高等植物のカドミウム(Cd)に対する耐性や吸収機構を担っている遺伝子を同定し、そのメカニズムを解明することを目的として本研究をおこなった。T-DNAタギングによるシロイヌナズナ遺伝子破壊系統を作成し、Cd含有培地における根の伸長量を指標としてカドミウム（Cd）に対する感受性個体の選抜を行った。その結果、Cdに対して強い感受性を持つ変異体(hsc1)を得た。この系統と野生型シロイヌナズナを比較した場合、0μM Cdでは根の伸長がさほど変わらないのに対し、50μM Cdにおいてはおよそ半分となっていた。この変異体におけるT-DNA挿入部位をTAIL-PCRで確認した結果、第3染色体に座上するTriose phosphate isomerase(TPI)遺伝子の第7イントロンであった。そこで、TPIがCd耐性に何らかの関与をしていると考え、野生型シロイヌナズナを用いRT-PCRによるTPIの発現解析を行った。100μM Cdを1週間暴露した場合、根において1/2MSよりも約5倍の発現量があった。しかし、茎葉においてはその発現に変化は認められなかった。さらに、変異体の根、葉いずれにおいても遺伝子の発現はまったく認められなかった。これらの結果は、TPIのCd耐性への関与の可能性を示唆するものである。

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我々は、O. brevisの重金属イオン輸送体であるbxa1遺伝子を単離同定してきた。Bxa1はCPx－ATPaseであり、Ag, Cu, Cd, Znを輸送可能な蛋白質である。このbxa1遺伝子について、酵母形質転換体を用いて重金属ストレスに対する以下の機能解析を行った。
bxa1導入株はベクターpYES2導入株（コントロール株）に比べ、液体・固形の両培地でCdにのみ感受性になり、bxa1を過剰発現させるとCdストレスの有無に関係なく生育が著しく阻害された。Bxa1とGFPの融合遺伝子を用いた酵母細胞内局在性試験から、Bxa1が主にEndoplasmic reticulum（ER）膜に局在することも明らかとなった。また、Bxa1導入株の走査型電子顕微鏡（SEM）の観察結果では、細胞サイズが小さくなり細胞の形状が通常の卵形から球形に変化したものが増加することを明らかにした。さらにCd処理細胞を同様にSEM観察したところ、Bxa1導入株では球形の細胞の出現頻度がコントロール株よりもさらに高くなることが明らかとなった。このことから、Bxa1は蛋白質合成の重要な場所であるERに局在化し、蛋白質の合成に何らかの影響を与え細胞増殖阻害や細胞形態変化を起こしていることが示唆された。現在、細胞内部の変化についても透過型電子顕微鏡（TEM）での観察を進めている。

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Cd汚染土壌のファイトレメディエーションには、植物がCdに応答する機構の幅広い理解が必要である。そのため演者らは培地上にCdの濃度勾配を形成させたCd濃度勾配培地を用いてCdへの応答が変化したシロイヌナズナ変異株を単離し、解析を行ってきた（第47回大会）。得られた変異株のうちWTに比べ強いCd耐性を示す変異株、T-32株は一つの不完全優性変異をもち、生育速度の低下や葉の形態の変化も同時に観察された。また、この変異株は高濃度のNiにも耐性を示したが、ZnについてはWTと同程度の耐性しかもたなかった。生育開始後3週間目の植物体の根を30μMのCd溶液で24時間処理し、植物体のCd濃度を測定した実験では、T-32株は乾物重あたりでWTの約2.5倍量のCdを蓄積していることが明らかになった。このことからT-32変異株の原因遺伝子を解明することで、ファイトレメディエーションの実用化に役立つ有用な知見が得られるものと期待された。現在、この変異の染色体上の座上位置を特定するための実験を行っている。

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カドミウム（Cd）は強い毒性を有する重金属で、Cd汚染土壌の浄化にあたり、植物の環境浄化能が注目されている。植物のCd無毒化機構として、グルタチオン（GSH）から合成されるファイトケラチン（PC）が知られている。しかし、PC合成酵素を過剰発現させた植物体はCdに対し高感受性を示し、耐性を付与できないことが報告された。
そこで本研究では、植物における新たなCd耐性機構を解明することを目的とし、カーボンイオンビーム照射により得た変異体のスクリーニングを行い、シロイヌナズナのCd高感受性変異体（Cd sensitive mutant 1 ; cds1）を単離した。これまでに、cds1変異体はCd以外にも、水銀（Hg）、亜鉛（Zn）に対し野生型よりも高感受性を示すことが明らかとなっている。また遺伝学的解析および阻害剤実験から、cds1変異体の原因遺伝子はPC合成酵素とは異なることが示唆されている。
今回、cds1変異体の地上部のCd含有量を測定した結果、野生型と有意な差がないことが判明し、cds1変異体の根から地上部へのCd輸送能には異常がないことが示された。またマッピングによりcds1変異体の原因遺伝子は、第4染色体下腕の約300kbp領域に存在することが示唆された。この領域に含まれる遺伝子の1つは、プロモーター領域に大きな欠損があることが明らかとなり、現在さらなる解析を行っている。

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ヨシ（Phagmites communis）はカドミウム耐性植物であり、100μM CdCl₂でも生育可能である。100μM CdCl₂で1週間生育させた茎のカドミウム含量は0．15mg／gDW、葉身では0．05mg／gDWであり茎の1／3であった。葉身の細胞壁結合性カドミウムは葉身全体のカドミウムの7割であったが、茎では5割であり、ヨシ茎は細胞内にも多量のカドミウムを集積させていることが示唆された。またカドミウム処理により茎特異的にデンプン顆粒が蓄積することが分かったが、この顆粒のカドミウム蓄積量はわずかであった。そこで我々はヨシ茎の細胞内カドミウム結合分子の特定を試みた。ヨシ茎の細胞内液を限外ろ過分画し、各分画のカドミウム含量を測定したところ、分子量3000以下と10000～50000において高い含量であった。SH基を定量したところ10000～50000画分においてSH基は少量であり、カドミウム処理による上昇も認められなかったが糖含量は処理により上昇した。これより10000～50000画分において、これまでに報告されているカドミウムをキレートするペプチド、ファイトキレーチンではない糖を含むカドミウム結合性高分子化合物が存在することが示唆された。現在、このカドミウム結合性高分子化合物の同定、デンプン顆粒との関係を検討中である。

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銅はすべての生物種において必須な微量金属である。高等植物における主要な銅タンパク質としては光合成電子伝達に関与するプラストシアニン(PC)や活性酸素消去系に関与するCu/ZnSOD (CSD)がよく知られており、シロイヌナズナにおいてCSDは細胞質と葉緑体に局在している(CSD1&CSD2)。このように銅は高等植物にとって必須である一方、過剰な銅は極めて有毒である。そのため細胞内において銅濃度は厳密に制御される必要がある。これまでの我々の実験からCSD1、CSD2の発現は銅欠乏条件下において共にdown-regulationされることが分かっている。また近年のゲノムレベルのmicroRNAプロジェクトによりmicroRNAのひとつであるmiR398がCSD1、CSD2を標的としていることが推測された。そこで今回の実験において我々はmiR398が銅欠乏条件下において特異的に発現し、CSD1、CSD2 mRNAを直接分解することを証明した。また銅欠乏時にはCSD1、CSD2の代わりとしてFeSODが特異的に発現し活性酸素消去機能を担っている。一方PCは銅欠乏時にもタンパク質の蓄積が観察された。これらの結果から、銅欠乏条件下では銅はmiR398の制御によりPCに優先的に渡される、すなわち銅不足の環境において植物は光合成を最優先に行うことが示唆された。

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銅は必須微量元素のひとつであり、植物体内の酸化還元酵素を構成する成分として重要な生理的役割をもつ。しかし、過剰な銅は、クロロシスや根伸長阻害などを起こす。そこで、本研究では銅耐性に関与する遺伝子を特定するためQTL解析を行った。シロイヌナズナLer/Cvi 及び、Ler/Col RILsを用い、コントロール区に対する銅ストレス下での根伸長量を銅耐性指標としてQTL解析（CIM法, p < 0.05）を行った。その結果、両RILsにおいて複数の共通するQTLが検出された。特に、第1染色体下部のQTL1は銅耐性変異への寄与率がLer/Cvi RILsで40%、Ler/Col RILsで20%と高く、QTL1領域には主要な銅耐性遺伝子が存在すると考えられた。また、銅感受性RIラインでは耐性ラインに比べ、地上部よりも根部への銅集積が高かった。よって、主要なQTL1は銅輸送に関与すると考えられた。実際に、copper-exporting ATPase遺伝子（HMA5）が両RILsのQTL1領域内に存在したため、その詳細な解析を行った。その結果、同遺伝子のT-DNA挿入遺伝子破壊株は、地上部よりも根部への銅集積が高く、銅ストレスに対し超感受性を示した。また、その感受性は、耐性親のLerアレルでは相補したが、感受性親のCviアレルでは相補しなかった。以上のことから、QTL1遺伝子はHMA5であると結論した。

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Cation diffusion facilitator (CDF) ファミリーの一つであるArabidopsis thaliana のmetal tolerance protein 1 (AtMTP1, 43 kDa）は、液胞膜に局在し、過剰亜鉛の毒性回避に重要であることを既に我々が報告している。液胞の亜鉛輸送を欠失した酵母変異株（亜鉛感受性株Δzrc1cot1）へAtMTP1を異種発現させると、亜鉛耐性が回復し機能相補する。この酵母より調製した液胞膜を用いた⁶⁵Zn²⁺輸送活性測定より、AtMTP1はH⁺との交換輸送によりZn²⁺を液胞へ輸送しているZn²⁺/H⁺ exchangerである事を初めて明らかにすることができた。しかし、細胞内の亜鉛は非常に低濃度に保たれており、どのように低濃度の細胞質亜鉛を輸送体が察知して、過剰な亜鉛のみを液胞へ輸送するのか興味深いが不明である。AtMTP1は4番目と5番目の膜貫通ドメインの間にHisを25個含むループを持っており、このHis-rich Loopが亜鉛輸送に重要であることをHis-rich Loop変異体を用いた解析より明らかにした。部位特異的な変異導入により、新たに特定した輸送機能に影響を及ぼす残基と共に、AtMTP1の構造と機能相関について報告する。

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OsNAC6はイネのNAC型転写因子である。OsNAC6の発現は低温、乾燥、塩ストレスで誘導されるが、傷害やいもち病の感染でも誘導される。酵母を用いた実験からOsNAC6には転写活性化能があることが示され、細胞内局在実験からOsNAC6-sGFP融合タンパク質は核に局在することが示された。また、OsNAC6を過剰発現したシロイヌズナやイネでは生育阻害が観察された。マイクロアレイ実験から、OsNAC6を過剰発現したシロイヌナズナとイネの両方で、多くの非生物的ストレス・生物的ストレス誘導性遺伝子群の発現レベルが上昇していることが判明した。一過的転写活性化実験から、パーオキシダーゼなど3種のタンパク質の遺伝子が、OsNAC6により転写活性化することが示された。これらの結果は、OsNAC6が非生物的ストレスと生物的ストレスに対して機能する転写活性化因子であることを示唆する。OsNAC6を過剰発現するイネでは、乾燥・塩ストレス耐性が向上したばかりでなく、いもち病耐性も向上していた。OsNAC6プロモーターなどのストレス誘導性プロモーターを用いて、OsNAC6をイネで過剰発現させると、生育阻害を示すことなくストレス耐性が向上した。OsNAC6は種々の植物のストレス耐性を向上させる有効なバイオテクノロジーツールとなることが期待される。

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RSOsPR10 (Root Specific Oryza sativa Pathogenesis-Related 10)は、イネ根におけるプロテオーム解析により乾燥、塩処理により発現が誘導されるタンパク質として検出され、これまでの研究により、mRNAの発現が乾燥、塩、プロベナゾール、いもち病菌、ジャスモン酸（JA）によって根に特異的に誘導され、低温、アブシジン酸、サリチル酸（SA）によっては増加しないことが分かっていた。本研究では、RSOsPR10に対する特異的抗体を用いてタンパク質レベルでの解析を進めた。その結果、塩および傷害処理におけるRSOsPR10の発現誘導はJAを介すること、さらにSAがJAの作用を抑制することが示された。また、JA欠損ミュータントであるhebibaを用い、この発現誘導がJA経由であることを確認した。さらに、イネ幼植物体におけるRSOsPR10の発現局在を、凍結切片を用いた免疫組織化学的手法を用い組織レベルで解析したところ、RSOsPR10は塩やJA処理前には検出されないが、処理後約24時間で根のほぼ全長にわたり維管束系を取り巻く細胞群（皮層）に発現していることが明らかになった。この時、葉での発現は観察されなかった。さらに、塩またはJAと同時にSAを処理することによってRSOsPR10の発現が抑制されることが組織レベルでも観察された。

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高等植物における、ポリプレノールやドリコール等のZ,E混合型ポリイソプレノイドの生理的意義については不明な点が多い。我々はZ,E混合型ポリイソプレノイドの生理機能解明を目的として、その基本骨格生合成を触媒するシス型プレニルトランスフェラーゼ（CPT）の機能解析を行っている。これまでの研究により、シロイヌナズナCPT相同遺伝子の1つであるAtCPT5は、炭素数30-35のポリイソプレノイドを合成する新奇な生成物鎖長特性を示す酵素をコードしており、また低温や浸透圧ストレス下でその遺伝子発現が誘導されることが明らかになった。本発表では、AtCPT5およびその反応生成物のストレス応答における関与を解明するために、AtCPT5過剰発現型形質転換シロイヌナズナを用いてストレス耐性試験を行った結果を報告する。
CaMV35SプロモーターにAtCPT5を連結したコンストラクトをシロイヌナズナに導入し、遺伝子の発現レベル及びCPTの活性レベルの異なる複数の形質転換ラインを獲得した。これらの形質転換体はAtCPT5の発現レベルの増加に伴って根の伸長が抑制される表現型を示した。ストレス耐性は、低温、塩、マンニトール（高浸透圧）の各ストレス条件下及びABA処理における根の伸長について評価した。その結果、過剰発現体は特にマンニトールによる浸透圧ストレスに対して耐性を示すことが明らかになった。

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乾燥ストレスによるアブシジン酸(ABA)生合成の活性化は植物の乾燥応答において重要な調節である。シロイヌナズナ9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 3（AtNCED3）は乾燥時のABA生合成の律速酵素であることが知られているが、その調節メカニズムはほとんど理解されていない。そこで、乾燥応答におけるAtNCED3蛋白質の量的変化と植物体内のAtNCED3の局在性を解析し、ABA合成部位に関する知見を得ることを目的として研究を行った。まず、ウエスタン解析により乾燥応答におけるABA生合成酵素（AtNCED3、AtABA2、AAO3）の量的な変動を調べた。乾燥処理前の植物において、AtABA2とAAO3の発現は検出されたが、AtNCED3の発現は検出できなかった。AtNCED3の発現は乾燥処理30分後より葉で増加することが確認された。次にロゼット葉におけるABA生合成酵素の発現組織（細胞）を免疫組織染色により調べた。乾燥処理前のロゼット葉において、AtNCED3の発現は確認できなかったが、乾燥処理後、NCED3は維管束柔組織において発現していた。AtABA2、AAO3も同様に維管束組織において発現していることから、乾燥により増加するABAは主に維管束組織で合成されることが示唆された。

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イネプロテインキナーゼSAPKsは高浸透圧ストレスやABAによって迅速に活性化を受ける。我々は植物のストレス応答におけるSAPK周辺のシグナル伝達機構を分子レベルで解明する目的で、Oc細胞由来cDNAライブラリからSAPKと相互作用しうるタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングを行った。その結果得られた陽性クローンの一つは、塩基配列からphosphatidylinositol 4-kinase β (PI-4Kβ)をコードしていた。phosphoinositideは、高浸透圧ストレスやABA応答に重要な働きをしていることから、この遺伝子に着目して解析を進めた。SAPKとの相互作用が認められた領域をGST融合タンパク質として大腸菌で生産し、組換えSAPK2タンパク質による試験管内リン酸化反応を行ったところ、このタンパク質はSAPK2の基質となりうることが分かった。PI-4Kβのin vivoでの機能を明らかにするため、シロイヌナズナのT-DNA挿入変異株を用いた表現型の解析を行った。シロイヌナズナには相同性の高い遺伝子が2つ存在したため、これらの2重破壊株を作製した。2重破壊株は、野生株と比較して細胞伸長の低下により、植物体が全体的に矮化していた。また、培地の浸透圧に依存した根の皮層及び根毛を含む表皮細胞の伸長肥大の異常が認められた。以上の結果は、PI-4KβがSAPKを介したシグナル伝達において何らかの機能を持つ可能性を示唆している。現在この2重破壊株の示す表現型についてさらに解析を進めている。

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水センシング機構の解明を目的として、我々は水屈性に異常を示す変異体のスクリーニングを行い、単離した変異体の一つであるcs2448の詳細な解析を行ってきた。これまでに、K⁺チャネルをコードしているAKT2遺伝子が水屈性異常の原因遺伝子であり、さらにその発現量が水屈性を示す部位である根端で、乾燥ストレスに応答して上昇することを明らかにした。本研究では、AKT2変異体の屈性特性とAKT2遺伝子の役割を検討したので報告する。
屈曲速度が測定できるように改良した水屈性検定法を用いて、幼植物体の根の水屈性を経時的に観察した。野生株は6時間後にほぼ最大屈性を示したが、cs2448やSALK研究所から供与されたakt2変異体は野生株より2時間以上遅れて屈曲し、遅延型の応答性を示す変異体であることが判明した。また、根におけるAKT2遺伝子の発現に植物ホルモンが関与しているかどうかをqRT-PCR法で調べたところ、アブシジン酸(ABA)によって誘導されることが明らかになった。ABA合成阻害剤やABA変異体を用いた実験から、水分感知から屈曲までのシグナル経路にABAが関与することが示唆された。
現在、根の伸長帯付近におけるAKT2遺伝子の発現変化を、AKT2プロモーターGUS植物を用いて調査し、水屈性に対する役割を調べている。

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これまでに、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha L.)の懸濁培養細胞を高濃度のショ糖を含む培地で前培養すると乾燥耐性が増大することを明らかにした。浸透圧調整物質としてマンニトールを前培養培地に用いた場合、部分的に細胞の乾燥耐性が増大することも明らかにしている。本実験では、細胞内外の糖の乾燥耐性増大効果について検討した。シリカゲル上で細胞を24時間乾燥させると含水量が0.1gH₂O/gDW以下まで低下した。このような細胞の生存率を再培養法によって調べると、前培養なしでは0%だが、0.5Mショ糖あるいは0.5Mマンニトールを含む培地で前培養すると、それぞれほぼ100%あるいは約20%であった。細胞のショ糖含量をHPLCで測定したところ、0.5Mショ糖あるいは0.5Mマンニトールを含む培地で前培養した場合、細胞内に蓄積したショ糖の量は前培養しないときより4倍以上あるいは約3.5倍増加した。これは浸透圧ストレス下で基本培地中のショ糖を細胞が取り込んだためと考えられる。0.5Mマンニトールを含む培地で前培養した細胞を0.5Mショ糖を含む培地で洗浄してから乾燥処理を行うと、乾燥後の細胞の生存率が著しく上昇し、乾燥後の細胞の生存率はほぼ100%になった。このことから、ゼニゴケ懸濁培養細胞において、細胞内外に存在するショ糖が乾燥耐性増大に効果的に働くことがわかった。

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ベタインは植物が塩・乾燥ストレスに曝されたときに作られる適合溶質である。植物の場合、ベタインは葉緑体で合成されるのでその輸送は重要であるが、ほとんど解明されていない。今回、ベタインを蓄積する死海の耐塩性ラン藻Aphanothece halophyticaからベタイントランスポーター遺伝子（ApBetT）を単離し、マングローブのそれ（AmBetT）と比較検討した。その結果、ApBetTはベタインのみを輸送し、ベタインおよびプロリンを輸送するAmBetTとは異なる基質特異性を示した。ApBetTによるベタインの輸送はNa⁺存在下のみによって見られ、K⁺や他のカチオンは効果がなく、ApBetTがNa⁺-ベタインシンポーターであることを示している。一方、AmBetTはH⁺-ベタインシンポーターであると思われる。ApBetTのベタインに対する親和性はAmBetTより高かった。両者の輸送活性のpH依存性が異なっていた。これらの結果について報告する。

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ベタインは植物が塩・乾燥ストレスに曝されたときに作られる重要な適合溶質である。多くの生物ではベタインはコリンの2段階の酸化により合成される、耐塩性ラン藻Aphanothece halophytica ではグリシンの3段階のメチル化反応によって合成される。これまでの研究の結果、ベタインの蓄積には、コリン、エタノールアミン、セリン等の前駆体の供給やコリンの葉緑体膜透過促進 が重要であることが示されている。今回、グリシンからサルコシンへのメチル化反応を触媒するグリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ（ApGSMT）およびサルコシンからジメチルグリシンへのメチル化反応を触媒するジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼ（ApDMT）遺伝子を導入したアラビドプシスを用いて、そのベタイン蓄積に及ぼす前駆体の効果について検討した。また、セリンの合成に関与する3-ホスホグリセリン酸脱水素酵素の性質、役割についても検討した。これらの結果について報告する。

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植物の細胞壁は細胞の物理的強度と構造を維持する小器官であるとともに，細胞機能の制御に重要な役割を果たしている．細胞壁構成成分のほとんどは炭水化物であるが，タンパク質もまた3次元的な物理的構造を形成する重要な役割を担っている可能性がある．そこで，ブラックマッペ（Vigna mungo L.）下胚軸細胞壁より，物性に関わるタンパク質の同定を目指した．ブラックマッペを，暗黒下，3あるいは7日間栽培した下胚軸を用い，3M LiCl (pH 6.8)で細胞壁結合タンパク質を抽出し，二次元電気泳動で分離した．主要なスポットを切り出し，N末端アミノ酸を解析し，10塩基解読した．BLAST解析より，細胞壁タンパク質，XTHやブラシノステロイド誘導性タンパク質と相同性が高いタンパク質などが得られた．この中で，機能不明のタンパク質（P1，P5）の解析を試みた．N末端アミノ酸配列をもとにプライマーを設計し，PCRを行い，タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを行った．その結果，P1はアルファルファのunknown proteinと，P5はタルウマゴヤシcurculin-like (mannose-binding) lectinと高い相同性が示された．現在，これらタンパク質の機能解析と発現を調べている．

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シロイヌナズナ分枝花茎の伸長域から凍結融解法により細胞壁試料を調製し、その伸展特性の解析を行った。伸展速度の張力依存性（SER特性）をProgrammable Creep Meter (PCM)を用いるスイープ法^（1）により求めた。特性解析に当たってSER曲線からノイズを除去して壁降伏パラメータを算出したが、この処理はMathematicaでプログラムを組んで行った。花茎細胞壁の破断張力は最大でも16 gf （pH 6.8）と小さいが、最大伸展速度は大きく25 %/h（pH 4.8 ）に達した。SER特性はキュウリ^（1）、ダイズ^（2）、ササゲ⁽³⁾などと同様強くpHに依存し、壁の酸による伸展は容易であることが分かった。しかしSER曲線の直線による近似は難しく、Lockhart 式をもとにした従来の方法による壁の特性解析はできなかった。そこでSER曲線の各接線につき、その勾配を「微分壁展性」、x-切片を「見かけの降伏張力」と定義する新たな拡張Lockhart 式を導入して解析したところ、シロイヌナズナ細胞壁の降伏特性を適切に記述することができた。
1) Takahashi et al., Plant Cell Physiol. 47, 1520 (2006).
2) Ezaki et al., Plant Cell Physiol. 46, 1831 (2005).
3) Okamoto & Okamoto, Plant Cell Envrion. 17, 979 (1994).

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α-アラビノフラノシダーゼ(α-arabinofuranosidase)はペクチンやヘミセルロースからアラビノースを遊離する細胞壁分解酵素の一つである。果実において、アラビノースは成熟時に細胞壁多糖類から遊離し、果実の軟化や肉質の形成に関与している可能性が示されている。また、アラビノースの存在は細胞接着に関与するという報告もある。トマト果実において、α-アラビノフラノシダーゼ活性を測定すると、成熟果実だけでなく生長中にも検出された。高等植物から精製されたα-アラビノフラノシダーゼはGlycoside hydrolase ファミリー3と51に分類され、それぞれ基質特異性が異なり、特にファミリー3に属するα-アラビノフラノシダーゼは同時にβ-キシロシダーゼ活性を有する二機能性を示す。したがって、本酵素は生体内でアラビノースの遊離以外にキシロースの遊離にも作用している可能性があるが、その役割や機能については不明な点が多い。そこで、トマト果実を用い、ファミリー3に属する4つのα-アラビノフラノシダーゼをクローニングした。4つの遺伝子の発現は異なっており、果実の細胞分裂期、肥大期、老化期にそれぞれみられ、別々の役割を担っていると推定された。リコンビナントタンパクを用いてその基質特異性を調べるとともに、形質転換トマトを作成中である。

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植物の必須元素ホウ素は細胞壁に局在し、ペクチン質多糖のラムノガラクツロナンII（RG-II）領域に特異的に結合している。我々は、このホウ素RG-II複合体の機能を解析する手段としてRG-IIの構造変異株の作出を進めている。特にRG-IIの特異的構成糖である2-ケト-3-デオキシオクトン酸（3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid; KDO）に着目し、変異導入の基盤となる知見を得るために高等植物のKDO生合成経路について検討中である。
CMP-KDO合成酵素（CKS；EC 2.7.7.38）は、KDOをRG-II合成の直接の基質である糖ヌクレオチドCMP-KDOに変換する酵素である。シロイヌナズナはCKS遺伝子1コピーを有する（At1g53000）。CKS遺伝子にT-DNA挿入を持つ3ラインについて解析したところホモ変異株は得られず、ヘテロ株の後代では野生型：ヘテロ型がおよそ1:1に分離した。かけ合わせ実験では、ヘテロ株を花粉親とした場合の後代は全て野生型であった。これらの結果は、CKS欠損によりKDOを含む正常なRG-IIが合成できない植物では花粉の稔性が失なわれることを示している。現在、cks変異が花粉の形成から授精に至るどの段階を阻害するかについて検討中である。

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高等植物の形態形成においては、分化した細胞同士の接着が重要である。しかし、その主役であるペクチンの生合成メカニズムや発現特性に関する知見は極めて乏しい。近年我々は、細胞接着性の弱くなった突然変異体nolac-H18の解析より、ペクチングルクロン酸転移酵素遺伝子：NpGUT1を同定した。この遺伝子は、頂端分裂組織で特に発現が強く、ホウ素-ペクチン分子間架橋およびホウ素の受容に必須の遺伝子である。同調化したタバコBY-2培養細胞を用いて細胞分裂過程におけるNpGUT1の発現パターンを調査した結果、M期前半に特徴的な強い発現を示し、その後は細胞分裂過程全体で弱い発現が観察された。そこで、DEX誘導アンチセンスNpGUT1(GUT1A)形質転換タバコBY-2培養細胞を用いて、同調培養開始直後からDEXによるGUT1A誘導を行い20時間後に観察を行ったところ、細胞接着性が弱くなり単細胞化したBY-2細胞が約30%の割合で形成され、NpGUT1は細胞板形成に重要であることが考えられた。また、DEX誘導GUT1A形質転換タバコを用いて、本葉が出る前の芽生えの茎頂に対してDEX添加を行った結果、茎頂がカルス化し、メリステムの細胞接着が弱くなっている様子が観察された。以上の結果より、NpGUT1は細胞分裂過程において重要であり、メリステムにおける細胞接着に貢献していると考えられた。

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ホウ素は高等植物の微量必須元素であり細胞壁ペクチンを架橋することによって細胞壁の構造を安定化させる働きがあると考えられている。演者はこれまでに低ホウ素条件下(5 μM)で成長可能なギンドロ培養細胞系(1/20-B)を確立し、ホウ素欠乏耐性機構について研究を行ってきた。その結果、ペクチン間のカルシウムによる架橋形成に必要なペクチンメチルエステラーゼ(PME)遺伝子の発現量が増加するとともに酵素活性が上昇することが明らかになりPMEがホウ素欠乏耐性に関与している可能性が示唆された。今回、ホウ素を含まない培地中で成長が可能な0-B細胞におけるPME活性とその遺伝子発現について調べたので報告する。
0-B細胞のPME活性は実験ごとのばらつきが大きく細胞系の不安定さを示していると考えられた。活性は非耐性細胞である1/1-B細胞よりも高く1/20-B細胞と同等であった。しかし、変動パターンは1/20-Bと大きく異なっており継代直後の高活性が6日目まで減少し、その後再び増加することが明らかになった。一方、PME遺伝子は1/20-B細胞と同様に継代後8～10日目で発現量が多く発現時期も1/1-B細胞では発現が見られない培養後期まで続いていた。これらの結果は0-B細胞においても1/20-B細胞と同様なホウ素欠乏に応答するPME遺伝子の発現と酵素活性の誘導機構が存在することを示唆している。

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多細胞植物の細胞壁は分化・形態形成機構において主要な役割を担っており、植物の部位や生長の各過程でその性質を様々に変化させる。我々は細胞壁合成の機構解明を目的として、Nicotiana tabacumを植物材料とし、アクティベーションタギングベクター pPCVICEn4HPTを用いてリーフディスク法による形質転換を行い、細胞壁合成関連遺伝子の活性化により細胞接着に異常を生じた変異体の作出を試みた。その結果、葉や茎が透明化し、細胞接着が弱い変異体を7系統単離し、これらをshoolac (shoot with loosely attached cells) 変異体群と名付けた。shoolac1変異体において、細胞壁多糖構造に生じた変異を解析するため細胞壁の単離・分画を行い、各画分の構成糖分析を行った。その結果、ヘミセルロース画分において、変異体のアラビノース含有量が野生型に比べ増加していたことから、ヘミセルロース中のキシログルカン側鎖の構造に変異が存在する可能性に注目した。そこでxyloglucan-specific endoglucanase処理を行ったヘミセルロース画分をLC-MSおよび¹H-NMR解析したところ、shoolac1変異体ではキシログルカン側鎖のアラビノース含有量が野生型に比べ約2倍増加していた。以上の結果より、キシログルカン中のアラビノース量の増加と細胞接着との関係が示唆された。

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多細胞生物にとって細胞間接着は、形態形成の調節を行う上で非常に重要な要素の一つである。我々はこれまでに、タバコ半数体植物に対してT-DNA tagging法を行い、細胞間接着に変異が見られ、器官分化能力を失った細胞接着変異株nolac （non-organogenic callus with loosely attached cells）を複数作出し、原因遺伝子の特定や機能解析を行ってきた。nolac-K4 株より単離した原因遺伝子NpLRX1 は、LRR（Leucine-rich repeat）領域と、EXTENSIN領域を持つキメラタンパク質をコードしていた。この構造より、NpLRX1は細胞の形の制御に関わる細胞壁タンパク質の一つであり、LRR領域を介して何らかのシグナル伝達に関与していると推測された。NpLRX1 -RNAi形質転換不定芽では、細胞の形や大きさが異常になり、細胞間に大きな間隙が観察された。一方、タバコBY-2培養細胞にNpLRX1 -RNAiを導入した場合、細胞の一部の肥大・突出や、表層微小管の配向に異常が観察された。また、LRR領域のみを発現させた形質転換不定芽やBY-2培養細胞においても、同様の表現型が観察された。NpLRX1 全長やEXTENSIN 領域の発現では、特に顕著な表現型は認められなかった。これらの結果より、NpLRX1はLRR領域を介して、細胞骨格系の因子に影響を与え、細胞の形を制する事で細胞接着に関与していると考えられる。

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植物細胞の形態制御には細胞壁のセルロース微繊維の配向が重要であると考えられており、その配向の制御には表層微小管が関与していることが示唆されている。
アオミドロは円筒状の細胞が横一列に連なった糸状の藻体を形成している。いくつかの種類のアオミドロは、藻体の末端に仮根を形成し基質に付着する。仮根は藻体の末端に位置する細胞が分化し、伸長と分岐を繰り返すことで形成される。これまでの研究において、微小管重合阻害剤であるオリザリンで処理をすると仮根が膨れることを示し、微小管が仮根の形態形成に重要な役割を担っていることを明らかにした。
セルロース合成阻害剤であるDCBで処理したところ、仮根の先端が破裂した。仮根ではカロースが合成されていることが知られている。DCB存在下でもカロースの合成が行われていたことから、仮根先端部でのセルロース合成が仮根の伸長に必須であることが明らかとなった。そこでセルロース微繊維の解析を行った。
仮根の細胞壁内面において、束状の微繊維が観察された。その配向は微小管に非依存的であった。オリザリン処理によって膨れた仮根においても束状の微繊維が観察されたことから、微小管は束状の微繊維の形成や配向には関与しないと考えられた。一方、仮根の先端部においてのみ、微小管と微繊維の方向が一致していた。この先端部におけるセルロース微繊維の配向制御が仮根の形態形成に重要であると思われる。

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植物ペルオキシダーゼの多くは、リグニン構成単位の1つであるシナピルアルコールを効率よく酸化できない。その原因として活性ポケット入り口に存在するPro139がシナピルアルコール(SA)の進入を妨げていることが示されている。一方、我々が単離した細胞壁結合性ペルオキシダーゼアイソザイムCWPO-Cは、SAに対して高い酸化能を有し、高分子モデル基質であるシトクロムcを酸化できることを見出した。今回、ホモロジーモデリングにより構築したCWPO-Cの構造解析およびアミノ酸化学修飾法によりCWPO-Cの基質の酸化部位の推定を行った。
ホモロジーモデリングにより構築したCWPO-Cと他の植物ペルオキシダーゼの結晶構造を比較したところ、活性ポケットはほぼ同じ大きさであった。また、SA進入の妨げになるPro139を保有していることから、活性ポケットでSAの1電子酸化反応を触媒しているとは考えにくい。
一方、チロシン残基特異的化学修飾剤であるテトラニトロメタン(TNM)でCWPO-Cを処理したところ、顕著な酸化活性の減少が認められた。また、TNM処理したCWPO-Cは、シトクロムcを酸化できないことからタンパク表面上のTyr残基が基質の酸化部位と推定された。CWPO-Cは4つのTyr残基を保有しているが、ホモロジーモデルから、これらのうちTyr74とTyr177がタンパク表面上に露出していることが判明した。したがって、これらのTyr残基が基質の酸化部位であると考えられる。

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繊維細胞と管状要素（道管・仮道管）の二次細胞壁は陸上最大のバイオマスを占める。これまでに二次細胞壁成分の生合成に関わる数多くの遺伝子が同定されてきたが、これら遺伝子が協調して発現するための分子機構についてはほとんど分かっていない。私たちはこれまでに2種類の道管（原生木部道管・後生木部道管）の分化を制御するマスター転写制御因子としてNACドメインタンパク質であるVND6とVND7を同定したが、本研究で私たちはVND6・VND7と同じサブファミリーに属するNACドメインタンパク質SND1(for secondary wall–associated NAC domain protein)が繊維細胞の二次細胞壁形成の制御の鍵を握る重要な転写活性化因子であることを突き止めた。SND1はシロイヌナズナ花茎で維管束間繊維と木部繊維に特異的に発現し、ドミナントリプレッションによって繊維細胞の二次細胞壁形成が強く抑制された。また異所的な過剰発現によって二次細胞壁形成関連遺伝子と繊維細胞で強く発現することがすでに見出されているいくつかの転写制御因子遺伝子の発現が上昇し、それに伴って非繊維細胞に異所的な二次細胞壁の沈着が起こった。

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イネ変異体ふ系71号(d50)は、高温感受的に矮化して、節間柔細胞は細胞壁肥厚を起こすとともに不均一な形状となる。これまでの解析から、この肥厚した細胞壁には、多糖にエステル結合したケイヒ酸類(polysaccharides-linked hydroxycinnamoyl esters; PHEs)が過剰に蓄積していることがわかった。PHEsは植物体に剛性と柔軟性を与えるために非常に重要であり、通常は皮層繊維や維管束細胞の細胞壁に含まれるが、柔細胞にはほとんど蓄積しない。また、ふ系71号の原因遺伝子D50がinositol polyphosphate 5-phosphatase (IP5P)をコードすることを明らかにした。続いて、D50の詳細な発現解析を行った。RT-PCR解析の結果、D50が根・葉身・葉鞘・茎・花のいずれの器官でもほぼ同じレベルで発現することが分かった。一方、プロモーターGUS解析の結果からはD50遺伝子が節間分裂期には主に分裂組織に発現することが分かった。現在、CaMV35S::D50::YFPをパーティクルボンバードメント法によりイネに導入しD50タンパク質の細胞内局在を解析しており、この結果も含めて報告したい。

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一般的に栽培イネは短日植物に分類され、短日条件下で開花が誘導されることが知られている。これまでの分子遺伝学的解析から、イネにおける光周性開花経路にはOsGI、Hd1、Ehd1、Hd3a遺伝子を介して開花が誘導されることが明らかにされてきた。しかし、これらの機構は一部の代表的な品種のみで調べられた結果であり、世界各地に幅広く分布した約20万品種とも言われるそれぞれの栽培イネ品種に共通した機構であるかは定かではない。またそれぞれの栽培イネは品種間で多様な開花時期を示すが、その分子機構の知見はほとんど報告されていない。以上を踏まえ、本研究では開花関連遺伝子の多様性の解析を行い、栽培イネにおける開花時期の多様性をもたらす原因とその分子機構を明らかにすることを目的としている。
本研究では、栽培イネにおける光周性開花経路の多様性の解析を行う目的で、栽培イネ64品種から構成されるイネコアコレクションを用いて、短日条件下における開花関連遺伝子の発現量および開花時期を調べた。この結果、Hd3a遺伝子の発現量と開花時期の間に相関関係が見られた。さらに、日本晴、カサラス、台中65号の3つの品種を用いて同様の解析を試みたところ、栽培イネの開花時期の多様性をもたらす要因の一つがHd3aの上流遺伝子の機能性である事が示唆された。以上を踏まえ本発表では、コアコレクションにおける開花時期の多様性と開花関連遺伝子の機能性の関係を議論したい。

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短日植物であるイネにおいて光周性反応の分子機構を明らかにするために、イネFTホモログであるHd3a遺伝子の発現調節機構およびその機能の解析を行った。イネFT遺伝子ファミリーに属するHd3aは、短日条件下では発現が上昇し、長日条件下では発現が抑制される事が明らかとなっている。またこの遺伝子の過剰発現体は、早咲きとなることから花成誘導のスイッチ遺伝子であると考えられている。しかし、Hd3aはホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質と相同性を示すこと以外に特徴的なシグナル配列はなく生化学的な機能は不明のままである。これまでに我々はHd3aの発現調節機構の解析の結果からHd3aのプロモーター領域が葉の維管束で特異的に機能していることを明らかにしている。そこで、Hd3aを篩管特異的に発現するrolC、RPP16 プロモーターおよび葉特異的に発現するCabプロモーターの制御下でHd3aおよびGFP融合したHd3aを発現する形質転換体を作成したところ、得られた形質転換体は顕著な早咲き表現型を示した。このことから、Hd3aが篩管や葉で発現すると茎頂分裂組織の花芽分裂組織への相転換が促されることが示唆された。

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イネは、日の長さが短くなると開花が誘導される短日植物である。この光周性経路において、生殖成長期へ転換を促進する遺伝子が、Hd3aであるとされている。RFT1は、Hd3aともっとも相同性が高く、第6染色体上にHd3aと近接して座乗している。本研究では、RFT1の開花制御機構を明らかにするため、発育段階別発現解析、及びRNAiによる機能解析を行った。
RFT1の発現は低いながらも、Hd3a同様の発現パターンがみられたことから、短日条件下で、リダンダントに開花を制御している可能性が示唆された。
RFT1とHd3aの組み合わせによるRNAiを用いた機能解析(短日条件下)を行った結果、Double RFT1-Hd3a RNAi個体は300日経ても開花せず、栄養成長を続けた事からRFT1は新規の開花促進因子である可能性が示唆された。WTでは、通常RFT1の発現は低く、Hd3aが主な開花促進因子とされているが、Hd3a RNAi個体では、Hd3aの発現の抑制を補償するかのように、 RFT1の発現が著しく上昇し、開花が促進した。さらに、RFT1の発現上昇時には、RFT1の転写開始付近でH3K9のアセチル化が上昇し、クロマチン修飾が変化していた。短日条件下におけるイネの開花は、Hd3aとRFT1のクロマチン修飾を介した二遺伝子間のコミュニケーションにより制御されている可能性が示唆された。

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我々はイネの開花機構を明らかにするため、短日植物に見られる光中断による花成遅延現象を利用した研究を展開している。イネに対して暗期の中央で白色光による光中断を一回行なうと、開花のスイッチとされるHd3a遺伝子の急激な発現抑制が観察されるが、この反応にはフィトクロムBが関係していることを報告した(Ishikawa et al. 2005)。その後、光中断の光源に単色光を用いる実験を行った結果、光中断によるHd3aの発現低下と開花遅延は赤色光の光量依存的に制御され、また赤色光による光中断効果は遠赤色光よって打ち消される関係を確認した。
さらにイネの開花における概日時計と光の関係を明らかにするためにHd1過剰発現体を用いた解析を行った。野生型においてHd1を過剰発現させた場合、長日条件下では開花に影響はないが、短日条件下ではHd1の発現低下と顕著な開花遅延を起こすことが明らかになった。一方、phyB変異体においてHd1を過剰発現する形質転換イネを作出したところ、短日条件でのHd1の過剰発現による開花遅延は見られず、むしろ開花促進が見られた。また、この条件ではHd3a遺伝子の発現も誘導されていた。以上の結果から、イネの開花における概日リズムとフィトクロムBからのシグナルの相互作用について考察したい。

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シロイヌナズナにおいてphyBやcry2・phyAといった光受容体は花成を制御していることが知られている。これら光受容体はCOタンパク質の安定性を制御することで、その下流にあるFTの発現を制御している。しかし、光受容体からFT発現制御に至る過程はまだ多くの点で不明であり、ここに位置づけられる因子は少ない。
われわれは、SALKより取得したあるT-DNA挿入株が顕著な遅咲き表現型を示すことを見出し、これをtdu変異体と名づけ詳しい解析を行った。野生型と比較してtdu変異体では、CO発現は変化していないにも関わらず、FT発現が低下していたことから、原因遺伝子はCOタンパク質の安定性もしくはFT発現を直接制御する因子をコードする可能性が示唆された。複数アリルの解析、過剰発現およびサイレンシング系統の解析から、この変異の原因が確かに当該遺伝子へのT-DNAの挿入によることを確認した。TDU遺伝子は新規の核タンパク質をコードしており、転写促進因子の多くで見られるグルタミンリッチな領域を持っていた。また、イネやシロイヌナズナの近縁種でも相同遺伝子が見出された。さらに、phyB変異体との二重変異体、単色光下での花成時期および胚軸伸長制御などからTDUがcry2の直下で働いている可能性が示唆された。

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シロイヌナズナでは様々な花成制御情報が、FTを含む花成経路統合遺伝子の発現制御の形で統合される。FT蛋白質はPEBP/RKIPファミリーに属しており、多くの植物種で相同分子種とみられる遺伝子が同定されている。近年、我々は遺伝学的解析によりFTと相互依存的に機能する別の花成制御因子FDを同定した。FDは茎頂で発現し、bZIP型転写因子をコードしている。本来子葉および葉の維管束で発現するFTを茎頂で発現させることでFTの機能喪失変異を相補できることから、FTは子葉および葉の維管束で発現し、茎頂へ移行してFDと相互作用して花成を制御する可能性が示唆された。一方、植物の相同分子種を含めてFT蛋白質の生化学的な機能は未だ不明である。FT蛋白質の機能的なEGFPとの融合蛋白質は核と細胞質の両方に存在した。また、FDの機能的なEGFP融合蛋白質は核局在を示す。そこで、BiFC法を用いてFTとFDの蛋白質間相互作用をタバコ表皮およびシロイヌナズナ形質転換体で観察したところ、両者が共存する核で蛍光を検出した。また、35S::FT:GR形質転換体はGR融合蛋白質の核移行条件であるdexamethasone依存的に花成が促進される。これらの結果は、FTが茎頂細胞の核内でFDと相互作用し花成促進に機能している可能性を強く示唆する。現在microarray解析を行いFTにより発現制御されている遺伝子の探索を行っている。

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シロイヌナズナの優性花成遅延変異体fwaでは、プロモーター領域のDNAメチル化の低下により、GL2型ホメオボックス遺伝子FWAが異所発現している。fwa変異体における花成阻害機構を明らかにするため、我々はエピアレルのfwa変異体及びFWA過剰発現体を用いたマイクロアレイ解析をおこなった。その結果、異所的に発現したFWAが他の遺伝子の転写制御を介して花成を阻害する可能性は低いと考えられた。一方、我々は酵母細胞内及びin vitroにおいて、FWA蛋白質がFT蛋白質と相互作用すること、この相互作用によって花成が阻害されることを明らかにした。さらに、FWAはFTとアミノ酸レベルで82%の高い相同性をもつTSFやウンシュウミカンのFTホモログであるCiFT、イネのFTホモログであるHd3aの過剰発現体の早咲き表現型を抑圧しないことから、FWAによる花成阻害効果はFTに特異的なものであると考えられる。
これらを踏まえて、我々はFWA蛋白質をFT蛋白質特異的な阻害因子として利用し、FT 蛋白質の作用機構を知るためのツールとして用いることを考えている。

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近年、「長距離花成シグナル」の一つとして、長日植物シロイヌナズナのFTが着目されている。FTは、花成経路統合遺伝子の一つであり、主に光周期に依存した花成促進に寄与する。FTは子葉および本葉の篩部で発現し、FT蛋白質の作用部位は茎頂であることが示唆されている。さらに最近FT mRNAが葉から茎頂に長距離輸送される可能性が報告された。我々は、FTによる花成促進効果の接木伝達性を検証することがこの問題に対して有力な手がかりを与えると考えている。
そこでシロイヌナズナに接木手法を導入してこの課題を検証した。用いた胚軸接木法は、4日目の芽生えを使い、胚軸に一部切れ込みを入れた台木に、胚軸で切断した接穂を差し込むY字型の接木法である。これまでに抽台後の植物において接木の成立を確認しているが、さらに接木がいつ成立するかを検討するため、経日的に接木面の樹脂切片を作製し維管束の連続性を調べた。これまでにこの接木法を用いて、内生のFT遺伝子およびFTトランスジーン（過剰発現）による花成促進効果が接木伝達性であることを示唆する結果も得た。現在は、これまでに検討したFTトランスジーンが内生のFT遺伝子を介して接木伝達性を発揮している可能性を考え、これを検証している。

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短日植物アサガオ（品種ムラサキ）の光周性花成誘導暗期の後半に発現するPnC401遺伝子のシロイヌナズナにおけるホモログとして単離されたAtC401は、N末側半分にSNF1タイプのキナーゼドメイン、C末側半分にPnC401と高い相同性を示す35アミノ酸からなる12回の繰り返し配列であるPPR motif (pentatricopeptide repeat)を含んでいる。AtC401はYeast two-hybrid法によって、PPR motifを介して長日経路の花成促進因子であるCONSTANS(CO)と相互作用を示すことが明らかとなっている。本研究では、AtC401の機能解明のため、AtC401過剰発現体 (AtC401-OX)、及びAtC401突然変異体 (atc401)と、CO-OX及びco-1との二重変異体の花成時期調査を行った。AtC401-OXでは花成時期に大きな影響を与えないが、atC401 mutantは弱い花成遅延を示した。また、CO-OXでは早期花成を示すが、CO-OX/AtC401-OXでは野生型よりも花成遅延を示し、CO-OX/atc401でも花成遅延を示した。これらの結果より、AtC401がCOと相互作用することにより、花成誘導の調節因子として機能する可能性が示唆された。

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