N応答制御機構への関与について考察する．

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基部陸上植物ヒメツリガネゴケにおけるアブシジン酸（ABA）の機能解析を目的に、ABAの代謝・不活性化に働くシロイヌナズナCYP707A3の過剰発現株を作出した。巨大葉緑体を持つ細胞が観察され、この表現型はABA添加により回復した。ABAが葉緑体の形態形成に関わる事が示唆されたため、野生型株を用いて詳細な解析を行った。まず、10μM ABAを投与したヒメツガネゴケ原糸体の葉緑体数を計測した。その結果、ABAの投与3日後までに葉緑体数が約二倍に増加した。ABAはヒメツリガネゴケ原糸体細胞の分裂も誘導することから、葉緑体の分裂は間接的な作用である可能性も考えられる。そこで、成熟して細胞分裂を行なわない茎葉体細胞を用いたところ、葉緑体数はやはりABA投与により約二倍に増加した。さらに、ABAシグナル伝達系の負の制御因子である PpABI1を欠損した株では、ABAを投与しない通常状態においても、野生株に比べて葉緑体数が約二倍に上昇している事が認められた。以上の結果から、ヒメツリガネゴケにおいてABAは葉緑体の分裂を誘導することが明らかとなった。

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ABI1はタンパク質脱リン酸化酵素2Cをコードし、アブシジン酸（ABA）情報伝達において上流で働くことが知られている。我々はABI1を介したABA情報伝達因子を同定するため、シロイヌナズナにYFP-ABI1融合タンパク質を過剰に発現させた形質転換体を作成し、GFPアフィニティーカラムおよび高精度のLC-MS/MS解析を行った。ABI1の相互作用因子として、ABAによって活性化するタンパク質リン酸化酵素であるSnRK2ファミリーや9つのABA受容体として報告されたPYR/PYL/RCARファミリーのメンバーを同定することに成功した。また、pyr1pyl1pyl2pyl4四重変異体はABAによる気孔の閉口応答を阻害することを見いだした。
X線結晶構造解析法により、我々はPYR1単体とABAが結合した状態のPYR1の立体構造を明らかとした。PYR/PYL/RCARの内部にある空洞にABAが入り込み結合すると、Pro-CapとLeu-Lockと呼ばれる2つの領域が構造変化を引き起こし、これらが蓋の役目をし、PYR/PYL/RCARはABAと安定な複合体を形成することを見出した。PYR1はABAの有無に関わらず二量体を形成するが、 ABAが取り込まれることで不安定かつ対称な2量体となることを示した。

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多くの植物種において、13位水酸化ジベレリン(GA)と13位非水酸化GAの存在が報告されている。この13位水酸化の生理的な役割はいまだ明らかになっていない。これまでに我々はGA13位水酸化活性を持つ二つのシトクロムP450酵素遺伝子をイネから見いだした。イネ二重変異体幼苗のGA内生量を分析した結果、13位水酸化活性型であるGA₁が著しく減少しており、逆に13位非水酸化活性型であるGA₄が増加していることを明らかにした。今回GA13位水酸化酵素一重変異体および二重変異体についてさらに解析を行った。各一重変異体のGA内生量を分析したところ、13位水酸化型中間体及び活性型GA量に二重変異体で見られたような著しい影響はみとめられなかった。さらに出穂期の二重変異体の茎および葉身のGA内生量を分析したところ、幼苗の分析結果と同様に13位水酸化GAの著しい減少が見られた。以上の結果から両P450遺伝子はイネにおけるジベレリン13位水酸化の主要な酵素遺伝子であると考えられる。

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収量増産を考える上で耐倒伏性を向上させることは重要である。倒伏はその状態により稈が湾曲して倒れる「なびき型倒伏」、稈が折れて倒れる「挫折型倒伏」にわけられる。イネを含む多くの作物では半矮性遺伝子の導入により「なびき型倒伏」に対し抵抗を付与してきた。実際、sd1や短銀坊主のようなジベレリン（GA）欠損変異体が収量増産に貢献した。しかしGA欠乏が稈形質に与える影響はほとんど研究されていない。そこで本研究ではGA突然変異体を用いて、GAの稈形質に与える影響を調査した。倒伏抵抗性評価に関し「なびき型倒伏」はcLr法、「挫折型倒伏」は挫折荷重測定法を用いた。各変異体のcLr値はGA欠損矮性変異体は野生型に比べて大きい値を、GA過剰徒長変異体は小さい値を示した。一方挫折荷重測定値は、矮性変異体は野生型より小さく、徒長変異体は大きい値を示した。次に稈の物理的強度に関わる稈径を測定した。その結果、矮性変異体は野生型よりも稈が細く、徒長変異体は太くなった。これらの結果より、挫折荷重値が矮性変異体で野生型よりも小さい値を示したのは稈が細くなったためであると示唆された。以上の結果より、ジベレリン半矮性遺伝子による短稈化は「なびき型倒伏」に対する抵抗性を向上させる一方、「挫折型倒伏」抵抗性は低下させると考えられた。本研究は農林水産省・新農業展開ゲノムプロジェクト(IPG-0003)の助成を受けて行われた。

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