植物細胞は多様なタンパク質を細胞外に分泌することが知られているが、その機能や分泌機構は十分には理解されていない。私たちは、ヒャクニチソウ管状要素分化系の培地中から単離したアラビノガラクタンタンパク質(AGP)の一種xylogenが、細胞間へ分泌されることで木部細胞への分化を誘導することを見いだした。xylogenはアミノ酸配列から、GPIアンカーによる膜への係留構造を持つことが予測された。そこで、本研究では、このxylogenの分泌のダイナミズムを、維管束分化過程で調査するため、シロイヌナズナのxylogenオルソログ遺伝子であるAtXYP2にGFP遺伝子を挿入したコンストラクトpAtXYP2:: AtXYP2-GFPをもつ形質転換植物を作出した。この形質転換植物を用いて蛍光局在解析を行った結果、AtXYP2は未分化の木部細胞列および前形成層で発現していることが示された。詳細な細胞内局在を観察したところ、根端付近の細胞においてはTGNを中心とする小胞輸送系に、伸長・分化領域においては細胞膜および細胞外に局在することが明らかになった。また、根端付近においては細胞内へ取り込まれるFM4-64との一過的な共局在も見られ、AtXYP2が細胞内へ取り込まれている可能性も考えられた。これらの結果を踏まえ、xylogenの輸送のメカニズムについて考察する予定である。

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Yellow-stripe like (YSL) transporters belong to the oligopeptide transporter (OPT) family. In the present study, we examined an uncharacterized member of YSLs fin rice, OsYSL16. Knockout of this gene resulted in decreased accumulation of Cu in the shoots, but there was no effect on the accumulation of other metals including Fe, Zn and Mn. Further analysis showed that the knockout line contained a higher Cu concentration in the older leaves, but less in the younger leaves compared with the wild-type rice. Furthermore, when cultivated under copper-deficiency condition, the seed fertility of the knockout line was significantly reduced, but there was no difference in the fertility under high Cu condition. OsYSL16 was expressed both in the shoots and roots. At the reproductive stage, OsYSL16 was especially highly expressed in the node. Immunostainning showed that the protein was mainly localized in the phloem of the node. Yeast expressing OsYSL16 showed transport activity for Cu-NA. Taken together, we conclude that OsYSL16 is a Cu-NA transporter, which is involved in the translocation of Cu through phloem transport.

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青色系統の花のほとんどはアントシアニンに由来する。中性から弱酸性の花弁液胞内で真の青色を発色するには、2価、3価の金属イオンとアントシアニンとが錯体形成することが必要である。我々は最近、チューリップ花弁の青色部分から液胞膜型鉄イオントランスポーターを見いだした。しかし、金属イオンの液胞内への輸送とそれに続く花色発現の機構については、未だ不明なことが多い。アジサイは、アルミニウムイオンが青色発現に必須であることがわかっているが、アルミニウムの細胞内へ、そして、液胞への輸送に関わる遺伝子は全く同定されていない。そこで、花が青くなる現象の分子メカニズムを明らかにすべく、アジサイの液胞へのアルミニウムイオン輸送に関わる遺伝子の単離を目的に研究を行なった。アジサイガク片cDNAライブラリーのうち、約12000の遺伝子の配列を読み、マイクロアレイを作製した。配列情報から予測される局在と機能から液胞膜トランスポーター候補を選び出し、酵母アルミニウム感受性株により機能を確認した。その結果、液胞膜のアルミニウムトランスポーターを同定することができた。さらに、細胞膜に局在するアルミニウムトランスポーター遺伝子候補を選び出し、酵母による解析からその輸送機能を持つ遺伝子を同定することができた。これにより、ガク片でのアルミニウムの細胞への取り込み、それに続く液胞への隔離に関わる遺伝子を同定することができた。

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マグネシウム（Mg）は多量必須元素であり、輸送体が報告されているが、そのホメオスタシス機構については不明な点が多い。本研究では、Mg欠乏応答に異常がある変異株の単離を目指して、スクリーニング方法の検討を行った。
まず始めに、Mg欠乏症状が出せる条件を検討した。寒天培地でシロイヌナズナを栽培したところ、地上部のMg量は欠乏条件で低下したが、表現型に変化は見られなかった。そこで、水耕栽培により欠乏処理を行ったところ、培地のMg濃度が50 μM以下になると欠乏症状が見られた。すなわち、寒天培地にはシロイヌナズナの生育に十分量のMgが含まれており、見た目の表現型を指標としたスクリーニングに寒天は適さないと考えられる。
そこで、Mg欠乏応答性遺伝子の発現を指標としたスクリーニング方法の確立を行った。まず、水耕栽培した地上部のマイクロアレイ解析を行い、Mg欠乏で誘導される遺伝子を同定した。次に、これら遺伝子の発現をMgホメオスタシスに関与しているMg輸送体の破壊株mrs2-7と野生型株で比較した。調べたいずれの遺伝子の発現は野生型株よりmrs2-7で高く、これら遺伝子の発現がスクリーニングに利用できると判断した。現在、応答性遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトをシロイヌナズナに導入し、Mgに応答した発光を示すか確認している。

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マグネシウム（Mg）は、植物にとって必要不可欠な元素であるが、恒常性、吸収、移行等に関する知見は非常に少ない。Mg研究が遅れている要因のひとつとして、利用しやすい放射性同位元素が存在しないことが挙げられる。Mgには2種類の半減期の短い核種が存在する。このうち本研究では、キャリアーフリーでの製造が可能な²⁸Mgに着目した。²⁸Mgは半減期約21時間のβ崩壊核種であるが、²⁸Mgを製造し供給する施設は日本国内には存在せず、また世界でも製造している施設は存在していない。そこで、かつて製造した経験のある東北大学のサイクロトロンを用い²⁸Mgを調整した。東北大学CYRICのサイクロトロンでα線を加速し、アルミニウム箔を照射し、²⁷Al(α,3p)²⁸Mg反応により²⁸Mgを製造した。照射後、アルミニウム箔を塩酸で溶解し、2回のイオン交換カラム等で精製して²⁸Mgのトレーサー溶液とした。調製した²⁸Mgはただちに東京大学へ移送し、植物への吸収実験に供した。播種後約3週間目で第6本葉してきた時期のイネに²⁸Mgを吸収させ、イメージングプレートで²⁸Mgの分布を解析した。その結果、最新葉より一つ古い葉である第5本葉の基部側より0-20mmに集積が見られ、またMgの要求性の高い組織を特定することができた。その他、さまざまなMg濃度で処理した場合の吸収特性を解析したので、発表したい。

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イネ体内におけるカドミウム(Cd)の輸送メカニズムの解明を目的とし、Cdの輸送経路を放射性核種109Cdを用いたイメージングにより解析した。第六本葉が抽出した直後の幼植物に¹⁰⁹Cd（2MBq/10ml 0.1μM CdCl₂）を15分間経根吸収させ、地上部へのCdの初期移行パターンの特徴を分析したところ、Cdは、抽出直後の第六本葉に優先的に移行することが示された。さらに、茎部切片のオートラジオグラフィから、第六本葉へ移行するCdは、他の葉を経由せず、根から直接輸送されると考えられた。また、他元素（³²P、³⁵S、⁴⁵Ca）の吸収動態との比較から、Cdの葉への初期移行パターンはP、SよりもCaに類似していること、さらにCdは篩管流によって輸送されていることが示唆された。
そこで、茎部における輸送経路を組織レベルで解析するため、特定の一本の根からのみ¹⁰⁹Cdを30分間吸収させ、直後に根と茎部間の組織の連続切片を作成し、¹⁰⁹Cdのイメージング解析を行った。その結果、Cdは茎部に到達した後、速やかに篩管へ移行することが示唆された。また、茎内を上方へと輸送される間、葉に向かう小維管束にはほとんど分布せず、大部分が茎内の維管束に留まる傾向が示された。これらの結果から考察されるCdの輸送経路について発表する。

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MCA1とMCA2は、シロイヌナズナにおいてCa²⁺取込みと機械刺激受容に関与する細胞膜タンパク質であり、互いにアミノ酸配列上で72.7 %の同一性がある。両タンパク質は、複数の推定上の膜貫通領域、N末端から順次機能未知のARPKドメイン、Ca²⁺が結合する構造であるEFハンドに似た領域、中心付近にコイルドコイル、C末端に動植物に広く存在するシステイン豊富なPLAC8モチーフを含む共通の構造上の特徴をもつ。MCA1とMCA2のCa²⁺取込みに重要な領域を特定するため、酵母発現系を用いてMCA1およびMCA2の部分削除変異体群を作製し、それらのCa^{2 +}取込み活性を調べた。その結果、N末端から173アミノ酸残基までのタンパク質はCa²⁺取込み活性をもっていたが、この領域をもたないN末端欠損タンパク質は活性をもたなかった。173番目のアミノ酸残基までには推定上の膜貫通領域(TM1)が1つ存在する。そのヘリカルホイール表示において、親水性アミノ酸が一局に集中して存在することが分かった。そのうちの一つであるAsp²¹をAsnに置換した結果、MCA1^D21Nの活性はなくなり、MCA2^D21Nの活性は約半分に減少した。これらの結果はMCA1とMCAのN末端から173番目のアミノ酸残基があればCa²⁺取込み活性に必要十分であり、そこに存在するTM1がCa²⁺取込みに関与していることを示唆する。

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亜鉛は植物の生育に必須な微量栄養元素であり、多くの酵素が機能する上で重要な役割を持つ。しかしながら、細胞内における亜鉛濃度が高まると、植物はクロロシスや根の伸長阻害などの成育阻害を受ける。このことから、細胞は亜鉛濃度を一定に保つための恒常性維持機構を持っている。
本研究では、過剰亜鉛に対する初期応答機構の解明を目的とし、iTRAQ解析法による定量プロテオーム解析を行った。本実験にはシロイヌナズナ野生型Col-0を用いた。Col-0はMS培地に300μM亜鉛が含まれるときに顕著な成育阻害を示すため、この条件を過剰量亜鉛濃度とした。MS培地で成育したCol-0の根に300 μM亜鉛溶液を0，3，6，16時間処理し、それぞれマイクロソーム画分を単離し、iTRAQ解析に用いた。この結果、ABC輸送体PDR8やSNAREタンパク質SYP122などが時間依存的に増加した。さらに免疫沈降実験ではPDR8とSYP122が相互作用すること、SYP122-GFPシロイヌナズナ形質転換体の根に亜鉛処理するとGFP蛍光が細胞膜上で強くなることなどを確認している。本発表では、プロテオーム解析により得られた結果に生化学的、細胞生物学的実験結果を加えて議論する。

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亜鉛は土壌汚染の一因であるが、動植物にとっての必須元素でもある。このため植物による環境浄化や、食品栄養価向上の対象元素として多くの研究がなされているが、その吸収・輸送機構の解明は十分ではない。本研究ではマメ科のモデル植物であり、亜鉛集積に系統間差があるミヤコグサ(Lotus japonicus)における亜鉛集積と関連QTLの解析を行った。実験にはMiyakojima、Gifuおよびそれらの組換え自殖系統を用いた。
発芽後4週における亜鉛含量を測定したところ、全ての組織で MiyakojimaよりもGifuにおいて亜鉛が蓄積されていた。Zn-65を用いたオートラジオグラフィにより植物体中の亜鉛分布を解析すると、Gifuにおいてより短時間で上位葉まで輸送されることが示された。また、地上部への亜鉛集積を指標として、約80系統の組換え自殖系統によるQTL解析を行ったところ、亜鉛集積に関わると考えられる複数のQTL領域が得られた。QTL領域の遺伝子型に特徴のある系統を選抜し、亜鉛分布を解析したところ、植物体全体で亜鉛の集積量が多い系統や、地上部へ積極的に輸送している系統が得られたことから、QTLと亜鉛分布の相関について考察する。また、マイクロアレイによる解析から、Gifuで高発現し、かつQTL領域に座乗する複数の亜鉛輸送体の相同遺伝子が得られたため、これらの亜鉛輸送活性を解析する予定である。

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重金属は酵素蛋白質の補因子の金属イオンと置き換わるため、また活性酸素を発生する無機触媒として振る舞うため植物にとって有害である。植物は、様々なレベルで重金属ストレスに対処するが、細胞レベルでは細胞膜輸送体による重金属の細胞外への排出と、液胞膜輸送体による重金属の液胞への隔離・貯蔵が、細胞質の重金属濃度低減と耐性に大きく寄与している。しかし、重金属輸送を担う分子実体は不明なものも多い。そこで本研究では、重金属のうち研究例が少ないマンガン（Mn）、亜鉛（Zn）、ニッケル（Ni）、カドミウム（Cd）について膜輸送体分子の存在可能性を検討した。
先に我々が開発した膜輸送体遺伝子コレクション（Amethyst）を過剰発現する、シロイヌナズナ形質転換株約200種類を、上記の重金属を混合した寒天培地で栽培し、コントロール株と比べよく育つ4株を選抜した。過剰発現株4株をさらに解析した結果、1株はマンガンと亜鉛に対する耐性が向上し、3株はニッケルまたはカドミウムへの耐性が向上していた。耐性株がもつ過剰発現ベクターにタグされている膜輸送体遺伝子を解析したところ、CAX型対向輸送体遺伝子がタグされた株が1株、植物間で保存された機能未知膜輸送体遺伝子がタグされた株が3株あった。これらの遺伝子がコードする膜タンパク質は、上記の重金属の膜輸送することで植物細胞に耐性を付与している可能性がある。

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H⁺-PPaseは高分子合成反応の副産物であるピロリン酸の加水分解に共役してH⁺を輸送するプロトンポンプである。若い植物組織では液胞膜タンパク質の約10％がH⁺-PPaseであり、V-ATPaseと共に液胞の酸性化に寄与している。一方、いくつかの組織免疫染色における報告では細胞膜における局在を示唆しており、いまだ議論の的になっている。
この問題を検証するため、我々はシロイヌナズナ液胞型H⁺-PPaseであるAtVHP1/AVP1の細胞質側ループにsGFPをつないだコンストラクトを複数作成し、own promoter下でWT及びvhp1株に発現させた。その結果、基質加水分解活性を完全に保持し、また密度分画により内在のH⁺-PPaseと同一のオルガネラに局在することが確認された。このVHP1-sGFPは液胞膜と共に、バルブ状構造と呼ばれる液胞のサブドメインに存在していることが明瞭に観察され、細胞膜には確認されなかった。組織レベルでは植物体全体に蛍光が認められたが、特に成長域の組織や維管束において強い蛍光と多数のバルブ状構造が見られた。またバルブ構造の数がVHP1-sGFPの発現レベルの違いにより強く影響されることを発見した。本発表ではH⁺-PPaseの生理的役割やバルブ構造の機能について議論したい。

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ホスファチジルグリセロール（PG）は様々な生体膜に存在するグリセロリン脂質であり、植物では主にチラコイド膜に存在し、光合成に必要であるということが報告されている。我々はPGの生理機能を明らかにするために、PGの生合成に関わるホスファチジルグリセロリン酸合成酵素をコードする遺伝子PGP1とPGP2が破壊されたシロイヌナズナの変異株の性質を調べている。
pgp1とpgp2変異株の葉の脂質を分析したところ、葉におけるPGの生合成には主にPGP1が寄与し、PGP2はわずかしか寄与していないことが明らかとなった。PGの生合成を完全に欠損すると考えられるpgp1 pgp2二重変異株の作出を試みたものの、二重変異株を得ることができなかった。PGP1/pgp1 pgp2/pgp2変異株を自家受精させたところ、脱水後に萎縮するアルビノの種子が1/4の分離比で観察された。そのアルビノ種子の胚を観察したところ、野生型と比べ発生が遅延し、子葉が短くなっていた。このことから、PGP1とPGP2に依存して合成されるPGは胚発生、子葉の成長、種子の段階における葉緑体の形成、に重要な役割を果たしていると考えられる。

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降雨などで土壌の湛水状態が続くと、土壌中の酸素濃度と酸化還元電位が低下し、畑作物の根は酸素欠乏を引き起こし、しばしば湿害が発生する。このような湛水土壌で、根の通気組織の形成と根外への酸素漏出(Radial Oxygen Loss)を防ぐROLバリアの形成は根の酸素欠乏を防ぐ重要な形質であると考えられている。
我々は、テオシントの一種であるZ. nicaraguensisとトウモロコシとを用いて、嫌気条件に適応する根の機構について解明することを目的とした。成長解析を行ったうえで、嫌気条件での根の通気組織とROLバリアの形成について解析した。その結果、テオシントはトウモロコシよりも高度に通気組織を発達させていた。さらにテオシントは根外への酸素漏出を防ぐROLバリアを形成したが、トウモロコシはROLバリアを形成しなかった。したがって、テオシントは嫌気的な環境に順応するために、高度に通気組織を形成し、さらにROLバリアを形成することで、根端へ酸素を効率的に輸送させ、耐湿性を高めていることが示唆された。現在、根の表層細胞におけるアポプラスティックバリアーについて組織化学的解析を進めている。
なお、本研究は、農研機構・生研センターのイノベーション創出基礎的研究推進事業の助成により推進された。また、種子を分譲していただいた農研機構・畜産草地研究所の間野吉郎博士、大森史恵氏に感謝の意を表する。

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植物を環境基準濃度(50 ppb)の二窒素酸化物(NO₂)を含む空気中で栽培すると、NO₂を含まない空気中での栽培に比べ、植物の生育やバイオマス量および葉サイズがほぼ倍加する。このNO₂の植物バイタリゼーション作用(Takahashi et al., New Phytol 168:149, 2005)は、シロイヌナズナを含め各種植物種で認められた。形態学的解析から、バイタリゼーションによるシロイヌナズナ葉サイズの増加は、細胞数の増加ではなく、細胞拡大に起因することが分かっている。細胞拡大の原因の一つとして核内倍加が知られている。本研究ではNO₂による細胞拡大が核内倍加に因るか否かを研究した。
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana C24）を、NO₂を含まない(<5 ppb)空気中で、22±0.3℃、相対湿度70±4%、人工照明下(40 μ mole photon m^-2 s^-1)、360 ppm CO₂の条件下で1週間栽培した後、NO₂を含む（50 ppb）[+NO₂植物]または含まない（<5 ppb）[-NO2植物]空気中で4週間栽培した。第8葉を採取してフローサイトメトリーで倍数性レベルを調査した。その結果、+NO₂植物と-NO₂植物との間に倍数性レベルに差がなかった。故に、NO₂バイタリゼーションによる細胞拡大は、核内倍加に因るものではないと結論された。

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一般に植物は、外部環境の変化や強光、高温、低温や乾燥などの環境ストレスに対して、遺伝子やタンパク質の発現など、組織や器官レベルでの応答を示し、外部環境への順化やストレス耐性を獲得する。この植物の環境応答メカニズムを利用し、適切なストレスを植物に与えることで、薬剤を用いることなく、病原抵抗性を付与する栽培方法などの研究開発が行われている。一方、果実などの青果物の大部分は、保蔵中および流通中に病原微生物による貯蔵病害の被害を受けることが知られる。本研究では、イチゴ（Fragaria x ananassa cv. Candonga）果実の保蔵前UV照射と異なる温度での貯蔵の有効性を病原抵抗性関連遺伝子群および二次代謝物関連遺伝子群等の発現を指標にして調べた。具体的には、イチゴ果実の収穫後、低温貯蔵を行う前に様々な強度のUV照射を行い、1℃，5℃，10℃で貯蔵し、経時的にサンプリングして遺伝子発現を調べた。その結果、遺伝子発現がUV照射と低温貯蔵の組み合わせにより制御可能であることが分かった。これらの結果は、イチゴ果実の保蔵性を向上させる上で、UV照射と低温貯蔵の利用が有効であることを示している。

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我々は、好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus vulcanus RKNが低温光条件（31 °C）への順化応答として細胞凝集することを報告している。この凝集はセルラーゼ処理で解消した。また、3つあるセルロース合成酵素様遺伝子（Tvtll0007, Tvtlr1795, Tvtlr1930-33）のうち、Tvtll0007の破壊でこの凝集は生じなくなった。今回、この凝集とセルロースおよびその合成酵素遺伝子の関係を明らかにするため、T. vulcanusでのセルロース定量法を確立し、セルロースの蓄積量を測定した。野生株の通常環境（45 °C）でのセルロース蓄積は約5 μg / 4 x 10⁹ cells (細胞乾重量の約0.01 %に相当)だった。一方、低温光条件では24 hで約2倍に増加し、その後も細胞増殖に応じてそのレベルを保った。この蓄積は凝集よりやや先行していた。一方、細胞凝集が起こらないセルロース合成酵素の三重破壊株やTvtll0007破壊株でもセルロースの蓄積の誘導は起こらなかったが、Tvtlr1795やTvtlr1930-33破壊株では野生株と同様の蓄積が見られた。以上のことはTvtll0007がセルロース合成酵素遺伝子であり、そのセルロース合成が低温光条件での細胞凝集の主要な要因であることを示している。

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植物は，細胞内の糖（C）および窒素（N）の相対量比（C/N）を感知し，それに応じて代謝や成長を調節する能力「C/N応答機構」を備えている．これにより，栄養条件や生育段階に応じてCとNを効率的に利用している．我々はC/N応答機構の解明を目指し，その関連分子としてシロイヌナズナから単離した，ユビキチンリガーゼATL31の機能解析を進めている．これまでの研究から，ATL31はユビキチン・プロテアソーム系において何らかのタンパク質の分解を調節することで，C/N応答を制御していることが示されている（Sato et al. Plant Journal, 60: 852, 2009）．また，ATL31の相互作用タンパク質として同定された14-3-3は，ATL31を介してユビキチン化され分解されることが明らかとなった．14-3-3はリン酸化タンパク質に結合し，活性や細胞内局在など様々な分子機能を制御している．本研究では，ATL31と14-3-3の詳細な相互作用解析を実施した．BiFC法から，ATL31と14-3-3は細胞膜で相互作用することが示された．したがって，ATL31は14-3-3を分解に導くことで，その制御下にある細胞膜タンパク質の活性を変化させている可能性が示唆される．現在，ATL31による14-3-3分解の生理的機能についても解析を進めている．本発表ではこれらの解析結果を報告する．

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植物は生育環境の栄養条件に応じて代謝，成長を巧みに制御しながら生きている。特に，基幹代謝の根幹を担う炭素源（C）と窒素源（N）の相対量比（C/N）の影響は大きい。著者らは，未解明のままである植物C/N応答機構に着目し解析を行ってきた。これまでに，シロイヌナズナ新規C/N応答制御因子としてユビキチンリガーゼATL31を単離し（Sato et al., Plant J, 2009, 60:852-864），続くプロテオミクス解析からユビキチン化標的候補分子として14-3-3タンパク質が同定されている。
本研究では，atl31及びホモログのatl6機能欠損変異体に加えて，新たに作製した14-3-3過剰発現体を用いて生化学および遺伝学的な解析を行うことで，ATL31と14-3-3相互作用の生理的意義について検証を行った。その結果，野生型背景で過剰発現させた14-3-3タンパク質がC/N依存的に蓄積し，atl31atl6二重変異体背景では蓄積が促進されていた。プロテアソーム阻害剤処理でも同様の蓄積効果が示された。さらに，14-3-3過剰発現体はC/Nストレス過剰応答を示し，atl31atl6背景でより顕著になることが示された。これらの結果及び14-3-3の生化学的知見を含めて，ATL31と14-3-3タンパク質相互作用を介した植物C/N応答制御機構の可能性について議論したい。

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26Sプロテアソームは異常タンパク質の分解による品質管理、また、特定タンパク質の分解による分子スイッチとしての機能を担う。
シロイヌナズナの26Sプロテアソームサブユニット遺伝子の多くが重複して存在しているが、それぞれのパラログ分子が持つ機能はまだ明らかとなっていないものが多い。これまでの研究から、プロテアソームサブユニットパラログ欠損変異体が、環境ストレスに異なる応答を示すことを明らかとしており、サブユニットパラログ間での機能が異なることが示唆される。また、栄養ストレス条件に応じて、プロテアソームがもつ3つのペプチダーゼ活性が変化するということが報告されている。これらのことから、植物において、様々な環境ストレスに応じた「環境ストレス応答型」プロテアソームが存在し、機能していることが考えられる。そこで、各環境ストレス条件下におけるプロテアソームの構造・ペプチダーゼ活性の変化を明らかとすることで、植物の環境適応機構の解明を目指した。
そのために、プロテアソームのアフィニティー精製、および精製産物のMS解析によりサブユニットの同定系を確立した。更に、精製産物の二次元電気泳動によりパラログ分子の分離・同定に成功した。
現在、この実験系を用いて、各環境ストレス条件下でのプロテアソーム構造変換およびプロテアソーム活性の変化の解析を進めており、これについて報告する。

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Small Acidic Protein 1 (SMAP1)遺伝子は、アンチオーキシン抵抗性変異体aar1の原因遺伝子で、合成オーキシン2,4-Dの応答機構にも関わる因子として同定された遺伝子である。これまでの研究から、SMAP1は、2,4-D情報伝達系においてAUX/IAAタンパク質の分解より上流のステップで機能すると推定されている。また、SMAP1がシロイヌナズナ抽出液中でCOP9シグナロゾーム複合体(CSN)と結合していることが明らかにされている。そこで、今回、SMAP1とCSNとの関係について遺伝学的知見を得るために、aar1変異体とCSNのサブユニットCSN5Aの変異体csn5a-1を交配し、二重変異体の作出をおこなった。その結果、aar1-1 csn5a-1は、aar1-1およびcsn5a-1に比べ、胚軸が短く、根の生長も遅いなどの形態的特徴がみられた。根における2,4-D感受性も相対的に低下しており、生長した個体は著しくわい化していた。この特徴は、35S:SMAP1-GFPの導入で解消された。以上の結果より、aar1変異体はほとんど形態的な特徴や生長異常はみられないが、CSNが充分に機能しない状態では、SMAP1が植物の正常な生長に重要な役割を果たしていることが示唆された。

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植物は様々な刺激に応答してNADPHオキシダーゼを活性化させ，活性酸素種 (ROS)を積極的に生成する．シロイヌナズナNADPHオキシダーゼAtrbohDとAtrbohFは，感染防御応答やABAシグナル伝達に関与する．ヒト培養細胞を用いた異種発現解析の結果，AtrbohDとAtrbohFはCa²⁺結合とタンパク質リン酸化により活性化されることが明らかとなった．両者の制御機構は共通していたが，AtrbohDのROS生成能はAtrbohFより高かった．この原因を明らかにするため，ドメインスワップ解析をおこなった．AtrbohDとAtrbohFは，膜貫通領域を挟んでN末端側にCa²⁺結合ドメインを含む制御領域，C末端側に触媒領域をもつ．各領域間をスワップさせたキメラタンパク質をヒト培養細胞に発現させ，ROS生成活性を比較した．その結果，AtrbohFのC末端領域をAtrbohDにスワップすると活性が上昇した．このことから，AtrbohDとAtrbohFのROS生成活性を特徴づけるドメインは主にC末端側の触媒領域であることが示唆された．
次に，AtrbohFの活性化におけるCa²⁺とリン酸化の関係について解析した．その結果，AtrbohFのCa²⁺による活性化はタンパク質のリン酸化状態に依存する一方で，タンパク質リン酸化による活性化はCa²⁺に依存しない可能性が示唆された．

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気孔は、植物葉表皮に存在する水蒸気や二酸化炭素の通路となる2個の孔辺細胞に囲まれた小さな孔で、乾燥・高濃度二酸化炭素・暗黒・菌の感染・植物ホルモンなどによって閉じるが、そのシグナル伝達経路については不明な点が多い。cGMPがニトロ化された8-ニトロcGMPが一酸化窒素（NO）および活性酸素（ROS）依存的に生成され、気孔閉鎖を誘導することを前回の本会で報告したが、今大会ではROSの給源について調査したので報告する。
ABAにより誘導されるニトロcGMPの生成は、酸化的電子伝達阻害剤、光合成阻害剤、暗所によって、その生成は阻害される。すなわち、ROSの給源として、ミトコンドリアおよび葉緑体が関与していることが明らかになった。

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イネは、動物と同様に、3量体Gタンパク質α(Gα)、β(Gβ)、γ(Gγ)サブユニットを有する。イネGα遺伝子欠損変異体d1 は、WTと比べて各器官が矮化する。昨年までに、d1の矮化の原因は細胞数の減少であることを明らかにした。つまり、Gαは細胞数を正に制御する因子と考えられた。幼苗期のWTとd1 に、7つの植物ホルモンを投与したところ、d1 はブラシノライド(24-epi BL)に対する応答が低下していた。一方、ブラシノステロイド(BR)受容体は、細胞数と細胞長を正に制御すると考えられている。本年度は、d1-1 とd61-2（BR受容体変異体）との2重変異体を用いて、両シグナリングが、細胞数の制御に共通したパスウエイを利用しているか否かを検討した。
葉鞘において、d1-1d61-2 の組織長は相乗的に減少した。この結果は、両シグナリングは独立している可能性を示唆した。しかしながら、d1-1d61-2 の細胞数は、d1-1 と同じであった。この結果は、葉鞘の細胞数の制御に関しては、d1-1 はd61-2 の下流に位置することを示した。現在、節間、外頴に関しても、細胞数に関して、同様の上位性が認められるか否かの解析を進めている。

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植物の3量体Gタンパク質は、動物と同様に、αサブユニット(Gα)、βサブユニット(Gβ)、γサブユニット(Gγ)から構成されている。イネにおいては、Gα遺伝子(RGA1)欠失変異体d1は、矮性、直立葉、濃緑葉、短粒などの表現型を示すことから、Gαは形態形成を制御することが明らかとなった。しかし、Gβ遺伝子(RGB1)とγ遺伝子(RGG1)の欠失変異体は未だ単離されていない。そこで、Gβの機能を推定するため、WTとd1-5の各々に、RNAi法を用いてRGB1発現抑制個体を作出し、rgb1RNAi/WT、rgb1RNAi/d1-5と名付けた。rgb1RNAi/WT、rgb1RNAi/d1-5は矮性、ラミナジョイント部位と節の壊死、種子の小粒化、稔性低下などの異常を示した。細胞数の制御に関しては、Gβは、Gαとは独立して、細胞数を正に制御することが示唆された。ラミナジョイント部位と節の壊死は、d1-5では見られなかった新規な特性であった。これらの結果は、イネにおいてGβは、Gαとは独立した機能を有することを示唆した。

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イネは最もアルミニウム（Al）耐性の高い穀物の一つで，その高い耐性には複数の遺伝子が関与していることは我々が最近同定したアルミニウム応答性転写調節因子ART1において明らかにした．ART1は新奇のC2H2型zinc finger転写因子で，下流に30余りの遺伝子を制御している（Yamaji et al., 2009）．本研究では，下流の遺伝子の一つであるSTAR1のプロモーター領域を用いて，ART1特異的なシス配列の同定を試みた．酵母one-hybrid法によって結合領域を絞り込んだ後，Gel shift assayを用いて詳細な検討を行った結果，ART1のシス配列はGGN[T/g/a/C]V[C/A/g]S[C/G]であることを突き止めた．このシス配列は，ART1が制御する31個の遺伝子のうち28個の遺伝子のプロモーター配列上において確認された．このシス配列がART1によるAl応答に関与していることをin vivoで確認するため，35S 最少プロモーターとGFPレポーターの上流に1回，あるいは5回タンデムにつないだコンストラクトをART1とともにタバコの葉肉細胞プロトプラストに導入した．その結果，このシス配列とART1の共存下でアルミニウムに応答したGFPの発現増大がみられ，5回タンデムに並べたほうがより強い応答性を示した．

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Rice is the most Al-tolerant species among small-grain cereal crops. Recent identification of a C2H2-type zinc finger transcription factor ART1 for Al tolerance has revealed that multiple genes are implicated in high Al tolerance in rice. Here, we functionally characterized one of downstream genes of ART1, named OsCDT3. OsCDT3 encodes a predicted peptide of 53 amino acid residues, of which 14 (26.4%) are cysteine residues. OsCDT3 was mainly expressed in the roots and its expression was specifically induced by Al exposure. Furthermore, the Al-induced expression was not observed in art1 mutant. Analysis with transgenic plants carrying pOsCDT3::GFP showed that the signal was observed in all cells of the root tips. Both transient expression of GFP-OsCDT3 in onion epidermal cells and western blot analysis in rice roots showed that OsCDT3 was mainly localized to the plasma membrane. Knockdown of OsCDT3 resulted in increased sensitivity to Al in rice. Yeast expressing OsCDT3 showed increased tolerance to Al and decreased accumulation of Al, but the tolerance to Cd was not altered. Our results indicate that OsCDT3 is one of the components required for high Al tolerance in rice.

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イネ科の野生植物メリケンカルカヤは高いAl耐性を示す。その耐性機構を解析した結果、1)根でのAl吸収を極力抑え、根に集積しない。2) Alを根から地上部へ移動させて根中での毒性濃度を下げる。3) 地上部へ移行したAlを葉の棘状組織に集積させ、毒性効果の広がりを抑える。4)抗酸化酵素（SODとcatalaseなど）を高く誘導させることで、体内中のAl毒性で生じる酸化ストレスの発生を軽減させるなど、4つのAl耐性機構が存在していた。特に2)と3)はこの植物に特異的な機構であった。
一酸化窒素（以下、NO）は一般に環境ストレス下での応答機構で、シグナル伝達物質として機能する場合がある。そこでメリケンカルカヤではNOが同様の役割を持つのか、金属ストレス条件下で検討した。その結果、Al処理でNOは顕著に発生したが、Cd、Cr、Cu、Zn処理では生成されなかった。また今回検討した他のイネ科植物では、どの金属処理でも生成されなかった。ところでAl処理では根の伸長阻害だけでなく、酸化ストレスや核DNAの切断化なども起こる。そこで根でNOの生成を誘導させた後にAl処理したところ、脂質過酸化の発生は抑制できたが、核DNAの断片化は抑制されなかった。また根の伸長阻害にも変化がなかった。メリケンカルカヤでのNO生成は、Alストレス特異的な応答だが、そのAl耐性への関与は限定的であると思われた。

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ホンモンジゴケ（Scopelophila cataractae）は、寺社仏閣の銅葺き屋根の下など銅濃度の高い環境下に偏在的に生育し、銅を蓄積する興味深いコケ植物である。しかしながら、これまでにホンモンジゴケの銅応答性に関する知見はほとんど得られていない。そこで、我々はホンモンジゴケ原糸体培養株に対する銅添加の影響を解析した。これまでに、微量の銅を添加した培養条件では、ホンモンジゴケ原糸体は無性芽形成を誘導する一方で、高濃度の銅添加条件ではオーキシンシグナル系を介したカウロネマ細胞の分化が生じることを明らかにした。この結果は、ホンモンジゴケが環境中の銅濃度に応じた細胞分化制御機構を有することを示唆する。また、この細胞分化制御は、銅以外のいくつかの重金属添加では引き起こされなかった。これはホンモンジゴケが銅特異的なセンシング機構を有することを示唆すると共に、自然界での銅環境下への偏在性を説明しうると考えられる。現在、上記の結果の詳細と銅添加の細胞機能への影響などの解析を進めている。本発表では、これまでに明らかにした結果と、そこから示唆されるホンモンジゴケの持つユニークな生理機能について報告したい。

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低リン条件下で生育する植物は、酸性ホスファターゼ(APase)活性を高め、根から分泌して根圏の有機態リンを分解してリンの吸収を増加させたり体内の有機態リンを分解して循環利用したりすることが知られる。低リン耐性が極めて高いヤマモガシ科植物は、その耐性の分子機構についてはあまり知られていない。そこで、本研究はヤマモガシ科Hakea laurinaにおけるAPaseを単離し、その機能を調査することを目的とした。
低リン条件で水耕栽培したHakeaのクラスター根を材料としてcDNAを合成した。既知のAPaseの保存性の高い領域を用いて設計したプライマーを用いて3'-RACEを行って得られた約0.9 kbの断片のクローンライブラリーを作成し、塩基配列の決定を行った。既知のAPaseと相同性の高い4つの断片が得られ、それぞれHlSAP1-4と命名した。これらの塩基配列は互いに40-76%同一であった。最も出現頻度の高かったHlSAP1はシロバナルーピンの分泌性APaseと72%のアミノ酸配列が同一であり、分泌性APaseであると考えられた。
蛍光基質を用いてHakeaの根におけるAPase活性の局在を調査したところ、クラスター根の根端の表皮細胞と根毛に極めて高い活性が確認されたことから、クラスター根で発現するAPaseは大部分が細胞外に局在し、根圏からのリンの吸収に貢献していると推察された。

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ナタネ（Brassica napus L.）から得られる油脂は、食用油としてのみでなく、バイオディーゼルの原料としても重要である。ナタネの油脂生産量に影響を与える要因の1つとして、生育環境、特に養分環境があげられる。そこで、油脂生産向上を目的に、植物の生育過程における養分元素の吸収動態について測定したので報告する。
実験材料として、20℃、連続光で水耕栽培したB. napus（Westar）を用いた。経時的な元素吸収量を調べるため、10種類の元素について生育時期別の吸収量を調査した。種子を蒸留水で7日間栽培後に改変MGRL水耕液で水耕栽培した。播種後7日目～114日目の間、定期的に水耕液をサンプリングして元素濃度を測定し、元素濃度の減少量から24時間での新鮮重量あたりの吸収量を算出した。元素分析は、ICP-AES等を用いて定量した。多量必須元素(N、P、S、Mg、Ca)については、いずれも播種後日数が経過するにつれて減少した。微量必須元素（Fe、Mn、Zn、B、Cu）については、開花期前後でそれぞれ特徴的な吸収を示した。さらに、畑地で栽培したWestarについても元素分析を行い、各元素の吸収量を測定した。水耕栽培と土耕栽培での元素吸収動態を比較するために、RIリアルタイムイメージングシステムを用いてリンの吸収動態を撮影した。本研究は、株式会社コンポン研究所の助成を受けて行っている。

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植物の無機元素輸送に関わる遺伝子の探索において、植物体内の元素濃度の網羅解析であるイオノームは強力な解析法の一つである。イオノーム解析では、元素吸収・輸送に異常を示す多数の植物系統を、統計に基づいて定量的かつ客観的に評価できるという利点がある。当研究室でも、これまでArabidopsis Col-0とLerの多元素比較解析により、Mo輸送体遺伝子MOT1を同定することに成功している。そこで今回、この多元素比較という手段をより広範囲の遺伝子資源に適用するために、ナショナルバイオリソースプロジェクトから分譲を受けた約3000系統のメチルニトロソウレア処理イネ突然変異系統を用いて、大規模なイオノーム解析を進めている。一次スクリーニングでは、栽培スペースの省力化や酸分解の効率化を検討し、我々は128穴セルトレーで栽培したイネから導管液を個体ごとに採取し、組織の分解を経ずに、直接ICP-MSで分析できる手法を確立した。さらに、導管液採取の過程で得られるイネ地上部、および再生イネ個体の種子を系統ごとに保管し、一度の栽培期間で導管液、地上部、および種子に至るまで、同一個体で高次的にスクリーニングできるシステムを考案した。これにより、根から地上部および種子に至るまでの経路の多元素輸送を効率的にモニターすることが可能である。現在、種子中のCdが著しく増加した変異株など複数の候補株を得ている。

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塩応答を支配する遺伝子を見いだすため，シロイヌナズナ脱分化細胞にアクティベーション・タギングを適用し，塩耐性カルス [salt tolerant callus (stc)] 変異系統を選抜した (植物生理学会年会, 2007; 2009). 150～200 mM NaClに耐性の18 種類のstc系統のうち，stc5に注目した．stc5においては，アクティベーションのためのT-DNAが染色体の3箇所に挿入されていることをTAIL-PCRにより明らかにした．これらのうち，ABCトランスポーターの1種である AtWBC27をコードする遺伝子は，stc5カルスにおいて，野生系統に比べて塩ストレスなしで約2倍，塩ストレス下で約4倍高く発現していることをリアル・タイム PCRにより見いだした．AtWBC27 (以後WBC27) の欠損変異系統は，NaCl以外にKCl，KNO₃やLiClに対しても，高い感受性を示した．さらに，これらの欠損変異系統は，ABAに対しても感受性が高く，WBC27による塩耐性は，ABAシグナルと連動している可能性が示唆された． WBC27の塩耐性における機能を明らかにするために，WBC27の強制発現系統を作製している．塩ストレスおよびABA応答シグナル伝達ネットワークにおいて，WBC27 がどのような役割を演じているかに興味が持たれる．

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We have previously reported finding of AtbHLH106 for salt tolerance by activation-tagging of Arabidopsis calli (JSPP meeting, 2009). We here show the evidences that AtbHLH106 (hereafter bHLH106) plays an important role not only in salt regulation but also in cold and ABA responses. An additional homozygous knock-out line newly generated by self-pollination, has shown sensitivity to salt stress to confirm our previous results. Knock-out lines were also sensitive to cold stress and different concentrations of ABA in a solid medium. Rescue lines have also been developed for bHLH106, showing the phenotype of enhanced tolerance to different levels of salt stress. Knock-out, rescue and over-expression lines were subjected to GeneChip analysis (Affymetrix), resulting in a number of genes up-regulated or down-regulated compared with wild-type with or without salt stress. Electrophoresis mobility shift assay (EMSA) has confirmed the interaction between bHLH106 synthesized in a cell-free system (CFS) and promoter sequences of at least five genes. These results provide proof for involvement of the transcription factor bHLH106 in a network of salt stress regulation in Arabidopsis.

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我々はこれまでにシロイヌナズナのNAC転写因子であるANAC078過剰発現株(Ox-ANAC078)において、166遺伝子が野生株と比較し強光条件下で誘導を受けていることを報告している(Plant Cell Physiol. 2009)。興味深いことに、これらの中に20Sおよび26Sプロテアソームを構成する13遺伝子が含まれていた。このことはプロテアソームはANAC078により制御を受けている事を示唆する。そこで本研究ではANAC078を介したプロテアソーム制御機構の解明を試みた。
プロテアソームを構成する遺伝子群の強光(HL:1200 μmol/m²/s)に対する応答を解析したところ、複数の遺伝子が誘導され、Ox-ANAC078では通常およびHL条件下において野性株よりも誘導されていた。また、26Sおよび20Sプロテアソームレベルについて解析を行ったところ、野性株と比較してOx-ANAC078では顕著な増加が認められた。またキモトリプシン様活性の測定を行ったところ、同様にOx-ANAC078で顕著な上昇が認められた。以上のことから、ANAC078は20Sおよび26Sプロテアソームレベルの制御に機能していることが明らかになった。

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VDAC(Voltage-dependent anion channel)は、ミトコンドリア外膜の主要タンパク質であり、動物細胞においては、エネルギー生産やアポトーシス誘導に重要な働きをしていることが知られている。しかしながら、植物におけるVDACの機能については、未だ多くのことが明らかにされていない。これまで我々は、Nicotiana benthamianaのVDACが、Pseudomonas chicoriiに対する非宿主抵抗性反応や、ヒトBax誘導性のHR様植物細胞死制御に関与することを報告しており、植物においてもミトコンドリアが、病原菌抵抗性反応や細胞死制御に深く関わることが示唆された。今回、Arabidopsis thalianaに保存されている全VDACに着目し、細胞内局在性、組織化学的観察、さらには、それぞれのノックアウト植物を用いた詳細な機能解析を通じて、AtVDAC個々の機能を明らかにした。さらに、ミトコンドリア局在型のAtVDAC1は、P.syringaeに対する抵抗性反応にも重要な働きをしていることを証明した。

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RGSV(Rice grassy stunt virus)の病徴は宿主が異常に多くの分げつを示すことである。植物の分げつは、頂芽優勢の破壊によって起こり、側芽の形成と側芽の伸長の2つのプロセスに分かれることが知られている。前者に関係する転写因子群(MOC1, RAX, REV, LAX等)の関与が明らかにされ、後者にはauxinとその輸送系、ストリゴラクトン(SL)、サイトカイニン、ジベレリンが正や負の関連を持っていることが知られている。RGSV感染時の宿主遺伝子応答を解析したところ、SLの合成系は抑制、GAの不活化（GAoxidase）の発現上昇が見られ、それ以外の関連遺伝子群の発現には顕著な変化が見られなかった。他のウイルス感染でもGA合成、不活化系の変化は観察されているがSLとGAが同時に起こっているのはRGSV感染時のみであった。次にRDV(Rice dwarf virus)の強中弱（S, D-84, O）系統の感染による表現系と宿主遺伝子応答の関係について解析した。RDVの病徴は萎縮であり、特に細胞壁合成系の遺伝子群等の発現抑制が見られるが、JAを介した防御系の応答が活発に誘導されている。RDV感染を妨げる宿主側の変異としてrim1-1変異が見いだされ、その宿主側での機能も解析されているが今回はウイルス感染応答の解析から見えてきたRIM1遺伝子の機能についても発表する。

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我々は、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を利用して、病害抵抗性遺伝子（R遺伝子）の機能について解析することを目指している。P. patensから見出されたPpC24遺伝子（Akita and Valkonen 2002）は、TIR-NBS-LRR型R遺伝子に特徴的なNBS（nucleotide binding site）の相同領域をもつ。このNBS上流にはToll and interleukin-1receptor like domain （TIR）は存在せず、kinaseと推定される領域が認められるが、下流のDNA配列には、R遺伝子のleucine rich repeat（LRR）との相同性を有する約1950bpのORFが観察される。これまでNBS下流の転写物は明らかでなかったが、本研究から、オルタナティブスプライシングによりその転写産物が少なくとも3種類存在するとわかった。推定kinase領域からの長い転写産物が複数種生成されていると予想されるが、NBS-LRR間にストップコドンが観察されることから、さらに検討が必要である。このKinase-NBS-LRRと相同的な配列は、P. patensゲノム上にPpC24を含めて少なくとも4箇所見られた。PpC24遺伝子のkinase領域のノックアウト株を作出したところ、形態的には野生型と変化なかった。

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植物固有の転写因子であるエチレン応答性因子 (ERF) は，転写因子として最大規模のファミリーを形成しており，様々な環境ストレス応答，病傷害抵抗性に関与することが明らかにされてきている．我々はこれまでに，転写抑制因子であるタバコNtERF3が，タバコモザイクウイルス (TMV) 感染時のN遺伝子による過敏感反応 (HR) 誘導に伴い発現誘導され，アグロバクテリウム浸潤法によるNtERF3の一過的過剰発現がタバコにHR様細胞死を誘導することを明らかにした．NtERF3はそのC末端領域にEAR転写抑制モチーフを有しているが，EARモチーフを有するナズナ，イネの転写抑制型ERFにも，細胞死誘導能を有する相同遺伝子が複数個見つかった．また，同様にEARモチーフを有し，細胞死誘導能を有するタバコERFも新たに複数個同定された．細胞死誘導能を有するタバコERFの中には，TMV感染によるHR誘導時に，NtERF3と同様に発現誘導されるものがあった．これらの結果から，NtERF3が属すサブグループ中には，HR細胞死誘導に関与する転写抑制型ERFが複数存在していることが考えられた．現在，ドミナントネガティブ型NtERF3による形質転換タバコを作製し，HR細胞死誘導，及びTMV抵抗性への影響を解析中である．

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イネにABA処理するといもち病罹病性が促進されることが知られている。これまで我々は、ABAがイネのSAシグナル伝達経路のキー制御因子であるWRKY45およびOsNPR1の遺伝子発現を抑制することを報告した。また、いもち病菌接種3-4 日後からイネの内生ABA量が徐々に増加する。本研究では、感染初期における感染部位周辺での防御応答にイネのABAが及ぼす影響を解析するため、ABA分解酵素OsABA8ox1またはABAシグナル伝達のドミナント・ネガティブ変異遺伝子OsABI(G→A)をdexamethazone（DEX）誘導的に発現するイネを用いていもち病菌感染過程を解析した。
ABAを前処理したイネにいもち病菌を接種すると病斑数が増加するが、接種後のABA処理は病徴に影響しなかった。また、DEX誘導的にOsABA8ox1またはOsABI(G→A)を一過的に発現誘導すると、いずれの場合も、菌接種前に発現誘導すると病斑数が減少したのに対し、接種後の処理では減少しなかった。これらのことから、感染初期の内生ABA量またはシグナル伝達がイネの防御応答に重要と考えられた。また、葉鞘接種後の細胞を観察した結果、DEX処理した葉鞘では、宿主細胞への菌糸侵入の抑制、イネ細胞の自家蛍光の増加、カロース沈着の減少が観察された。これらの反応とSAシグナル伝達経路との関係についてさらに解析を行っている。

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サリチル酸（SA）は植物の病害抵抗性の二次シグナル物質として主要な役割を担うが，SAシグナル伝達の調節機構については不明な点が多い．本研究では，シロイヌナズナとキュウリモザイクウイルス黄斑系統（CMY-Y）のモデル感染系を用い， SAシグナル伝達の調節機構の解明を目指した．上記の感染系は，R遺伝子依存的かつ細胞死が誘導されない抵抗反応である高度抵抗性（extreme resistance; ER）が誘導される．まず，CMV-Y感染後の時系列メタボロームデータを取得し代謝プロファイル解析に供試した．その結果，接種後1時間以内に特徴的な代謝変動が認められた．そこで感染初期応答に着目し，CMV-Y感染後のSAやSA誘導体の内生量と，SA生合成またはSA代謝に関与することが知られている酵素遺伝子群の発現量を調べた．その結果，CMV-Y接種後1時間以内にSA配糖化酵素遺伝子UGT74F1の発現が抑制されることを見出した．UGT74F1は傷害ストレス応答性遺伝子であり，CMV-Y接種時のコントロール処理区（カーボランダム処理）で発現が誘導される．実際，ERが誘導される感染系ではSA配糖体の蓄積量が低く抑えられ，CMV-Y接種後3時間以降にSA蓄積量が増加した．以上より，植物のウイルス抵抗性時のSAシグナル伝達の活性化は，SA配糖化の負の制御機構が重要な役割を担う可能性が考えられた．

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サリチル酸は植物の感染防御応答における重要なシグナル分子であり、その合成は病原菌の感染で誘導される。サリチル酸合成は葉緑体と深く関係しており、シロイヌナズナの場合、葉緑体に局在するイソコリスミ酸合成酵素（ICS）によってコリスミ酸から合成される。また、サリチル酸合成が光依存性であることも報告されている。一方、我々は、葉緑体チラコイド膜に局在するCa2+結合タンパク質CASが、病原体の共通分子パターンPAMPs が誘導する防御応答と、非親和性菌感染時に見られる過敏感細胞死などの強い防御応答の両方に関与することを明らかにし、植物の感染防御応答において葉緑体が重要な働きをしている可能性を示唆した（植村他 第51回植物生理学会年会）。本研究では、植物の感染防御応答における葉緑体タンパク質CASの役割を明らかにするために、植物ホルモンの網羅的解析技術を用い（Izumi et al.Anal Chim Acta 2009）、細菌性エリシターflg22処理に対する植物ホルモンの挙動を詳細に解析した。その結果、CASノックアウト変異体(cas-1)では、flg22が誘導するサリチル酸合成が抑制されることを明らかにした。また、cas-1ではサリチル酸を介して誘導されるPR1遺伝子の発現誘導も見られなかった。これらの結果は、葉緑体タンパク質CASがサリチル酸の合成制御に関わっている可能性を示唆する。

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病原菌は病原性タンパク質であるエフェクターを植物の細胞内に多数送り込み、PAMP (pathogen-associated molecular pattern)の認識シグナルにより誘導される防御反応を撹乱し抑制する。それに対して植物は抵抗性タンパク質（Rタンパク質）によってエフェクターを認識し、より強い防御反応を誘導する。ジャガイモ疫病菌(Phytophthora infestans)のエフェクターAVR3aは植物細胞内へ入り、PAMPであるINF1の認識シグナルを抑制するが、そのメカニズムはよくわかっていない。アミノ酸配列からはその機能を推測することができないため、タンパク質の立体構造解析を行った。その結果、AVR3aは4つのαヘリックスが束になった構造を持つことが明らかとなった。表面電荷分布を基に解析したところ、正電荷のアミノ酸が集中する特徴的な領域が膜脂質であるホスファチジルイノシトールリン酸の結合に重要であることがわかった。この領域に変異を持つAVR3aは、Rタンパク質であるR3aによって認識されるが、INF1の認識シグナルを抑制することができなかった。このことから、ホスファチジルイノシトールリン酸の結合がAVR3aの病原性の機能に重要な役割を持つことが示唆された。本発表では、AVR3aの立体構造から見えてきた脂質結合領域と病原性の機能との関係について議論する。

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我々はケミカルバイオロジー手法を用いて抵抗性遺伝子依存性の防御機構の解明を行っている。シロイヌナズナ培養細胞とトマト斑葉細菌病菌DC3000 avrRpm1株を96穴プレート上で感染させる独自の系を用い、市販の多様性化合物ライブラリー10,000個の大規模スクリーニングから過敏感細胞死を亢進する低分子有機化合物を7種類単離した。この中の一つであるCB_6は野生型及びSA欠損sid2変異体に添加すると防御遺伝子PR1の発現を誘導し、SAアナログ活性があることがわかった。一方でSA内生量には影響しなかったことから、CB_6はSA合成の正のフィードバック制御には関与しないと考えられた。またCB_6はSAのようにジャスモン酸(JA)によるLOX2遺伝子の発現を抑制せず、SAがJAシグナルに対して示す拮抗作用は持たないことがわかった。現在、このSAの働きを部分的に模倣するCB_6の標的タンパク質同定を複数のアプローチで進めている。化学遺伝学的手法としてCB_6の生育抑制効果に対して非感受性を示すシロイヌナズナsgi (SA agonist insensitive)変異体を14個単離し、それらのマップベースクローニングを進めている。また、生化学的手法としてビオチン化プローブによる精製実験及び酵母3ハイブリッド法を利用した探索法を検討している。

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我々はケミカルバイオロジー手法によるサリチル酸(SA)を介した病害抵抗性機構の解明を目指している。これまでにシロイヌナズナ培養細胞とトマト斑葉細菌病菌(Pst) DC3000 Rpm1株を用いた感染系を用い、市販の多様性化合物ライブラリーの大規模スクリーニングから過敏感細胞死亢進剤を7個単離した。今回、互いに構造類似性を示すCB_8とCB_9及びCB_11とCB_12の作用機序について報告する。これらの薬剤はシロイヌナズナに添加すると、病原性及び非病原性のPstに対する抵抗性を誘導した。防御遺伝子PR1の発現解析から、これらの薬剤にはSAアナログ活性はなく、感染時の防御応答を増強する働きを持つことがわかった。そこで薬剤の働きとしてSA不活性化の阻害を想定し、SA 2-O-β-D-glucose（SAG）を生成する配糖化酵素（SAGT）UGT74F1への影響を調べた。その結果、CB_12を除く薬剤とそれらの類縁体がSAGT活性を阻害することを見出し、酵素反応速度論解析からSAGTの反応機構及び薬剤の阻害様式を明らかにした。これら薬剤のSAGT阻害並びにHR亢進における有効濃度は一致しており、薬剤作用はSA配糖化阻害に伴う遊離SA量の増加と考えられた。シロイヌナズナのUGT74F1欠損株では耐病性が向上していたことから、耐病性付与技術の開発戦略の標的としてのSAGTの有効性が示された。

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高等植物の葉緑体電子伝達成分であるプラストキノン(PQ)は、その酸化還元により電子移動に関与している。現在までに、PQの酸化還元測定には、直接的な方法としてHPLCによる分析、間接的にはクロロフィル蛍光、ポーロラグラフィによる測定があった。しかし、HPLC法により求められるPQには、光照射により酸化還元状態が変化するphotoactive PQ以外に光条件（電子伝達）に関与しないnon-photoactive PQが含まれていた。実際、暗中の葉片のPQの60％以上が還元型で存在している場合もあり、正確なphotoactive PQ測定法が必要であった。その中で、Krukら(2006)が、阻害剤の組み合わせによりphoto, non-photoactive PQsの分別測定が可能であることを示した。しかしながら、Kruk法ではphotoactive PQの酸化還元の範囲を超えるPQ酸化還元が得られることが分かった。このことから、Kruk法の改良を行うことでphotoactive quinoneの定量を行い、その酸化還元状態とクロロフィル蛍光、光強度の関係について調べた。

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シアノバクテリアNostoc sp. PCC 7422株を親株として作成した取込み型ヒドロゲナーゼ遺伝子挿入破壊株（ΔHup株）は、密閉容器内において酸素発生条件下で光生物的にニトロゲナーゼにより水素を約30%まで蓄積した。硝酸塩を含む培地から含まない培地に移して2日までを誘導期、それ以降を水素生産期とし、Arを主体とし窒素とCO₂の濃度を変えた培養気相下で、水素の蓄積量と水素生産の持続性に対する影響について調べた。既に報告したように、水素生産期の窒素濃度が高いと水素生産活性は低く、活性の持続には濃度約0.5-1%が最適であった。窒素濃度を0.5%とし、誘導期と水素生産期で培養気相中のCO₂濃度を0.03%、1%、5%として培養した場合、誘導期、水素生産期ともに濃度5%のものが最終的水素濃度が高かった。水素生産期で約一週間毎に気相の回収および気相更新を行ったところ、培地を更新することなく60日以上にわたって水素の生産が維持された。水素蓄積実験の培養容器としては、ブチルゴム栓付きの密閉容器を用いているが、水素と酸素の放出、CO₂の吸収と放出によって、時間の経過とともに内圧が上昇してしまう。クレハ社のBeselaバッグは、透明で比較的水素バリアー性が高い。バッグから分析用に気体を採取するためのガスサンプリングデバイスを開発したが、これらを用いた水素蓄積の測定結果についても報告する。

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シアノバクテリアは呼吸電子伝達鎖と光合成電子伝達鎖がプラストキノンプールを共有しており、光化学系IIとNADH脱水素酵素複合体が共にプラストキノンを還元する。呼吸電子伝達鎖が光合成電子伝達に与える影響を明らかにするために、Synechocystis sp. PCC 6803のNADH脱水素酵素複合体の第5サブユニットをコードする遺伝子であるndhF1 (slr0844)を破壊した株を解析した。PAMクロロフィル蛍光測定により求めた生育光強度(20μmol/m²/s)での光合成電子伝達の実効量子収率Φ_IIはndhF1破壊株の方が野生株よりも高くなっていた。しかしながら、酸素電極を用いて測定した飽和光照射下での光合成電子伝達活性は、野生型とndhF1破壊株で大きな違いは見られなかった。低温クロロフィル蛍光スペクトルの測定によって、野生型は15分間の暗順応によりステート2になるが、ndhF1破壊株では暗順応をしてもステート2になりにくいことが明らかになった。呼吸の末端酸化酵素の阻害剤であるKCNを添加するとどちらの株も暗順応でステート2になる。以上の結果は、ndhF1破壊株においては、NADH脱水素酵素複合体の活性低下によりプラストキノンプールがより酸化的になり、ステート2になりにくくなった結果、高い光合成の実効収率を示すと結論できる。

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単細胞で窒素固定能を示す（ニトロゲナーゼ遺伝子を持つ）シアノバクテリアは、貯蔵多糖として可溶性のグリコーゲンではなく、緑色植物のアミロペクチンに類似した不溶性のα-グルカンを蓄積する。その1種、Cyanobacterium sp. NBRC 102756 株では、鉄栄養欠乏により多糖蓄積量が乾重あたり 15% から 40% に増大した。本研究では、同株の多糖生産能に及ぼす鉄栄養、光照射条件を検討した。鉄添加条件（0.47 ppm Fe）では、培養開始（前培養からの希釈）後 24 時間以内は、生育速度が顕著に高いことに比較して多糖合成量が少なく、結果として 24 時間後、細胞あたりの多糖量は減少する傾向が認められた。一方、鉄欠乏条件では、培養開始直後に多糖量の急激な増加が認められた。バイオマス生産に及ぼすエネルギー投入量の効率化を図る目的で、異なる光照射条件（明暗サイクル）での多糖生産量を調べた。鉄添加条件において培養開始後 120 時間後の多糖蓄積量は、連続光照射と 18 h 明/ 6 h 暗条件でほぼ同等であった。その後、6 h 明/ 18 h 暗条件まで、照射時間が短くなるとともに多糖量は減少した。鉄欠乏条件では、連続光照射条件から、照射時間の減少に応じて多糖蓄積量は連続的に低下した。暗期において、細胞内の多糖含量にはほとんど変化は認められなかった。

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葉緑体では活性酸素種はチラコイド膜の表面または疎水領域で生成するため，膜脂質の不飽和脂肪酸は容易に酸化され，さらに分解されて毒性の高いα,β-不飽和アルデヒド（活性アルデヒド；RAL）を生じる。例えばタバコ葉では強光照射によりアクロレイン，(E)-2-ペンテナールなどのRALが増大するがRAL消去能を高めた組換えタバコは強光耐性，パラコート耐性を示す。またRALは葉緑体カルビン回路のチオール酵素を強く阻害する。すなわち，RALは細胞の酸化的損傷の一因である。本研究では，不飽和脂肪酸に由来する多様なRALのうちどれがもっとも強く光合成を阻害するか評価した。葉緑体ストロマ画分に様々なアルデヒドを加え，一定時間後にカルビン回路酵素および活性酸素消去系酵素の活性を測定した。PRK，GAPDH，DHAレダクターゼはRALにより敏感に失活した。リノレン酸の13位過酸化物から生じる4-oxo-(E)-2-hexenal（OHE）はこれらの標的酵素を阻害し，その半阻害濃度は，既知RALのうち最も強毒性のアクロレインと同程度だった。OHEは，傷害応答アルデヒド (Z)-3-hexenalをチラコイド膜に与えることで生じるが，グルタチオンにより効率よく消去される。すなわち，傷害部位で生じた(Z)-3-hexenalは健全部位の光合成を潜在的に阻害しうるが，その効果はグルタチオンにより抑制されている。

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光合成電子伝達にはLinear electron transport（LET）とPSI Cyclic electron transport（CET）の二つの経路があり、CETはATP合成と光ストレスからの防御の両方の機能を有している。また、CETにおいてPGR5依存経路とNDH依存経路の二つの経路の存在が明らかになっている。アンチマイシンA（AA）はミトコンドリアの電子伝達阻害剤であるが、葉緑体のPGR5依存CETを特異的に阻害する。しかしAAは阻害に高い濃度が必要であり、CET以外の反応も阻害するため、理想的なCETの阻害剤とは言えない。またPGR5タンパク質のアミノ酸置換がAA耐性を付与することから、AAはミトコンドリアと異なり、PGR5依存CETを触媒する仮想の酵素であるFQRのキノン結合サイトに直接相互作用しない可能性がある。本研究では、より効果的なCET阻害剤の探索を目的として、シロイヌナズナの野生株とNDH依存経路・PGR5依存経路をそれぞれ欠損したcrr2-2およびpgr5を用い、種々の置換フェノール類のCET阻害活性をMini-PAMを用いた蛍光測定により評価した。今回AAの数十分の一の濃度でAAと同等の阻害活性を示す化合物を発見したので報告する。また、おそらくNDH依存経路に強い阻害活性を示す化合物も見出したので併せて報告する。

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