光合成系カロテノイド(Car)は光保護作用を行っている。そのメカニズムを知るために、バクテリオクロロフィル(BChl)の光分解に対するCarの作用を調べた。Rhodobacter (Rba.) sphaeroides R26.1からCarをもたない光反応中心(RC)、Rba. sphaeroides Ga、2.4.1からメトキシヌロスポレン(共役二重結合数n = 9)、スフェロイデン(n = 10)が結合したRCを調製した。赤色光(λ > 760 nm)を照射し、スペシャルペアバクテリオクロロフィル(P)のブリーチングの時間変化を追跡し、夫々のCarの酸化還元的光保護作用を比較した。スピリロキサンチン(n = 13)が結合したRhodospirillum rubrum S1のRCは調査中である。また、溶液中のBChl aとLH2に対しても、同様の実験を行った。
その結果、(1) BChl aは溶液中で光により酸化され、3-acetyl-Chl aに変化する。Carを加えるとこの反応は抑えられるが、nに依存しなかった。(2) RCのPでも同様の変化が起こり、nが大きくなると、抑制効果は増大した。(3) LH2のBChlでも同様の変化とn依存性が見られた。
以上の結果より、Carの光保護作用は、BChlとCarが蛋白に結合することでnに依存して効率的になることが期待される。

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   緑色硫黄細菌Chlorobium limicolaのアンテナ複合体「クロロゾーム」は、光エネルギーを捉えて、光反応中心に一重項エネルギーを伝達している。クロロゾーム内には「ロッドエレメント」と呼ばれるバクテリオクロロフィル(BChl) cの高次会合体が存在しており、その構造は未だ明らかになっていない。構造決定を行うためには、¹³C-BChl cと¹²C-BChl cを1:1に混合した再構成クロロゾームを用いて、固体NMR分光による分子間情報の抽出が不可欠である。そこで、当研究室の原田が昨年度の日本植物生理学会で報告した方法でクロロゾームの再構成を行い、多方面から評価を行った。評価には、(1) 形態学的知見を調べる蔗糖密度勾配遠心・ゼータ電位・動的光散乱と電子顕微鏡を，(2) ロッドエレメント中のBChlの配置を調べる固体NMR・電子吸収・円偏向二色性分光と粉末X線回折を，(3) 励起状態のダイナミクスを調べるサブピコ秒時間分解吸収分光を用いた。
   その結果、(1) 再構成クロロゾームは、天然のクロロゾームとよく似た回転楕円体でより長い構造をもつ，(2) ロッドエレメント中の色素の配置は、ほぼクロロゾームと等しい，(3) 励起状態の特性についても、基本的にはクロロゾームと同じであると判断された。
   現在、再構成クロロゾームを用いた構造解析を進めている段階である。

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クロロフィリドaオキシゲナーゼ（CAO）はクロロフィルaからクロロフィルbへの変換を触媒する酵素であり、CAOの制御機構は集光アンテナサイズの制御に関わっている。CAOはA，B，Cの3つのドメインからなり、Aドメインは分解制御、Bドメインはリンカー、Cドメインはクロロフィルb変換触媒機能をもつと考えられている。CAOは葉緑体内のどこで機能しているか、またその部位への局在に必要なドメインはどれであるかを確かめるために、各ドメインを削ったゲノム配列にGFPを融合させシロイヌナズナで強制発現した株を使用して、共焦点顕微鏡および免疫電顕を用い、CAOの蓄積パターンの観察を行った。その結果、葉緑体内においてCドメインを持つ変異体ではCAOは葉緑体の特定の部位に集中して蓄積しているのに対し、Aドメインを持つ変異体では葉緑体全体にに蓄積している様子が観察された。これらの結果は葉緑体内でのクロロフィルb合成及びCAOの分解場所を示唆するものであると考えられる。また葉組織の観察で、Aドメインを持つ変異体が葉肉細胞および表皮細胞の葉緑体に均一に蓄積しているのに対し、Cドメインを持つ変異体ではCAOは表皮の小型の葉緑体に集中して蓄積している様子が確認された。さらに現在はCAOの分解機構を探るためEMS処理を用いたCAO蓄積変異体のスクリーニング、解析を実施中である。

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光合成のクロロフィル代謝系において、クロロフィリドaオキシゲナーゼ（CAO）はクロロフィルaをクロロフィルbに転換する酵素として、重要な役割を果たしている。クロロフィルbの量はCAOタンパク質の蓄積によって制御されていることがわかっている。CAOはA、B、Cの3つのドメインからなる。そのうちAドメインが単独でその制御に関わりさらにその制御はClpプロテアーゼによるCAOの分解によるものであることが、最近の私たちの研究で明らかになった。しかし、Aドメイン内のどの領域がこの制御に関わっているかはまだ明らかにされていない。今回、Aドメイン内の分解に関わる領域を探るために以下の解析を行った。ランダム変異導入法を用いて、Aドメインに変異の入ったCAOを発現させたシロイナズナの変異株を1000株作製した。発現させたCAOには、共焦点顕微鏡での蓄積のスクリーニングを可能にするためにGFPを融合した。1000株の解析の結果、7箇所の制御機構に関わる可能性の高いアミノ酸置換箇所を見つけることができた。次にAドメインのN末端から10アミノ酸残基ずつ削っていき、制御機構に関わるような領域を探した。解析の結果、N末端から50アミノ酸残基削った変異株から過剰な蓄積が見られ、この付近に制御機構に関わる配列があること明らかになった。今回、この配列に関するさらなる解析を報告する。

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Vibrational relaxation and internal conversion of carotenoids (Cars) are closely related to singlet energy transfer from Cars to Bacteriachlorophyll (BChl). Here, subpicosecond time-resolved stimulated-emission spectra of all-trans-neurosporene, spheroidene and lycopene in n-hexane were recorded upon excitation at different vibronic levels of 1B_u⁺ (v=0, 1, 2) in order to investigate the effect of vibrational relaxation. From time-resolved spectra, we found stimulated-emission spectral patterns do not change with time evolution, however, the patterns at the same delay time are completely different when excited to different vibronic levels. Comparing the observed spectra at the beginning of different excitations with simulated emission spectra based on Frank-Condon principle, we found characteristic emission pattern from the 1B_u⁺(v=0), 1B_u⁺(v=1) and 1B_u⁺(v=2) levels. The results indicate vibrational relaxation is much slower than internal conversion from the 1B_u⁺ state, which suggest energy transfer rate and efficiency between Car and BChl (Chl) may be excitation energy-dependent in the antenna complexes.

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Chlorophyll c is widely existed in seaweeds and planktons as a light-harvesting pigment just like chlorophylls a and b in green plant. Chlorophyll c has a carboxyl group which directly attached to the conjugation system of the porphyrin skeleton, and therefore, it has a high potential as natural resourced dye sensitizer for organic solar cells. In this paper, Chlorophyll c₁ (Chl c₁) and Chlorophyll c₂ (Chl c₂) were extracted from Undaria pinnatifida(Wakame). They were used as sensitizers in titania-based Graezel-type dye-sensitized solar cells (DSSCs). The solar energy-to-electricity conversion efficiency (η) determined for each sensitizer were as follows: Chl c₁, η = 3.4%; Chl c₂, η = 4.6%. Their oxidation products which we call Chl c₁', Chl c₂'were also examined, however their performance was lower than the Chl c₁ and Chl c₂. The Chl c₂-sensitized solar cell exhibited the highest value.

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イネのstay green突然変異体nyc1においては葉が老化してもLHCIIおよびクロロフィルやカロテノイドなどのLHCIIに結合する色素の分解が抑制される。NYC1はマップベースローニングの結果から、クロロフィルb分解の最初の反応を触媒するクロロフィルb還元酵素をコードしていると考えられる。現在、NOL (NYC1のパラログであるNOLの遺伝子産物) のクロロフィルb還元活性は確認されているが、NYC1の活性は確認されていない。そこで、NYC1の機能に関するさらなる知見を得るため、モデル植物であるシロイヌナズナのNYC1遺伝子の変異体At-nyc1-1の解析を行った。その結果、イネと同様に葉が老化してもLHCIIとクロロフィルbの分解が抑制され、stay greenの表現型になるがクロロフィルaは分解した。さらに、nyc1変異によるカロテノイド、個々のLHCタンパク質、光化学系コアタンパク質、光合成活性、チラコイドの変化について、またNYC1のmRNA、タンパク質、局在などの発現型の解明によりシロイヌナズナにおける老化時のクロロフィルbの分解機構の解明についても報告する。また、in vitroで大腸菌を用いて発現させたNYC1とNOLタンパク質の活性測定についても報告する。

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クロロフィルは、4つのピロール環に加えて5番目の環状構造E環をもつ。E環生成を触媒するMg-プロトポルフィリンIXモノメチルエステル（MPE）シクラーゼには、構造的に全く異なる2種類の酵素が存在する。一つは、O₂を基質とする好気的酵素AcsF、もう一つはH₂Oを基質とする嫌気的酵素BchEである。植物はAcsFを、多くの光合成細菌はBchEを用いており、光合成生物は生育環境の酸素レベルに応じていずれかの酵素を用いていると考えられる。しかし、嫌気条件でも生育できるラン藻がいずれの酵素を用いるかについては不明である。Synechocystis sp. PCC 6803のゲノムには、2つのacsF類似ORFと3つのbchE類似ORFが存在する。本研究では、ラン藻のMPEシクラーゼ遺伝子を同定するため各ORFの欠損株を単離し、好気条件と嫌気条件における形質を検討した。その結果、2つのacsF類似ORF欠損株は、好気あるいは嫌気条件のいずれかにおいて中間体MPEを蓄積したが、3つのbchE類似ORF欠損株ではそのような中間体蓄積は検出されなかった。これらの結果から、Synechocystis sp. PCC6803のMPEシクラーゼは、bchE類似ORFではなく、2つのacsF類似ORFにコードされ、これらを生育環境の酸素レベルによって使い分けてE環を生成していることが示唆された。

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バクテリオクロロフィルaの基本骨格バクテリオクロリン環は、2つのニトロゲナーゼ類似酵素、暗所作動型プロトクロロフィリド還元酵素（DPOR）とクロロフィリドa還元酵素（COR）の連続した反応によって形成される。DPORはL-蛋白質とNB-蛋白質、CORは X-蛋白質とYZ-蛋白質（各々ニトロゲナーゼのFe-蛋白質とMoFe-蛋白質に類似）とよばれる二つのコンポーネントから構成される。今回、紅色細菌Rhodobacter capsulatusにおける大量発現系を活用し、NB-蛋白質とYZ-蛋白質の生化学的解析を行った。精製したNB-蛋白質とYZ-蛋白質は、各々の基質プロトクロロフィリドとクロロフィリドを結合していた。このことは、NB-蛋白質とYZ-蛋白質は、各々DPORとCORにおける触媒コンポーネントであることを示している。これらの金属中心の同定を目指してEPR解析を行った。YZ-蛋白質からはg=2.04、1.94、1.92のシグナルが検出された。一方、NB-蛋白質はそのままではEPRサイレントであったが、ATPとL-蛋白質の存在下でg=1.94、1.92のシグナルを示した。これらの結果は、NB-蛋白質とYZ-蛋白質は、MoFe-蛋白質とは異なり比較的単純な [4Fe-4S]型クラスターをもつ点では共通しているが、それらのクラスターの性質は大きく異なることを示唆している。

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暗所作動型プロトクロロフィリド（Pchlide）還元酵素（DPOR）は、（バクテリオ）クロロフィル生合成系においてポルフィリンD環二重結合を還元することでPchlideをクロロフィリドに変換する反応を触媒する。DPORは、ニトロゲナーゼのFe-蛋白質とMoFe-蛋白質に各々類似した2つのコンポーネントL-蛋白質とNB-蛋白質から構成される。ニトロゲナーゼの機能発現には、主に金属中心の形成やそれらのアポ蛋白質への挿入反応などに関与する窒素固定生物に特有の酵素群が必要とされ、大腸菌では活性型として発現させることができない。DPORについては、各コンポーネントの安定な活性評価系が確立されていなかったため、大腸菌における機能発現の評価が困難であった。私たちはこれまでの研究で光合成細菌Rhodobacter capsulatusの発現系を利用したアッセイ系を確立してきた。そこで本研究では、このR. capsulatusの活性評価系を活用してDPORコンポーネントの大腸菌での機能発現を評価した。その結果、両コンポーネントともに大腸菌において活性型として発現することが確認された。この結果は、DPORコンポーネントの機能発現には大腸菌細胞の有する酵素群で充分であり、DPORの金属中心はニトロゲナーゼとは異なり大腸菌内で生合成可能なタイプであることを示唆している。

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ラン藻Synechocystis PCC6803のヒスチジンキナーゼHik33は、低温、酸化ストレスはレスポンスレギュレーターRre26に、塩・高浸透圧ストレスはRre31にシグナルを伝達する極めてユニークなHikである。また、Hik33に特異的に相互作用する新規調節因子Ssl3451が存在することも、他のHikには見られない特徴である。我々は精製タンパク質を用いた生化学的な解析から、Ssl3451はHik33と1：1の量比で相互作用し、Hik33の自己リン酸化を促進すること、in vitroでのリン酸基転移活性の解析、およびin vivoでの遺伝子発現解析から、Ssl3451がHik33からRre31へのシグナル伝達を抑制することを見出した。Ssl3451のホモログは、シアノバクテリアと高等植物のゲノムにのみ特有に保存されている。我々はこれらホモログ中に高度に保存され、かつ極性をもつ3つのアミノ酸に着目し、それぞれをアラニンに置換した改変体タンパク質（K20A, T21A, R29A）を調整した。Ssl3451に比べ改変体K20A、T21A、R29Aは、Hik33の自己リン酸化活性を著しく低下させた。このことから、Ssl3451ホモログは植物細胞においても同様の働きをすると推測された。発表ではSsl3451の生体内での機能について考察する。

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ミドリゾウリムシから単離した共生クロレラはグルコースの添加で顕著に増殖し、また一部アミノ酸の取り込みもグルコースによって約2倍促進された。グルコースによるSer輸送促進の用量作用曲線から、EC₅₀は3 μMと低濃度であった。興味深いことに、放射性標識グルコースを用いた検討の結果、グルコース自体は細胞内には取り込まれなかった。以上の結果から、グルコースが共生藻のSer輸送促進に対しシグナルとして働いていると考えた。グルコース応答によってSerだけではなくAlaやGlnも同様にその輸送が促進されたが、Argの輸送にはほとんど影響がなかった。影響されるアミノ酸は共にgeneral amino acid transport system (GATS)で輸送されることから、グルコース応答とGATSとの関連性が示唆された。Ser輸送のキネティクス解析を行った結果、グルコースにより最大輸送速度が約2倍上昇した。タンパク質合成の関与が考えられたが、タンパク質合成をシクロヘキシイミド処理で阻害した細胞でもグルコースに応答したので、この応答には新たなタンパク質合成は関わっていない。種々グルコースアナログを用いて構造活性相関を検討した結果、L体は活性を示さず、1, 2, 5位の立体配置と3, 6位の水酸基が応答に重要であることがわかった。

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糖は、エネルギー源・炭素骨格源であると同時に、植物の発生・成長を多面的に制御するシグナル因子としても機能する。我々はFOX(full length cDNA over-expressor) Hunting Systemを用いて、シロイヌナズナのgain-of-function型糖耐性変異体の単離と糖応答に関わる具体的な分子ネットワークの解明を試みた。糖変異体の単離方法として、糖応答に対する窒素の影響と浸透圧ストレスを考慮した高糖濃度/低窒素濃度（300 mM Glc./0.1 mM N）培地でのスクリーニングを実施した。その結果、過剰な糖による生育阻害に対して耐性を示す変異体ssv1 (super survival 1) の単離に成功した。野生株が通常成長不能となり枯死するのに対し、この変異体では、子葉が緑色化し、本葉の展開も観察された。また、過剰な糖応答時に野生株で観察される光合成関連遺伝子やアントシアニン合成系遺伝子の発現変動が、この培地で生育させたssv1 では観察されなかった。この変異体の原因遺伝子SSV1は、RING finger motifをもつユビキチンリガーゼ（E3）をコードしていたことから、糖のシグナル伝達経路にはユビキチンカスケード／26Sプロテアソームシステムが関与することが示唆された。また、in vitroにおけるSSV1のユビキチンリガーゼ活性の検出も試みており、 ssv1変異体の諸性質をあわせてこれらについて議論したい。

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MAP kinase cascadeは真核生物に広く保存されているシグナル伝達系の一つであり、高等植物においては環境ストレスや病原菌に対する適応に重要な役割を果たす事が報告されている。我々はMAPKKの一つであるMKK3に着目し、新規MAPキナーゼMKK3-MPK6カスケードを同定し、ジャスモン酸(JA)のシグナル伝達経路に関与する事を示してきた。JAシグナル伝達には、JA特異的経路とエチレン(ET)と協調して働くJA/ET協調的経路が存在する。MKK3とMPK6のloss-of-function、gain-of-functionトランスジェニック植物体を用いて、JA処理時のET蓄積量、下流マーカー遺伝子の発現を検討した。その結果、MKK3-MPK6カスケードはJA特異的経路を負に制御している事が明らかとなった。更にmkk3/atmyc2二重変異体を用いた解析から、AtMYC2がMKK3カスケードの下流で機能することが明らかとなった。この結果は、AtMYC2の発現機構が正と負の相対する制御により調節されていることを示唆する。またein2、ein3遺伝子破壊変異体を用いた解析から、MKK3-MPK6カスケードのJAによる遺伝子発現にも内在性ETのシグナル伝達系が必要である事が明らかとなった。JAシグナル伝達におけるMKK3-MPK6カスケードの生理学的機能について考察する。

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植物の病害抵抗性では、MAPキナーゼカスケードが重要な役割を果たしている、と考えられている。シロイヌナズナでは葉肉細胞プロトプラストを用いた一過的発現実験により、MEKK1（MAPKKK）が、PAMPs（pathogen－assiciated molecular patterns）のひとつ、flg22によって誘導されるMAPキナーゼカスケード（MKK4／MKK5－MPK3／MPK6）の上流で機能すると提唱されている。一方、two－hybrid解析などの実験結果から、上記とは別のカスケード（MEKK1－MKK1／MKK2－MPK4）も示されている。flg22はMPK3、MPK4、MPK6のいずれも活性化するが、MEKK1の役割については遺伝学的に検証されていない。
この問題を解決するため、MEKK1のT－DNA挿入変異体を用いて種々の解析を行った。mekk1では、維管束組織特異的、かつ温度依存的に細胞死とH₂O₂蓄積が見られた。この表現型はRAR1とSID2に部分的に依存していた。MEKK1はflg22によるMPK3とMPK6の活性化に必要ではなく、MPK4の活性化に必須だった。MPK4はサリチル酸を介した防御反応を負に制御することから、MEKK1がMPK4と共にカスケードを構成し、防御反応を負に制御する可能性が示唆された。

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種々のストレス応答の初期過程において、膜電位変化に伴う細胞外からのCa²⁺流入がシグナル伝達に重要な役割を果たすと考えられているが、Ca²⁺動員機構やその分子的実体は、不明な部分が多い。我々は、イネから膜電位依存性Ca²⁺チャネル候補遺伝子OsTPC1を単離し、過剰発現株や、レトロトランスポゾンの挿入変異による機能破壊株を作成すると共に、細胞質中にCa²⁺感受性発光タンパク質アポエクオリンを発現させた形質転換培養細胞や植物体を作出し、ルミノメーターや超高感度カメラを用いて、細胞質Ca²⁺濃度を非破壊計測する簡便な実験系を確立した。感染シグナル、酸化ストレスなど、さまざまな刺激により、特徴的なパターンを示す細胞質Ca²⁺濃度変化が誘導された。Ostpc1機能破壊株の培養細胞では、タンパク質性の感染シグナル（エリシター）誘導性の細胞死や細胞の褐変化、MAPキナーゼの活性化などが著しく抑制される(Plant J. 2005)。本発表では、Ostpc1機能破壊株及び野生型株において、感染シグナルにより誘導される遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイ法により網羅的に比較すると共に、ストレス誘導性の細胞質Ca²⁺濃度変化のパターンを比較解析した結果について報告し、ストレス誘導性Ca²⁺動員や遺伝子発現の制御におけるOsTPC1の役割について議論する。

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植物は自己と非自己を認識し自らの身を守っている。中でも、キチン、βグルカン断片、LPSなどの微生物固有の分子パターン（PAMPs）認識に基づく防御応答は、いわゆる基礎的抵抗性の重要な要素として注目されている。
我々は最近、イネのキチンエリシター受容体であるCEBiP（Chitin Elicitor Binding Protein）とその遺伝子を単離同定した*。一方、CEBiP自身は細胞内ドメインを持たないため、シグナル伝達を媒介するPartner proteinの存在が示唆された。我々は今回、エリシター応答性の変化を指標として、こうした遺伝子の機能が破壊されたシロイヌナズナ突然変異体の探索を行った。
検討の結果、受容体キナーゼをコードする遺伝子のDNA挿入突然変異体の1つにおいて、キチンエリシター応答性の顕著な変化が認められた。この変異体では、キチンエリシターに対する活性酸素応答が特異的に消失し、また、キチンエリシター処理によるMPK3とMPK6の活性化や防御応答関連遺伝子の活性化もほぼ完全に抑制されていた。マイクロアレイ解析においても、突然変異体では、野生型で発現誘導が見られた遺伝子のほとんどに誘導が見られなかった。これらの結果はこの受容体キナーゼがキチンエリシターシグナル伝達に必須であることを示している。*Kaku et al., PNAS, 103, 11086 (’06)

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酵母や動物には存在しない植物特有のカルシウム依存性プロテインキナーゼ（CDPK）は、高等植物において多重遺伝子族を形成している。カルシウムイオンは情報伝達における普遍的かつ二次的な情報伝達因子であるため、様々な情報伝達経路にCDPKが関与すると考えられる。しかしながら、これまでに高等植物のCDPKの機能が明らかにされた研究は数例しかなく、これら遺伝子族内での機能分担/重複に関する知見は得られていない。我々はFull-length cDNA Over-eXpressor gene (FOX) hunting systemの手法を利用して塩や低温などの環境ストレス耐性や炭素代謝および窒素代謝に関わるイネCDPK遺伝子の効率的な同定およびそれらの機能解明を試みている。網羅的に作出したイネCDPK遺伝子の過剰発現イネ系統から高塩ストレスや低温ストレスに耐性を示すイネを探索した結果、これまでに耐塩性が強まった3系統のCDPK過剰発現イネを同定している。現在、これらの系統について詳細な解析を行っている。

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RSGはジベレリン（GA）内生量調節に関与するbZIP型転写活性化因子である。植物体においてその機能を阻害するとGA内生量が著しく低下し矮化形質を示す。これまでの解析により、1）真核生物に広く保存された制御因子、14-3-3蛋白質はリン酸化されたRSGの114番目のセリン残基（S114）を介してRSGと結合する事、2）RSGは核-細胞質間をシャトルするが、14-3-3蛋白質との結合により核局在が阻害される事、3）GA刺激はRSGのS114のリン酸化及び14-3-3蛋白質との結合を促進する事等を明らかとした。これらの結果から、GA刺激により、RSGのS114のリン酸化が亢進し、14-3-3蛋白質との結合が促進された結果、RSGは核外へ輸送され、GA生合成系酵素遺伝子の発現が抑制されると考えられる。我々は、RSGのS114を特異的にリン酸化するカルシウム依存性蛋白質キナーゼNtCDPK1を同定した。GAがNtCDPK1を介していかにしてRSGの機能を抑制するかを調べるため、GA刺激によりNtCDPK1が翻訳後修飾を受けるかを調べた。その結果、GAを植物体に投与するとNtCDPK1がリン酸化されること、RSGとNtCDPK1の複合体形成が促進されることが明らかになった。

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植物の生育は乾燥や高塩や低温のような環境ストレスの影響を受ける。シスエレメントDRE/CRTはこれらの環境ストレス応答における遺伝子発現制御に関わっている。シロイヌナズナのDREB/CBFはこのDRE/CRTに結合し、多くのストレス応答性遺伝子の発現を制御している。このDREBホモログ遺伝子としてイネのOsDREBを単離した。OsDREB1A, 1B遺伝子は低温誘導性遺伝子で、これらの遺伝子を過剰発現したイネは多くのストレス誘導性遺伝子の発現を誘導し、乾燥・高塩・低温ストレス耐性が向上することを報告した。
今回我々は10個のDREB1/CBFファミリーの遺伝子をイネで同定した。この内6つの遺伝子は低温ストレス誘導性を示したが、他の4つは異なった発現を示した。OsDREB1遺伝子の転写活性化能をシロイヌナズナとイネのプロトプラストを用いた一過的発現系の実験で調べた。GAL4のDNA結合ドメインをOsDREB1に融合させた実験系では9つのOsDREB1が転写活性化能を持つことを確認した。一方、DREB1Aの標的遺伝子であるrd29AのDRE配列をリポーターと結合して用いた実験系では、7つのOsDREB1で転写活性化が確認された。これらの結果は、10個のOsDREB1はDNA結合ドメインの構造は類似しているが、機能に違いがあることを示唆している。

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これまでに我々は、シロイヌナズナの強光および高温ストレス応答性の熱ショック転写因子 (HsfA2) を同定し、本遺伝子の過剰発現によりHSPやストレス防御に関与する遺伝子の発現が誘導され、その形質転換植物は厳しい酸化ストレスに耐性を示すことを明らかにしてきた (Plant J.,2006) 。さらにH₂O₂処理によりHsfA2が迅速に誘導されることから、HsfA2は酸化的ストレス応答に重要な制御因子であることが示唆された。
そこで、HsfA2の酸化的ストレス応答に関与する上流のシグナル伝達経路を同定するために、シロイヌナズナ培養細胞T87にタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド (CHX) で前処理を行い、H₂O₂によるHsfA2の誘導への影響について解析した。その結果、CHX処理によってHsfA2の初期応答の遅延が認められ、本遺伝子の酸化的ストレス応答の引き金は、細胞質で新規に合成されるタンパク質が関与することが示唆された。また、T87細胞を用いてプロテアソーム阻害剤 (MG132) 処理によるHsfA2の発現を解析したところ、処理15分後より迅速に誘導されることが明らかとなった。このことから、HsfA2の酸化的ストレス応答にはプロテアソーム経路が関与しているが示唆された。現在、プロテアソームと酸化的ストレスとの関係およびHsfA2の発現制御に関わる因子の探索を行っている。

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Multiprotein bridging factor 1 (MBF1) は、そのアミノ酸配列が真核生物の間で高度に保存され、転写因子と TATA-box binding proteinの双方を橋渡しすることで標的遺伝子の転写を活性化する転写コアクチベーターとして酵母や動物で報告されている。シロイヌナズナでは MBF1 が 3 種類存在している (AtMBF1a, 1b, 1c, Tsuda et al., 2004)。そのうち AtMBF1cについてはエチレンシグナル伝達系を介してストレス応答に関与していることが示唆されているが (Suzuki et al., 2005)、AtMBF1s に結合するシロイヌナズナのタンパク質は報告されておらず、その分子機構はまだわかっていない。我々はこれまでに AtMBF1s を過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作製したが、明瞭な機能の解析には至らなかったことから、 AtMBF1s の転写コアクチベーターとしての機能を改変したキメラ転写コアクチベーターを過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作製し、その変化を観察することにより AtMBF1s が関与するシグナル伝達系を同定することを試みた。すると、これらの形質転換植物には、光感受性の異常が見られた。そこで光応答に関して解析したところ、光形態形成の変異体に似た光感受性を示すことが確認され、AtMBF1s が光応答のシグナル伝達に関与することが示唆された。

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冬季に温度が氷点下になる地域に生育する植物は、低温馴化により高い凍結耐性を獲得し、細胞外凍結に耐えることができる。植物細胞は細胞外凍結下では必ず氷晶より機械的ストレスを受けるため、低温馴化過程で機械ストレス耐性を上昇させていることが予想される。近年、動物細胞では機械ストレス耐性に細胞膜修復機構が深く関与していることが明らかとなってきた。細胞膜修復機構とは、機械ストレスにより生じる細胞膜の“穴”を、“穴”を通して細胞外から流入するカルシウムをシグナルとして利用することにより、内膜を用いて損傷した細胞膜を修復する機構である。細胞膜修復の報告は動物細胞のみではあるが、この機構が植物の高い凍結耐性に関与している可能性は十分にある。我々は、シロイヌナズナ葉より単離したプロトプラストを用いて、凍結下における細胞外カルシウムの有無による凍結耐性の差により、凍結耐性に対する細胞膜修復の可能性を検討してきた。その結果、少なくともプロトプラストの凍結耐性には細胞膜修復が関与し、またその耐凍性は氷晶成長に対するものであると推定された。しかし、プロトプラストには細胞壁がないため、実際の植物細胞の現象と異なる可能性がある。そこでシロイヌナズナ葉より生きた組織切片を作製し、低温顕微鏡を用いて細胞膜修復による凍結耐性を検討を行った。その結果、この場合でも細胞膜修復が氷晶成長に対する耐性に関与すると推定された。

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温帯域に生育する植物は、凍らない程度の低温にさらされると凍結ストレスに対する耐性が増大する（低温馴化）。低温馴化過程では細胞膜の脂質や膜タンパク質の組成変化が起こり、このことが凍結ストレス下における細胞膜の構造・機能維持に深く関わると考えられている。低温馴化によって凍結耐性が増大した植物では、細胞膜スフィンゴ脂質含量の減少が共通してみられる。スフィンゴ脂質は、細胞膜上で不均一に分布し、シグナル伝達や膜輸送などを行う機能性タンパク質が集合した「細胞膜マイクロドメイン」の形成と維持に関わることが動物細胞を用いた近年の研究によって提示されている。これらのことを踏まえ、本研究では、低温（2℃）処理前後のシロイヌナズナ植物体を用い、スフィンゴ脂質に富んだ細胞膜画分を非イオン性界面活性剤不溶性細胞膜（DRM）画分として単離し、DRM画分に局在するタンパク質成分の低温処理に伴う挙動について比較解析を行った。SDS-PAGEや2D-PAGE解析の結果、DRM局在タンパク質の発現パターンが低温処理によって量的・質的に変動することが示された。また、MALDI-TOF-MSによるDRM局在タンパク質同定では、細胞膜脂質や膜タンパク質の再構築への機能が推察されるタンパク質群がDRM画分に存在し、これらのうち幾つかのタンパク質発現量が低温処理によって変化することが明らかとなった。

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植物が氷点下の環境に曝され細胞外に氷晶が形成すると、細胞内外に水の化学ポテンシャル差が生じ、植物細胞に致命的な傷害をもたらす脱水ストレスが細胞膜に加わると考えられる。温帯以北に生育する植物の多くは、凍らない程度の低温で低温馴化し、凍結耐性を増大させる。これは、低温馴化で細胞膜中の不飽和リン脂質の構成比が増加し、脱水ストレスに対する耐性が増大するからだと推測されている。低温馴化では、細胞膜タンパク質の構成も変化するが、それらの凍結耐性への寄与は不明である。我々は、シロイヌナズナを用い、低温馴化で量的に変動する細胞膜タンパク質をプロテオーム的手法で解析した。その結果、低温馴化で増加する膜タンパク質の一つとして、動物細胞のシナプトタグミンと相同性の高い、シナプトタグミン様タンパク質AtSytAを同定した。動物細胞のシナプトタグミンは、機械的ストレスによって傷害を受けた細胞膜の修復に関わるとされる。細胞膜は、細胞外の氷晶から脱水ストレスだけでなく機械的ストレスも受けることから、AtSytAが機械的ストレス耐性に関与する可能性が示唆される。しかし、これまで細胞膜に加わる機械的ストレスに対する耐性と凍結耐性の関係について議論した研究はほとんど無い。本発表では、凍結耐性におけるシロイヌナズナAtSytAの機能を知るために行った逆遺伝学的な解析の結果を主に報告する予定である。

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寒冷条件下の植物はその生育や代謝が著しく阻害される。種々の生産活動の場である葉緑体もまた、様々な代謝活動が著しく低下し、葉緑体タンパク質の凝集や膜の構造変化・崩壊などが起こる。シロイヌナズナ葉緑体タンパク質Cor15amは植物の低温耐性獲得に関与すると考えられる低温誘導性タンパク質であるが、同タンパク質の生化学的性質ならびに機能は未だ不明である。そこで、我々は生化学的手法を用い、Cor15amの機能解析を行った。生化学的解析により、Cor15amは葉緑体内で複合体を形成しており、ストロマに局在することが示された。また、Cor15amの発現は葉緑体分化に影響されることがわかった。葉緑体ストロマにおける同タンパク質の機能を知るために、凍結融解で容易に失活する乳酸脱水素酵素（LDH）を用いin vitro凍結保護アッセイを行った。その結果、Cor15amは凍結融解によるLDHの失活を防ぐことがわかった。同時に、イムノアフィニティ精製により、Cor15amはLDHと相互作用することも明らかとなった。また、Cor15amはストロマのタンパク質と相互作用している可能性が示唆された。これら結果は、Cor15amが低温条件下において、葉緑体タンパク質と相互作用することによりその機能を保護していることを示唆している。

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低温ストレス下では葉緑体包膜の構造変化・崩壊が起こり、光合成をはじめとする葉緑体内の様々な代謝活動が著しく低下すると考えられる。低温で発現誘導される遺伝子の一つである COR413IM1 は、その産物が葉緑体膜への局在が予想される機能未知遺伝子で、光や脱水ストレスおよびアブシジン酸によっても転写誘導されることがわかっている。本研究ではシロイヌナズナにおける Cor413im の局在解析およびT-DNA挿入変異株の生理学的解析を行ったので報告する。まず、前駆体タンパク質を in vitro 転写翻訳システムにより合成し、in vitro 葉緑体インポート実験を行った。その結果、Cor413im1 が葉緑体包膜に局在することが明らかになった。さらに Cor413im1-proteinA 融合タンパク質の過剰発現体を用いた解析により、Cor413im1 のトポロジーを明らかにした。また、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティー精製の結果から、Cor413im1 は高分子複合体を形成する新規葉緑体包膜タンパク質である可能性が示唆された。次に COR413IM1 およびそのホモログ遺伝子である COR413IM2 の T-DNA 挿入変異株を単離し、様々な生理学的解析を行った。その結果、いずれの変異株においても代表的な COR 遺伝子の発現パターンが野生株とは異なることが明らかとなった。現在これら遺伝子破壊株の凍結耐性試験を行っており、それらの結果と併せて Cor413im タンパク質の機能を考察する。

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雪の酸性化は酸性雨と同様にこの10年間で着実に進行し、環境への影響が懸念されるが、その影響は定かではない。そこで我々は、酸性雪の積雪層下で植物が局所的に雪氷表面に濃縮された酸性物質に長期的に曝されたり、酸性度の強い融雪水に曝されたりすることを想定し、越冬性作物の冬小麦幼苗をpH 2からpH 4に調整した硫酸溶液中で凍結融解することで酸性雪ストレスを模し、酸性雪が越冬性植物に与える影響を調べることにした。これまでに、低温馴化した冬小麦緑葉を硫酸存在下で凍結融解（SAS処理）すると傷害が助長されることがわかった。そこで本研究では、低温馴化した冬小麦個体を-4℃のSAS処理（pH 2）に4時間施した後、融解してから10℃の12時間日長の条件下に移して再生長させ、個体への影響を調べた。冬小麦緑葉の葉齢の違いによりSAS処理に対する応答性に差異がみられたため、葉齢別に応答性を評価した。pH 2のSAS処理後に再生長させた冬小麦の第1葉（成熟葉）では、SAS処理直後に生じた可視傷害部位は広がらないが、著しく脱水されて生重量が低下することが分かった。一方、第2葉ではいずれも大きな影響は見られなかった。おそらく葉齢によって凍結抵抗性が異なるため、第1葉と第2葉でSAS処理後の再生長への影響にも違いが生じたものと考えられる。SAS処理直後に冬小麦に大きな傷害が観察されなくても、再生長過程において緑葉に影響が出ることが強く示唆された。

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北方落葉広葉樹の木部柔細胞は深過冷却と呼ばれる凍結回避機構により氷点下温度に適応している。これまで、この深過冷却機構は、木部柔細胞のプロトプラストが細胞壁の構造特性により脱水や植氷といった細胞外の氷晶の影響から隔離された微小な液滴として存在することで水の均質核形成温度（-40℃）まで過冷却を続けることによると考えられてきた。しかし、われわれの最近の研究により、細胞壁に傷害を与えることなく細胞の膜構造を破壊し、細胞内成分を漏出させると木部柔細胞の過冷却能力が低下することが明らかとなり、細胞壁の構造特性のみではなく細胞内成分も深過冷却機構に関与することが示唆された。そこで、北方落葉広葉樹のカツラ（Cercidiphyllum japonicum）の木部組織から抽出した可溶性成分から、過冷却を促進する成分の単離を試みた。その結果、溶液中で起こる氷核形成を阻害する4つの化合物を単離した。これらの化合物の構造解析を行ったところ、いずれもフラボノール配糖体であることが明らかになった。その中でもケンフェロール-7-O-β-グルコシドの活性が最も高く、氷核細菌（Erwinia ananas）を含む溶液の温度を1.0 mg/mLで9.0℃も低下させた。今後、これらの化合物の局在性や季節的な過冷却能力の変化に伴う蓄積量の変化を調べ、フラボノール配糖体が樹木木部柔細胞の深過冷却機構に果たす役割を検討する。

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大腸菌の低温馴化においては，低温ショックタンパク質（CSP）の蓄積が不可欠である．CSPは低温下で生じるRNAの2本鎖構造を解くRNAシャペロンとして機能する.我々はコムギの低温ショックドメイン（cold shock domain ; CSD）タンパク質WCSP1が細菌のCSPと構造・機能的に保存されたドメインをもつことを明らかにしている．今回，我々はシロイヌナズナのゲノムにコードされる4つのCSDタンパク質のうち，AtCSP1についての機能解析の結果を報告する．まず，RT-PCRによる発現解析を行なったところ，AtCSP1の発現は低温処理（4℃）により増大することが示された．次に大腸菌より組換えAtCSP1タンパク質を精製し， in vitroで2本鎖DNAをモデル基質とした核酸解離活性を検討した．その結果、AtCSP1は2本鎖DNAを解離させる活性を持つことが明らかとなった． AtCSP1プロモーター::GUS融合遺伝子の発現解析により，AtCSP1は幼苗の茎頂、根の先端組織などの分裂が盛んな組織や葯で特異的に発現していることが分かった．AtCSP1::GFP融合遺伝子をパーティクルガンを用いてシロイヌナズナの根の細胞内に導入し、一過的に発現させたところ、核内特に核小体で強いシグナルが確認された．以上の結果からAtCSP1はRNAシャペロンとして，核内においてmRNA, rRNAのプロセシング等に関与する可能性が考えられた．

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トレハロースは微生物においては乾燥ストレスの防御物質として機能するが，植物では蓄積が極微量であるため，異なる機能を有すると考えられる．植物におけるトレハロース生合成は，Tre6P合成酵素（TPS），Tre6P脱リン酸酵素（TPP）による二段階の反応で行われる．我々はこれまでにイネ幼苗において発現するTPP遺伝子OsTPP1を単離し，その発現が低温処理（12°C）によって一過的に誘導されること及び低温により細胞内総TPP活性及びトレハロース蓄積量が一過的に上昇することを示している（Plant Mol. Biol. 58: 751-762, 2005）．
今回，イネにおけるOsTPP1の働きを解析する為に，ユビキチンプロモーターの下流にOsTPP1を接続させたコンストラクトをイネに形質転換させたOsTPP1過剰発現体を作出した．過剰発現体は稔実の低下と穂が伸長する形態異常が観察された．可溶糖の解析の結果，OsTPP1過剰発現体ではトレハロース含量が約3-6倍に増加していた．またこの時グルコース及びフルクトースが野生株と比較して約3-15倍蓄積していることを明らかにした．さらに，興味あることにOsTPP1過剰発現体は根の伸長においてABA高感受性を示した．これらの結果より，OsTPP1はトレハロースの蓄積またはその前駆体（Tre6P）の減少を介して，糖代謝及びABAシグナル伝達系に関与することが示唆された．

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イネの穂ばらみ期、とりわけ小胞子初期の冷温による花粉の発育障害は、東北日本において甚大なイネの冷害をもたらす。小胞子初期から小胞子中期にかけて、冷温に応答して、ジャスモン酸生合成遺伝子OPDAR1とタンパク質分解酵素に類似のドメインを持つ機能未知遺伝子Radc1 が顕著に発現レベルを低下させること、逆に、ポリアミン生合成遺伝子SAMDC1が顕著に発現レベルを上昇させることが見いだされた。また、イネ葯で冷温により極度に発現が抑制される遺伝子Radc1 及びOsSalT の5'上流域のほぼ同位置に、新規なシスエレメントとしてDNAトランスポゾンCastawayを含む配列が確認された。これらのイネ葯冷温ストレス応答遺伝子について、遺伝子のプロモーター配列（5'上流域およそ2 kbp以内）にレポーター遺伝子GUSあるいはGFPを連結したコンストラクトをイネに導入し、遺伝子の葯における発現様式と冷温応答性を確認した。現在、遺伝子の発現様式を in situ hybridizationにより詳しく検討するとともに、形質転換植物体イネを作成して、これらの遺伝子の機能解析を進めている。

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葉緑体膜の脂質を構成するトリエン脂肪酸の含有量は、植物の温度適応性と密接に関係しており、その含有量を減少させることで、耐暑性を付与できることを示した事例が報告されている。トリエン脂肪酸は、葉緑体および小胞体に局在するω-3デサチュラーゼによって合成される。本研究では、冷涼な気候を好むシクラメンに耐暑性を付与することを目的として、シクラメンの葉緑体型ω-3デサチュラーゼ遺伝子（CpFAD7）を同定し、この遺伝子の発現をRNA干渉により低減させた形質転換シクラメンを作出した。得られた形質転換体では、CpFAD7 mRNAの蓄積がほぼ完全に抑制され、葉における主要な脂肪酸に対するトリエン脂肪酸の含有量が、栽培種における約50%に対して、約2%にまで減少していた。後代の低トリエン脂肪酸個体において耐暑性を評価した結果、栽培種が萎れ症状を示す38℃、5日間の高温処理でも萎れ症状が顕著に緩和された。トリエン脂肪酸の含有量は温度適応性だけでなく、土壌乾燥に対する適応性とも関わっていることが示唆されている。しかしながら、12日間の無灌水処理により耐乾燥性を評価した結果、低トリエン脂肪酸個体の萎れ症状には、栽培種との間に有意差が認められなかった。
以上の結果より、シクラメンではトリエン脂肪酸の含有量を抑えることにより、耐乾燥性を低下させることなく、耐暑性の付与が可能であることが明らかになった。

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Ice nucleation is considered to be an important mechanism in cold hardy plant tissues to avoid excess supercooling of protoplasm and properly induce extracellular freezing and to accommodate ice crystals in the specific tissues in extra-organ freezing. However, there have been only a few studies on ice nucleating activity (INA) associated with wintering plants. We characterized highINA in cold hardy twigs. The INA in the twig was localized in bark where it was tightly bound to cell walls fraction while intracellular fractions had much less INA. The presence of high INA in cell walls fraction of stem bark corresponds well to the freezing behavior (extracellular freezing) of the bark tissues, high temperature exotherm detected in differential thermal analysis and ice accumulation in the bark tissues. The stem INA tended to decrease when measured after the stem was frozen to deeper temperatures. The stem INA was resistant to various antimicrobial treatments.

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モデル植物であるArabidopsis thalianaは様々な地域でエコタイプが発見され、その数は約1000種程度とされている。エコタイプ間には1000塩基に1つ程度しか塩基配列が異ならないにも関わらず、近年の研究により、ストレス耐性などにおいて、非常に大きなバリエーションがあることが明らかとなってきた。我々のグループでは、理研BRCに収集されている354種のA. thalianaエコタイプについて、土植え植物の耐塩性評価を行った。その結果、ゲノムシークエンスが公開されているCol-0はA. thaliana のエコタイプの中でも塩高感受性であり、Col-0よりも耐塩性を示すエコタイプが非常に多く存在することが明らかとなった。本研究では、Col-0と比較して特に高い耐塩性を示し、寒天培地上での耐塩性試験でも再現性良く耐塩性が認められたLl-1に着目し、マッピングにより, 原因遺伝子を同定することを目的として研究を進めている。
Col-0×Ll-1_F1植物はLl-1と同程度の高い耐塩性を示すことから、Ll-1が持つ耐塩性は優性であることが明らかとなった。劣性の表現型を示すF2植物を用いて、Ll-1の耐塩性因子をマッピングした結果、第4染色体の上部に原因遺伝子の存在が示唆された。このマッピング結果は理研のマッピングシステムでも同様の結果が得られている。

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モデル植物であるArabidopsis thalianaは世界中に非常に多くのエコタイプが分布する。各エコタイプ間では1000bpに1つ程度しか塩基配列が異ならないものの、近年の研究により、様々な表現型の違いが見出されている。我々のグループでは、理研BRCに収集されている354種のエコタイプの耐塩性を評価し、ゲノムシークエンスが読まれているCol-0に対して、顕著な耐性を示す、あるいは高感受性を示すエコタイプを発見した。本研究では単離された耐塩性、あるいは塩高感受性エコタイプの、発芽時における耐塩性を評価した。その結果、幼植物時で塩耐性を示すエコタイプは発芽時では塩高感受性を示し、一方、幼植物時で塩高感受性を示すエコタイプは発芽時では耐塩性を示す逆相関の傾向が見られた。このような発芽時と幼植物時の耐塩性の逆転現象は、極度の耐塩性を示す塩生植物などでも観察されることが知られている。
そこで本研究では、幼植物時と発芽時における耐塩性の逆相関が、同一因子によるものなのか、あるいは違う因子によるものなのかを明らかにするために、耐塩性の逆転現象が明確に観察される、耐塩性エコタイプ、 Zu-0を用いて、発芽時および幼植物時、それぞれの塩耐性遺伝子のマッピングを行った。

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我々のグループでは、理研BRCに収集されている354 種類のArabidopsis thalianaエコタイプの耐塩性評価を行い、Col-0に対して塩に耐性あるいは高感受性を示すエコタイプを見出した。これらのうち、耐塩性エコタイプとして単離されたBu-5に関しては、低濃度の塩で馴化させた場合、Col-0よりも著しく高い耐塩性を示すことが明らかとなった。
Bu-5の塩馴化によって増強された耐性が、塩ストレスの持つイオンストレスあるいは浸透圧ストレスのどちらに対するものかを調べたところ、 LiCl, CsCl を用いたイオンストレスには耐性を示さず、sorbitol を用いた浸透圧ストレスに耐性を示すことが明らかとなった。現在、Bu-5の塩馴化過程における転写レベルでの変化を調べるため、マイクロアレイ解析（Affymetrix Arabidopsis Genome Array）を進めている。さらに、Bu-5の耐塩性遺伝子を特定するためにマッピングを行った結果、原因遺伝子は第 5 染色体下腕に存在することが明らかとなった。これまでに原因遺伝子の存在範囲を数百 kbp 内に絞ることに成功した。

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塩生植物Thellungiella halophilaは、塩腺などの耐塩性に特異的な形態を持たない、モデル植物Arabidopsis thaliana近縁の塩生植物である。T.halophilaは極度の耐塩性を持つほか、凍結ストレス、酸化ストレス、さらには高温ストレスに対しても顕著な耐性を示すことから、植物の非生物ストレスを対象とする非常に有用な遺伝資源と言える。そこで我々はT.halophilaの様々な発生過程の葉、根、鞘、種子、あるいは、塩、凍結、低温ストレスおよびABAを処理した植物体を用いて、20000クローンを含む完全長cDNAライブラリーを作製した。20000クローンについて、5’および3’末端よりシークエンスを行ったところ、計35171配列を得た。これらをアセンブリーツールcap3で処理後、クラスタリングを行った結果、9565の独立したクローンを含むことが明らかとなった。なお、完全長率については88%と、これまでに報告される生物種の完全長cDNAと同等であった。本大会では、このT.halophila完全長cDNAライブラリーの評価をA.thalianaと比較して報告する。

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Arabidopsis thaliana 近縁の塩生植物である Thellungiella halophila は、1) A. thaliana と形態が似ている、2) A. thaliana と同様の形質転換方法を用いることが可能、3) A. thaliana と核酸レベルで90%以上の相同性を有することから、A. thaliana との比較ゲノミクスに適する、これまでの塩生植物にない利点を持ち、顕著な耐塩性を示す。これまでの非塩生植物を用いた研究により、Na⁺の輸送に関わる細胞膜Na⁺/H⁺アンチポーター（SOS1）,液胞膜Na⁺/H⁺アンチポーター（NHX1）,細胞膜Na⁺トランスポーター（HKT1）が耐塩性において必須であることが報告されている。すなわち各変異株は塩高感受性を示し、各過剰発現植物は塩耐性を示す。T. halophila の耐塩性においても、A. thaliana と比較して、地上部への塩の蓄積が非常に抑制されていることからNa⁺輸送が優れていることが示唆された。本研究では、塩生植物 T. halophila におけるNa⁺輸送体の機能解析を行うために、T. halophila SOS1, NHX1 , HKT1 完全長cDNA を用いて、全長シークエンス、塩処理時における発現解析を行った。また現在、イオンクロマトグラフィーを用いて両植物体の塩蓄積量について調べているので合わせて報告する。

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塩生植物Thellungiella halophilaは、モデル植物であるArabidopsis thalianaと核酸レベルにおいて90％の相同性を持つ近縁種で、塩ストレスに対し極めて高い耐性を示す。T, halophilaは塩ストレスの他に、凍結ストレス、酸化ストレスなどにも耐性を示すことが明らかになっている。本研究では、その他の様々な非生物的ストレス耐性を確認した結果、新たに高温ストレスに対しても顕著な耐性を示すことを明らかにした。T. halophilaは、孔辺細胞の数がA. thalianaに比べて2倍あることから、効率良く蒸散・放熱することができるため、高温ストレス耐性を示すということが一因として考えられた。そこで、細胞レベルにおいても高温ストレス耐性を示すのか調べるために、T. halophilaおよびA. thalianaをカルス化し、細胞レベルでの高温ストレス耐性を評価した。その結果、T, halophilaは、細胞レベルにおいても高温ストレス耐性を示すことが明らかとなった。T. halophilaはストレス非存在下において、既知のストレス誘導性遺伝子群を高発現していることが知られている。そこで現在、転写レベルにおけるT. halophilaの高温ストレス応答を調べるため、高温ストレス下におけるA. thalianaとの比較発現解析を行っている。

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RelA/SpoT タンパク質とは原核生物に特有なストレス適応機構である『緊縮制御』の原因分子、グアノシン-5’-二リン酸-3’-二リン酸 (ppGpp) を合成する酵素である。原核生物において ppGpp はストレス下で蓄積され、RNA ポリメラーゼと結合して各種遺伝子の発現を正または負に制御する分子機構が解明されつつある。近年、原核生物に特有と考えられてきた RelA/SpoT の相同タンパク質が、高等植物であるシロイヌナズナの葉緑体からも発見され、高等植物にも『緊縮制御』のようなストレス適応機構が存在する可能性が考えられている。当研究室では塩生植物シチメンソウの耐塩性機構の解明を目指し、大腸菌を用いた機能スクリーニング法により、その耐塩性に関与する遺伝子の単離を試みた。その結果、RelA/SpoT 相同タンパク質 (SjRSH) をコードする cDNA を導入した大腸菌に耐塩性の向上が認められている。本研究では高等植物における RelA/SpoT 相同タンパク質の生理学的な役割の解析を目指し、SjRSH を導入した形質転換シロイヌナズナ、またシロイヌナズナ自身のRSH (AtRSH) 発現レベルを低下させた形質転換シロイヌナズナを作出し、それらのキャラクタリゼーションを試みた。

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当研究室では、大腸菌を用いた機能スクリーニング法により塩生植物由来の耐塩性関連遺伝子の探索を進めて来た。その結果、アイスプラント（Mesembryanthemum crystallium）の葉から作成した cDNA ライブラリーから葉緑体型RNA 結合タンパク質（McRBP）をコードすると考えられるcDNA を導入した大腸菌に顕著な耐塩性の向上が認められた。同タンパク質の機能解析を進めた結果、McRBPはRNAに対する結合能を有し、大腸菌内でRNAシャペロン様の活性を有することが確認された。次に、McRBP を過剰発現するタバコを作出し、それらの耐塩性の評価を試みた。その結果、非ストレス条件下において、野生株とMcRBP形質転換タバコに生育の違いはほとんど認められなかったが、150 mM の NaCl を含む水を与え続けた場合、野生株に比べMcRBP形質転換タバコに顕著な生育が認められた。アイスプラントの葉におけるMcRBP mRNA の発現量を real time RT-PCR で調べた結果、McRBP mRNAの発現は塩ストレスやアブシジン酸の添加により誘導されることが確認された。
以上の結果から、McRBPは、アイスプラントの塩ストレス下での生育に重要な役割を担っているものと考えられた。

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塩、乾燥、低温といった環境ストレスに対する単子葉植物の耐性機構を明らかにすることを目的として、私たちは、単子葉モデル植物であるイネを用いた分子遺伝学的な解析を行っている。これまでに、イネの内在性レトロトランスポゾン (Tos17) の挿入変異系統群から3種の塩感受性変異体 (rice salt sensitive; rss) を同定した。塩、高浸透圧、低温ストレスに対してそれぞれ感受性を示すrss1変異の原因遺伝子RSS1を同定したところ、既知の機能ドメインをもたない、新規なタンパク質をコードしていた。RSS1相同遺伝子は、単子葉植物で高度に保存されている他、原始被子植物や裸子植物にも存在するが、双子葉植物からは見出されていない。rss1では、塩ストレス存在下において、野生型に比して顕著に生長が阻害されるのみならず、根の分枝パターンや分裂組織の形態に異常がみられる。またRSS1は、野生型イネの分裂組織や葉の幼原基など、若い成長の盛んな組織でより強く発現する。RSS1は、未知の環境ストレス耐性機構に関わる因子であることが示唆されるが、現在、その分子機能の詳細について解析を進めている。また、rss2やrss3についても、変異体の特徴づけを行い、原因遺伝子の単離同定を目指している。

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当研究室では，耐塩性を獲得した耐塩性光合成成育突然変異系統pst2 (photoautotrohic salt tolerance 2) においてAtbHLH19転写因子の発現が野生系統に比べて特異的に高いことを明らかにした．AtbHLH19は，塩ストレスにより第一イントロンの一部が選択的スプライシングを受けた不完全スプライス型のmRNAだけでなく，第一イントロンが除かれた完全スプライス型のmRNAも混在する．本研究では，植物の耐塩性獲得の過程におけるAtbHLH19の機能の解明を目的とした．
2種類の転写産物を強制発現したシロイヌナズナ形質転換系統は，両者とも野生系統よりも高い耐塩性を示した．さらに，マイクロアレイ解析を行い，完全スプライス型および不完全スプライス型タンパク質により発現を制御される遺伝子を特定した．現在，その遺伝子のプロモーター領域にbHLH19が結合することを確認するため，ゲルシフトアッセイを検討している．また，AtbHLH19に相同な遺伝子がシロイヌナズナに3種類存在するため，これらとのヘテロダイマーの形成によるDNA結合能の変化についても検討する．以上を踏まえ，AtbHLH19転写因子の機能および耐塩機構への関与を考察する．

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We have applied activation tagging with enhancer sequences derived from cauliflower mosaic virus to selection of mutants tolerant to salt in fundamental cell functions, and further identified causal genes. Out of 62,000 transformed calli screened, more than 25 mutants were identified to be resistant to 150 mM NaCl. Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) was carried out to determine the locations of T-DNA integration in the genome. Expression of the genes adjacent to the T-DNA insert was analyzed at normal (no NaCl) and 150 mM NaCl-containing media through real-time PCR by LightCycler. In one of the mutants, expression of a gene (patent to be applied) was found to be enhanced more than 10 times at the normal medium while more than 100 times at 150 mM-NaCl stress level. Regenerated mutant plants showed enhanced tolerance to salt stress as compared to the wild-type. The expression profiles are being analyzed for other mutants.

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我々は、シロイヌナズナの耐塩性変異体stm1を単離し、その原因遺伝子がアンキリンリピートタンパク質をコードすることを明らかにした(第47回本会年会)。本研究では、STM1遺伝子の欠損がどのように耐塩性に関与するかを知るために、塩ストレスに伴うNa⁺の蓄積について、stm1変異体と野生株を比較した。Na⁺の蓄積が緩和された植物は耐塩性を示すことが知られている。塩ストレス下におけるstm1変異体のNa⁺含量は野生株と同様であったため、stm1変異はNa⁺含量調節とは異なる耐塩性機構に関与する可能性が示唆された。次にstm1変異体の乾燥、浸透圧ストレスに対する耐性を調べた。植物の乾燥、浸透圧ストレス応答機構は塩ストレス応答機構と部分的に共通しており、耐塩性植物は同時にこれらのストレスにも耐性を示す場合が多い。stm1変異体は乾燥、浸透圧ストレスに対して野生株と同様に損傷を受けたことから、stm1変異は塩ストレスに特異的な耐性機構に関与する可能性が示唆された。耐塩性に関与する重要な反応として、活性酸素の生成と除去がある。塩ストレスに応じて活性酸素が生成されるが、過剰な活性酸素の蓄積は植物を枯死させる。stm1変異体では、塩ストレス下における活性酸素の蓄積が野生株と比較して抑えられていたため、活性酸素の蓄積の低下がこの変異体の耐塩性の原因である可能性が考えられた。STM1は、塩ストレスに応じた活性酸素の生成、蓄積に関与していることが予想される。

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イネOsPti1aを欠失した変異体では、病原菌の感染に関わらず葉に擬似病斑を示し、一連の抵抗性反応が誘導される。OsPti1aはトマトPti1(SlPti1)相同遺伝子であるセリン/スレオニンキナーゼをコードしており、イネにおいてOsRAR1の上流で機能し、抵抗性シグナル伝達を負に制御する新規な因子であることを昨年本大会で報告した。今回我々はOsPti1aを介する抵抗性シグナル伝達について解析を進めるため、アミノ酸置換によりキナーゼ活性を欠失させたOsPti1a^K96N変異タンパク質を作成した。OsPti1a^K96Nをnull変異体に導入したところ、ospti1aでみられる擬似病斑の形成および矮性の表現型が相補された。またイネにおいてSlPti1相同遺伝子は2コピー存在するが、OsPti1bはOsPti1aに比べ植物体での発現量が非常に低く、また自己リン酸化活性を有していない。OsPti1b遺伝子をospti1a変異体において高発現させたところ、OsPti1a^K96Nを導入した場合と同様にospti1a変異が相補された。以上のことからOsPti1aによる抵抗性の抑制にはOsPti1aのキナーゼ活性ではなく、ある閾値以上のPti1タンパク質の存在が必要であると考えられた。また、培養細胞を用いた実験より、ospti1a変異体ではH₂O₂に対する感受性が高く、野生型より低濃度のH₂O₂で細胞死が有意に強く誘導されたことから、OsPti1aは活性酸素による細胞死の誘導制御に関与していると考えられた。

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OsPti1aはOsRAR1の上流で機能し、R遺伝子による耐病性シグナル伝達を負に制御する新規な因子である。ospti1a変異体の培養細胞はH2O2に対する感受性が高く、野生型よりも低濃度のH2O2で細胞死が誘導されたことから、ospti1a変異体の表現型がROSシグナルの制御機構の欠失により生じていることが推察された（高橋ら、本大会）。OsPti1aを介した耐病性シグナル伝達機構を明らかにするために、two-hybrid法によりOsPti1aに結合する因子PIP1(Ospti1a-interacting protein 1) を単離した。PIP1はAGCキナーゼファミリーに属し、シロイヌナズナのOXI1( oxidative signal inducible 1)と高い相同性を示す。OXI1はROSシグナルを正に制御することから、PIP1はイネにおいてROSシグナル伝達に関与する可能性が考えられる。AGCキナーゼファミリーは真核生物に広く保存されており、PDK1 (3-phosphoinotiside dependent protein kinase1)によって活性を制御されていることが知られている。そこで、two-hybrid法を用いてPIP1とPDK1の相互作用を解析するとともに、in vitroにおけるPDK1からPIP1へのリン酸化によるシグナル伝達を明らかにした。PDK1のTos17挿入変異体についても解析を進めており、以上の結果とあわせて、OsPti1aを介した耐病性シグナル伝達について考察する。

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OsMPK6(昨年度はOsMPK2として発表)はエリシターにより急速に活性化され、イネの病原体認識に重要な役割を持つと考えられる。また、トランスポゾンTos17の挿入変異体（osmpk6変異体）では恒常的にPR10aの発現上昇が見られ、エリシター誘導性の他の防御関連遺伝子も多くが野生型と同程度かそれ以上に発現していた。そのため、OsMPK6は防御関連遺伝子の負の制御因子と考えられた(2006年度本大会報告)。OsMPK6によるPR10a発現上昇の要因を解析するため、OsMPK6遺伝子を導入した相補体とosmpk6変異体を比較したところ、osmpk6変異体におけるOsMPK3様キナーゼの恒常的な活性化と発現上昇が見出された。このことから、OsMPK6はOsMPK3の活性と発現の両方を抑制していると推測された。一方、MPKが制御する防御応答反応を解析するため、MAPKKであるOsMKK4遺伝子を誘導的に発現する形質転換植物を作製した。恒常的活性型OsMKK4の蓄積に伴いOsMPK6とOsMPK3様のキナーゼが活性化された。また、防御関連遺伝子の発現が上昇し、細胞死が誘導された。このことからOsMKK4はOsMPK3, OsMPK6へのリン酸化シグナルカスケードを担い、防御関連遺伝子発現、細胞死に至る一連の防御反応を制御していると考えられる。

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ポリアミンは、様々な生理活性を持つ低分子化合物である。本研究室では、タバコモザイクウイルスによって誘導されるタバコの過敏感反応（HR）へのポリアミンの関与を明らかにした。ポリアミンは、細胞間隙に蓄積した後、ポリアミン酸化酵素（PAO）に分解される過程でH₂O₂を発生し、過敏感細胞死を誘導する。しかし、この知見は、タバコのHRに限定しており、ポリアミンが他の植物のHRに関与するかは不明である。また、病原体の種類に影響しないnonhost HRへの関与も知られていない。そこで、ポリアミンがタバコ以外の植物のHRおよびnonhost HRに関与するかを検討した。シロイヌナズナとイネにHRを誘導する病原体を接種すると、タバコと同様、細胞間隙にポリアミンが蓄積した。このことは、双子葉類だけでなく単子葉類のHRにもポリアミンが関与することを示す。タバコにnonhost HRを誘起すると、ポリアミン合成および分解系遺伝子群の発現が誘導され、細胞間隙にポリアミンが蓄積した。感染部位では、H₂O₂の発生と過敏感細胞死が観察された。さらに、VIGS法でPAO遺伝子の発現を抑制すると、H₂O₂の発生減少と不完全な過敏感細胞死が観察された。このことは、nonhost HRでもポリアミン由来のH₂O₂が関与することを示す。以上の結果は、ポリアミンが、植物の病害抵抗性に普遍的に作用する可能性を示唆する。

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