高等植物イソアミラーゼ（ISA、ISA2、ISA3）はα-1,6グルコシド結合分解酵素であるが、アミロペクチンの構造を整形することでデンプン合成に必須である。そして、高等植物のISAの最大の特徴は、複合体を形成することである。近年の解析から、イネ胚乳ではISA1とISA1-ISA2の2種類の複合体が存在するが、ジャガイモ塊茎やアラビドプシス葉ではISA1-ISA2のみであることが明らかとなった。 イネの2種類のISA複合体の機能の理解はアミロペクチン生合成解明への重要なポイントである。
本研究ではイネを用いてISA2過剰発現系統、RNAiによるISA2抑制系統を作成した。ISA2過剰発現により、双子葉植物のように胚乳ISA複合体は全てISA1-ISA2型に変換したが、種子中のデンプン蓄積量は低下し、その性質も野生株と比較して劇的に変化した。また、可溶性のデキストリンの蓄積が認められた。 一方、ISA2抑制系統にはISA1ホモ複合体のみが存在するが、表現型は野生株と同等であった。 以上の結果は、正常なイネデンプン合成にはISA1が重要であり、ISA1-ISA2のみでは十分なトリミングができないことを示している。また、単子葉と双子葉植物間でISA複合体の構成と機能が異なることが示唆された。

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イネ登熟期のアミロペクチン生合成に関与する主要なスターチシンターゼ(SS)はI型(SSI)とIIIa型(SSIIIa)であり，各シングル変異体の分析からそれぞれのアイソザイムの機能が推定された (Fujita et al., (2006), Plant Physiol. 140: 1070-1084; Fujita et al., (2007), Plant Physiol. 144: 2009-2023)。本研究では，両変異体の交配後代から得られたイネ変異体の胚乳澱粉の性質および他の澱粉生合成関連酵素への影響を調べた。SSI変異体とSSIIIa変異体の交配後代のF₂種子から，両親には見られない白濁種子が得られ，これらの遺伝子型には、ss1ss1/SS3ass3aとSS1ss1/ss3ass3aの2タイプが存在した。また，登熟胚乳のSS活性は，いずれのタイプも顕著に低下していることが明らかになった。一方、SSIおよびSSIIIaの両方の活性が完全欠失した登熟種子は得られず，不稔になると考えられた。両タイプの白濁種子のアミロペクチンの鎖長分布は，野生型や両親変異体とも異なるユニークなパターンを示し，アミロース含量が高かった。また、アミロース合成に関与するGBSSIタンパク質量およびSSの基質を供給するAGPaseの活性も野生型や両親変異体よりも増加していた。

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イネスターチシンターゼ(SS)は10個のアイソザイムを持ち、変異体の解析からそのいくつかは機能が明らかになっている。SSIIIaは、アミロペクチンの長鎖伸長に関与する(Fujita et al., 2007)。一方SSIVbの単独変異体は、種子や澱粉粒の形態、アミロペクチンの鎖長構造等が野生型と非常に類似しているため、SSIVbの機能は不明であった。そこで、本報告ではイネSSIIIaとSSIVbの二重変異体を作出し、それらの特性を調べることでSSIVbの澱粉生合成における機能解明を試みた。
二重変異体の種子形態は両親とは異なる白濁種子だった。種子重量と澱粉含量はそれぞれ野生型の81%と、70%であった。澱粉粒の形状は野生型とは全く異なる完全球形だった。これは澱粉合成能の低下により、アミロプラスト内での充填がルーズになったためと推測される。アミロペクチン鎖長分布と、枝切り処理後の澱粉のゲルろ過解析から、二重変異体ではアミロペクチン長鎖の減少がSSIIIa欠損変異体よりも大きくなり、アミロース含量も増加していた。以上の結果よりSSIVbはSSIIIaと類似した機能を持ち、SSIVbが単独で欠損した場合にはその機能がSSIIIa等によって補われているため表現型に表れないと考えられた。

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近年、各国政府が二酸化炭素排出削減を打ち出すなど、炭素循環に高い注目が集まっている。これら要求に対しては、光合成生物の炭素代謝の理解と制御を目的とした基礎研究が必須である。これまでに我々は、単細胞性シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のRNAポリメラーゼシグマ因子SigEが、糖異化遺伝子の発現を正に制御することを明らかにしてきた。今回我々は、SigEの過剰発現株を構築し、SigE過剰発現による糖代謝の改変を試みた。トランスクリプトーム解析の結果、zwf, gndなど酸化的ペントースリン酸経路の酵素の遺伝子やglgX, glgPなどのグリコーゲン異化酵素の遺伝子が、SigE過剰発現により誘導されることが明らかになった。ペプチド抗体を作製し、ウエスタンブロット解析を行った結果、トランスクリプトーム解析の結果と一致して、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼや6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼなどのタンパク質量が増加していた。また、グリコーゲンの減少やTCA回路の代謝産物の変動など、代謝産物レベルでもSigE過剰発現による改変が見られた。これらの解析結果をふまえ、本発表では、シアノバクテリアの糖代謝制御機構の理解および光合成微生物を用いた代謝工学への展開について考察する。

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殆どのシアノバクテリアにおいて、貯蔵多糖グリコーゲンの合成を担う枝作り酵素（BE）は唯一存在する。Synechococcus elongatus PCC 7942 株における BE 遺伝子（Synpcc7942_1085）にスペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入し変異導入を試みたが、不完全であった。下流方向に強いプロモーター配列を含む抗生物質耐性遺伝子カセットを用いて形質転換を行った結果、完全な遺伝子欠損株を得ることが出来た。この変異株におけるグリコーゲン蓄積量は野生株の 55% に減少し、多糖分子内の鎖長分布のピークは重合度 8 から 4 へと変化した。しかし、ザイモグラムで検出される強い BE 活性を消失してもなお分枝鎖の形成が認められたことから、未知の BE アイソフォームが存在する可能性が強く示唆された。最近、Thermococcus kodakaraensis において GH57 ファミリー遺伝子産物が BE 活性を示すことが明らかにされた。そこで S. elongatus の GH57 相同遺伝子（Synpcc7942_1889）欠損株を作製した。欠損株においては野生株と比べ、グリコーゲン量が僅かに減少するのみであった。これに対し、BE と GH57 の二重欠損株ではグルカン蓄積量が著しく減少し、生育速度も顕著に低下した。両遺伝子産物の多糖代謝における役割について考察する。

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デンプン枝作り酵素（BE）はアミロペクチンの分岐結合を形成する酵素で、デンプン合成に重要な酵素の一種である。アミロペクチンの多様な分子構造に直接影響し、デンプンの物性にも関与する。これまでの変異体や組換え体を解析した研究から、イネ胚乳にはBEI, BEIIa, BEIIbの3種類のアイソザイムがデンプン合成に関与し、それぞれ異なる機能を果たしていると考えられるが、in vitro実験で証明する必要がある。本研究では、リコンビナント精製酵素を用いて、アミロペクチンやアミロースなどの基質を用いた反応を行い、次の結果を得た。○3者のkinetic parametersを初めて決定し、それぞれ独自の数値を持つことがわかった。○BEIのアミロースに対する最低鎖長はグルコース重合度（DP）60程度であるが、BEIIa, BEIIbはともにDP100以上である。一方、分岐グルカンの場合には、BEIIでは最低鎖長はDP12で、BEIよりも短鎖によく反応する。このように分岐グルカンと直鎖グルカンではBEの最低鎖長が大きく異なっていた。○BEIIbは事実上DP7と6のみの鎖を転移するが、BEIIaはDP6-13（DP6が最大）と比較的広い範囲の鎖を転移する。BEIはDP6-15（DP10-12が最大）の鎖を転移するとともに、内部鎖にも反応する。3者のアミロペクチン合成における役割についても議論する。

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トマトの水耕栽培で根だけを12℃に冷やすと果実の糖度が高まる。果実の肥大期には一時的にデンプンが蓄積し成熟期には消滅、それに伴いブドウ糖と果糖が増加するパターンは根域冷却の有無で変わらない。しかし根域冷却によりデンプンが著しく増加し、果実当たりのデンプン蓄積の増加は成熟後の果糖やブドウ糖の増加にほぼ匹敵する。デンプン量の変化と関連酵素の遺伝子発現パターンとよく似る。ところが糖度上昇に直接関与するとされるインベルターゼLIN5 (細胞壁) とTIV1 (液胞) の遺伝子発現は根域冷却でむしろ抑制される。本研究ではこの矛盾を解明するために関連酵素の活性を比較検討した。その結果、可溶性画分の酸性インベルターゼ活性はTIV1遺伝子発現とほぼ同じ挙動を示す一方で、不溶性画分の中性インベルターゼ活性はLIN5遺伝子とは異なり、根域冷却でむしろ促進された。しかしその大きさで糖度上昇を説明するには不十分と思われる。一方デンプン分解に関与すると推定されるショ糖リン酸合成酵素 (SPS) 活性は開花後40日の果実肥大期には 根域冷却で著しく高く、果実の成熟に伴い低下した。この挙動はデンプン量の変化とも一致している。ショ糖リン酸ホスファターゼ (SPP) 活性も同じ傾向を示し、糖度上昇への関与を示唆するものの、同様にデンプン分解に関与すると考えられるSuSyでは根域冷却による活性促進は認められなかった。

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Synechocystis sp. PCC6803の解糖系遺伝子 fructose-1.6-bisphosphate aldolase (fbaA) は、連続光照射条件下でもグルコース存在下の5分間光パルスの間欠光条件下でも転写が誘導される。しかし、 sll1330 欠損変異株では、連続光照射条件下ではfbaAは発現するが、5分間パルス条件下では発現しない。sll1330の遺伝子の発現量は、グルコースを含まない培地中では低下し、グルコース添加すると光の有無にかかわらず30分後には5倍以上に上昇した。sll1330の遺伝子のプロモーター部分を改変し、sll1330がグルコース非添加でも強く発現するように増強した遺伝子改変株を作製し、野生株と比較した。無機培地での独立栄養的な生育、完全暗所での従属栄養的な生育にも差が見られなかった。グルコースの非存在下での5分間パルス条件下でのfbaAの遺伝子発現は、野生株と比べて増加していた。このことから、sll1330が発現していれば光シグナルのみでfbaAが発現することが示唆された。ウエスタンブロッティングによるSll1330タンパク質の定量を試みた結果、細胞内での存在量は非常に微量であると示唆された。

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膜脂質の代謝の研究では，合成が主に研究されていて，分解の研究は比較的手薄である。Gclustを用いて比較ゲノム情報を整理してみると，植物の脂質の分解に関わる酵素の遺伝子は合成に関わる遺伝子と同じくらい多数あることがわかる。グリセロ脂質の代謝では，実際に完全に分解するほかに，脂肪酸の交換による作り替えがあるが，これは脂肪酸組成に変化がない限り明確にわからない。この問題を研究するには，放射能ラベルした脂肪酸の取込も有効であるが，既存の膜脂質プールがどのように代謝回転しているのかを調べるには，安定同位体標識が有効である。私は以前にC-13を用いてシアノバクテリアの細胞を標識し，同位体の分子内分布を調べることによってアシル基の不飽和化がグリセリン骨格に結合したままで起きることを証明した。同じ手法を用いて，アシル基の交換を調べることができる。本研究では，シアノバクテリアの細胞を光合成的にC-13でラベルして得られる糖脂質MGDGの質量分析データをもとに，C-13含量の詳細な解析を行う手法を開発し，これを用いて得られた結果の一部を紹介する。脂質のリサイクリングの意義として，膜内での脂質のダイナミックな流れを引き起こすことができることを指摘したい。現今の分子レベルの研究は生命体構成部品の記載に終始している感があるが，こうした「流れ」を実証できれば，生命の研究に新たな可能性が開ける。

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シアノバクテリアは光合成生物のモデルとして、光合成系を中心とした代謝の制御に関する研究に使用されている。独立栄養生物であるシアノバクテリアは、光や栄養などの外部環境の変化に対応して代謝状態を柔軟に調節していると考えられるが、栄養欠乏条件などに対する代謝物量やその変化を直接調べた例はほとんど報告されていない。本研究では栄養欠乏条件に対する代謝応答を解析する目的で、炭素・窒素・硫黄代謝の中枢を担っているアミノ酸類の細胞内プールの定量法を確立した。分析に用いるシアノバクテリアは、対数増殖期にある培養液を遠心またはろ過により集菌し、液体窒素中で凍結させた後、抽出する時まで-80℃で保存した。凍結した菌体からメタノールにより抽出を行った後、その残渣をメタノールと水の混合溶媒中でジルコンビーズを用いて破砕して上清を回収し、合わせて抽出液とした。抽出液は遠心エバポレーターを用いて乾燥させておき、分析時に水に溶かして使用した。水に溶かした抽出物は固相抽出の後に誘導体化し、ガスクロマトグラフィー質量分析計(GC-MS)に導入して分析・定量を行った。さらに、この系を用いて測定した窒素欠乏や硫黄欠乏、光条件変化に対する網羅的なアミノ酸プールの変化について報告する予定である。

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ATP合成酵素は、電子伝達系によってエネルギー産生膜内外に形成されるプロトンの電気化学的勾配を利用して、ATPを合成する。この酵素はプロトン勾配が不十分なときや、水溶性部分のF₁のみでは、ATP加水分解のみを触媒する。シアノバクテリアのF₁には、γサブユニットの中ほどに、大腸菌やミトコンドリアなど他のγサブユニットにはない約25アミノ酸挿入配列が存在する。我々は、挿入配列を欠損させたF₁と野生型を比較し、この挿入配列の機能を調べた。
挿入配列を欠損させたF₁は野生型と比べてATP加水分解活性が大幅に上昇した。さらに、1分子回転観察実験により、変異体の高い活性は、F₁に内在的に存在する阻害機構、ADP阻害に陥りにくいためであることがわかった。すなわち、挿入配列の生理的な役割は、ADP阻害に陥りやすくすることで夜間などプロトン勾配の形成が十分でないときに、無駄なATP加水分解を防ぐものと考えられる。この推論の当否を調べるため、挿入配列を欠損させたATP合成酵素をもつシアノバクテリア変異株を作製した。明暗条件で野生株と変異株の生育を比較しても差は見られなかったが、細胞内のATP量を定量すると、暗所において変異株で顕著な減少が見られた。以上の結果から、ADP阻害にかかりやすくしてATP加水分解反応を抑制することが、生体内のATP量の維持に重要であることがわかった。

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分子シャペロンDnaKはATPase活性を有し、DnaJ、GrpEと共に新生ポリペプチドのフォールディングを始めとする幅広い細胞機能に関与する。シアノバクテリア Synechococcus elongatus PCC 7942 には3つのdnaKホモログ(dnaK1, dnaK2, dnaK3)、及び4つのdnaJホモログ(dnaJ1, dnaJ2, dnaJ3, dnaJ4)が存在し、これらは必須性、ストレス応答、細胞内局在が異なることが明らかとなっている。各DnaK, DnaJは組み合わせを変えることで特異的な機能を分担することが考えられたため、これらのパートナーシップについて解析した。
S.7942株のDnaK、DnaJ、GrpEを精製し、マラカイトグリーン法を用いてATPase活性を比較した。3つのDnaKの中ではDnaK2が最も高いATPase 活性を示した。またDnaKのATPase活性はDnaJとGrpEの添加によって増加した。特にDnaK1、DnaK2に対してはDnaJ2が、DnaK3に対してはDnaJ3が最もATPase活性を促進した。
現在、変性させたルシフェラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを基質としたリフォールディング活性についても比較している。本発表ではそれらの結果についても報告する。

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酸素発生型光合成をおこなうシアノバクテリアでは活性酸素に対する防御が重要な環境応答の一つとなる。本研究室では酸化ストレス下におけるDNAマイクロアレイ解析をおこない、酸化ストレス応答性転写因子Slr1738や鉄硫黄クラスター生合成に関与する転写因子SufRについて報告している。これらの先行研究において、過酸化水素＋強光ストレスによりsll1158 - sll1161遺伝子群の発現が強く誘導されることがしめされている。Synechocystisのゲノム上ではsll1158 - sll1161遺伝子群上流にLysR型推定転写因子Slr1245が存在しており、これが遺伝子群の発現調節をしていると予測された。そこで、slr1245遺伝子破壊株を作製し、過酸化水素ストレス応答を調べたところ、sll1158 - sll1161遺伝子群の誘導がおこらなくなった。また、Slr1245タンパク質を大腸菌で発現・精製し、in vitroにおいてsll1158上流配列と結合することを確認した。以上の結果より、Slr1245は過酸化水素ストレス下でsll1158 - sll1161遺伝子群の発現調節に寄与していることを示した。今後はSlr1245による転写活性化メカニズムを明らかにし、また、sll1158 - sll1161遺伝子群の生理的な役割を探る予定である。

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好塩・好アルカリ性螺旋状シアノバクテリアArthrospira (Spirulina) は古くから食用として、現在も健康食品などとして産業的に価値の高いシアノバクテリアである。我々はArthrospira platensis NIES-39のほぼ完全なゲノム構造を決定した。18のコンティグの並びをオプティカルマッピングにより決定し、その結果、6.8 Mbpからなる一つの環状ゲノムを持つことが分かった。配列決定できた6.7 Mbpには6630個のタンパク質遺伝子と2セットのrRNA遺伝子、40個のtRNAが検出された。78%のタンパク質遺伝子が既知の配列と相同であった。計621 kbpのゲノム領域がグループIIイントロン、ファージ様配列、ISなどの転移因子とリピート配列に対応した。ファージ様配列を介したゲノム再編成も検出された。A. platensisは、非窒素固定糸状性シアノバクテリアとしては初めてのゲノム配列となる。そこで、これまでにゲノム解読が終了しているシアノバクテリアとの比較ゲノム解析により、糸状性特異的な遺伝子を見いだした。選別された多くの機能未知遺伝子の中に、糸状性に関わる新規遺伝子の存在が期待される。また、A. platensisゲノムのユニークな特徴として、グループIイントロン、制限修飾系、cAMP情報伝達系、走化性などに関わる遺伝子について報告する予定である。

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Synechococcus elongatus PCC7942（以下S. 7942）を始めとする淡水性シアノバクテリアは、一細胞辺り複数コピーのゲノムをもつことが知られている。しかしながら、シアノバクテリアのゲノム複製機構は不明な点が多く、複製開始点に関しても実験的な検証は行われていない。本研究では明暗によって細胞周期を厳密に同調でき、dnaN上流領域に複製開始点が予測されているS. 7942の複製開始点の同定を行った。
複製の研究にはチミジンアナログであるBrdUがよく用いられる。しかし、S. 7942にはBrdUのDNAへの取り込みに必要なチミジンキナーゼ (TK) 遺伝子が保存されておらず、野生株ではBrdUの取り込みが確認できなかった。そのため、ウィルス由来のTKをS. 7942ゲノム上に導入し、解析用の株 (TK株) を構築した。暗培養条件下で複製を完全に停止させたTK株に、BrdUを添加した後、光照射により複製を開始させて新規合成されたDNAをBrdUで標識した。BrdUで標識されたDNAを免疫沈降法によって単離した後、次世代シーケンサーを用いて複製開始領域を解析した。その結果、dnaN上流領域が複製開始領域であることが示唆された。

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ラン藻などのバクテリアのゲノムには自然突然変異がおきやすいことは経験的に広く知られている。実際、ゲノム解読に用いられた菌株と研究室レベルで保持されている菌株では、塩基配列に複数個所の違いがある例、またそれらが表現型にも影響を与えている例が報告されている。このような問題を完全に解決するには研究室で保有する菌株ゲノムの再解析が必要である。本研究においては次世代シーケンサーを用いてラン藻Synechococcus elongatus PCC 7942 株（東京農大保有株）のリシーケンスをおこない、2005年に報告されているPCC 7942ゲノムとの配列比較をおこなった。解読したリード配列をPCC 7942ゲノム配列上にマッピングし、ゲノムワイドな1塩基多型、欠失領域の検出を試みた。その結果、東京農大で保有する株においては7つの1塩基多型、及び連続した48.7 kbにおよぶ領域の欠失が起きていることが明らかになった。この結果から、バクテリアのポストゲノム解析をおこなう上でのリシーケンスの重要性が明らかになった。またde novo アセンブルによるゲノムの再構築についても考察する。
本研究は文部科学省「戦略的研究基盤形成支援事業」の一環として実施したものである。

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タバコのbZIP型転写活性化因子RSGはジベレリン(GA)の内生量調節に関与する。RSGの機能はGA内生量に応じた細胞内局在調節によって制御されており、その制御にはSer-114のリン酸化が重要である。NtCDPK1はRSGのSer-114をリン酸化する酵素として単離され、RNAiを用いたノックダウン解析からNtCDPK1はRSGを特異的にリン酸化することが示された。本研究では、NtCDPK1の基質認識機構の解明を目的とした。欠失変異およびアミノ酸置換変異タンパク質を用いたpull-down解析からNtCDPK1のN末端非保存領域がRSGとの結合に必要であること、またその結合にはN末端非保存領域のArg-10が特に重要であることが示された。Arg-10をアラニンに置換したNtCDPK1はRSGのリン酸化能を著しく減少させたが、リン酸化能自体は維持していた。また、シロイヌナズナのCDPKの一つ、AtCPK9の非保存領域をNtCDPK1のものと置換したキメラCDPKはRSGのリン酸化能を獲得した。キメラCDPKを過剰発現するタバコはNtCDPK1を過剰発現するタバコと同様に機能した。これらの結果から、非保存領域を改変することで、CDPKの基質特異性を操作し、細胞内のカルシウムのシグナル伝達経路を再構築することができる可能性が示唆された。

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植物は限定された生育環境において，糖（炭素源，C）と窒素（N）を効率よく利用するために，細胞内のC/Nを感知し適応する「C/N応答機構」を備えている．我々はこれまでに，シロイヌナズナを用いた遺伝学および生化学的解析から，新規ユビキチンリガーゼATL31がC/N応答制御機構の重要因子であることを明らかにした（Sato et al. Plant J, 60: 852, 2009）．本研究では，ATL31によるユビキチン化標的タンパク質について検討した．
ATL31にエピトープタグを付加し，免疫沈降およびMS解析を行った結果，ユビキチン化標的候補分子として14-3-3タンパク質群が同定された．14-3-3は多くのリン酸化タンパク質に結合し，その活性を制御する分子であり，CおよびN代謝に関わる酵素群の活性制御においても重要な役割を担う．その後の解析から，in vitroおよびin vivoにおいてATL31と14-3-3タンパク質が結合すること，またATL31はin vitroにおいて14-3-3タンパク質をユビキチン化することが確認された．さらに，野生型植物体内ではC/Nストレスにより特異的な14-3-3タンパク質が蓄積し，一方でATL31過剰発現体ではその蓄積が起こらないことが示された．現在ATL31によるin vivoでの14-3-3ユビキチン化の検出等の最終的な検証を行っている．

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植物には，積極的な活性酸素種(ROS)生成を担うNADPH oxidaseの酵素本体として、rboh (respiratory burst oxidase homolog)が存在し、シロイヌナズナには10種のアイソザイムAtrbohA-Jがある。私達はヒトHEK293T細胞異種発現系を構築し、AtrbohD, Cが、Ca²⁺結合と自身のリン酸化により相乗的に活性化することを明らかにした。一方、rbohには、低分子量Gタンパク質Rac/ROP等のタンパク質が結合し、活性制御に関与する可能性が示唆されている。そこで本研究では、AtrbohのROS生成活性制御におけるAtRac/ROP等の活性制御候補因子の機能や、Ca²⁺･リン酸化による制御との関係を明らかにすることを目的に、異種共発現系の構築を試みた。HEK293T細胞にAtrbohとconstitutively active型やdominant negative型AtRac/ROPを共発現させ、ROS生成活性を指標に種々のAtRac/ROPの機能を評価した結果について報告する。ROS生成制御機構の解明における異種共発現系の有効性についても議論する。

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植物は、生体防御応答、形態形成等の過程で積極的に活性酸素 (ROS) を生成する。ROS生成酵素NADPH oxidaseの酵素本体としてrespiratory oxidase homolog (rboh) が同定されており、その活性化は時空間的に厳密な制御を受けていると考えられる。シロイヌナズナに存在する10種のrbohのうち、AtrbohDは、ヒト培養細胞を用いた異種発現系解析から、N末端領域のEF-handモチーフへのCa²⁺の結合と、自身のリン酸化により、相乗的に活性化されることが明らかとなった (Ogasawara et al., JBC 2008)。
rbohの活性制御にはCa²⁺の結合とリン酸化以外にも、特にN末端細胞質領域において複数の制御因子との相互作用が関与する可能性がある。そこで、感染防御応答や気孔閉鎖等に関与するAtrbohD, AtrbohFのN末端領域と相互作用する因子を酵母two-hybrid法により単離を試みた．これまでに，相互作用候補因子としてプロテインキナーゼ，防御応答関連因子を含む19種を単離した。現在、異種共発現解析系(先崎ら本大会発表)を用いて、rbohのROS生成活性に対する候補因子の共発現の影響について検証している。相互作用因子を介したAtrbohD, AtrbohFの活性制御機構について議論する。

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根毛形成には細胞内極性の確立と維持が必須であり、その過程におけるフォスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PI(4,5)P₂)とその生成酵素であるフォスファチジルイノシトール-4-リン酸-5-キナーゼ(PIP5K)の重要性が示されている。一方、土壌中のリン酸欠乏時に根毛形成が促進されることが知られるが、その制御機構は明らかではない。本研究ではシロイヌナズナのPIPK2、3、4遺伝子に注目し、リン酸欠乏時の根毛伸長の制御機構における機能を解析した。pip5k3変異体では野生型に比べ、根毛発生・伸長が減少することが報告されていたが、pip5k2、4変異体においても同様の表現型を示すことがわかった。また、pip5k2・3二重変異体、pip5k3・4二重変異体では根毛伸長がより抑制されることから、これら遺伝子の機能の重複性が示唆された。リン酸欠乏時にpip5k2変異体では野生型と同様に根毛発生・伸長が促進されたのに対し、pip5k3、4変異体では促進の低下がみられた。PIP5K3、4遺伝子にはリン酸欠乏応答転写因子PHR1の認識配列があることからも、これら遺伝子がリン酸欠乏時の根毛伸長の制御に関わることを裏付けている。現在、PHR1認識配列を削った変異プロモーターをpip5k3、4変異体に導入した部分相補体を作製し、根毛伸長のリン酸欠乏応答における生物学的意義の解析を進めている。

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AtPCaP2 (Plasma membrane associated cation-binding protein-2)は当研究室で発見された新規カチオン結合蛋白質のホモログである。本研究ではPCaP2の生理機能の解明を目的に、発現様式と生化学的特性を検討した。GFPを用いた細胞内局在解析では、細胞膜にPCaP2-GFP蛍光が観察された。PCaP2のN端にはミリストイル化シグナル配列が存在し、この修飾に必須のGly-2を置換すると細胞質局在になったことから、PCaP2はN-ミリストイル化によって細胞膜にアンカーしていることが明らかとなった。続いてリコンビナントPCaP2を作製し生化学的特性について検討したところ、PCaP2はCa²⁺との結合能をもち、さらにPtdIns(3,5)P₂, PtdIns(4,5)P₂, PtdIns(3,4,5)P₃と相互作用した。またPCaP2はCa²⁺依存的にCaMと結合し、PtdInsPsとPCaP2の相互作用はCa²⁺/CaMによって弱められることも明らかとなった。promoter-GUS解析では、PCaP2は根毛と花粉に特異的優先的に発現すること、そして培地に高濃度のKClあるいはNaClが存在するとPCaP2は著しく誘導されることも明らかになった。PtdInsPsを介したPCaP2の情報伝達についても述べたい。

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ABA hypersensitive germination2-1 shows pleiotropic phenotypes including an ABA hypersensitivity, an SA hypersensitivity, and a dwarf phenotype. The ahg2-1 mutation seems to reduce the expression of the polyA specific ribonuclease. To address the molecular basis of the AHG2/PARN function and the effect of the ahg2-1 mutation, we conducted a genetic screen for suppressor mutants of ahg2-1 using root elongation as a physiological marker. We isolated a dozen of candidates with various suppressor strengths. Interestingly, most of the suppressor mutants suppressed all the ahg2-1 phenotypes; ABA and SA hypersensitivities, and dwarf phenotype, suggesting that the functions of these suppressors and AHG2/PARN are closely related. We identified the corresponding gene for a suppressor mutant. We will discuss the function of the suppressor and the mechanisms by which ahg2-1 causes such the diverse and complicated effects.
Nishimura et al., Plant J., 44, 972-, 2005.
Nishimura et at., Plant Cell Physiol., in press.

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ヒスチジンキナーゼ（HK）をシグナル受容体とする二成分制御系は植物に普遍的な情報伝達機構と考えられる。シロイヌナズナなどのモデル植物の研究からサイトカイニン応答などにおいてHKがホルモン受容体として中心的な役割を担っていることが明らかになっている。また、二成分制御系因子から派生したと思われる擬似レスポンスレギュレーター（PRR）は概日時計中心振動体因子であることも示されてきた。このように高等植物において重要な生理機能を担っている二成分制御系も進化的にはバクテリアの情報伝達系に由来していることは確かである。事実、シロイヌナズナHK（AHK2/3/4）が大腸菌細胞内でサイトカイニン受容体として機能することが示されている。したがって、二成分制御系に関してその生理機能の多様性を進化論的な視点を導入して解析することは興味深い。このような視点に立ち、今回は陸上植物の進化を考える上で重要な位置にあるヒメツリガネゴケに焦点をあて二成分制御系遺伝子群のゲノムワイド俯瞰（インフォーマティクス）を行った。高等植物に普遍的なHK遺伝子群のほぼ全てが既にコケに存在すること、加えて多数のコケ特有のHK遺伝子が存在すること,また時計関連PRR類似遺伝子も存在することなどの情報をまとめる。加えて、サイトカイニン受容体と相同なコケ遺伝子が実際にサイトカイニン受容体として機能することを明らかにした。

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ヒスチジンキナーゼ（HK）をシグナル受容体とする二成分制御系は植物に普遍的な情報伝達機構と考えられる。事実、シロイヌナズナなどの研究からサイトカイニン応答などにおいてHKがホルモン受容体として中心的な役割を担っていることが明らかになっている。また、二成分制御系因子から派生したと思われる擬似レスポンスレギュレーター（PRR1/3/5/7/9）は概日時計中心振動体因子であることも示されてきた。これら主にシロイヌナズナの研究から得られた知見を他の植物種に普遍化し、かつ二成分制御系の機能的多様性を理解することは、植物生理学の進展にとって必須のステップと考えられる。例えば、マメ科植物ではその特徴である根粒形成にサイトカイニン受容体HKが関与していることが示されている。
このような視点に立ち、今回は世界の穀類生産の1/3を占めるマメ科植物に焦点をあてた二成分制御系の解析を行った。具体的には、マメ科植物のモデルとしてゲノム情報の豊富なミヤコグサに関して二成分制御系遺伝子群と概日時計関連遺伝子群のゲノムワイド俯瞰（インフォーマティクス）を行ったのでその詳細な情報を提供する。また、幾つかの重要な点に関してはミヤコグサを用いた実験を行うことで情報を補強したので併せて報告する。

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植物の生育は乾燥、高塩、低温などの環境ストレスの影響を受ける。シロイヌナズナのDREB1/CBFはシスエレメントDRE/CRTに結合し、多くのストレス応答性遺伝子の発現を制御している転写因子である。我々はイネのDREB1ホモログ遺伝子としてOsDREB1を単離した。これまでに、OsDREB1A遺伝子は低温誘導性を示し、この遺伝子を過剰発現したイネではlip9などのストレス誘導性遺伝子の発現が上昇し、乾燥・高塩・低温ストレス耐性になることを報告した。さらにイネはOsDREB1遺伝子ファミリーとして10遺伝子を保持し、OsDREB1Gは非常に高い転写活性化能を持つことやOsDREB1Fはシロイヌナズナのrd29A由来のDREを活性化できるが、lip9遺伝子のプロモーターは活性化できないことを報告した。
今回、我々はDNA結合特性を調べるためにゲルシフト解析を行った。少なくとも9つのOsDREB1はシロイヌナズナのrd29A由来のDREに結合することを確認した。一方OsDREB1Fはlip9遺伝子のプロモーターの持つDREへの結合が非常に弱いことを確認した。またデキサメタゾン誘導性のプロモーターでOsDREB1Gの発現を制御したイネを用いて、OsDREB1Gに制御される遺伝子を調べたところ、OsDREB1Aとの共通性が確認されたが、OsDREB1G特異的な遺伝子も確認された。

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ポプラは春に開芽、展葉し秋に休眠、落葉する年周期性を示す。しかし、根の成長や機能の年周期性についてはあまり知られていない。そこで我々は、1年を通した根の機能の変動を明らかにするため、導管液を2年間に渡って採取し、根で吸収・生産された成分の変動と、根で発現する遺伝子の発現変動を調査した。導管液成分は多くのものが年周変動を示し、無機元素や植物ホルモン、アミノ酸は2月~3月の導管液中に豊富に存在していた。一方多種類のタンパク質はほかの成分に先がけて12月~3月の導管液に豊富に存在していた。このように導管液成分の存在ピークは成分により異なっていた。根における遺伝子発現は、細胞膜アクアポリン（PIP）が導管液量の増加する4月頃から、サイクリン（CYCB）は根の成長が活発になる6月頃から強く発現していた。さらに、導管液中に最も豊富に存在していた25 kDaのタンパク質 (XSP25)をMS解析によって同定し、その遺伝子発現と、ABA合成酵素（NCED） の発現パターンを調査した。その結果XSP25は冬期の根において合成され、ABA投与により発現が誘導されることが分かった。また低温処理により地上部のみでNCEDの発現が増加していた。このことから冬期の低温により地上部で合成されたABAが篩管を介して根へ移動し、XSP25の合成を促進している可能性が考えられた。

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三量体型G-タンパク質は、α、β、γサブユニットで構成され、植物においてはジベレリンやABAの信号伝達で機能することが知られる。シロイヌナズナのゲノムには、予想される三次構造が酵母や動物のサブユニットそれぞれと高い類似性を示す一分子のα、β、とニ分子のγサブユニットがコードされる。野生型とGα変異体の芽生えにおいて、シロイヌナズナのAffymetrixアレイを用いて遺伝子発現を解析したところ、ジャスモン酸信号伝達に関わる遺伝子群が野生型と異なる発現を示した。そこで、Gα変異体とOverexpressorを用いて、これらのジャスモン酸存在下での表現型と、合成および信号伝達に関る遺伝子発現を解析した。また、グローバルな遺伝子発現についても、野生型とGα変異体を用いて解析し、野生型においてジャスモン酸の制御を受ける遺伝子群のうち29％の発現が、変異体で統計的に有意に異なっていた。これらの結果から、三量体型Gαタンパク質がジャスモン酸信号伝達の少なくとも一部に関わることが示唆された。

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ヘテロ三量体Gタンパク質を介した細胞内シグナル伝達は真核生物に広く保存されており、植物においてはオーキシンやアブシジン酸、糖などへの応答においてヘテロ三量体Gタンパク質の重要性が示唆されている。共役する受容体にリガンドが結合するとヘテロ三量体Gタンパク質のサブユニットが乖離し、各サブユニットが二次メッセンジャーの産生に関わる酵素など他のタンパク質の活性を調節することで下流の経路へとシグナルが伝えられると考えられているが、このような調節を受けるタンパク質に関する知見は植物においては乏しかった。本研究では、酵母ツーハイブリッド法によりシロイヌナズナの三量体Gタンパク質βサブユニット(AGB1)の相互作用因子を探索し、bZIP型転写因子であるVIP1を新たな相互作用因子として同定した。植物体内におけるAGB1とVIP1との相互作用をBiFC法により調べたところ、核において蛍光の回復が見られたことから、これらは核において相互作用すると考えられた。植物体内におけるVIP1の機能について更に詳しく調べるためCaMV35Sプロモーターを用いてシロイヌナズナにVIP1を構成的に発現させたところ、塩、アブシジン酸、グルコースの存在下で種子の発芽が著しく阻害された。AGB1はアブシジン酸シグナリングを負に制御することが知られていたが、上の結果より、この経路にVIP1が介在する可能性が示唆された。

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通常の栽培イネは浅水で生育し深水状態では呼吸ができず溺死するのに対し、浮イネは水位の上昇に伴い節間伸長を行うことで呼吸を確保し深水状態でも生存できる。これまでに浮イネ性に関するQTL解析が行われた結果、第1、第3及び第12染色体に座乗する3つのQTLが検出され、このうち最も強い効果を示した第12染色体QTLの原因遺伝子がエチレンのシグナル伝達に関連する新規の転写因子Snorkel1及びSnorkel2であることを同定した。しかし、非浮イネ品種が急激な浮イネ性を獲得するためにはSnorkelの導入だけでは不十分であり、その他のQTLとの相互作用が不可欠である。本研究では浮イネにおける節間伸長メカニズムの全容解明を最終的な目的とし、Snorkel以外の浮イネ性制御遺伝子を単離するために、準同質遺伝子系統(NIL)及び複数のQTL領域を保持したピラミディング系統を用いて、それぞれのQTLが節間伸長に及ぼす効果を調べた。さらに、この結果をもとに第1、第3染色体QTLの原因遺伝子を同定するために高精度連鎖解析を行った。また、これまでに検出された3つのQTL以外の新規の因子を同定するために、浮イネ品種C9285と非浮イネ品種T65に3つのQTL領域を導入した系統NIL1-3-12との交雑F₂集団を用いてQTL解析を行った。以上のことから、浮イネにおける節間伸長メカニズムの全容解明を試みる。

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タイやカンボジア、バングラデシュなどの東南アジアや南アジアでは、毎年雨季になると大規模かつ長期間にわたる洪水が起こる。このような地域では、通常栽培されている作物は水没し溺死してしまう。一方、浮イネは水位の上昇にあわせて節間伸長をすることで草丈を急激に伸ばし草丈を常に水面上に出すことが可能となる。その結果、浮きイネは水面上に出た葉を利用して呼吸や光合成に必要なガス交換を行うことができるので、溺死することなく生存するという特殊な機構を持っている。この浮イネが示す洪水回避機構、すなわち節間伸長制御機構の解明は、深水条件下での節間伸長機構の解明だけでなく植物における不良環境への適応に対して新たな知見をもたらすと考えられる。本研究では、最近単離された浮イネ関連遺伝子、SNORKEL1（SK1）およびSNORKEL2（SK2）について機能解析を行った。
単離されたSK1, SK2は、AP2/ERF 転写因子群のうち、ERF sub-familyに分類される遺伝子群（ERFs）に含まれることが明らかとなった。ERFsはエチレンシグナル伝達経路上において、EIN3によって転写が誘導され、その後エチレン応答性遺伝子の発現を制御することが知られている。本発表では、SK遺伝子の下流因子について報告する。

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気孔は大気中のCO₂濃度を感知してその開度を調節し、高CO₂条件では閉じ、低CO₂条件では開く。従って気孔にはCO₂をシグナルとして感知し、細胞内にシグナルを伝達するメカニズムの存在が示唆されているが、その分子的実体の多くは不明である。そこで我々は、CO₂依存的な葉面温度変化を指標に、多数のCO₂非感受性シロイヌナズナ変異株を単離し解析を進めてきた。これまで単離された変異体は、CO₂濃度に関わらず常に気孔が開いたままの変異体、もしくは常に閉じたままの変異体に大別されていたが、cdi6 変異体はそのどちらにも属さず、低CO₂にも高CO₂にも応答しない、新しいタイプの変異体であることが分かった。その原因遺伝子は、植物独自の転写因子をコードしていた。また孔辺細胞の核で特異的に発現することが分かった。これらの結果より、CDI6はCO₂応答性に関わる新規の気孔特異的な転写因子であると考えられた。そこで、CDI6制御下にあるターゲット因子を明らかにするため、野生株とcdi6 変異体の孔辺細胞における遺伝子発現をマイクロアレイ解析により定量、比較を行った。その結果、気孔開閉調節因子や気孔形成因子を含む100近くの遺伝子の発現がcdi6 変異により大きく変化しており、また気孔で強く発現する複数の遺伝子が発現低下していた。CDI6は気孔での遺伝子発現制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。

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植物の表皮に存在する気孔は、青色光に応答して開口して植物と大気間のガス交換を促進し、乾燥ストレス下では植物ホルモン・アブシジン酸（ABA）に応答して閉鎖し、植物体からの水分損失を防いでいる。本研究では、気孔開閉のシグナル伝達の分子機構を明らかにすることを目的として、EMS処理したシロイヌナズナを用い、気孔開度に依存した葉の重量変動を指標にした気孔開度変異体のスクリーニングを行った。単離した変異体の一つftd2（fast transpiration in detached leaves 2）は、矮性でペールグリーンの表現型を示し、気孔開度は明暗両条件下で顕著に開口していた。そこで、マッピングおよびシークエンスによる原因遺伝子の同定を進めたところ、第5染色体の上腕に存在するTSB1 (TRYPTOPHANE SYNTHASE BETA SUBUNIT 1)にミスセンス変異（G162E）を見いだした。TSB1はトリプトファン合成の最終段階に関わる酵素であり、既知のtsb1変異体では、トリプトファン前駆体が蓄積することによりトリプトファン非依存性のオーキシン合成が促進され、内生オーキシン量が増加していることが報告されている。現在、TSB1の活性測定、野生型TSB1を用いた相補実験を進めており、これらの結果についても報告する予定である。

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塩ストレスは作物の成長・収量を減少させる代表的な非生物的ストレスの一種である。塩ストレスにさらされたオオムギの根の水輸送特性及び制御機構を解明するため、我々はプレッシャーチャンバー法を用いた研究を進めており、これまでに塩ストレスによって引き起こされる水輸送活性の変化は浸透圧刺激を受容することによるものであることを明らかにした。また、耐塩性品種ではストレス開始後1時間で水輸送活性は急速に低下し、4時間で一過的な回復が起こるが、脱リン酸化阻害剤であるokadaic acid (OA) 処理によってストレス開始後1時間で起こる水輸送活性の急激な低下は抑制されたものの、未処理と比較した場合にその抑制程度は不十分なものであった。一方、エンドサイトーシス阻害剤のwartmannin（WM）処理では十分に抑制された。さらに、エキソサイトーシス阻害剤のbrefeldin A (BFA) 処理によってストレス開始4時間で起こる水輸送活性の一過的回復が抑制された。これらのことは、膜タンパク質のリン酸化、およびエンドサイトーシスを伴ったリサイクリングが関与している可能性を示唆するものである。現在免疫学的手法による解析も進めており、これらについても報告する。
この研究は生研センター基礎研究推進事業の支援を受けて行った。

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アクアポリンは、水チャネルを構成して生体膜を介した水の移動を促進する。一般に、アクアポリンの水透過活性の解析には、アフリカツメガエル卵母細胞が用いられる。我々は、花粉プロトプラストを利用して、植物アクアポリンの水透過活性の解析を試みた。テッポウユリ（Lilium longiflorum）花粉からは、直径が約95 μmで均一性の高いプロトプラストが単離された。花粉で高い活性を示すZm13プロモーターのもとで、原形質膜アクアポリン（PIP）をコードするシロイヌナズナAtPIP1;1、AtPIP2;1、ニンジンDcPIP1;1、DcPIP2;1が発現するようにプラスミドを構築した。これらのプラスミドのPCR増幅断片を、エレクトロポレーション法で花粉プロトプラストに導入し、低張液（350 mMマニトール）中での体積の増加を観察した。AtPIP2;1あるいはDcPIP2;1を導入した場合は、ベクターコントロールに比べて高い体積増加が見られた。一方、AtPIP1;1あるいはDcPIP1;1を導入した場合は、ベクターコントロールと同程度の体積増加が見られた。これらの結果から、植物細胞においてもPIP2は単独で高い水透過活性を示すが、PIP1は単独では水透過活性を示さないことが明らかになった。このように、テッポウユリ花粉プロトプラストは、簡易なアクアポリン活性測定システムとして利用できる。

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シロイヌナズナのゲノムには疎水性ドメインを6個以上持ち膜輸送体をコードすると予想される遺伝子が約1,400存在するが、それらの多くは機能不明である。我々は新たな膜輸送体を発見する手段として、これら遺伝子の総当たり発現解析が有効と考え、膜輸送体限定遺伝子ライブラリAmethyst (Arabidopsis membrane transporter and hydrophobic protein cDNA clones stack)を作製している。
本研究では、遺伝子導入が容易で、様々な既存アッセイ法が活用可能な動物細胞での発現系を構築した。具体的には、個別管理しているAmethyst遺伝子961種類を、CMVプロモータを持つ動物細胞発現ベクターに移植し、動物細胞発現用ライブラリpCMV-Amethystを作製した。次に、総当たり発現スクリーニングの一例として、微量元素の一種であるモリブデンの細胞内濃度に影響する膜輸送体遺伝子を探索した。HEK293T培養細胞を宿主として、Amethyst膜輸送体とモリブデン酸可視化バイオプローブ（MolyProbe）を共発現させ、MolyProbeのFRET蛍光の経時変化を比較分類した。

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気孔は青色光に応答して開口するが、この時、青色光は孔辺細胞の青色光受容体フォトトロピンに受容され、細胞膜プロトンポンプを活性化し気孔開口の駆動力を形成する。これまでの研究により、孔辺細胞のプロトンポンプは、C末端スレオニン残基のリン酸化とリン酸化部位への14-3-3蛋白質の結合により活性化されることが明らかとなっているが、この反応を触媒するプロテイン・キナーゼやホスファターゼは不明である。本研究では、細胞膜プロトンポンプのリン酸化反応について解析を行った。
ソラマメ孔辺細胞より単離したミクロゾーム画分を用いてin vitroでのプロトンポンプのリン酸化反応を調べた結果、ATPに依存してC末端スレオニン残基のリン酸化されることが明らかとなった。また、同様なリン酸化反応は、シロイヌナズナ黄化芽生えより単離した細胞膜画分においても検出された。さらに、このリン酸化反応は、臨界ミセル濃度を超える非イオン性界面活性剤TritonX-100が存在すると顕著に阻害されることを見出した。これらの結果から、プロトンポンプのリン酸化に関わるプロテイン・キナーゼは細胞膜に存在しており、その活性には細胞膜構造が必要であることが示唆された。今後は、人工膜小胞へ再構成したプロトンポンプのリン酸化反応について解析を進める予定であり、この結果についても報告したい。

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細胞膜プロトンポンプは、ATP加水分解のエネルギーを利用して水素イオンの能動輸送を行い、細胞膜を介した水素イオンの電気化学的勾配を形成する一次輸送体である。これまでの研究により、プロトンポンプはC末端スレオニン残基のリン酸化とリン酸化部位への14-3-3蛋白質の結合により活性化されることが明らかとなっているが、プロトンポンプのリン酸化・脱リン酸化反応を触媒するプロテイン・キナーゼやホスファターゼは不明である。本研究では、プロトンポンプの脱リン酸化反応について生化学的解析を行った。
シロイヌナズナ黄化芽生えより単離した細胞膜を用いてin vitro脱リン酸化反応を調べた結果、細胞膜中にプロトンポンプを脱リン酸化するホスファターゼが存在することがわかった。次に、各種ホスファターゼ阻害剤の影響を調べた結果、脱リン酸化はEDTAにより阻害された。そこで、脱リン酸化に対する2価カチオン要求性を調べたところ、Mg²⁺またはMn²⁺を必要とすることが明らかとなり、タイプ2Cホスファターゼの関与が示唆された。さらに、プロトンポンプの免疫沈降物においてもプロトンポンプの脱リン酸化が引き起こされることから、プロトンポンプとホスファターゼは複合体を形成している可能性が考えられた。現在、複合体に含まれる蛋白質について解析を進めており、それらの結果についても報告する予定である。

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様々な生物種のK⁺チャネルの輸送活性調節はリン酸化等の細胞質側のC末端領域の修飾やサイクリックヌクレオチドなど分子の結合によって行われていることが知られている。シロイヌナズナの孔辺細胞に局在する内向き整流性Shaker型K⁺チャネルKAT1は6回膜貫通タンパク質であり、細胞質側にサイクリックヌクレオチドが結合することが予測されるCyclic nucleotide binding domain (CNBD)配列を含むC末端領域を持つ。我々は、KAT1のリン酸化部位を野生型KAT1のC末端領域のペプチドを用いたIn vitroとIn gel kinase assay及び質量分析により同定した。さらに、アフリカツメガエル卵母細胞及び酵母発現系を用いたK⁺輸送活性測定の結果から、同定されたリン酸化部位が、K⁺輸送活性調節に重要な影響を及ぼすアミノ酸であることを見いだしている(Sato et. al. Biochem. J. 2009)。シロイヌナズナでは9種類のShaker型K⁺チャネルが同定されているが、このアミノ酸は全てのK⁺チャネルにおいて保存されていた。そこで、これらのK⁺チャネルについて保存されたアミノ酸のリン酸化とK⁺輸送活性調節に対する影響、さらには複数のシグナリング経路を介してKAT1のC末端領域がK⁺輸送活性を調節する可能性について考察する。

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我々は、シロイヌナズナのCa²⁺透過性機械受容チャネル候補の遺伝子MCA1とMCA2を特定し、植物体および出芽酵母発現系を用いてその解析を行ってきた。両タンパク質は互いに高い相同性をもち、植物体および出芽酵母においてCa²⁺取込みに関与することが示されている。しかし、両タンパク質はイネ、タバコをはじめとした様々な植物にホモログがあるが、いずれも機能未知で、既知のイオンチャネルとの間にアミノ酸配列上の相同性がなく、両タンパク質の構造とCa²⁺取込みメカニズムの関連は明らかではない。これまでに、我々はMCA1の細胞膜に局在することを明らかにしており、昨年、MCA2も出芽酵母発現系において細胞膜に局在することを報告した。今回、MCA1およびMCA2の構造と機能、および局在について新たな知見を得たので報告する。タンパク質の持つモチーフと機能の関連を調べるため、出芽酵母発現系にMCA1およびMCA2の部分切断ポリペプチド、およびEF hand-like motifに変異を入れたポリペプチドを発現させ、Ca²⁺取込みの解析を行った。その結果、両タンパク質の間で変異によるCa²⁺取込み活性への影響に違いがみられた。そして、シロイヌナズナにおいて、MCA1-GFPと同様にMCA2-GFPも細胞膜に局在すること、および出芽酵母発現系においてMCA2が膜貫通タンパク質であることを明らかにした。

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液胞は巨大なオルガネラであり、不要タンパク質の分解、色素やタンパク質の蓄積や細胞の形態形成、恒常性維持など多様な機能をもつ。植物においてショ糖は主要な輸送物質であり、液胞内には高濃度のショ糖が蓄積されている。ショ糖は浸透圧調節や代謝に重要であるが、その輸送を担うトランスポーターの機能については不明な点が多い。
本研究ではまずタバコの液胞膜型ショ糖トランスポーター(NtSUT4)を同定し、NtSUT4-GFPを恒常発現するタバコ培養細胞(BY-SUTG)を作出した。次に細胞生長に関するNtSUT4の機能を解析するため、液胞を除去したミニプロトプラストの培養系を用いて細胞形態の変化について評価を行った。その結果、培養2日目の細胞断面積についてはコントロールとBY-SUTGの両者の間に差異がみられなかった。一方、BY-SUTGの細胞伸長率(細胞長軸/細胞短軸)はコントロールと比較して減少していたことから、BY-SUTGでは細胞の長軸方向への伸長が抑制されることが示唆された。そこで同様にミニプロトプラストにおいてカルコフローによりセルロースを染色し、その蛍光輝度を定量的に測定した。その結果、BY-SUTGの方が蛍光輝度が高く、セルロースの蓄積量が増加していることがわかった。以上の結果からNtSUT4がショ糖の輸送を介して細胞壁の形成に影響を与え、細胞形態に関与する可能性について議論する。

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イネ科植物はキレート化合物であるムギネ酸類を分泌し、その鉄錯体をトランスポーターにより取りこむ機構を有している。今回、我々はペチュニアにオオムギのムギネ酸類3価鉄錯体トランスポーター遺伝子HvYS1を導入し、培地にムギネ酸類鉄錯体を添加することによりペチュニアが鉄を獲得し、アルカリ耐性植物になるかを検証した。HvYS1遺伝子をアグロバクテリウム法によりペチュニアに導入し、RT-PCRによりHvYS1の発現を確認した系統を用いて、デオキシムギネ酸鉄錯体（DMA-Fe(III))含有のpH 5.8またはpH 8.0の水耕培地においてアッセイを行った。栽培2週間後の根の抽出物から、負イオンESI-FTICRMS (ElectroSpray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry)法で検出を行った。HvYS1を発現させたペチュニアの根においてのみ、DMA-Fe(III)の分子イオンピークが得られた。またアルカリ培地で水耕栽培を行い、遺伝子組換え体がコントロールに比べて全重量が2倍に、根の鉄濃度も1.5倍に上昇した。この結果により、イネ科固有の鉄獲得機構を利用して、イネ科以外の植物に対してアルカリ耐性を付与できることが示された。

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多くの高等植物は高塩環境におかれると生育阻害をうける。生育阻害は細胞質におけるNa+濃度増加の結果おこる、浸透圧上昇による吸水阻害、K+/Na+比の減少あるいは活性酸素の増大により引き起こされると考えられている。細胞質でのNa+濃度の上昇を防ぐ機構の一つとして植物細胞では液胞でのNa+の隔離が良く知られている。これまで我々はオオムギやマングローブ培養細胞、シロイヌナズナの根において高塩環境下で、細胞成長を伴わずに液胞体積が増大していく現象が観察している。
本研究では高塩環境下におけるイオン隔離と液胞動態の関係を明らかにするため、分子レベルでの解析が容易であるシロイヌナズナ植物個体とシロイヌナズナ培養細胞Deep株を用いて細胞内でのNa+の分布と液胞、小胞の動態について解析を行った。高塩処理をすることにより植物体の根端細胞、培養細胞において液胞体積の増大が観察された。このとき液胞膜の挙動をGFP蛍光を用いて観察したところ小胞様構造が激しく運動する様子が観察された。Na+/H+対向輸送体（NHX1）抗体を用いて免疫染色を行ったところ細胞質に小胞様構造が観察された。またNa+と結合すると蛍光をだす Sodium Greenを用い、細胞内のNa+分布を観察したところ、植物体、培養細胞ともに体積が増大した液胞内と周囲の小胞様構造にNa+が蓄積している様子が観察された。

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酸性土壌に於ける化学ストレス物質であるアルミニウムイオン(Al³⁺)に対する耐性機構の一つとして根端からの有機酸放出が知られる。これまでに我々はコムギからAl³⁺によって活性化されるリンゴ酸輸送体、ALMT1(Al-activated Malate Transporter 1)を単離同定すると共に、C末端に存在する親水性領域（CTドメイン）が細胞外に局在することを明らかにしている。本研究に於いて我々は、CTドメインに存在する酸性アミノ酸に変異導入したALMT1蛋白質をアフリカツメガエル卵毋細胞に発現させ、二電極膜電位固定法を用いた電気生理学的機能解析を行った。その結果、3箇所の酸性アミノ酸変異がそれぞれ、Alで活性化されるリンゴ酸放出を完全に抑制したことから、この領域に対するAl³⁺結合がALMT1の活性を制御する可能性を見出した。また、CTドメイン欠損蛋白質、さらにコムギALMT1のN末膜貫通ドメインとアラビドプシスAtALMT1のCTドメインとのキメラ蛋白質を発現する卵母細胞を用い、CTドメインが果たす役割の重要性及び共通性についても検証した。それにより、CTドメインが輸送機能に重要であること、アラビドプシスのCTドメインとのAl活性化領域に相違があることが示唆された。

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ヒ素汚染はバングラデシュや西ベンガル地域を中心とする南アジア等で深刻な問題を引き起こしている。土壌中のヒ素は作物により吸収され、健康被害を引き起こす。広範囲にわたるヒ素汚染土壌の浄化は困難であることから、汚染土壌化でもヒ素を吸収しにくい作物の作出が求められている。すなわち、植物のヒ素輸送機構を解明する必要がある。最近、亜ヒ酸の輸送体がイネやシロイヌナズナで同定された。また、シロイヌナズナではヒ酸の吸収にリン酸トランスポーターが関与していることが報告されている。我々の研究においても、イネにヒ酸を与える際に、リン酸を欠乏させると、ヒ酸の毒性効果が高まることを見いだし、イネにおいてもリン酸トランスポーターがヒ酸輸送に関与している可能性が示唆された。そこで、本研究ではイネのリン酸トランスポーターのヒ酸吸収への関与を検討した。イネにリン酸トランスポーターは13種類あり、これらの発現の組織特異性やリン酸欠乏に対する応答は異なっていた。比較的発現の高いリン酸トランスポーター遺伝子にT-DNA挿入を持つ変異株では、ヒ酸の取込みが低下していることを見いだした。このことはイネにおいてもリン酸トランスポーターがヒ酸輸送に関与していることを示唆している。現在、当該遺伝子についてのRNAi系統を作出しそのヒ酸吸収について検討を進めている。

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アルミニウムイオン（Al）はすべての生物にとって毒性を示すが、どのようにして細胞の中に進入するのかは、まだ明らかにされていない。本研究では、イネからアルミニウムトランスポーター(Nrat1)を単離し、機能解析を行った。Nrat1(Nramp Aluminum Transporter 1)はNrampファミリーに属し、根で発現していた。またその発現はAlによって増大した。Nrat1の局在性を抗体染色で調べた結果、根の先端ではすべての細胞、基部では表皮以外のすべての細胞の細胞膜に局在していた。OsNrat1を酵母に発現すると、Al感受性が高くなった。また酵母へのAlの取り込み量もNrat1の発現によって増加した。しかし、他の2価金属（マンガン、鉄、カドミウム）に対しては輸送活性を示さなかった。さらにAl-クエン酸やAl-シュウ酸複合体に対する輸送活性も示さなかった。Nrat1が破壊されたイネでは、Al耐性が野生型に比べ弱くなった。しかし、他の金属（CdとLa）に対する耐性は変わらなかった。また細胞内のAl濃度を比較すると、Nrat1破壊株では、野生型に比べ低くなっていた。一方でNrat1をイネに過剰発現した結果、アルミニウム耐性が弱くなり、根のアルミニウム濃度も高くなっていた。これらの結果はNrat1がアルミニウムイオンを特異的に輸送するトランスポーターであることを示している。

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コメへのCdの蓄積を抑制するためには、それに関与する分子機構を明らかにする必要がある。本研究で我々は、イネのCd集積に関与するQTL遺伝子を単離し、その機能解析を行った。
これまでにCd高集積系統（Anjana Dhan）と低集積系統（日本晴）を交配して得たF₂集団を用いて地上部のCd集積に関与するQTL解析を行ったところ、第7染色体に効果の大きい新規QTLが検出された。1774個体のF₂を用いて、ファインマッピングを行った結果、候補遺伝子としてP-type ATPaseをコードする遺伝子CASTLE1の単離に成功した。この遺伝子は両系統ともに主に根で同程度に発現していた。日本晴においてRNAiにより遺伝子発現を抑制した場合には地上部のCd濃度が増加し、過剰発現させた場合は逆に濃度が減少した。興味深いことに、いずれの場合も他の重金属の濃度の変化が見られなかった。抗体染色によりタンパクの局在を調べたところ、根の全ての細胞でシグナルが検出され、液胞膜への局在が認められた。酵母を用いたアッセイの結果、日本晴型CASTLE1はCdの輸送活性を示したのに対し、Anjana Dhan型は活性を示さなかった。これらの結果は、この輸送体は根で液胞内へ特異的にCdを隔離することによって、地上部へのCdの輸送を制限しており、その機能の欠損がAnjana DhanのCd高集積に寄与すると考えられる

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カドミウム（Cd）は有害重金属であり，環境汚染や作物汚染が問題になっている。我々は，低Cd蓄積性のナス科植物であるトルバム（Solanum torvum）から，シロイヌナズナNRAMP1と高い相同性を示す遺伝子StNRAMP1を単離した。StNRAMP1遺伝子の発現は鉄欠乏で強く誘導され，Cd添加で抑制された。StNRAMP1を導入した酵母はCdに対する感受性が増大した。また，GFP融合タンパク質をタマネギ表皮細胞で発現させると，緑色蛍光は主に細胞膜に観察された。これらの結果から，StNRAMP1は細胞膜に存在しCdを輸送し得るinflux型の鉄トランスポーターであると推察された。さらに，35Sプロモーター制御下でStNRAMP1遺伝子を発現する形質転換タバコを作製した。形質転換体は通常の栽培条件下で顕著な葉脈間クロロシスを呈し，症状は下位葉でより激しく表れた。また，Cdを含む寒天培地では生育が強く抑制された。水耕栽培による5日間のCd処理（0.1 μM）の結果，形質転換体の最新葉に含まれるCdは非形質転換体の約1/5であった。葉脈間クロロシスを呈した第二新葉でも同様にCd蓄積量が減少していたが，鉄含量が約2倍に増加していた。これらの結果から，StNRAMP1の過剰発現はタバコ体内の鉄の分配を変化させ，その結果，Cdの地上部への移行あるいは蓄積が抑制されたと考えられた。

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植物は鉄欠乏に応答して鉄の吸収・利用に関与する遺伝子群の発現を誘導する。これまでに我々は、鉄欠乏応答性シスエレメントIDE1（Iron Deficiency-responsive Element 1）に特異的に結合するイネの新規ABI3/VP1型転写因子IDEF1（IDE-binding Factor 1）を同定した。本発表では、IDEF1の発現を誘導または抑制した形質転換イネを用いて、鉄欠乏条件下でのIDEF1標的遺伝子を詳細に探索した。鉄欠乏1日目の根においては、鉄の吸収・利用に関与する鉄欠乏誘導性遺伝子の大多数がIDEF1により正の制御を受けていた。これに対して鉄欠乏2日目以降には、これらの遺伝子の制御は緩やかで限定的なものへと変化した。IDEF1標的遺伝子のプロモーター領域には、IDEF1結合コア配列 (CATGC) および、種子成熟過程における発現を制御する RY element (CATGCA) が高い比率で存在した。そこで種子成熟過程で発現する late embryogenesis abundant (LEA) 遺伝子の発現を調べたところ、多くが鉄欠乏により葉と根で誘導され、鉄欠乏初期よりもその後の応答において特に顕著にIDEF1に制御されることが明らかになった。以上の結果から、IDEF1は鉄欠乏の初期応答とその後の応答とで異なる制御を使い分けていると考えられる。

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植物の転写因子DREB1/CBFは、DRE/CRT/LTREと呼ばれるシス配列に特異的に結合し、環境ストレスに対する耐性獲得に関わる多くのストレス誘導性遺伝子の発現を制御する。3つのDREB1遺伝子群の発現は、低温条件下で一過的に強く誘導され、その一方でストレスのない条件下では低く抑えられおり概日リズムによって制御されている。これら3つの遺伝子のプロモーター領域の配列は相同性が高く、共通の転写制御機構を持っていると考えられた。そこで本研究では、DREB1遺伝子群の転写制御について解析を行なった。
DREB1Cのプロモーター配列をつないだGUSレポーター遺伝子を導入した形質転換植物の解析により、発現制御に関わる65bpの領域を同定した。この領域内には、低温応答において転写を正に制御する配列と概日リズムにおいて負に制御する配列の両方が含まれていた。また、酵母のワンハイブリッド法により、この65bpの配列に結合するタンパク質をコードするPIF7cDNAを単離した。プロトプラストを用いたトランジェント発現系による解析から、PIF7はDREB1Cプロモーターに結合し、転写を抑制した。また、PIF7遺伝子のT-DNA挿入変異植物体では、概日条件下でのDREB1の発現が野生型よりも増加していた。以上の結果より、PIF7は概日条件下でのDREB1の発現を抑制する転写因子であることが示唆された。

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