葉の細胞間隙から葉緑体へのCO₂拡散は、光合成の重要な律速要因である。この拡散のしやすさをあらわす葉肉コンダクタンス(g_m)は、乾燥ストレス時に低下するという報告も多い。g_mの測定には、ガス交換測定による細胞間隙CO₂濃度(C_i)の精確な測定が前提となる。しかし、植物は、乾燥条件下で気孔を閉じるので、気孔コンダクタンス(g_s)が低下し、さらには気孔開度の葉面における不均一性(パッチネス)も引き起こしてしまう。過去に行われた研究は、この点を考慮したものは少なく、C_iの測定値は精確性に欠ける。
われわれは、気孔開閉によるg_sの低下や、パッチネスの問題を回避するためにABA合成経路変異体Nicotiana plumbaginifolia (aba1)を用いた実験系の確立を試みた。乾燥ストレスの指標として、水を十分量与えた時の土壌含水量を100%とし、含水量を20%程度まで低下させた。このときWTにおいてg_sが大きく減少するのに対し、aba1では顕著な減少がみられなかった。本研究では、この系を用いて、乾燥時、乾燥からの回復時におけるg_mの経時変化を測定している。同時に、g_mの変化の原因と考えられる、細胞膜タンパク質アクアポリン量、細胞間隙に面している葉緑体の面積(S_c)、カルボニックアンヒドラーゼ活性についても測定している。これらを合わせて報告する予定である。

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光阻害の原因がクロロフィルによる吸光だとするエクセス説と、マンガンによる吸光だとするマンガン説との間の論争に決着を見いだすべく、異なる色の光により葉内にどのような光阻害の勾配ができるかを調べた。
リンコマイシン処理によりD1タンパク質の修復を阻害したリーフディスクを、白、青、緑、赤の光で光阻害処理した。光ファイバーを用いたクロロフィル蛍光測定装置とマニュピレーターを組み合わせ、先端を細くした光ファイバーを葉内に差し込んで行く事で、葉内の各深さでのクロロフィル蛍光の測定が可能となった。また、光阻害の勾配の結果を従来のクロロフィル蛍光測定装置の結果と比較した。
葉の表面付近では青、赤、緑の順で光阻害が強く起こっていたが、葉の内部では青、緑、赤の順に変わっていた。それぞれクロロフィルの吸光波長スペクトルおよびマンガンの吸光波長スペクトルと一致するため、二つのメカニズムの両方が関与していないと説明できない結果であった。これは我々の先行研究Oguchi et al. 2009 PCPを支持する結果である。
また、光阻害された葉のFv/Fmについて、従来のクロロフィル蛍光測定装置で赤色の測定光を使用しているものはこれを過大評価しており、青色の測定光を使用しているものは過小評価している事が明らかになった。それぞれ、光阻害の勾配がある葉の深い部分と浅い部分を測定しているためであると考えられる。

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樹林の下層部（林床）の光環境は、太陽光が樹木の影響を強く受けた低強度の間接光と、影響の少ない高強度の直達光から成る。直達光による光強度の上昇・下降は非常に速く、強光状態は数秒から数分間続く。林床には、しばしば、直達光が短時間に集中して、断続的に差し込む。林床植物は、光変動によるエネルギー流入の激しい変動に対応して生存しなくてはならない。林床植物のクワズイモ（Alocasia odora）を、林床（変動光）と蛍光灯下（連続光）で栽培し、それらの葉に、一定時間の強光/弱光を交互照射した。光化学系II由来のクロロフィル蛍光を測定した結果、連続光個体の電子伝達速度（ETR）は強光に対する定常値が強光/弱光の周期を重ねる毎に低下したのに対し、変動光個体は素早く応答し、強光時のETRは一定値を保った。変動光と同強度の強光を連続照射した場合、両個体のETRとも光阻害を受けなかった。この結果は、連続光個体では光合成が光変動によって抑制されることを示唆している。一方、変動光個体の光変動に対する素早い応答は、葉緑体チラコイド膜のオルタナティブな電子伝達経路の関与を示唆していた。光変動による光合成の抑制と、光変動に対する素早い応答をもたらすメカニズムの解明を目指し、クワズイモに加えてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の変異体を使った実験を進めている。

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植物は光合成により炭素を固定しているが、固定した炭素の約半分を呼吸によって放出している。陸上植物の呼吸量は、化石燃料や森林破壊による人為的な炭素放出量の6倍にも上ると言われている (Amthor 1995, Canadell et al. 2007)。高CO₂条件下では、多くの植物種において葉面積あたりの光合成速度が増加することが報告されている (Long et al. 2004)。一方、高CO₂条件での呼吸速度については明確な傾向や変化の要因についてはまだ不明な点が多い (Wang & Curtis 2002)。一般に植物の呼吸速度は、基質量とATP消費速度に律速されている。高CO₂条件において呼吸速度が変化する場合、基質量あるいはATP消費速度の変化によるものであると予想される。
そこで本研究では、高CO₂条件での呼吸速度の日周変化とそのときの律速要因を明らかにすることを目的とした。390 ppmvおよび780 ppmvのCO₂濃度下でシロイヌナズナを栽培し、20日目の植物体を用いて、夜明け前と日没前の呼吸速度の律速要因を調べた。栽培CO₂濃度による呼吸速度の応答性の違いが見られた。さらに、その変化の要因を明らかにするために、夜明け前、日中、日没前の一次代謝産物をCE-MSにより定量を行い、呼吸速度との関連について考察する予定である。

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アイスプラントは播種後5週目に水ストレスを受けると、約10日間で光合成がC3型から多肉植物型酸代謝（CAM）型になる。このとき、多くのCAM関連酵素が転写レベルで誘導される。しかし、これらの遺伝子上流域の機能的解析は2,3の例を除きされていない。我々はCAM化で誘導されるプラスチド型グルコース-6-リン酸/リン酸輸送体遺伝子（McGPT2）の転写活性制御機構を明らかにするため、McGPT2の転写開始点上流約-2.6 kbとその5'側を欠失させたDNA断片をホタル・ルシフェラーゼORFとつないで、パーティクルガンでC3型およびCAM型アイスプラント葉組織に導入し、プロモーター活性を比較した。その結果、-0.24 kbまでの領域でCAM化での誘導シグナルを、-0.24～-0.7 kb領域付近で日周期による制御シグナルを、それぞれ受けている可能性が示唆された。また、アイスプラントは、植物体がまだ小さい播種後4週目に水ストレスを受けるとCAM化に15日以上かかる。そこで、播種後4週目の植物にストレスをかけ、McGPT2上流域のプロモーター活性を比較したところ、その活性上昇もCAM化同様、大きく遅れることがわかった。このことはアイスプラントのCAM化能は植物の生育にも転写レベルで影響を受けることを示唆している。

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植物は過剰な光エネルギーに対する防御機構を持っている。そのうちの一つに、過剰に吸収した光エネルギーを熱として安全に消去する機構がある。このような機構は、必要以上に光エネルギーを消去しないように環境に応じて確実に制御されることが重要であるが、その制御機構の詳細は分かっていない部分も多い。今回、光合成生物の強光順化に関する新たな知見を得る目的で、発現パターンやホモログの存在などから強光順化に関わる機能未知遺伝子（LAP1:Light Acclimation Protein1）を同定し、その機能解析を行った。シロイヌナズナlap1変異体は、葉がペールグリーンになり、この傾向は強光条件でより顕著になった。また、クロロフィル蛍光測定法により、その変異体は非光化学消光（NPQ）が野生型に比べて高かった。これらのことから、LAP1タンパク質が強光順化に関与する可能性が示唆された。LAP1はシアノバクテリアを含む酸素発生型光合成生物に高度に保存されており、シアノバクテリアのLAP1ホモログも、現在機能解析を進めている。それらの結果を合わせ、具体的なLAP1の機能を議論する。

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シアノバクテリアは光環境に応じて遺伝子発現を制御し、PSI反応中心タンパク質をコードするpsaAはその主要な標的遺伝子の一つである。以前われわれはレスポンスレギュレーターRpaAがpsaA遺伝子上流配列に特異的に結合しうることを報告した。Synechococcus elongatusではRpaAが概日リズム依存的にヒスチジンキナーゼSasAによりリン酸化されること、SynechocystisではHik8 (SasA) が従属栄養時に糖代謝関連遺伝子群の発現に関与することが報告されている。本研究ではSynechocystisを用いてグルコース及び光応答時のpsaA発現におけるRpaAの関与を検討した。psaAの発現は暗所で停止し、光照射またはグルコース添加により誘導されるが、rpaA破壊株やhik8破壊株では誘導時の転写活性が顕著に低下していた。転写誘導は電子伝達鎖阻害剤により抑制されたことから、電子伝達鎖のレドクス状態に応答してHik8-RpaAを介したpsaA誘導がおこることが示唆された。一方、RpaAの結合が上流配列にみられないPSIIアンテナタンパク質cpcBやHik8による制御が報告されている解糖系遺伝子の発現にもrpaA破壊の影響があらわれたことから、RpaAは間接的な発現制御にも関与すると考えられる。

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緑藻クラミドモナスを含む水生光合成生物は、光照射下のCO₂欠乏条件で無機炭素濃縮機構 (carbon-concentrating mechanism: CCM) を誘導する。クラミドモナスにおいてCCMはマスター制御因子CCM1（CIA5）による制御を受けており、ccm1変異株では低CO₂条件（0.04% CO₂を含む空気を通気した条件）で51個の遺伝子を誘導することができない。既にcDNAアレイを用いて38個の無機炭素濃縮機構関連遺伝子が推定されている。本研究ではcDNAアレイにスポットされていない他の無機炭素濃縮機構関連遺伝子を同定するためにRNA-seq法を用いて発現解析を行った。野生株と変異株からRNAを抽出してRNA-seqを行い、36塩基の配列データを得た。得られた配列についてKyoto Chlamydomonas Genome Database (KCGD http://chlamy.pmb.lif.kyoto-u.ac.jp/) を用いて解析を行い、CCM1制御下の低CO₂誘導遺伝子について議論する。

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高等植物の葉緑体には，チオレドキシン (Trx) を介した光依存的な酸化還元による活性調節機構が存在し，カルビン回路など多くの経路がこれにより制御されている．一方，水圏の主要な一次生産者である珪藻類の葉緑体では Trx の存在は確認されているものの，その標的分子及び生理的意義は知られていない．本研究では，海洋性珪藻 Phaeodactylum tricornutum の葉緑体における無機炭素獲得系の酸化還元制御について調べた．P. tricornutum には二つのピレノイド局在型βカーボニックアンヒドラーゼ，PtCA1 及び 2 が存在し，無機炭素濃縮機構に重要な役割を担うと考えられている．これらの成熟型を大腸菌で発現し，シロイヌナズナ由来の二種の葉緑体型Trx (AtTrx-f2/-m2) 及び珪藻由来の葉緑体型 Trx (PtTrxM) 存在下及び非存在下でCA 活性を比較した．Trx と DTT を共添加したときに CA 活性が大幅に上昇したことから，PtCA1 及び 2 が Trx の標的酵素の一つであることが示唆された．PtCA1 及び 2 の活性部位以外の二つの Cysを Ser に置換した変異体を作製し，CA 活性測定及び非還元 SDS-PAGE を行った．その結果，分子内ジスルフィド結合を形成することによって，CAが不活性化されることが明らかになった．

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枯草菌RuBisCO-like protein (RLP) は硫黄代謝においてジケトメチルチオペンチルリン酸のエノール化を触媒し、この反応はRuBisCOのCO₂固定反応の初発段階であるリブロースビスリン酸のエノール化と類似している。両酵素がエノール化を触媒するにはCO₂によるK201のカルバミル化が必須であり、この触媒塩基の形成により酵素が活性化状態となる。興味深いことに、RLPは低CO₂濃度下(約2μM)においてRuBisCOよりも高い活性化率を示す。RLPのこの性質に関与する残基として、カルバメート酸素と水素結合(2.8Å)を形成するH294が予想された。H294Q、N、A変異RLPはk_catが野生型の2－8%、K_mが2.2－3倍に変化し、最大活性発揮に野生型より高いCO₂濃度を必要とした。この結果から、RLPのH294は低CO₂濃度下での活性化維持に寄与すると予想された。H294は全てのRuBisCOとRLPで保存されているが、植物RuBisCOではH294とカルバメートの距離が3.4Å以上離れており、この残基の活性化維持への寄与は低いと考えられた。植物はRuBisCOの活性化調節により環境に応じた光合成最適化を可能としている。植物RuBisCOはH294の活性化維持機能を低下させることで、活性化が調節可能なRuBisCOへと適応させているのかもしれない。

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近年著しく増加する大気中のCO₂濃度は、今世紀末には現在の約2倍に到達すると推定され全世界的な問題となっている。一方で、このCO₂濃度の上昇は光合成量を増大させて農作物の収量の増加やバイオ燃料などの有用物質生産量の増加に結びつく可能性も期待される。しかしながら、一部の植物では高CO₂条件下で育成しても光合成速度には向上は見られない上に窒素同化能力が抑制されることが知られている。我々は、今までに窒素同化に必要な炭素骨格の生合成経路の酵素遺伝子の発現に関わるトウモロコシ転写因子Dof1を発現しているシロイヌナズナ形質転換体において、培地中のアンモニアイオンと光エネルギーが十分な場合には窒素同化と同時に炭酸固定の活性化、さらには硫黄同化の促進が観察されることを報告してきた。ここでは、CO₂濃度の変化がDof1形質転換体における窒素同化と炭酸固定の活性化および硫黄同化の促進にどのような影響を及ぼすかについてターゲットメタボローム分析によって明らかにし、遺伝子工学によってもたらされた窒素同化能力の強化が植物の高CO₂応答に及ぼす影響について議論する。

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暗順応させたイネの葉にPPFD = 1,500 μmol m^-2 s^-1 の強光を5分間照射した際に誘導されるNPQの大きさについて調べた。ジャポニカ品種ササニシキのNPQは2.0程度でありインディカ品種ハバタキの1.5程度と比較して有意に大きい。World Rice Core Collectionの50品種ほどについてもNPQを測定した結果、2品種の例外を除いてジャポニカ品種のNPQは1.65よりも大きくインディカ品種のNPQは1.65より小さかった。ハバタキ-ササニシキのbackcross inbred lineを用いてQTL解析を行ったところ、NPQサイズを制御する遺伝子座qNPQ1-1とqNPQ1-2が第一染色体に同定された。このうちqNPQ1-2はadditive effectが大きくササニシキのアリルがNPQを正に制御する。qNPQ1-2領域にはイネの二つのPsbS相同遺伝子のうちの一つPsbS1が座上しておりササニシキとハバタキのNPQサイズの違いにPsbSが関与している可能性がある。PsbS1の過剰発現体を作成しPsbS1の発現量とNPQサイズの相関を調べたところ、PsbS1の発現量が高まるに従ってNPQが大きくなった。PsbS1遺伝子領域のDNA塩基配列を比較したところ、ジャポニカ品種と比べてインディカ品種ではPsbS1遺伝子プロモーターに欠失があった。

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光化学系II(PSII)は、光合成反応において水を分解し、分子状酸素を発生する役割を持つ膜タンパク質である。この酸素発生に伴って生じる電子は、活性チロシン(Yz)、活性中心クロロフィルダイマー(P680)、クロロフィル、フェオフィチン、プラストキノン(PQ)の順にPSIIの内部を移動し、電子伝達の終端となるQBサイトに結合したPQをプラストキノールに還元する。その後、このプラストキノールはPSIIから離れ、脂質2重膜を経てシトクロムb6fに電子を供給する。
我々は、QBサイトに強固に結合してPSIIから電子を受ける電子受容部、剛直な共役鎖からなる電子移動部、その先端に位置して還元反応を実現する触媒部の3つを連結した分子を合成し、PSIIを利用した人工光合成を実現させたいと考えている。本研究では、その第1段階として、除草剤として知られる様々な分子をQBサイトへ結合させ、それぞれの結合様式を確認することで、上記の電子受容部をデザインし合成するための基礎情報を得ることを目標としている。
用いた除草剤は、QBサイトにPQと競争的に結合し、PSIIの酸素発生活性を阻害することが知られている。今回、PSII結晶にこれらの阻害剤をソーキングすることで複合体結晶を得た。それらの2.3－1.9Å分解能データから、QBサイトにおける各阻害剤の結合様式を結晶構造から明らかにした。

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光化学系I複合体はシアノバクテリアでは三量体、高等植物ではアンテナタンパク質を結合した単量体として機能すると考えられてきた。一方、我々は糸状性シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120において、系I複合体が四量体で存在することを発見した（Watanabe et al. 2010 PCP in press）。本研究では単離法を改善することで、Anabaenaから四量体だけでなく、フィコビリタンパク質（PBP）を結合した系I超複合体を単離することに成功した。一般にPBPはリンカータンパク質を介してロッドとコアを構成し、さらに会合して巨大なフィコビリソーム（PBS）を形成し、主に系II複合体に結合しエネルギー伝達することが知られている。一方、本研究で単離した系I超複合体は、分光解析やタンパク質組成からコアを形成するPBPやリンカータンパク質を含まなかった。しかし、ロッドとコアを結合するリンカータンパク質であるCpcG3が特異的に同定された。AnabaenaはCpcGを4コピー持っているが、通常のPBSからはCpcG3のみ同定されていなかった。CpcG3はC末端に疎水性領域を持つため、コアを介さずに系I複合体と結合することが予測される。現在、特異的抗体を用いてCpcG3の挙動と系I複合体との結合について検討中であり、これらを含めて系I複合体とPBSとの関係について議論する。

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光化学系II蛋白質で行われる光合成水分解反応は、5つの中間状態 (S₀-S₄) のS状態サイクルにより進行する。このサイクルの平均遷移効率は様々な手法により見積もられてきたが、各S状態遷移のそれぞれの効率の評価はこれまで困難であった。正確な遷移効率を決定することは、光合成水分解反応の理解のために必要不可欠である。そこで本研究では、フーリエ変換赤外(FTIR)分光法を用いて各S状態遷移の効率を見積る手法を新たに開発した。好熱性シアノバクテリアThermosynecoccus elongatusの光化学系IIコア複合体に人工電子受容体フェリシアン化カリウムを添加し、測定用試料とした。この系II試料の各閃光誘起FTIR差スペクトルには、S状態遷移の構造変化に由来するシグナルと、水分解系から人工電子受容体への電子移動に由来するシグナル（フェリシアン化物イオンとフェロシアン化物イオンのCN伸縮振動）が観測された。フェロ/フェリのバンド強度の閃光数依存性は、水分解反応に特徴的な4閃光周期振動を示した。シュミュレーションの結果、S₁->S₂, S₂->S₃, S₃->S₀, S₀->S₁遷移の効率が、それぞれ、92, 91, 88, 93%と見積もられ、S₃->S₀遷移が最も小さい効率を示した。このような傾向は、ホウレンソウの試料においても見られ、酸素発生系の一般的な性質であることが示された。

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光合成酸素発生反応は、光化学系II蛋白質中のMnクラスターにおける水の酸化によって行われる。水分子の類似体であるアンモニアは、基質水分子と交換することによって酸素発生を阻害すると考えられてきたが、その阻害機構の詳細は明らかとされていない。そこで本研究では、NH₄Cl添加による酸素発生阻害のpH依存性と、S₁→S₂遷移のフーリエ変換赤外 (FTIR)差スペクトルを測定することにより、酸素発生反応におけるアンモニア阻害の分子機構を調べた。ホウレンソウの光化学系II膜標品、及びPsbP,PsbQをあらかじめ除去した試料に100 mM のNH₄Clを添加し、酸素発生活性をpH5.0-8.0の範囲で測定した結果、どちらの試料でもこのpH領域において約40%の活性低下が見られた。また、pH 6.5におけるS₂/S₁FTIR差スペクトルは、NH₄Cl添加によって、カルボキシル基のCOO^－対称及び逆対称伸縮振動領域に大きな変化を示した。このシグナル強度のNH₄Cl濃度依存性は、酸素発生阻害のNH₄Cl濃度依存性とほぼ一致した。以上のことから、NH₄Clによる阻害効果は、NH₃ではなく、むしろNH₄⁺によって起こることが示された。Mnクラスターのカルボキシル配位子、または水素結合ネットワークを形成するカルボキシル基へのNH₄⁺の相互作用が、酸素発生反応の阻害を引き起こすと考えられる。

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ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803の光化学系II複合体（PSII）のプロテオミクスにより、PSIIには複数の機能未知タンパク質が共存することが示唆されている。そのうちの一つSll1252は、N末側の伸長領域とC末の側のS4様ドメインを持ち、全ての光合成生物にホモログ遺伝子が保存されている。S4ドメインの上流に薬剤耐性遺伝子を挿入した、Sll1252挿入破壊株(sll1252ins)は弱光下では生育できたが、強光条件では顕著な光傷害を示した。変異株のPSII活性と呼吸活性は野生株と同程度であったが、全体の電子伝達活性（H₂O →MV）は低下していた。DNAマイクロアレイ解析の結果、Sll1252ins株は野生株をDBMIB処理した場合と極めて類似した遺伝子発現プロファイルを示し、そのPQ-poolは野生株より還元状態であったことから、sll1252ins株はPQを介したPSIIからCyt_b6/fへの電子伝達に異常をきたしていることが示唆された。強光での増殖速度及び全体の電子伝達活性（H₂O →MV）が野生株レベルに回復した復帰変異株を取得したところ、その全てでカナマイシン耐性遺伝子の直後に内在性の転移因子が挿入されていたことから、Sll1252のN末端側ないしC末端側断片の発現がPSIIからCyt_b6/fへの電子伝達に異常を引き起こす可能性が示唆された。

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原始紅藻Cyanidium caldariumの光化学系II (PSII) 表在性タンパク質はPsbO, PsbV, PsbUおよびPsbQ′から構成され、シアノバクテリアの表在性タンパク質の組成とは異なっており、その結合様式もシアノバクテリアと同一でないことが報告されている。このPSII 第4の表在性タンパク質PsbQ′は他の紅藻や珪藻にも存在するが、その局在情報は不明である。
そこで我々は、PsbQ′がPSII膜タンパク質のどのサブユニットと結合しているかを明らかにするために、静電的結合部位にアタックし架橋する水溶性カルボジイミド（EDC）を用いてC. caldarium のPSIIに対し反応を行い、抗体反応により近接関係の解析を行った。その結果PsbQ′と膜タンパク質との架橋産物を得た。同様の結果はC. merolaeのPSIIでも得られた。さらに、大腸菌から大量発現させたPsbQ′のシステイン残基にスピンラベルを導入し、膜に再構成後、Y_Dラジカルとの距離をパルスESR(PELDOR)にて測定した。その結果、PsbQ′とY_Dラジカル間に34－35Åの距離情報を得た。これらを総合してPsbQ′の局在部位について報告する。

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多くの植物にとって光は季節を感知するための主要な環境要因である。本研究では日長による陸上植物の生長相制御機構の原形と進化を解明するために、長日植物であると報告されている基部陸上植物ゼニゴケに着目した。ゼニゴケの日長測定の分子機構を解析するために、ゲノムデータベースより概日リズム構成因子の探索を行い、候補遺伝子の一次構造解析を行った。その結果TOC1/PRRファミリー、GI、ADO/FKF/LKP/ZTLファミリーに高い相同性を示す遺伝子を単離し、それぞれMpTOC1、MpPRR2、MpGI、MpFKF1と命名した。系統樹解析によりこれらの遺伝子は被子植物のオルソログであることが示唆された。次にノザン解析により長日条件下の概日時計構成因子の発現解析を行った。その結果、MpGIは夕暮れ、MpTOC1は夜中、MpPRR2は夜明けに発現ピークをもつ明暗応答を示した。これらの遺伝子の日内発現変動は被子植物の対応する遺伝子と類似していた。さらにMpPRR2の発現様式を野生株とMpPHY RNAi株で比較したところ、夜明けの発現上昇がMpPHY RNAi株において抑制されていた。このことは、MpPRR2の夜明けの発現誘導をMpphyが正に制御することを示唆している。以上からゼニゴケは被子植物にみられる計時機構の原形を保持しており、その基本メカニズムと進化を解析する有用なモデルだと考えられた。

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高等植物の光周性応答は概日時計機構と密接に関連している。シロイヌナズナの代表的な光周性には長日特異的な花成促進と、短日特異的な胚軸伸張が知られている。光周性花成経路においては、長日の明期後半にB-Boxドメインをもつ転写因子COが活性化することでフロリゲンとしての機能をもつFTを転写誘導する機構が明らかにされている。一方、胚軸伸張制御においてはbHLH型転写因子PIF4/5が関わっていることが報告されている。PIF4/5はmRNAレベルで明期にピークをもつ概日リズムを示すが、そのタンパク質は赤色光照射下で速やかに分解されることから、PIF4/5は短日条件の暗期後半に活性化していることが推定された。これに従えば、PIF4/5の下流で機能する遺伝子は短日特異的に暗期の終わりにピークをもって誘導されるはずである。そこで、我々はPIF4/5の支配下にある遺伝子の中から上記の条件を満たす遺伝子を選抜し、その候補の一つとしてATHB2を同定した。光受容体や概日時計因子変異体を用いて、ATHB2 mRNA発現を種々の明暗サイクル条件下で解析することにより、PIF4/5が短日条件特異的に暗期後半で活性化していることが示唆された。以上の結果から、概日時計と光受容体が協調してPIF4/5-ATHB2出力系を制御することで短日特異的な胚軸伸長が起こる機構を説明するための外的符合モデルを提唱する。

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生物時計は、動物では睡眠やホルモン調節、植物では花成制御や葉の就眠運動などに重要な役割を果たしている。動物と植物の時計遺伝子に相同性は無いものの、(1)動植物の生物時計はフィードバックループ制御という共通した分子機構を持っていること、(2)花成や就眠運動の実現には、個々の細胞が持つリズムを個体レベルで統合する必要があること、(3)植物における組織特異的な機構は決して珍しい物ではないことなどから、植物にも動物で見られるような生物時計の組織特異的な機能分担があると考えられた。しかし、植物は脳に対応する明確な中枢を持たず、特定の組織を外科的な方法での切除が難しいことから、これまで生物時計を組織特異的に解析することは困難であった。
今回、シロイヌナズナの葉肉・維管束・表皮をそれぞれ短時間で単離し、様々な日長における各組織の時計遺伝子発現を調べた。その結果、TOC1やPRR3といった日長に応答して発現ピークを変化させる時計遺伝子の葉肉での発現パターンは個体全体で見たときと同じであった一方で、維管束での発現パターンは日長非依存を示し、少なくとも葉肉細胞と維管束の間では異なる発現制御機構が存在することが明らかとなった。さらに、こうした結果をより簡便に解析するために、スプリットルシフェラーゼを応用することで組織特異的な時計遺伝子発現を非侵襲的に測定する方法を新たに開発したので、併せて報告する。

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マメ科植物は早朝に葉を開き、夕方に葉を閉じる。この現象は就眠運動と呼ばれ、内在性の生理活性物質である覚醒物質(LOF: Leaf-Opening Factor)と就眠物質(LCF: Leaf-Closing Factor)の濃度バランスが生物時計によって調節されることで起こると考えられている。近年、Cassia属のLOFに結合するタンパク質の部分配列を東北大の研究グループが特定し、そのタンパク質がメチオニン合成酵素(MS: Methionine Synthase) である可能性を示した。そこで、実際にLOFとMSが結合するのか、その結合によってMSの活性に変化があるのか、また他の植物のMSでも同様の働きをしているのかを調べるために、エビスグサ(Cassia obtusifolia)のMSを単離し、発現誘導を行った。それと並行して、マメ科のモデル植物であり、ゲノムが公開されているミヤコグサ(Lotus japonicus)からMSの配列を検索し、クローニング、発現誘導、抗体作製を行った。エビスグサ、ミヤコグサのMSの発現誘導の結果、どちらのリコンビナントタンパク質もメチオニン合成活性を示し、またLOFと結合したものの、LOF存在下において活性は影響を受けなかった。以上のことから、その生理的役割はまだ不明であるもののin vitroにおいてLOFとMSと結合するということが示された。

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種子の乾燥耐性や休眠性は、植物ホルモンのアブシシン酸(ABA)によって調節される。種子や胚では、ABAの情報伝達にVP1/ABI3が重要な転写調節因子として関与することが知られている。受精胚発生のモデルであるニンジン(Daucus carota)の不定胚から、VP1/ABI3の相同遺伝子としてC-ABI3-1とC-ABI3-2の2種類が単離された。C-ABI3-1とC-ABI3-2は、遺伝子発現のパターンは似ているものの、それぞれの過剰発現細胞の解析から、ABA誘導性遺伝子の発現調節においては異なる役割をもつ可能性が示された。ABA誘導性遺伝子(DcECP31)、C-ABI3-1、C-ABI3-2の発現におけるC-ABI3-1とC-ABI3-2の作用を明らかにするため、シロイヌナズナabi3-6変異体あるいはニンジンnon-embryogenic cellsを用いてトランスアクチベーション解析を行った。その結果、DcECP31の発現はC-ABI3-2よりもC-ABI3-1によって強く誘導されること、C-ABI3-1の発現はC-ABI3-1とC-ABI3-2によって減少されることが示された。これらの結果から、C-ABI3-1とC-ABI3-2は、ABA誘導性遺伝子だけでなく、C-ABI3-1とC-ABI3-2の発現量の調節にも関与していると考えられた。

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ニンジン体細胞胚の形態形成における細胞分裂の制御系を明らかにする目的で, 演者らは細胞周期停止因子KRP (Kip-related protein)に注目し, 植物体や体細胞胚の発達における同因子の発現について調べることとした.
ホモログ遺伝子の単離にはRT-PCR法を用い, CDK-cyclin 結合部位ドメインの保存配列を基に縮重プライマーを設計, 体細胞胚由来の鋳型cDNAより2種類のcDNA断片(DcICK1, 2)を得た. 全長cDNAの情報からDcICK1と2はそれずれ229個と231個のアミノ酸より成っていた. DcICK1遺伝子についてはゲノム-PCR法により3つのエクソンと2つのイントロンから構成されていることが明らかとなった. DcICK1および2はシロイヌナズAtKRP3と相同性が高く,また, モチーフ構成も良く似ていた. qRT-PCR法により組織別相対発現量を調べたところ, 共に茎頂や根端で高い発現が観察された. 一方, 発達中の体細胞胚においてはその発現量はほぼ一定であった. 次に, 発達中の体細胞胚についてDcICK1-mRNAに対する in situ ハイブリダイゼーションを行ったところ, 球状型胚では胚全体で発現が認められ, 特に表皮原基下部で強いシグナルが見られた. また, 魚雷型胚では子葉原基で強いシグナルが観察された.

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植物組織片からの器官再生は、頂端分裂組織の新生を経るため、その解明は頂端分裂組織形成機構の理解に大いに寄与することが期待される。我々は、器官再生を指標として、シロイヌナズナの温度感受性突然変異体を多数単離し、解析を進めてきた。その一つrid3は、制限温度下で不定根形成やシュート再生の不全を示し、頂端分裂組織の新形成に必要な細胞増殖統御に欠陥があると考えられる。責任遺伝子のRID3については、WD40リピートタンパク質をコードしていること、シュート再生過程ではカルス形成時に発現が上昇し、茎頂分裂組織形成に先立って局所的に発現が低下することなどを明らかにしている。
通常の発生では、胚形成の進行とともに決まったパターンで発現する一群の遺伝子の制御下に、最初の頂端分裂組織の構築が起きる。このときにRID3が果たしている役割について、いくつかの実験を行って検討したので、本発表ではその結果を報告する。制限温度下でrid3変異体を結実させて胚を調べたところ、様々な形態異常が観察されたほか、頂端分裂組織の形成や維持に関わる遺伝子の発現パターンが大きく変化していることがわかった。また、RID3の発現を調べると、初期胚では全域で高く、後期胚では分裂組織を避けるように局所的に低下していた。これらの結果は、RID3が器官再生だけではなく胚発生においても、頂端分裂組織形成に関与していることを示している。

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種子植物の胚発生については、球状胚期以降の体軸や器官原基形成について比較的多くの知見が得られている一方で、初期胚の分裂を制御する機構については知見が乏しい。我々はこれまで、シロイヌナズナの根特異的アクティベーションタギング系を用いて、新規なパターン形成制御因子の探索を行ってきた。その過程で、植物特有のRKD遺伝子ファミリーが、細胞分裂の促進能や脱分化能を持つことを見出し、その機能解析を進めている。シロイヌナズナのRKDファミリーは、RKD1-5の5つの遺伝子からなるが、レポーター解析により、それらのすべてが胚の特定の領域で発現していることが明らかとなった。また、単一遺伝子の機能欠損変異体では、rkd4変異体のみが初期胚のパターン形成に異常を示すことが分かった。RKD4とGFPの融合タンパク質は核に局在し、RKD4のアミノ末端領域が酵母において転写活性化能を示したことから、RKDタンパク質は一次構造からの推定通り、転写因子として機能すると考えられる。RKD遺伝子を誘導的に過剰発現させた実生では、初期胚特異的な遺伝子群の発現が活性化していた。また、それらのうちのいくつかは、rkd4変異体で発現レベルが低下していた。以上の結果は、RKDタンパク質が初期胚における遺伝子発現を制御することで、その正常な発生を促進していることを示唆している。

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Recent environmental issues have prompted an increase in the demand for wood, so it is important to understand the process of wood formation. We focused on 16 poplar (Populus trichocarpa) NAC domain protein genes, PtVNS (VND, NST/SND and SMB related proteins) genes, which are homologous to Arabidopsis transcription factors regulating the differentiation of xylem vessels and fiber cells. 12 PtVNS genes including both VND and NST groups were expressed in developing xylem tissue and phloem fiber, whereas in primary xylem vessels, only the VND group genes were expressed. By using the post-translational induction system of AtVND7, a master regulator of xylem vessel differentiation, many poplar genes functioning in xylem vessel differentiation were identified. Transient expression assays showed the variation in PtVNS transactivation activity toward downstream genes. Moreover, overexpression of PtVNS genes induced ectopic secondary wall thickening in poplar leaves as well as in Arabidopsis seedlings with different levels of induction efficiency according to the gene. These results suggest that wood formation in poplar is regulated by cooperative functions of the NAC domain proteins.

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私たちはこれまでに、シロイヌナズナ培養細胞の道管要素への分化転換を同調的に誘導する実験系を確立し、これを用いたマイクロアレイ解析により道管要素分化誘導過程において発現が変動する遺伝子を多数同定した。さらに、これらの中で、NACドメイン転写因子をコードするVASCULAR-RELARED NAC-DOMAIN7 (VND7)が道管分化のマスター因子であることをすでに明らかにしている。本研究ではVND7の発現制御に関わる転写因子を同定するために、道管要素分化過程でVND7と同調して発現が上昇する転写因子に着目し、VND7プロモーター:ルシフェラーゼをレポーターとしたパーティクルボンバードメントによるトランジェント解析を行った。その結果、VND7を含む7種のVNDファミリー遺伝子すべてがVND7の発現を正に制御することが明らかとなった。また、VND以外の80種の転写因子について解析を行ったところ、VND7の発現を正に制御する複数の転写因子を同定した。このうち、新たに同定したNACタイプの転写因子の機能解析を進めたところ、過剰発現体において異所的な二次細胞壁形成が認められた。このことから、現在NAC転写因子について更なる機能解析を進めており、その結果についても報告したい。

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植物細胞の分化転換過程におけるクロマチンの動態および遺伝子の発現変動に関する新たな知見を得るため、ヒャクニチソウ単離葉肉細胞木部分化系を用いて、分化過程でのヒストン修飾の変動を調べた。その結果、ヒストンH3のアセチル化レベルは培養開始後に上昇し、分化の方向性が決定づけられると考えられる時期に下がることがわかった。そこで、管状要素分化に対するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤TSAの与える影響を観察したところ、阻害剤の濃度および添加時間に依存的して分化が抑制された。特に、分化の方向性が定められると考えられる時期に添加したとき最も分化が抑制された。さらに、ヒャクニチソウジーンチップ解析により、TSA添加が遺伝子発現に与える影響を調べた。その結果、分化の進行に伴って発現量が増大するZ14693とTSA添加により一層発現量が増大するZ1282の2つのヒストン脱アセチル化酵素遺伝子が見出された。また、TSA 添加から6時間後に、約60の転写関連因子が2倍以上の高発現を示し、中でも転写コリプレッサーTPLに似た遺伝子群の発現が顕著に上昇した。これらにより、管状要素分化転換過程におけるヒストンアセチル化／脱アセチル化の制御の重要性が示唆された。これらの結果を基に、分化過程における遺伝子発現の制御とクロマチン修飾の関連について考察する。

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ホスホリパーゼD（PLD）は生体膜の構成成分の一つであるホスファチジルコリンをコリンとホスファチジン酸（PA）に加水分解する酵素で、細胞内情報伝達に関わる。シロイヌナズナのPLDには、真核生物に保存されているPX-PH PLDと、植物特異的なC2 PLDの2つのタイプが存在する。PX-PH PLDをコードするPLDζ1遺伝子は転写因子GL2に直接制御され、根毛の発生パターン形成や細胞形態形成に関与する。そこで我々はPLDζ1の根毛形成過程における細胞内機能の解明を目指した。
既に報告されているPLDζ1遺伝子のT-DNA挿入変異体では、根毛発生パターンおよび根毛形態の異常は見られない。しかし、そのT-DNA挿入変異体はPLDζ1遺伝子の機能が保持されている可能性があることが判った。次に、遺伝子機能欠損変異体であると考えられる新たな変異体を用い、遺伝学的解析を行った。この変異体のT-DNA挿入ホモの系統では、一部の幼植物体は成長阻害及び、致死の表現型を示すが、大部分の個体は有意な表現型を示さない。そこで、PLDζ1-YFP融合タンパク質をコードする導入遺伝子を用いた相補実験により、この表現型がPLDζ1遺伝子機能の欠陥によることを確かめた。さらにこの相補体植物を用い、PLDζ1-YFPの細胞内局在性を観察した。

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維管束は、動物における血管や神経のように、植物全内に水分や種々の栄養分、さらにはシグナル分子を運ぶという重要な役割を担っている。したがって、体内の維管束ネットワークは遺伝的に保存されたパターンをとっている。シロイヌナズナの根では、線対称の位置に原生木部が配置された二元型の構造をとる。しかし、変異体lonesome highway(lhw)は、この二元型が一元型の構造となるという特徴的な表現型を示す。当研究室ではこれまでに、LHWはbHLH型の転写因子をコードしていること、根の構造決定および成長の維持に重要な機能を持つことを明らかにしてきた。シロイヌナズナのLHWには3つのパラログ遺伝子が存在し、それらに関しても重要な機能を持つことが期待される。しかしながら、それらの遺伝子はいずれも解析がなされていない。そこで本研究ではLHWの3つのパラログ遺伝子について解析を行った。まずこれらの遺伝子の発現する組織を特定するため、これらの遺伝子のpromoter-GUS形質転換体およびpromoter-YFP:NLS形質転換体を作出した。また、T-DNA挿入変異体を取り寄せ、その表現型解析を行った。本大会では、これらの遺伝子発現解析及び、表現型解析の結果について報告する。

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前形成層・形成層細胞から成る維管束分裂組織は、篩部と木部の境に存在し、植物体の二次肥大成長をつかさどっている。これまでの研究から、維管束分裂組織において幹細胞を維持する細胞間シグナルの一つとして、CLE ファミリーに属す分泌性ペプチド TDIF が働くことが明らかになってきた。篩部細胞より分泌された TDIF はロイシンリッチリピート型受容体キナーゼ TDR/PXY を介して前形成層細胞に受容される。このシグナルが前形成層細胞の木部分化を抑制することが、幹細胞および分裂組織の維持に不可欠である。しかしながら、維管束の継続的な二次肥大成長にわたって TDIF シグナルがどのように働いているのかは明らかになっていない。
本研究では、シロイヌナズナの維管束二次肥大成長において TDIF シグナル系関連遺伝子変異体群の詳細な表現型解析を行うことを目的として実験を行った。TDIF をコードする CLE41 遺伝子および受容体をコードする TDR 遺伝子などの維管束組織特異的遺伝子のプロモーター GUS マーカーのコンストラクトを作成し、野生株および各変異体へと導入した。このマーカーラインを用いた組織学的な解析をもとに、TDIF シグナルの前形成層・形成層への作用について報告する。

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植物特有のホメオドメイン型転写因子をコードする WUSCHEL-related HOMEOBOX (WOX) 遺伝子群は、植物の成長と発生において重要な役割を担っている。遺伝学的な解析から、WOX 遺伝子の機能が徐々に明らかにされつつあるが、その細胞レベルでの働きを制御する分子機構はまだ明らかになっていない点が多い。
これまでに私たちは WOX4 遺伝子が維管束の前形成層細胞群で強く発現し、その細胞増殖の促進に関与していることを見出している。そこで今回、WOX4 遺伝子の転写調節制御について解析を行った。WOX4 は、WUSCHEL (WUS) と同様、その C 末端付近に TLXLFP 配列を含む WUS box を持つことから、主として転写抑制因子として働くと考えられる (Leibfried et al., 2005; Ikeda et al., 2009)。そこで、転写活性化型に改変した WOX4 遺伝子 (Ikeda et al., 2009) を発現誘導するコンストラクトを作成し、これをシロイヌナズナ培養細胞に形質転換した。確立した培養細胞では、エストロゲン誘導後約6時間で十分な遺伝子発現の誘導が見られた。現在、この培養細胞株を用いた遺伝子発現解析を行っており、その結果を報告する。また、WOX4 の DNA 結合能についても合わせて報告する予定である。

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植物の維管束組織系は植物体全体の養分及び情報のネットワークとして極めて重要である。この維管束の形成・維持過程では、低分子分泌ペプチドCLE41/44 (TDIF)が重要な役割を果たす。CLE41/44は篩部から分泌され、前形成層細胞膜上でTDRに受容される。その結果、前形成層の細胞分裂が促進されるとともに、道管分化が抑制される。CLE41/44と配列がよく似たCLEモチーフは、CLE42及びCLE46にも存在し、CLE42はTDIF活性をもつ。しかし、CLE46はTDIF活性を示さず、機能は良く分かっていない。そこで、私たちはCLE46の機能を解析することにした。
これまでのCLE46プロモーター活性の解析より、CLE46は発芽1週間では発現が見られず、2週目以降に維管束で発現することが分かっている。また、CLE46は特に木部領域で発現していた。従って、CLE46も維管束に関連した機能をもつことが予測された。そこで、維管束形成におけるCLE46の働きを調べるために、CLE46過剰発現体、CLE46 RNAi体の作出を試みた。そして、形質転換体においてCLE46の発現がそれぞれ過剰になっているライン、及びノックダウンされているラインを得た。本研究では、これらの形質転換体における表現型を報告するとともに、合成CLE46ペプチド投与の実験の結果についても報告する。

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植物の形態形成にとって、分裂組織とそこから新生される器官の細胞運命を分けることは非常に重要であり、このために、両者を隔てる境界部の確立が行われる。NAC型転写因子であるシロイヌナズナCUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1)は、境界部の形成に重要な役割をもつ。CUC1の下流で機能する遺伝子の探索が行われ、転写制御を受ける候補遺伝子が同定された。そのうちのひとつ、LIGHT-DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 4 (LSH4)は、植物で保存されたALOG遺伝子ファミリーに属し、核局在タンパク質をコードする。LSH4は胚、芽生え、葉や花などの器官の境界部で発現していた。ステロイドホルモンの誘導系を用いた実験から、LSH4はCUC1によって直接転写制御を受けることが示唆された。LSH4の過剰発現株では、茎頂メリステムの拡大と葉原基の成長の抑制が見られ、花ではがく片上部に裂け目が入ったり、異所的な花と花器官が形成される等の異常が見られた。以上のことから、LSH4 はCUC1に直接転写されて境界部で発現し、細胞の増殖と分化を調節していることが示唆された。

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オーキシンはシロイヌナズナの側根形成を正に制御する。これまでの研究から、オーキシンを介した側根形成において、オーキシン応答転写調節因子であるAuxin Response Factor 7（ARF7） およびARF19が転写活性化因子として働くこと、また、IAA14/SOLITARY ROOT (SLR) はARF7/19との相互作用を介してオーキシン応答を負に制御することが示されている。機能獲得型変異体slr-1では、非分解型IAA14がARF7/19を恒常的に不活性化することにより、側根形成が完全に抑制される。しかしながら、このオーキシン依存的転写調節機構の詳細は不明なままである。今回、側根形成時のオーキシン応答に関わる新たな因子としてメディエーターの機能制御因子MED13をコードするMACCHI-BOU 2 (MAB2) を見いだした。mab2 slr-1 二重変異体においてslr-1の側根形成不全が抑圧されたことから、MAB2はオーキシンを介した側根形成を負に制御していることが示唆された。さらに、遺伝子発現解析を行ったところ、mab2 slr-1二重変異体でARF7/19のダイレクトターゲット遺伝子であるLBD16とLBD29の発現が回復していることがわかった。これらのことから、MAB2が側根形成時にIAA14と協調して転写抑制因子として機能している可能性が示唆された。

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多くの高等植物は花の基部に苞葉と呼ばれる葉様器官を形成するが、アブラナ科植物であるシロイヌナズナにおいては苞葉の発達が確認されない。これまでの研究によって、シロイヌナズナの花原基の基部にも潜在的な苞葉原基領域が存在することが明らかになっており、シロイヌナズナにおいて苞葉の発達を抑制する機構の存在が示唆されている。これまでに苞葉の発達抑制因子としてPUCHI遺伝子およびBLADE-ON-PETIOLE1 (BOP1)/BOP2両遺伝子が報告されており、それぞれ別の経路で協調的に苞葉の発達を抑制する。
今回、新たな苞葉の発達抑制因子としてAtMed13をコードするMACCHI-BOU 2 (MAB2)遺伝子を報告する。mab2変異体の表現型を詳細に解析したところ、花の形成初期からその基部に苞葉原基の発達が観察された。次に、MAB2とPUCHIおよびBOP1/BOP2との遺伝学的関係を、多重変異体を作成して調べたところ、MAB2はPUCHIと異なる経路で協調的に苞葉原基の発達を抑制する一方で、BOP1/BOP2と同じ経路で機能することが示唆された。さらに、Yeast two hybrid法によってMAB2/AtMed13が含まれるCDK8複合体の構成因子がBOP2と相互作用することが明らかになった。これらの結果を踏まえ、シロイヌナズナにおける苞葉の発達抑制機構について発表する。

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オーキシンの分布は、オーキシン排出担体PIN-FORMED (PIN)に依存して形成される。近年、子葉形成過程においてPIN1の細胞内局在を制御するNPH3様タンパク質MACCHI-BOU 4 (MAB4)が単離・同定された。MAB4遺伝子には4つの相同遺伝子MAB4/ENP-LIKE 1 (MEL1)、MEL2、MEL3およびMEL4が存在する。前年会において、mel1 mel2 mel3 mel4四重変異体においてPIN2の存在量が減少し、PIN極性が乱れることを報告した。この原因を探るために、FRAP解析および薬理学的解析を行った。mel変異が細胞膜上のPIN2の可動性に影響を与えるかを調べるため、PIN2-GFPを発現する四重変異体に対してGFP消光を行なったところ、野生型と同等のFRAPが観察された。このことから、MEL遺伝子がPIN2の可動性に関与しないことが解った。加えて、PIN2のエンドサイトーシスに対するmel変異の影響を調べるために、エンドサイトーシスの阻害剤A23を四重変異体に処理し、PIN2の局在解析を行った。四重変異体ではA23の阻害効果が野生型に比べて弱くなっており、mel変異によってPIN2のエンドサイトーシスが促進されることが明らかとなった。以上より、MELはPINのエンドサイトーシスの制御を介して、オーキシン極性輸送に関与することが示唆された。

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高等植物の器官形成に、オーキシン排出キャリアーPIN-FORMED1（PIN1）依存的なオーキシン極性輸送が重要な働きをする。PIN1の詳細な局在解析から、器官形成過程に、器官形成領域にPIN1極性が収束しオーキシンを集積する第一段階と、器官中央領域のPIN1極性が逆転しオーキシンを下部へと流し落とす第二段階が存在することが明らかとなっている。しかし、一連のPIN1極性を制御する分子機構は未だ解明されていない。そこで我々は、器官形成時のオーキシン極性輸送を制御する因子として同定されたNPH3様タンパク質MACCHI-BOU 4（MAB4）とその相同タンパク質MEL1およびMEL2に着目し、それらの機能解析を行った。まず、地上部の器官形成に重篤な異常を示すmab4 mel1 mel2三重変異体において、PIN1の局在を調べた。その結果、第二段階におけるPIN1の局在に異常が認められ、MAB4ファミリーがオーキシンのシンクとして機能するPIN1の局在を制御することが明らかとなった。また、第一段階から第二段階の移行にオーキシンの蓄積そしてシグナル伝達が関与すると考え、オーキシンシグナル伝達とMAB4ファミリー遺伝子の関係を調べた。その結果、MAB4ファミリー遺伝子がオーキシンシグナル伝達の下流に位置することが分かった。本発表では、これらの結果に基づき新たな器官形成モデルを提唱する。

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高等植物の根系構築には発芽後の側根形成が重要な役割を果たす。側根はオーキシンが高濃度に局在した内鞘細胞から生じ、形成過程を通してオーキシン濃度が高く保たれている。しかし、連続的に形成される多数の側根の分布を時空間的に制御する機構はほとんど解っていない。オーキシン応答マーカーDR5rev::erGFPを用いて野生型の側根形成の開始過程を観察したところ、細胞分裂以前に形成されたオーキシン応答スポットの約半数は側根形成に関与せず消失する事が明らかになった。主根は一定の速度で伸張を続けるが、側根は主根端から約2mm程度の領域にほぼ一定の時間間隔で発生した。これらの結果は、側根形成が周期的なシグナルによって制御されていることを示唆している。puchi変異体は野生型と比較して側根の分布が乱れており、形成される側根数が多い。puchiではオーキシン応答スポットが密に形成され、それらの一部は消失するが消失までの時間が野生型より長かった。そして、puchiでは野生型では見られない側根形成サイトすぐ近傍にもオーキシン応答スポットが観察された。PUCHIはオーキシンによって発現誘導される。なお、細胞周期G₂/M期マーカー発現部位の約85%が野生型でもpuchiでも側根を形成した。これらの結果から、PUCHIは側根形成部位の近傍の領域において細胞分裂前に側根形成を負に抑制していることが示唆された。

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維管束植物において、根端メリステムの活性を維持することは根系の発達にとって重要である。我々は根端メリステムの維持機構を明らかにすることを目的として、シロイヌナズナから根の成長・発生に異常を示す劣性変異体LR11-4を単離し、解析を行った。LR11-4変異体は、1）野生型に比べ主根の細胞分裂活性および細胞伸長能がともに低いため主根長が顕著に短くなる、2）側根形成頻度は野生型と同程度だが、側根がほとんど伸長せず停止する頻度が高い、などの表現型を示す。精密マッピングと相補実験の結果、LR11-4変異体の原因遺伝子がプラスチド局在型Fructose-1,6-Bisphosphate Aldolase1 (FBA1) 遺伝子であることを明らかにした。また、FBA1ゲノム配列の制御下でFBA1-GFP融合タンパク質を発現させたところ、根冠や葉のプラスチドに局在が見られた。これらの結果から、プラスチドにおけるFBA1機能が根端メリステムの維持に必須であることが強く示唆された。しかし、FBA1が地上部および根の両方で発現することから、どの器官で発現するFBA1が根端メリステムの維持に重要なのか不明である。そこでこの点について検討するため、野生型とFBA1欠損変異体との接木実験を行った結果について報告する予定である。

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シロイヌナズナの側根形成は木部に接した内鞘細胞の不等分裂によって開始される．この過程はSLR/IAA14とARF7, ARF19を介したオーキシン応答性遺伝子発現によって制御されており，その下流ではLBD (Lateral Organ Boundaries-domain)/ASL (Asymmetric Leaves2-like)ファミリーに属するLBD16/ASL18の発現誘導が重要である．しかし，LBD16を含むオーキシン誘導性LBD/ASLメンバー(LBD16, 17, 18, 29, 33)が側根形成のどの過程を制御するのかは明らかになっていない．LBD16ゲノム制御下でLBD16-GFPを発現させたところ，LBD16は核に局在し，側根形成開始前から特定の内鞘細胞で発現した．同様にして転写抑制ドメインを融合させたLBD16を発現させたところ，側根形成開始が特異的に阻害され、内鞘細胞の分裂は観察されなかった．これらのことから，LBD16を含む上記のLBD/ASLメンバーは，転写制御を介して内鞘細胞の分裂開始に関与していることが示唆された．また，この植物では側根形成開始が阻害されたにもかかわらず，オーキシン応答を示す内鞘細胞が多数観察された．この結果はLBD16を含むLBD/ASLメンバーの機能抑制が側根形成の開始頻度にも影響することを示している．

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植物が複雑な形をつくりあげるためには、細胞同士の緊密な連携が不可欠である。近年、植物細胞間の相互作用を担う情報伝達物質として、様々なペプチド性のシグナル分子が単離されてきている。中でもCLE(CLAVATA3/ESR)ペプチドは、主に分裂組織で機能し、細胞レベルでの分裂や分化の厳密な制御に関わる。これらペプチド群をコードするCLE遺伝子は、シロイヌナズナに32遺伝子存在するが、まだ多くの遺伝子の機能については不明な点が多い。そこで、CLEペプチドの新規機能探索のため、26種のCLEペプチドを化学合成し、植物体への影響を調べた。その結果、CLE9/10ペプチドが原生木部道管の形成を阻害することを明らかにした。更に、CLE10遺伝子の過剰発現体においても同様に原生木部の形成阻害がみられた。その一方、CLE受容体の機能欠失変異体clv2では逆に過剰な原生木部道管が形成された。これらの結果は、内生のCLE遺伝子が原生木部形成の制御に関わる可能性を示唆している。次に、CLEペプチドの作用機構を解明するため、ペプチド処理時の遺伝子発現の変化を網羅的に解析した。興味深いことに、サイトカイニンのシグナル伝達経路の負の制御因子(Type-A ARRs)の発現量が有意に減少していた。これらの結果をもとに、遺伝学的解析を行ない、CLEペプチドとサイトカイニンシグナルとのクロストークの一端を明らかにした。

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高活性型サイトカイニンであるトランスゼアチン(tZ)の生合成経路では、まず前駆体としてtZにリボースリン酸が付加されたヌクレオチド体が合成される。ヌクレオチド体からtZへの活性化には、リボースリン酸が外れることが必要である。この活性化には二通りの経路、脱リン酸化および脱リボシル化からなる二段階経路と、脱リボースリン酸化が一段階の反応でおこなわれる直接経路が報告されている。しかしながら、各経路の役割については明らかにされていない。二段階経路に関与する遺伝子は未同定である一方で、直接経路にはLONELY GUY(LOG)遺伝子によってコードされるcytokinin riboside 5’-monophosphate phosphoribohydrolaseの関与が知られている。本研究では直接活性化経路の機能解析を目的に、シロイヌナズナLOGファミリー遺伝子(AtLOG1-5,7-8)の多重変異体を作製した。安定同位体標識化合物を用いたトレーサー実験の結果から、多重変異体はサイトカイニン活性化経路が大幅に滞っていることがわかった。また、七重変異体は非常に強いサイトカイニン欠損の表現型を示した。これらのことは直接活性化経路がサイトカイニン活性化における主要経路であることを強く示唆している。log多重変異体の表現型の特徴から示唆される各LOG遺伝子の機能についても報告する予定である。

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植物の発生から栄養生長、花芽分化から種子形成にいたる様々な局面で植物ホルモンは情報分子として極めて重要な役割を演じている。個々のホルモンは情報伝達系を介し遺伝子発現を制御するとともに、他のホルモンとの量的バランスによる相互制御により、多様な作用を可能にしている。我々は半自動固相抽出法とUPLC-タンデム四重極質量分析器（UPLC-ESI-qMS/MS）、カルボン酸修飾試薬ブロモコリンを利用することで、活性型分子種を含むサイトカイニン23種、IAAとそのアミノ酸縮合体を含むオーキシン7種、アブシジン酸、ジベレリン12種の計43分子種を同じ植物試料（新鮮重量10～100 mg）から、180 サンプルの測定を同時に行なう方法をすでに報告している。今回さらにジャスモン酸とサリチル酸の同時定量も可能にした。この方法によりブラシノステロイドを除く主要ホルモン内生量の動態を一度に把握することが可能になった。イネの各器官における内生ホルモン量を解析したところ、花器官におけるGA4, GA7の蓄積や、止め葉の基部と先端部間でのシス型、トランス型サイトカイニン分子種の偏在が明らかになった。シロイヌナズナにおいても同様の解析をし、器官レベルでのホルモン内生量の違いを明らかにした。この方法を利用することで、複数のホルモン代謝系および情報伝達系の相互制御のしくみに関する有益な情報が得られるものと期待される。

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パルプ生産に適した植林木Eucalyptus globulusは、挿し木による増殖が困難な樹種であり、改善が必要であった。発根能の異なるE.globulusについて、植物ホルモンの一斉分析の結果、発根率5％程度の難発根系統では発根率90％以上の易発根系統と比べて3倍程度インドール酢酸（IAA）量が低く、IAAのアミノ酸複合体であるIA-Aspについても顕著に少なかった。
そこで、様々な植物ホルモンの生合成および代謝に関与しているチトクロームP450に着目し、これらの働きを阻害することが期待されるトリアゾール誘導体の中から、発根を促進する化合物のスクリーニングを実施した。スクリーニングでは、材料として難発根系統を用いて、260種類のトリアゾール誘導体を発根培地に添加し、発根促進の有無によって選抜した。その結果、5種類の化合物を選抜することができた。選抜した化合物の一つであるMA65について、シロイヌナズナへ処理したところ、発芽後の根の増加が確認された。また、MA65培地で生育させたシロイヌナズナの内生IAA量を測定したところ、2倍以上多かった。さらに、胚軸部分を切り取り、MA65を含む培地で培養すると無添加と比べ、多数の不定根が観察された。以上から、今回選抜したMA65の発根促進作用は、植物の内生オーキシン量の作用による可能性が示唆された。

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オーキシンは細胞伸長や細胞分裂、組織の分化など植物の様々な応答の中心的に働く植物ホルモンである。
シロイヌナズナでは、F-boxタンパク質であるTIR1がオーキシン受容体として働く事が知られている。TIR1は、オーキシン応答の抑制因子であるAUX/IAAとオーキシン依存的に結合し、これをポリユビキチン化することにより分解へと導く。シロイヌナズナには、オーキシン受容体ホモログが5つ(AFB1-5)、AUX/IAAタンパク質ホモログが30個存在する。これらのAFBタンパク質とAUX/IAAタンパク質は機能分化している可能性が示唆されている。さらに、これらの間の認識にも特異性がある可能性がある。ここでは、AFBタンパク質とAUX/IAAタンパク質の全ての組み合わせの認識の特異性を調べる事を目的とした。TIR1とIAA17を共発現する酵母中では、オーキシン依存的にIAA17が分解されることが知られている。ここでは、各受容体候補を発現する酵母と、各AUX/IAAにルシフェラーゼを融合したタンパク質を発現する酵母を作成し、掛け合わせることにより、全ての受容体候補とAUX/IAAについてのペアを持つ酵母を作成した。オーキシン添加後の、酵母が示すルシフェラーゼ活性の変化を調べたところ、受容体とAUX/IAAの間の認識に、ある程度の特異性が有るらしいことがわかってきた。

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被子植物の細胞は、リプログラミングを経て完全な植物体に再生することができる。この過程にはオーキシンが必須であるが、その作用のしくみは不明な点が多い。我々は幹細胞化へのリプログラミングにおけるオーキシンシグナリングの役割を明らかにするために、高い分化転換能を持つヒメツリガネゴケを用いて研究を進めている。ヒメツリガネゴケでは葉を茎葉体から切り離し光条件下で培養すると、切断面の細胞がリプログラミングされて原糸体幹細胞に分化転換するが、この過程は抗オーキシンBH-IAAによって抑制された。BH-IAAはオーキシン受容体TIR1に対しオーキシンと競合することで、その下流のオーキシン応答性転写因子ARFを介した転写制御を抑制するものと考えられている。よって、葉細胞のリプログラミングにはARFを介した遺伝子発現ネットワークが重要であるものと考えられる。そこでリプログラミングに関わるARFを同定する為に、ヒメツリガネゴケに存在する13種のARF 遺伝子を単離し、エストロゲン誘導型のARF高発現株およびマイクロRNA (amiRNA)による発現抑制株を作製した。その結果、少なくとも2種のARFがリプログラミングに関わる事が明らかとなった。現在、これら2種類のARFの機能解析と平行して、超並列シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析による標的遺伝子の同定を進めている。

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我々は、インドール-3-酢酸 (IAA)の生合成阻害剤としてL-アミノオキシフェニルプロピオン酸 (AOPP)を同定した。しかしAOPPはMS培地中で分解されやすく、phenylalanine ammonia-lyase (PAL)にも作用するなど特異性が低い。そこで、本研究ではAOPPをリード化合物としてより優れたオーキシン生合成阻害剤の開発を試みた。AOPPから構造展開して様々な化合物を合成し、その作用を調べた。その中でKOK1169と名付けた化合物は、IAA生合成酵素TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE of ARABIDOPSIS 1のリコンビナントタンパク質の酵素活性をAOPPよりも強く阻害した。その一方、AtPAL2リコンビナントタンパク質の酵素活性に対する阻害作用は低下していた。また、シロイヌナズナにおいて、処理後3時間における内生IAA量の減少はKOK1169とAOPPで同程度だったが、30 μMで8日間処理するとAOPPでは形態変化が見られなかったが、KOK1169では生長抑制が見られた。この8日間処理でKOK1169と同時にIAAを投与すると、形態がコントロール区と同程度に回復した。以上の結果から、KOK1169はAOPPより特異的なIAA生合成阻害剤であることがわかった。本研究は、生研センターイノベーション創出事業の一環として行われた。

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外性オーキシンに対するシロイヌナズナAUX/IAA19の応答をルシフェラーゼレポーターで測定した。その結果、内生IAA19の発現とルシフェラーゼ活性に相関が見られ、発光がプロモーター活性を正しく反映していた。野生型主根切片で100 nMのNAAに対する応答は一過的に増大し、3 hでピークを迎えた。一方、AUX/IAA19の優性変異体msg2-1の定常状態の発光量は野生型の約半分だった。応答は一過的であり、2 hでピークを迎えた。最大発光強度も野生型の約半分であり、立松ら(2004)の報告に準じていた。この最大発光強度の低下は安定型IAA19変異タンパク質の蓄積によると解釈できる。しかし、オーキシン投与後1 hまでのカイネティクスはmsg2-1と野生型で似ていたことから、msg2-1変異はオーキシン応答の初発段階での関与は小さいと予想された。このことは、msg2-1の根がwtと同様の重力屈性を示すことの解釈となりうる。そこで、重力屈性時におけるpresentation timeを長くする実験を行ったところ、msg2-1の根が傾斜屈性を示すことを見出した。この結果は、分解速度の異なるAUX/IAAタンパク質の組合せが重力屈性の方向（GSA）を決定し、傾斜重力屈性の源となっている可能性を示唆するものである。

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