パーム油を産生する油糧作物アブラヤシ（Elaeis guineensis）では、組織培養から再生させた植物体でmantledと呼ばれる形態異常が高頻度（5～10%）で発生することが知られている。その際、雄蕊から雌蕊への変化が起きていることから、雄蕊決定に関与するクラスB遺伝子にエピジェネティックな変化が起きている可能性が示唆されている。今回我々は、花で強く発現しているアブラヤシのDEFICIENS相同遺伝子EgDEF1、GLOBOSA相同遺伝子EgGLO1およびEgGLO2のゲノム配列を決定し、それらの野生型植物体でのシトシンメチル化の状態をbisulfite sequencing法で調べた。その結果、いずれの遺伝子もプロモーターや5’ UTRではメチル化されていなかったが、EgGLO1の少なくともexon 4からintron 6までの1 kb以上の領域で、CG、非CGのいずれの配列も高度にメチル化されていることがわかった。一方、EgGLO2の対応する領域ではCG配列のみがメチル化されていた。EgGLO1とEgGLO2は配列の相同性が高いが、EgGLO1のみintron 6にマイクロサテライト様配列を持つ。これらの結果は、このマイクロサテライト様配列がEgGLO1の非CG配列の高メチル化に関与していることを示唆する。本研究は平成15年度産業技術研究助成事業「アブラヤシ（Elaeis guineensis）の生産性向上の基礎となる分子遺伝学的研究」により実施された。

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ピリジンヌクレオチドであるNAD(P)は単に酸化・還元反応のみならず、転写やシグナル伝達に関与することが明らかになってきた。ピリジンヌクレオチドのターンオーバー（分解と再合成）は、ピリジンヌクレオチドサイクル(PDC)によりなされるが、生物種によりサイクルの構成酵素は異なる。植物では、PDCは、動物よりも多くの構成酵素からなり、さらにサイクルから派生してトリゴネリンやニコチン酸グルコシドが生産されるなど特有な代謝経路があることが推定されるが、その詳細は明らかにされていない。本研究では、植物におけるPDCの特徴を、ジャガイモ、ミヤコグサ、モヤシマメなどの植物を用い、標識化合物の代謝と関連酵素活性についての実験データと、遺伝子データベースから調べ、動物のPNCと比較した。各植物で、NAD→ニコチンアミドモノヌクレオチド→ニコチンアミドリボシド→ニコチンアミド→ニコチン酸→ニコチン酸モノヌクレオチド→ニコチン酸アデニンジヌクレオチド→NADの7酵素が関与するPNCVIIが機能しうることが示された。これ以外にも、ニコチン酸リボシドを経由するサイクルの存在も示唆された。このサイクルの中間産物であるニコチン酸の一部は、トリゴネリンやニコチン酸グルコシドに変換されるが、どちらに変換されるかは、植物種や器官により異なった。植物におけるこれらのニコチン酸抱合体の役割について考察する。

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咲き分けや絞り模様を生じるアサガオ(Ipomoea nil)の易変性変異体の多くはEn/Spm類縁トランスポゾン、Tpn1(Transposable element of Pharbitis nil one)ファミリーの転移によって生じていることがわかっている。これまで同定されたTpnはいずれも非自律性因子であり、自律性因子がコードする転移酵素（トランスポゼース）遺伝子を利用し転移している。これまでの研究において、既に同定されているEn/Spmスーパーファミリーの転移酵素遺伝子をもとに自律性由来と考えられるTpnの複数の転写産物を単離し、それらから推定される転移酵素TNPδとTNPαを決定した。このTNPδのアミノ酸配列は他の植物で同定されているEn/Spm類縁因子の転移酵素であるTNPD（またはTNP2）と比較すると、それらと共通するトランスポゼースドメインを保存していた。一方、TNPαは既知の自律性因子由来のTNPA（またはTNP1）との相同性を示さないかわりに、C末側にシステインプロテアーゼ様の活性ドメインをもつことが示唆された。このドメインはイネのRim2/HIPA因子やMedicagoに存在するEn/Spm類縁因子にも存在することから、Tpn1ファミリーを含むこれらのトランスポゾンがトウモロコシのEn/Spmとは異なるサブグループに属することを示唆する。

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イネ科植物は根圏から鉄を獲得するために、三価鉄キレーターであるムギネ酸類を根で合成・分泌して根圏の不溶態鉄を可溶化して三価鉄-ムギネ酸類錯体の形で吸収する。最近、ムギネ酸類の前駆体であるニコチアナミンが血圧降下作用を持つことが報告された。ダイズ種子にはニコチアナミンが豊富に含まれており、イネに比べると30倍も含まれている。ダイズ種子中のニコチアナミン含有量をさらに高めることができれば機能性食品として非常に有効であると考えられる。ダイズはタンパク質、脂質源として重要な作物であるが、イネやタバコなどに比べてアグロバクテリウム法による形質転換効率が非常に低く、遺伝子組換え体の作出はあまり普及していない。アグロバクテリウム法による形質転換法は低コピーで遺伝子を植物体に安定的に導入できるため、これを確立できれば非常に有用であると考えられる。本研究では、ニコチアナミン含有量の高いダイズの創製を最終目的として、ダイズ子葉を用いたアグロバクテリウム法によるダイズの形質転換技術の確立を目指した。ニコチアナミンは高血圧抑制効果を持つため、機能性作物としての応用が期待される。試行錯誤の結果、安定して再生体を得られる条件を確立した。今後は、ダイズ種子の発芽状態、ハイグロマイシン濃度や光・温度・湿度条件をさらに検討し、形質転換効率の改善を行っている。

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相同組換えを利用して、ゲノム上の任意の部位を予めデザインした配列に再現的に改変できる遺伝子ターゲティングは、機能ゲノム学的解析の有力な手法のであるが、高等植物では、マウスES細胞に比べてターゲティングの頻度が低く困難と考えられてきた。我々は、強力なポジティブ・ネガティブ選抜とPCRスクリーニングを組合せて、主要穀物中でゲノム情報が整備された野生型イネのWaxy遺伝子のターゲティングに成功した。我々の手法は、原理的にどの遺伝子にも適応可能で、組換・修復系遺伝子を操作しないため、改変標的遺伝子の機能解析も適している。事実、我々は重複遺伝子としてイネの第11染色体に座乗している Adh1と Adh2の個別改変や、 Adh1変異体の隣接する Adh2を改変した2重変異体の再現的作出に成功した。さらにDNAのメチル化に関与する2つのクロマチンリモデリング遺伝子 OsDDM1aと OsDDM1b、3つのDNAメチル化遺伝子 OsMET1a、 OsMET1b 、 OsDRM1aの個別改変にも成功した。これらの内で、 OsMET1a、 OsMET1b、 OsDRM1aの各プロモーターに GUS遺伝子をつなげたノックイン改変体では、組織特異的 GUS発現も検出できた。 Adh1以外の7遺伝子のターゲティングの頻度は得られた形質転換カルスの1-5%程度なので、マウスES細胞と同頻度のイネの普遍的遺伝子ターゲティング系を確立できた。

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我々は、アグロバクテリアによる大規模形質転換と強力なポジティブ・ネガティブ選抜及びPCRスクリーニングを組合せ、イネの8遺伝子を遺伝子ターゲティングにより個別改変し、同一な変異を持つ複数の改変植物を再現的に作出して、相同組換えを介した普遍的遺伝子ターゲティング法を確立した。そこで、イネ11番染色体上に3つの遺伝子が同方向に並んで座乗しているAdh遺伝子(Adh1、Adh2)を用いて、ターゲティングに係る組換え過程の解析を行った。先ず強力なポジティブ・ネガティブ選抜の生残りカルス中の導入遺伝子を解析したころ、T-DNAは断片化され、全てポジティブマーカーを有し、機能しうるネガティブマーカーは有していなかった。即ち、ポジティブ・ネガティブ選抜のエスケーピーは全くなく、T-DNAボーダー配列を介した高頻度のランダムな挿入を効果的に排除できたため、多くの場合、得られた形質転換カルスのターゲティングの頻度はマウスのES細胞と同程度となることが判明した。また、目的通りの相同組換え(true gene targeting：TGT)以外に、2回の組換えの内一方は相同組換えで他方は非相同組換えにより生じるOSI (one-sided invasion)も稀に観察された。さらに、相同領域に複数の塩基置換を導入したベクターを用いて、相同組換えのcrossover pointsも検討した。得られた結果を基に、ターゲティングに係る組換えの分子機構を多面的に考察する。

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理研PSC植物ゲノムグループではこれまでシロイヌナズナの機能獲得型変異系統を利用し、植物遺伝子の総合的な機能解析を目指してきた。これら変異系統では35Sプロモーターの恒常的発現制御により、系統を作成する段階で導入した遺伝子を過剰発現させている。したがって過剰発現させる事により植物の成育や形態に大きな影響を及ぼす重要な遺伝子は、胚性致死を引き起こすなど、系統を作成する段階で解析対象から除かれる。植物では転写因子による機能調節が特に重要な役割を果たしている事が解ってきており、前述の様に系統を作成する段階で除かれる遺伝子群には多くの転写因子が含まれていると考えられる。そこで我々はグルココルチコイド受容体を利用した機能誘導系を用いて、総合的な転写因子過剰発現系統の作出を試みている。本変異系統は各転写因子を一種類ずつ過剰発現させたものであり、DEX処理により導入された転写因子の機能が誘導される仕掛けになっている。そのため全ての転写因子について機能の重要性に関わらず変異系統を得る事が出来る。また転写活性化因子を転写抑制化因子に機能変換し導入したCRES-T変異系統とは、機能付加に対する機能欠損と反対の関係になり、これら変異系統同士の比較により重要な機能情報が得られると考えられる。
これらをふまえ本発表では作出中の変異系統についての現状と、機能解析の例を示し、本変異系統の有用性を議論する。

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我々はシロイヌナズナの核コード葉緑体タンパク質の機能解析を目的に、葉緑体タンパク質のタグラインの大規模収集を行った。我々は、予想プログラムから葉緑体に移行すると予想された2,090個の葉緑体タンパク質の内、遺伝子の内部にトランスポゾンまたはT-DNAが挿入した1,374個、3,416ラインのタグラインを収集し、ホモラインプールの作製を行った。この過程で、albinoまたはpale-green変異体(apg変異体)や形態が異常な変異体などの多数の表現型異常変異体が得られた。702ラインの理研のDsタグラインから、578ラインのホモライン(404遺伝子)、59ラインの表現型異常変異体(43遺伝子)、62ラインのホモラインが得られない変異体(51遺伝子)が得られた。表現型異常を引き起こす43個のDs挿入遺伝子の内、20遺伝子は同じ表現型を示す複数のアレルが存在することから、これらは葉緑体形成に重要な遺伝子であると考えられた。ホモラインが得られない51個のDs挿入遺伝子は、葉緑体形成必須遺伝子であると考えられ、葉緑体が胚発生に深く関与することが示唆された。さらに、環境ストレスに関与する葉緑体タンパク質の機能を明らかにするために、578ラインのホモラインを用いたストレス耐性スクリーニングを行った。現在いくつかの薬剤や光・温度などの環境変化に対する感受性の異なる変異体の候補が得られており、その解析結果について報告したい。

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蛍光寿命とは、蛍光物質が励起されてから基底状態に戻るまでの時間の長さのことを言う。Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)は、組織内・細胞内の蛍光寿命を測定し、これを可視化して示す手法であり、現在非常に注目されている。蛍光色素を利用した細胞内のpH測定やイオン濃度測定、レシオイメージングやアクセプターブリーチングなどの方法によるFRET効率の測定では、従来蛍光の強度に依存した観察・測定が行われている。しかし、蛍光強度は、蛍光色素の細胞内への取り込み効率や蛍光褪色、及び蛍光タンパク質の発現量などの様々な要素に依存する為、正確な定量が困難である。一方蛍光寿命は、蛍光の強度に依存しない蛍光物質特有の値である為、蛍光強度を用いた測定に伴う様々なアーティファクトを除いた正確な定量を行うことが出来る。また、蛍光寿命はpHなどの細胞内環境の違いによって変化することが知られている。これを用いることにより、オルガネラや細胞内マイクロドメインの環境変化を追うことが可能である。
筆者は、この蛍光寿命測定法を用い、蛍光タンパク質の細胞内局在の違いによる蛍光寿命の変化、またpHによる蛍光寿命の変化などを調べたのでそれを報告する。これらのデータは、病原体応答を始めとした様々な環境の変化に伴う細胞内変化の定量的観察の基盤となることが期待される。

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group IIイントロンは、オルガネラや細菌、ウィルスのゲノムから見出されている。group IIイントロン内には、スプライシングされたイントロンRNAをDNAの特定配列部に挿入させた後に、これを逆転写してDNAに変換するのに必要は酵素がコードされている。オルガネラの遺伝子内に侵入したイントロンDNAは、メカニズムは不明だが、進化的に長い時間のうちに消えてしまう。フランスで採集された褐藻P.littoralisのミトコンドリア LSU rRNA遺伝子には4つのgroup IIBイントロンが、cox1遺伝子には、3つのgroup IIAイントロンの存在が報告されている。6カ国で採集されたP.littoralisについて、イントロンの有無をPCR法を用いて調べた。その結果、サンプル毎に、上記2種類の遺伝子内に挿入されているイントロンの数は様々であること、また同一サイトに挿入さているイントロンであっても、その内部配列に大きな違いが見られることが解った。これらのデーターを系統解析することにより、日本で採取したサンプルで見出された、LSU rRNA遺伝子内の第4イントロンとフランスのサンプルが持つ遺伝子内の第1イントロは、ごく最近侵入してきたイントロンである事が明らかになった。

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昨春、新学習指導要領（いわゆるゆとり教育）による高校教育を受けた学生が大学に入学した。東京大学では、これに関連して以前から大学1，2年次における教育のあり方を検討するとともに、論理（モデルを立てる）と実証（実験によって確かめる）のサイクルを伴う自然科学導入プログラムの開発に取組んできた。
東京大学教養学部生物部会においては、従来の生命科学系（東京大学では理科2類、3類）学生対象の実習「基礎実験（生物）」の内容を吟味し、新たに「基礎生命科学実験」として新規3種目の開発を含む全11種目の全面的改訂を行った。また、今春から生命科学系の学生に加えて文系と理工系（理科1類）の学生にも実習選択の門戸が開かれるのにともない、教育背景が多様な学生にも効果的に実習内容を伝えられる教科書副教材（DVD教材）を作製した。
本大会では、「基礎生命科学実験」の植物関連種目である、(1)電気泳動による光合成関連タンパク質の分離、(2)植物の多様性と生殖（クラミドモナスの接合、シダ植物の世代交代、テッポウユリの花粉管伸長）、(3)被子植物の維管束構造の紹介も含めて、我々の取組みを発表する。

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熱帯雨林の林床草本には特殊な葉を持つ物が多い。Schismatoglottis calyptrataというサトイモ科の植物の葉には、クロロフィルが欠損しているわけでもないのに、部分的に斑が入っている。葉の横断切片を作って調べてみると、斑の原因は表皮細胞と柵状細胞の接着が弱いために、空隙ができ光が乱反射するためだと分かる。このような構造斑入り葉は、日本産草本にもユキノシタなど、いくつかの植物で同様の事例が知られている。このSchismatoglottis calyptrataとユキノシタを材料とし、未だに理解の浅い構造斑入り葉の生態的な意義と発生過程を探ることとした。
構造斑入り葉の斑の部分で、表皮細胞と柵状細胞間の空隙で光が乱反射することから、斑の部分では斑の無い部分に比べ光合成に使える光が少なくなり、炭素固定能が劣ることが推定される。事実、斑入りの葉は斑の入らない葉に比べて光合成速度が劣っていた。
だが、斑が入るものと全く入らないものが、全く同じ生育環境下でかなりの確率で共存していることを考えると、斑入りの葉が一方的に不利ということは考えづらい。何がこうした構造斑入りの形質を進化させたのだろうか。現在、斑の部分と斑の無い部分の間で、クロロフィルの質や量の違い等について解析しており、その結果について、斑構造が発生過程のどのステージでどういった理由で現われるのか、といった点と合わせ報告する。

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Photosynthesis is affected by the conductance of CO₂ from the atmosphere to the site of carboxylation. The location of chloroplasts in the mesophyll cells may affect the length of the diffusion pathway for CO₂. Using different light treatments to induce chloroplast movements we studied the effect of chloroplast location on a number of photosynthetic parameters in Arabidopsis thaliana. In addition, we examined these parameters in mutants which do not show a chloroplast avoidance response under high light conditions. Furthermore, we investigated the internal conductance after externally applying an inhibitor of chloroplast movement. Following gas-exchange measurements we sampled the leaves for anatomical measurements to quantify the length of the diffusion pathways. Our results indicate that chloroplast movement affects internal conductance for CO₂, and this in turn exerts a small effect on the photosynthetic capacity in A. thaliana.

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我々は、イネ完全長cDNAをシロイヌナズナにおいて過剰発現させたイネFOX（full-length cDNA overexpressor）ラインを用いて、光合成に関与する遺伝子を同定することを目指している。スクリーニングには、クロロフィル蛍光を二次元画像として経時的に測定できるシステムを用いた。これまでに約6,000ラインの測定が終了しており、野生型と異なるクロロフィル蛍光パラメーターを示す23ラインを単離した。これらの変異体は蛍光パラメーターの違いにより数パターンに分類された。単離したラインには、葉緑体移行シグナルを持つタンパク質をコードする遺伝子、転写関連遺伝子、機能未知遺伝子などが導入されていた。また強光ストレスに関わる遺伝子を同定するため、強光処理（1,000 μE, 1 h）後の光化学系II最大量子収率（Fv/Fm）を指標としたスクリーニングもあわせて行っている。これまでに約2,500ラインのスクリーニングが終了しており、強光ストレス後のFv/Fmが野生型より高い2ラインを単離した。このうち1ラインにおいては、機能未知遺伝子が導入されていた。現在、単離したcDNAのシロイヌナズナへの再導入、表現型の観察を随時行っている。本研究は、平成18年度科学振興調整費「イネ完全長cDNAによる有用形質高速探索」によって行なわれている研究である

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C₄光合成ではCO₂は葉肉細胞でPEPカルボキシラーゼによって固定され、C₄ジカルボン酸の形で維管束鞘細胞に運ばれたのち脱炭酸され、RubisCOによってに再固定される。このCO₂濃縮機構によりRubisCOのオキシゲナーゼ反応が抑えられるため、C₄光合成は乾燥条件や高温条件下などで有利に働く。しかしその代謝反応にはC₃光合成よりもより多くのATPが必要となる。C₄植物では光化学系I循環的電子伝達活性が高いことが報告されており、この電子伝達がATP合成を駆動するためにΔpH形成に関与することが示唆される。これまでにシロイヌナズナではPGR5に依存する経路とNDHに依存する経路の二つの循環的電子伝達が働くことが示されている。C₄光合成における2つの経路の役割を解明するため、C₃型およびC₄型（NADPリンゴ酸酵素型）のそれぞれの種が存在するフラベリアを用いてPGR5およびNDHの発現量と組織局在を調べた。NDHの発現量はこれまでの報告と同様にC₄種の維管束鞘細胞で非常に高くなっていた。PGR5はC₃種よりもC₄種において発現量が高く、葉肉細胞よりも維管束鞘細胞において発現量が高かった。これらの結果からフラベリアではPGR5依存とNDH依存の2つの光化学系I循環的電子伝達はどちらもC₄型光合成の駆動に貢献していることが示唆された。

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これまでに、NPQ誘導に、CEF-PSIが寄与していることを明らかにしている。CEF-PSIの光学系Iからプラストキノン(PQ)への電子のバックフローの経路として、NADPH dehydrogenase依存経路とFerredoxin:quinone oxidoreductase (FQR) 依存経路の存在が知られているが、両経路の制御機構に関してはほとんど解明されていない。今回、in vivoにおいて、CEF-PSI活性はフェレドキシン(Fd)により律速されており、その律速過程の解除がNPQを増大させるという仮説の証明を試みた。
葉緑体形質転換技術により、シロイヌナズナ由来のFdを葉緑体で過剰発現する形質転換タバコを作出した。形質転換株は野生株よりも高いFoを示したが、far-red光照射により形質転換株のFoは、野生株のFoレベルまで低下し、形質転換株においてFQRによるストロマからPQへの電子の流れが増強されていることが示された。また光合成linear electron flowが低下する状況下において、野生株に比べて、形質転換株のCEF-PSI活性はより高い値を示し、同様にNPQも増大していた。一方で、キサントフィルサイクル色素のプールサイズとPsbSタンパク質量は、両植物間で差は見られなかった。以上の結果は、私たちの仮説を強く支持するものであった。

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一般的に、C3光合成タイプの陸生高等植物では、葉緑体内のCO₂濃度(Cc)は、外気CO₂濃度の半分程度である。このようなCc低下の原因の一つは、気孔腔から葉緑体までに葉内CO₂拡散コンダクタンス（gm） が存在するためである。近年、形質転換植物を用いた研究により、葉の細胞膜型アクアポリン量とgmとの間に正の相関がある事が示された。以前の報告から、乾燥ストレスはgmを低下させることがわかっている。しかしながら、このようなgmの低下がアクアポリン量の変化で説明できるのかどうか、明確ではない。そこで、タバコ（Nicotiana tabacum）を材料に、常に潅水し、成育させた個体（コントロール処理）と、間欠的に潅水した個体（乾燥処理）を用意し、gmとアクアポリン量の変化を調べた。gmはクロロフィル蛍光とガス交換速度の同時測定により推定し、その後、葉面積あたりの窒素を定量した。PIP1型とPIP2型アクアポリン抗体を用いて、ウェスタンブロット法により、葉のアクアポリンを検出し、定量した。その結果、乾燥処理個体のgmはコントロールに比べ約3分の1に減少し、両処理個体ともgmは窒素量と正の相関を示した。PIP1型アクアポリンは検出されなかったが、PIP2型アクアポリン量は処理個体で若干、増加した。以上の結果は、乾燥ストレスに伴うgmの低下は、葉のアクアポリン量の減少を伴わない事を示唆した。

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シアノバクテリアは、光環境の変化に応答して、光化学系量比調節、アンテナサイズの調節などを行っている。シアノバクテリアの強光応答においてはsll1961が光化学系量比調節に関わっている。しかしながら、Sll1961の機能と環境応答メカニズムの間の関係については明らかとなっていない。Sll1961は転写調節因子に相同性をもっており、その標的遺伝子を明らかにする目的で、sll1961変異株を用いたトランスクリプトーム解析が行われた。その結果から、Sll1961転写調節因子の標的候補がいくつか得られている。そこで本研究では、Sll1961標的候補遺伝子の転写制御と光化学系量比調節の関係について調べた。標的候補のうちslr0364, slr0366, slr2057の転写産物量は、sll1961破壊株において著しく減少していた。この減少は、弱光で培養された細胞でも強光で培養された細胞でも同様に見られた。それらの遺伝子破壊株の光化学系量比を解析した結果、sll1961破壊株と同様の表現型を示す株は存在しなかった。ただし、野生型とは若干異なる光化学系量比を示すものがあることから、Sll1961がこれらの標的遺伝子の転写制御を通じて光化学系量比調節に関わる可能性が考えられる。

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葉の老化過程やストレス条件下において蓄積する活性酸素は、タンパク質分解の引き金として機能している可能性が提案されている。先に私たちは、低温弱光下のキュウリ葉において、Rubiscoの大サブユニット（LSU）が活性酸素によって直接的に分解される事を報告した。本研究では、低温弱光下のLSU分解についての植物間比較を行い、その結果をもとにLSU分解をもたらす要因について解析した。低温感受性のキュウリ、インゲン、トマト、ダイズ、イネ、低温耐性のコムギ、ホウレンソウ、シロイヌナズナの葉切片に低温弱光処理を行ったところ、キュウリ、インゲンにおいてのみ、LSU分解が観察された。また、キュウリやインゲンではLSU分解に先立って、光化学系I反応中心サブユニットPsaBの分解が生じていた。さらにキュウリやインゲンでは、熱放散の劇的な増加、抗酸化酵素活性の低下、CO₂やMg²⁺が結合していないフリーの不活性型Rubisco（E-form）の割合の増加が見られたのに対して、LSU分解が起こらないコムギやシロイヌナズナでは、熱放散の増加、抗酸化酵素活性の維持、E-formの割合の低下が見られた。以上の結果から、低温ストレス下の葉において活性酸素によるRubisco分解には、抗酸化酵素活性の低下、PsaBの分解、及びRubiscoがE-formで存在すること、の三つの要因が複合的に関係している可能性が示唆された。

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Chlamydomonas raudensis(UWO241)は，Lake Bonney(南極)より採取された単細胞緑藻である．南極ドライバレーに位置するLake Bonnyは塩湖であるため，UWO241株は耐低温性とともに耐塩性を有している．また，この株は，緑藻や高等植物が持つ光環境適応機構の一つ，ステート遷移の自然欠損株と報告されている．この株を低温蛍光スペクトルにて解析したところ、生育環境に近い高塩濃度条件下では励起エネルギー再分配が誘導されず，ステート遷移が欠損しているという従来の報告と一致した。一方、低塩条件下ではステート遷移と同様の励起エネルギー再分配が誘導された．しかし，ショ糖密度勾配超遠心法により光化学系タンパク質複合体を精製したところ，ステート遷移に見られる集光性アンテナタンパク質の移動が見られず，また，アンテナタンパク質のリン酸化も起きていなかった．低塩条件下で見られるこの励起エネルギー再分配は，ステート遷移を代替する光環境適応機構として機能している可能性がある．電子顕微鏡観察により，NaCl濃度の低下がチラコイド膜グラナ構造のスタッキング状態に影響を与えることが明らかとなったが，それに起因する光化学系複合体の局在変化が，スピルオーバーによる励起エネルギー再分配を誘導するものと結論した．

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常温で育てたイネ（あきたこまち）の幼苗全体を10°C前後の低温に曝しても、根の吸水抑制で葉が巻くものの、白化や枯死といった可視的な障害を起こすことはない。ところがこの時に根の温度を高く保つと、枯死に至るような顕著な障害が葉に起こり、またそれに先立ち光合成機能に著しい障害が起こることがわかった。この「高地温依存性低温障害」の基本特性を明らかにし、その原因解明の手掛かりを得る目的で、3葉期の幼苗に低気温／高地温（10°C/25°C）処理を明期（650 µmol·m^-2·s^-1）12時間／暗期12時間通して行い、クロロフィル蛍光解析等を行った。低温処理1日目の明期には低地温（10°C）との可視的な相違は認めらなかった。光合成能力（Fv/Fm、ΔF/Fm'）の低下は高地温でやや大きかったものの低地温でも起こり、クロロフィル蛍光パラメータ等に低地温と高地温で質的な違いは認められなかった。しかし2日目の明期前に高地温の幼苗第3葉の光合成機能に大きな質的変化が起こり、明期になると光合成能力が急速に低下した。この状態の幼苗を常温に戻すといずれも第3葉に変色や白化を起こし、3日以内にはかなりの部分が枯れた。また低気温／低地温処理では水分含量と溢泌液量が著しく減少したが、低気温／高地温処理では常温時と変化が無かった。この高地温依存性低温障害では、光合成機能と根の吸水機能との間に密接な関係があることが示唆される。

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カルシウムを除去したほうれんそうの光化学系II粒子をS2状態で－20 Cで光照射後凍結してチロシンZ(Y_Z)をトラップした。この試料について4.2KでELDOR（電子電子2重共鳴）を観測した。その時間変動の周波数は約20 MHzでMn₄個を点双極子と、みなすとY_Zからの距離は凡そ14 Aになる。シアノバクテリアのX-線解析では、Mn間の距離は3 A 位あり、クラスターの大きさは5³ A³以上である。
点双極子での近似はよくないので、4個のMnのスピン射影を考慮し、またX-線解析の座標を入れて4個のそれぞれのMnとチロシンの双極子相互作用を集めた計算でフィットした。スピン射影はPeloquinの値を使用、X-線はLollの報告による最新の3 Åの分解能の座標を用いた。また電荷についてはEXAFS研究の提案しているS2ではMn（III）Mn(IV)₃をとると仮定し4個の位置のMnがどの射影をとるか24通りの計算を行って最も実験と合うものを選んだ。その結果X-線による番号1のMnがY_Zに最近接にあり、3価をとることがわかった。この値を使用したYD-Mn4のELDORのS2とS0状態のフィットを以前観測したELDORについて行った。

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PsbMは光化学系II複合体(PSII)の低分子量サブユニットの一つであり、その分子質量は約4 kDa、1回膜貫通へリックスを持ち、ラン色細菌から高等植物まで保存されている。ラン色細菌PSIIの結晶構造において、PsbMは二量体の中心位置、すなわち、2つの単量体の境界位置に存在し、このことからPsbMはPSII二量体の安定化に寄与することが推測される。PsbMの役割を明らかにするため、我々はPsbMを欠失させたThermosynechococcus vulcanus変異株からPSIIを精製し、ハンギング・ドロップ法によりその結晶化を行い、4.2Å分解能における結晶構造解析に成功した。野性株由来PSIIとの差フーリエ図から、変異株ではPsbMに対応する電子密度が欠けており、PsbMサブユニットが欠損していたことが確認された。イオン交換クロマトグラフィーによりPSII単量体と二量体の割合を調べたところ、野性株に比べ変異株では単量体の量が増えていたことがわかった。また、変異株由来のPSIIは単量体と二量体のいずれにおいても野性株に比べ酸素発生活性が低下していた。これらの結果から、PsbMはPSII二量体の安定化を維持することにより酸素発生活性の維持に寄与していることが結論付けられた。

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光化学系II複合体(PSII)の中心部分は原核生物から真核生物まで高度に保存されているが、酸素発生にかかわっている表在性タンパク質や低分子量サブユニットの一部は生物種によって異なっている。PSIIの立体構造は、原核生物であるラン色細菌由来のものについて報告されているが、真核生物由来のものについては報告されていない。紅藻は、原核生物に最も近い真核藻類の一つであり、その光化学系も、ラン色細菌と高等植物の間に移行している段階にあるといえる。紅藻PSIIには、20 kDaという、ラン色細菌に存在しない、4つ目の表在性タンパク質が結合しており、このような紅藻とラン色細菌のPSIIの構造上の違いを明らかにするためには紅藻PSIIの立体構造解析が必要である。本研究では紅藻由来PSIIの結晶構造を解析するため、Cyanidium caldariumを用いて、PSIIの大量精製と結晶化を行った。精製方法としては、大量培養した細胞をガラスビーズで破壊してチラコイド膜を調製し、n-Dodecyl-β-D-maltosideを用いてチラコイド膜を可溶化し、その後2回のイオン交換クロマトグラフィーにより高い酸素発生活性を持つPSII二量体を精製することができた。このPSII二量体を用いて、ハンギング・ドロップ蒸気拡散法による結晶化条件のスクリーニングを行い、結晶の析出に成功した。

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脂質は膜タンパク質の重要な構成成分の一つであり、ラン色細菌の光化学系II(PSII)において、14個の脂質分子が結合していることが結晶構造から示された。我々は、PSIIにおける脂質の役割を明らかにするため、精製したPSII二量体をリパーゼ及びホスホリパーゼ処理し、電子伝達活性への影響を調べている。好熱性ラン色細菌Thermosynechococcus vulcanus由来PSII二量体をホスホリパーゼまたはリパーゼ処理することにより酸素発生活性がそれぞれ40%、16%低下した。そのうち、ホスホリパーゼ処理による酸素発生活性の低下は主にQAからQBへの電子伝達の阻害によるものであった。しかし、ホウレン草由来PSII二量体に同様な処理を施したところ、酸素発生活性がいずれも80%以上低下し、その低下はPSIIの酸化側、還元側の両方で阻害を受けたことに起因することが分かった。両処理の脂質含量への影響を調べたところ、T. vulcanus由来PSIIに比べ、ホスホリパーゼ処理がホウレン草PSIIのリン脂質含量を、またリパーゼ処理が同PSIIのMGDG含量を著しく低下させた。これらのことから、好熱性のT. vulcanusに比べ、ホウレン草PSIIにおける脂質分子の結合が弱く、これがホウレン草PSIIの安定性を著しく低くした重要な原因の一つであると推定された。

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PsbZは植物からシアノバクテリアまでの光化学系II (PSII) 複合体に存在している約6.5kDaの2回膜貫通蛋白質である。X線結晶構造解析から、PsbZはCP43とPsbKの近くに存在することがわかっている。これまでにタバコやクラミドモナスでの解析から、PsbZはPSII-LHCII super complexの安定性、キサントフィルサイクルに関わることが報告されている。しかし、シアノバクテリアにはLHCIIもキサントフィルサイクルも存在せず、PsbZの機能は未知である。
我々は好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatus BP-1を用い、PsbZをコードするpsbZ遺伝子破壊株を作製し、PsbZ欠損PSII複合体を単離した。通常の生育条件では親株とpsbZ破壊株との間の生育に大きな差は見られず、細胞、チラコイド、PSII複合体の状態での酸素発生活性にも、親株とpsbZ破壊株の間に大きな差は見られなかった。SDS-PAGEによる構成蛋白質の比較から、psbZ破壊株のPSII複合体ではPsbZだけではなくPsbKが消失していることが明らかになった。このことから、PsbZはPSII複合体内でのPsbKの安定化に関与することが示唆された。異なる培養条件での生育についても合わせて報告する。

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PsbPは、高等植物や緑藻の光化学系II(PSII)酸素発生系Mnクラスター周辺のチラコイド膜ルーメン側に存在する膜表在性タンパク質である。これまでに我々の研究室ではRNAi法でPsbPの発現を抑制したタバコ（ΔPsbP株）を作出し、PSII最大量子収率の指標であるFv/Fm値の顕著な低下や生育の遅れ、そして特にMnクラスターの不安定化が生じる事を明らかにしてきた。これに加えてΔPsbP株では光化学系I (PSI)の量が極端に減少し、循環的電子伝達に関わるNDHやCyt b₆/f複合体サブユニットの蓄積量が増加する。こうした現象は緑藻クラミドモナスのPsbP欠損株では認められない。そこで次にPSII内部の電子受容体であるQ_AとPSI反応中心クロロフィルであるP700の酸化還元状態を解析した。その結果、ΔPsbP株ではQ_Aが還元されている状態でも、P700は酸化されており、高等植物ではPsbPの欠損がチラコイド膜電子伝達鎖全体に大きな変化を引き起こす事が示唆された。本発表ではΔPsbP株に関するクロロフィル蛍光と熱発光を用いた解析結果に加え、葉緑体遺伝子発現やチラコイド膜タンパク質複合体形成への影響も報告する。

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高等植物には光化学系II酸素発生系タンパク質（OEC）であるPsbPに加えて、PsbPドメインタンパク質と呼ばれる機能未知のパラログが複数存在している。特に我々がPsbP-like（PPL）と呼ぶタンパク質は、その配列からシアノバクテリアのPsbPホモログ（CyanoP）により近い原核型のパラログであると考えられる。この事実は、CyanoPが光合成の進化の過程でPsbPやPPLを含む多様なPsbPドメインタンパク質となり、高等植物で様々な生理機能を担うようになった可能性を示唆している。そこで本研究ではPsbPドメイン機能の多様性と重要性を明らかにするべく、原始的なPsbPパラログであるPPLに着目し、その機能の解明を試みた。シロイヌナズナのPPL（PPL1、PPL2）はプロテオーム解析でチラコイド内腔での蓄積が報告されているものの、その機能に関してはin vivo、in vitroともに一切報告されていない。そこで、まずはアミノ酸配列を用いたホモロジー検索、立体構造予測などを行ってPPL1とPPL2の機能予測を行った。ついでそれら情報をもとに、実際にシロイヌナズナppl1、及び、ppl2変異体を用いた機能解析を行った。その結果、PsbPドメインの機能分化を考える上で非常に興味深い知見が得られたので報告する。

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珪藻は、世界中の海洋や淡水に生息する単細胞藻で、熱帯雨林に匹敵する炭素同化を行う水域圏の炭素循環において最も重要な藻類である。このように水域圏の生態系で最も重要な藻類であるにもかかわらず、珪藻の光化学系2複合体（PS2）の生化学的な研究はほとんどない。その大きな原因の一つは、珪藻は珪酸質の固い殻に覆われているため細胞破壊が難しく、高い酸素発生能をもつチラコイド膜が調製できないと考えられてきたことにある。そこで、本研究において珪藻細胞の破壊方法を種々検討した結果、凍結融解により容易に珪藻細胞が破壊できることを見出し、高い酸素発生活性をもつIntactなチラコイド膜を調製することに成功した。さらに、チラコイド膜をTriton X-100処理した後の遠心分画により珪藻PS2を部分的に精製することにも成功した。この珪藻PS2には、CP47, CP43, D2, D1, Cyt b559などの膜蛋白に加え、5種の表在性蛋白が結合していることを見出した。これらの表在性蛋白を、抗体を用いたウエスタンブロッテングとN末端アミノ酸配列から調べた結果、4種は紅藻タイプの表在性蛋白（PsbO, PsbQ’, PsbV, PsbU）であったが、1種は未同定のものであることが判明した。珪藻PS2の諸特性について発表する予定である。

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珪藻は水域圏における主要な光合成生物種であるにもかかわらず、光化学系II複合体(PSII)についての詳細は明らかでない。最近、榎並らによって珪藻Chaetoceros gracilisから高い酸素発生活性を保持したPSII 標品が調製され、この標品には5種類の表在性タンパクが結合していることが明らかになった。これらの表在性タンパクについてN末端アミノ酸配列を調べた結果、4種類は紅藻の表在性タンパクPsbO, PsbQ', PsbV, PsbUと相同性を示し、1種類は紅藻ゲノムと珪藻ESTに未知タンパクとして報告されているタンパクであった（長尾ら、今大会）。これら表在性タンパクの詳細を明らかにする目的で、今回は、珪藻PSII標品に存在する5種類の表在性タンパクのクローニングを行い、塩基配列を決定した。その結果、psbVのみ色素体ゲノムにコードされており、他の4種の表在性タンパク遺伝子は、すべて核ゲノムコードであった。さらに、予測されるアミノ酸配列からリーダーシークエンス領域を解析すると、核ゲノムコードの遺伝子は全て葉緑体ERのシグナルペプチドから始まり、葉緑体膜とチラコイド膜のトランジットペプチドを持つことが明らかになった。この結果は、PsbO, PsbQ', PsbV, PsbUに加えて未知の表在性タンパクもルーメン側に存在し、酸素発生系で機能している可能性を示唆している。

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Acaryochloris spp.はクロロフィルd (Chl d) を主要色素 (> 95%) として持つシアノバクテリアである (Miyashita et al. 1996; Murakami et al. 2004, Miller et al. 2005)。 A. marinaのChl a量は光質によって変化するが常に一定量存在している (Mimuro et al. 2004)。Huらよる過渡吸収の解析により (Hu et al. 1998）、光化学系Iの初期電子供与体はChl aでなくChl dであることが報告されている。しかし、光化学系II (PS II) 由来の遅延蛍光がChl a領域に観測されることが三室らにより報告されていることから (Mimuro et al. 1999, 2004)、PS IIの初期電子供与体のクロロフィル種の同定は議論が続いている。 我々はこの疑問を解決するためにPS II複合体の単離精製を試みた。2種類のカラムクロマトグラフィーとショ糖密度勾配遠心を組み合わせることによってPS II複合体の単離精製に成功した。単離されたPS II複合体はChl d, Chl a,フェオフィチンaおよびα－カロテンを持ち、電荷分離活性を保持していた。これらの結果に基づき、光化学系IIの性質について考察する。

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Phytochrome signaling involves a complex network of processes with branches taking place in distinct cellular and subcellular compartments. For long time, phytochtomes were considered cytoplasmic proteins. However, it is now known that photoconversion of phyA and phyB to their active forms triggers nuclear translocation. For phyB, nuclear translocation is necessary and sufficient to control seedling deetiolation. However, for phyA, the subcellular sites for the control of deetiolation responses remained to be investigated. We have produced two new types of GFP-fusion transgenic plants expressing phyA-GFP with a nuclear localization signal (APAGL) or with a nuclear export signal (APAGE) under the PHYA promoter and in the phyA mutant background. The predicted subcellular distribution and protein accumulation levels comparable to the Wt-phyA were corroborated. Selected lines are being used to dissect effects of altered subcellular compartmentalization on phyA signaling. Results on the physiological and cell-biological characterization of these lines will be discussed.

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葉の形態は、光環境に応じて可塑的に変化する。中でも、様々な植物でみられる陽葉形成は強光下で生育することにより誘導される。この陽葉形態の特徴は、柵状組織細胞の葉の表裏方向への極性伸長が促進され、且つ細胞層数が増えることである。しかし、それら形態形成を制御する光環境応答メカニズムの多くは不明である。
植物は、光環境を認識するため複数の異なるファミリーに属する光受容体を用いており、主に phytochrome、cryptochrome、及び phototropin がある。我々はシロイヌナズナ光受容体変異株による陽葉形成への影響について解析した。シロイヌナズナ野生株は、通常の約10倍の光強度の強光条件 (500 μmol m ^-2 s^-1) で生育させると典型的な陽葉を形成する。一方、phyB 変異株、cry1cry2 変異株、及び phot1phot2 変異株を用いて陽葉形成の検証を行った結果、phot1phot2 変異株において柵状組織の細胞形態に著しい異常があることが解った。野生株の柵状組織細胞においてみられる表裏方向への極性伸長がphot1phot2 変異株ではみられず、結果として細胞形態が球状に近くなっていた。これらの結果は、phototropin が柵状組織細胞の極性伸長制御に関与する事を示唆すると共に、これまでに知られていない新たな phototropin の機能解明につながると期待される。

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フラビンを発色団として持つBLUFタンパク質は、多くの微生物の光障害応答に関与する青色光受容体である。その光反応は、他の青色光受容体（フォトトロピンまたはクリプトクロム）のそれとは異なる特異な機構で行われている。現在までの研究から、BLUFタンパク質に光を照射すると、フラビンと近傍のアミノ酸側鎖との水素結合ネットワークが変化し、それが光シグナル状態を形成する上で重要であることがわかった。この水素結合ネットワークの変化に引き続き特定のβシートの構造変化が引き起こされ、最終的に光情報が下流の因子へ伝達されると考えられている。今回我々は、光情報をタンパク質構造へ変換する機構の詳細を明らかにする目的で、紅色細菌のBLUFタンパク質AppAを用いて、光依存的なβシートの構造変化が分光学的に観測されないW104A変異体の生化学的解析と、その変異をゲノムに持つ変異株の表現型を調べた。その結果、W104A変異AppAタンパク質は、光依存的な活性の変動を示さないことがわかった。また変異株の表現型からW104A変異体はシグナリング状態（Light state）に固定されていると考えられた。得られた結果と近年明らかとなった数種のBLUFタンパク質の結晶構造を元に、その光反応のメカニズムを議論する。

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黄色植物(不等毛類)に属するフシナシミドロ（Vaucheria frigida）から2種の新奇のLOVタンパクを発見した．それらは1個のLOV ドメインと1個のbZIPドメインを持っていた．これらはRNAi で破壊すると青色光照射域で誘導される分枝形成が起こらなくなることから，青色光（細胞）形態形成の光受容体であることが明らかになった(2005 植物生理学会 新潟)．これらのうち一つは生殖器官形成の制御に関与していることも示唆された．BLAST検索の結果，2004年に公開された海産ケイ藻のゲノムに複数個のオルソログが見つかった．近縁の褐藻ヒバマタ（Fucus distichus）受精卵のmRNAからもオルソログを単離できた．そこで，この光受容体タンパクをAUREOCHROME（AUREO）となづけた． FucusのAUREOも光受容体としての機能を持つと推定できるが，有名な極性誘導の受容体であるかは未解明である．フシナシミドロ，褐藻やケイ藻にはフォトトロピン（PHOT）が見つからない． AUREOの発見が褐藻やケイ藻，卵菌の光生物学の引き金になることが期待される．黄色植物は二次共生によってうまれた植物群であるので，AUREOがホスト真核生物に由来するのか，それとも共生した紅色植物に由来するのかを明らかにすることは真核生物の進化と系統を考える上でも有益である．

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LOVドメインはPAS ドメインのサブファミリーで、Light-Oxygen-Voltage センサータンパク質に特異的なドメインである。LOVタンパク質の一つであるフォトトロピン(phot)はLOV1、LOV2と呼ばれる二つのLOVドメインを持っている。報告されている結晶構造はほぼ同じにも関わらず、LOV1とLOV2は異なる機能を示すことが知られている。様々な機能の光制御において、LOV2が主要な光スイッチとして働き、LOV1はほとんど機能していない。一方、LOV1は二量化部位として重要な役割を担っていると考えられる。そこで本研究では、シロイヌナズナphotのLOVドメインのオリゴマー構造、および、それらの光による変化を、架橋試薬を用いた実験により調べた。シロイヌナズナは、広範囲の光量に応答するphot1、強光センサーであるphot2の2種類のphotをもつ。LOV1はphot1およびphot2ともに二量体を形成していた。しかし、LOV2のオリゴマー構造はphot1とphot2の間で異なっていた。Phot2-LOV2は単量体として存在し、架橋試薬処理後の見かけの分子量の光による変化が観測された。一方、phot1-LOV2は単量体以外に、二量体、四量体などが共存するが、それらの光による変化は認められなかった。

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PixJ1は単細胞性シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803の正の走光性に必至なフィトクロム様光受容体である。フィトクロムと同じ赤色光を吸収する発色団phycocyanobilin (PCB)を結合するが、青色光吸収型（Pb型、最大吸収435 nm）と緑色光吸収型（Pg型、最大吸収535 nm）の間を可逆的に光変換する新奇の光受容体であることをすでに報告した。本研究では、PixJ1の光反応過程を明らかにするために、77～298 Kの範囲でPb型に青色光、またはPg型に緑色光を照射して紫外／可視吸収スペクトルを測定し、照射前後の各温度における吸収差スペクトルを調べた。さらに、PCBを結合したシアノバクテリアのフィトクロムCph1についても同様の測定をおこない、PixJ1の結果と比較した。
植物フィトクロムのPr型からPfr型への光反応では、Prからlumi-R、meta-Ra、meta-Rcの中間体を経てPfr型に変換することが知られている。lumi-Rは175 K以下（植物フィトクロム）または213 K以下（Cph1）で形成することが知られているが、PixJ1ではlumi-R様の中間体が77 K以下で生じることが分かった。250 K以上でPbからPgへの光反応が検出され、275 Kでほぼ反応が完了していた。以上の結果と低温蛍光の結果などをもとにPixJ1の光反応について議論する。

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It has been reported that there is the crosstalk between phytochrome B (phyB) and phytochrome C (phyC) in Arabidopsis. However, we found that the crosstalk between phyB and phyC in rice (Oryza sativa ) is quite different from that in Arabidopsis. In rice phyB mutants, phyC protein levels were greatly reduced in the seedlings grown in the dark, but not in the light. Intriguingly, phyC protein exhibited higher light-labile in WT than in phyB mutants. All these results indicate the involvement of phyB in regulating phyC levels in rice. On the other hand, phyC-mediated responses were not distinguishable in rice phyB-deficiency mutants, suggesting the involvement of phyB in phyC-regulated photomorphorgenesis. To access the molecular mechanisms of crosstalk between phyB and phyC in rice, several transgenic lines were produced and analyzed. Implications of interactions between phyB and phyC on the versatility of plant light sensing and signaling mechanisms will be discussed.

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シアノバクテリアは開環テトラピロールを結合する一群の GAF ドメインを持ち、その中に植物のフィトクロムと異なる吸収ピークを示すものがある。われわれはこの一群をシアノバクテリオクロムと総称し、先行研究で走光性の新奇光受容体、好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatus BP-1 の TepixJ 色素結合ドメイン TePixJ_GAFの性質を報告してきた。常温性シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 で発現、精製した His タグ融合 TePixJ_GAF は 433 nm と 531 nm の可逆的な光変換を示した。質量分析から、色素結合ペプチド断片を同定し、色素の分子量がフィコシアノビリン (PCB) と同じことを示したが色素の吸収スペクトルはフィコシアニンの PCB とわずかに異なっていた。本発表では PCB を色素に持つ Synechocystis のフィトクロム Cph1 と TePixJ_GAF を用いた詳細な変性実験と時間分解スペクトル測定結果を報告する。 酸性尿素での実験は、 TePixJ_GAF の色素、 Cph1 のPCB は共にタンパク質を変性しても光変換するが、前者の吸収スペクトルは後者と明らかに異なっていた。時間分解吸収変化のグローバル解析は TePixJ 光変換過程で複数の異なる中間体が存在することを明らかにした。以上のことは TePixJ がフィトクロムと同様に C リングと D リングの間で異性化反応を起こすが他の部位が構造的に異なる幾何異性体である可能性が考えられる。

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フィトクロムは、植物において赤色・遠赤色光受容体として様々な光応答に関わっている。一方、シアノバクテリアのゲノムから、フィトクロムと似て非なるタンパク質群が見つかり、シアノバクテリオクロムと呼ばれている。これらのうち、走光性を制御するTePixJが、フィトクロムとは全く異なり、青色ー緑色光吸収型光変換を示すことが当研究室により解明された。また、未知のシアノバクテリオクロムがゲノム中にさらに存在するため、より多様な光受容体の存在が期待される。本研究では、TePixJとオルソログ関係にありながら、色素結合型GAFドメインは異なるサブファミリーに属する、Anabaena sp. PCC 7120のPixJ（AnPixJ）に着目し、その光化学性質を解析した。
AnPixJの色素結合型GAFドメイン（AnPixJ-GAF2）をヒスタグ融合タンパク質として、フィコシアノビリン産生大腸菌で発現・精製した。AnPixJ-GAF2は開環テトラピロールを共有結合し、緑色光吸収型（543 nm）と赤色光吸収型（648 nm）の間を可逆的に光変換する新規の光受容体であった。また、酸性尿素（pH2.0）による変性実験により、オーソドックスなフィトクロムであるCph1と色素レベルでは同じ光反応が起きていることが示唆された。これらの結果から、AnPixJ-GAF2における光反応機構について議論する。また、当研究室で現在行っている他のシアノバクテリオクロムとの比較を基にした、今後の展望についても議論したい。

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フィトクロムは植物における赤・遠赤色光受容体として様々な光応答に関わっている。一方、シアノバクテリアのゲノムからフィトクロムと似て非なるタンパク質群 (シアノバクテリオクロム) が見出された。Synechocystis sp. PCC 6803 (S.6803) のシアノバクテリオクロムの1つであるCcaS (sll1473) は、フィコビリソームの構成タンパク質(CpcG2)の発現を光波長依存的に制御し、光合成系へのエネルギー分配に関わることが当研究室で報告された。CcaSはシアノバクテリオクロムの色素結合型GAFドメイン、フラビン結合型LOVドメインを併せ持つ特異なHisキナーゼ様タンパク質であり、本研究ではそのセンサー機能の解明を目的として様々な生化学解析を行っている。
CcaSのGAFドメインを、S. 6803およびフィコシアノビリン (PCB) 産生大腸菌でHisタグ融合タンパク質として発現・精製した。両者は、緑色光吸収型と近赤色光吸収型を光可逆的に変換し、吸収差スペクトルはほぼ一致した。このことからPCBがCcaSのGAFドメインに結合することが示唆された。N末の膜貫通領域を除いたCcaSをPCB産生大腸菌で発現・精製し、吸収スペクトルからPCBとともに、フラビンが結合していることが確認された。また、緑色光吸収型と赤色光吸収型では自己リン酸化活性に違いが見られた。現在、CcaSからレスポンスレギュレーター (CcaR:slr1584) へのリン酸転移反応を解析中である。

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大気中の窒素酸化物（NOx； 実質的に一酸化窒素NOと二酸化窒素NO₂からなる）は、外在活性窒素である。植物体内に取り込まれたNO₂由来の窒素の一部はケールダール法で回収されない未解明窒素（UN）化合物となる。ニトロ化合物はUN化合物の1つである。NO₂暴露により植物タンパク質はニトロ化される。本研究では、ニトロ化タンパク質のプロテオミクスおよびタンパク質ニトロ化の酸素発生への影響を解析した。
NO₂暴露したシロイヌナズナ（4週齢）葉から抽出したタンパク質をSDS-PAGEで分離、抗ニトロチロシン（NT）抗体を用いてウェスタンブロット解析した。その結果、抗NT抗体と反応する複数のバンドが観察された。そこで、タンパク質を二次元電気泳動で分離、抗NT抗体―ウェスタンブロット解析した。その結果、>1000個のタンパク質の内、7個のタンパク質スポットが抗体と反応した。各タンパク質スポットをMALDI-TOF MS分析、PMFにより同定した。その結果、これら7個のスポットは、すべてPSII表在性タンパク質PsbOまたはPsbPに帰属された。PsbQのニトロ化は観察されなかった。単離葉緑体を用いた解析からも同様な結果が得られた。以上、外在活性窒素によりPsbOとPsbPが選択的優先的にニトロ化されることが分かった。さらに、PsbOやPsbPのニトロ化と酸素発生阻害には並行関係が観察された。

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ゲノムDNAやその前駆体であるヌクレオチドは常に活性酸素（AOS）によって酸化される危険に曝されている。それに対して、大腸菌やヒトではヌクレオチドプールの浄化（MutT, MTH1）および塩基除去修復（MutM, OGG1, MutY）からなる防御機構により酸化ヌクレオチドによる突然変異の発生を防いでいる。我々はこれまでに、シロイヌナズナNudix hydrolaseファミリーの一つであるAtNUDX1は酸化ヌクレオチド [8-oxo-(d)GTP] に対する加水分解活性を有し、大腸菌mutT欠損株の突然変異を抑制することを示した。そこで本研究では、AtNUDX1および塩基除去修復酵素の機能解析を行った。AtNUDX1は大腸菌mutT欠損株における8-oxo-GTPによるmRNAへの転写エラー発生頻度を抑制した。シロイヌナズナNUDX1破壊株では通常条件下におけるゲノム中の8-oxo-グアニン量が野生株と比較して約1.5倍に増加していた。さらに、パラコートによる酸化ストレス暴露により、8-oxo-グアニン量は約2倍にまで増加した。これらのことから、AtNUDX1は酸化ヌクレオチドプールの浄化に機能していることが示唆された。現在、AtNUDX1および塩基除去修復に関わるAtOGG1およびAtMMHの細胞内局在性について解析を行っている。

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ガラクチノール（Gal）より合成されるラフィノース属オリゴ糖（RFOs）の生合成はガラクチノール合成酵素（GolS）が律速である。我々はこれまでに、シロイヌナズナGolS1および2は熱ショック転写因子HsfA2の標的遺伝子であり、H2O2処理によりHsfA2と同様にGolS1および2もまた誘導を受けことを明らかにしている（Plant J. 2006）。そこで本研究では、GalやRFOsレベルと酸化ストレスとの関係を明からかにするために、in vitroおよびin vivoにおけるGalやRFOsの生体内抗酸化剤としての機能解析を行った。先ず、HsfA2が制御するRFOs合成関連遺伝子を同定するために、GolSおよびラフィノース合成酵素（RS）アイソザイムの発現をHsfA2過剰発現シロイヌナズナ（35S::HsfA2）において解析したところ、GolS1、2、4、RS2が転写レベルで誘導を受けていた。また、Galおよびラフィノース（Raf）は35S::HsfA2の葉で著しく蓄積されていた。さらに、酸化的ストレス条件下でもGolS1-4、8、RS2が誘導を受け、それに伴いGal、Rafの蓄積が認められた。一方、in vitroでのサリチル酸競合捕捉実験による解析おいて、GalおよびRFOsは高いヒドロキシルラジカル消去能を有していた。GalおよびRFOsを高蓄積するGolS過剰発現株は、野生株に比べて酸化的ストレス耐性能の向上が認められた。以上のことから、GalおよびRFOsは適合溶質としてだけではなく、抗酸化剤としても機能することが明らかとなった。

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イネは塩ストレスなどの酸化ストレスへの応答において、しばしばカタラーゼ（CAT）活性の低下が見られ、塩ストレス傷害において重要な因子ではないかと考えられている。イネよりも耐塩性が強いヒメタイヌビエでは、塩ストレスによりCAT活性は増加していた。CATは植物防御反応のシグナル物質であるサリチル酸（SA）との結合により阻害される。そこで、CAT活性とSA含量との関係を調査したところ、イネにおいてSA含量は塩処理によって増加していたが、ヒメタイヌビエにおいては有意な増加は見られなかった。SAが蓄積しないヒメタイヌビエにおいてCAT活性が低下せず耐塩性が強いという結果から、SA蓄積が植物のストレス傷害を増幅させていると想定された。
SAの蓄積がストレス傷害を増強することを確認するため、SAを前処理した後、塩ストレスを与え、ストレス傷害と抗酸化酵素活性の変動を測定した。イネにおいてはSA前処理後に塩ストレスを与えても、SA無処理の場合と比較して生育に差は見られず、CATを含む抗酸化酵素活性の変動にも影響は見られなかった。一方、ヒメタイヌビエにおいてはSA前処理により塩ストレス傷害が増大し、SA無処理の場合では見られなかったCAT活性の低下とスーパーオキシドジスムターゼ活性の増加が生じていた。以上の結果から、植物におけるSA蓄積は塩ストレス下の酸化傷害に大きく関与していることが示唆された。

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過酸化脂質から生成されるアルデヒドやケトンなどのカルボニル化合物は，反応性が高く，低濃度では細胞のシグナル分子として働き，高濃度では細胞機能に障害をもたらす。葉に含まれるカルボニル化合物の制御と生理的効果を解明するため，シロイヌナズナ葉からの抽出，2,4-ジニトロフェニルヒドラジンでの誘導体化，HPLCによる分別定量法を確立した。標準化合物との比較から，炭素鎖長3～10，C=C不飽和結合数0～2のアルデヒド及びケトンを同定した。シロイヌナズナの3つのエコタイプCol，Nos，Lerの葉には炭素鎖長3～10の，50種以上のカルボニル化合物が含まれており，C=C二重結合をもつものも同定された。ColはNos，Lerに比べ，3Z-hexenalおよび2E-hexenal の含量が有意に低かった。これはColでhydroperoxide lyase 活性が低いことと対応する。

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環境ストレス下では、葉緑体は光過剰状態となり、葉の細胞成分は活性酸素種により酸化される。過酸化脂質から生じるアルデヒド、ケトンは葉緑体のカルビン回路を阻害する。一方、アルデヒド消去酵素を過剰発現した植物は環境ストレス耐性が増強される。すなわち、アルデヒドやケトンは環境ストレスに関与している。特に、α,β-不飽和カルボニル化合物を飽和カルボニル化合物に還元する2-alkenal reductaseの過剰発現は強光ストレス耐性を増強する。このことから、強光条件下では、葉緑体でα,β-不飽和カルボニル化合物が生じ、細胞に障害を与えると考えられる。葉緑体でどのようなアルデヒド、ケトン種が生成するかを調べるため、ホウレンソウ葉緑体からアルデヒド、ケトンを抽出し、2, 4-dinitrophenylhydrazineで誘導体化し、HPLCで分離・定量した。標準物質との比較から、葉緑体中には、butyraldehyde, n-hexanal, n-nonanalなど8種類の飽和アルデヒド、2E-hexenal, 2E-nonenalなど3種類のα,β-不飽和アルデヒド、および未同定のアルデヒド、ケトンが少なくとも9種類検出された。この中で最も含量が高かったのは12-oxophytodienoic acid、acetone（それぞれ35 μmol/mg Chl, 15μmol/mg Chl）であった。

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オゾンは植物において可視障害を伴うクロロフィル（Chl）分解を誘導することが知られているが、オゾン誘導のChl分解機構については未だ不明な点が多い。本研究では、オゾン感受性タバコBel-W3の葉において観察できる現象（Chl分解反応時の吸光スペクトル変化、Chl a/b 比の変化、蛍光性分解産物の生成パターン）を試験管内において再現できること、in vivo 、in vitro での反応は共に老化誘導性のクロロフィル分解経路と類似した経路を辿ることなどを確認し、in vivo とin vitro の両方で生じるChl分解産物のHPLCによる解析と、TOF-MS（時間飛行型質量分析計）利用したHPLC画分中のChl分解産物の同定を行った。

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FOX-hunting法（Full-length cDNA Over-eXpressor gene (FOX) hunting system）を用いてゲノムワイドな完全長cDNAのランダム高発現による形質転換体を得た後、Cd耐性・蓄積能関連遺伝子の探索に応用した。耐性関連遺伝子の探索にはT0カルス、吸収・蓄積能関連遺伝子の探索にはT1種子からの実生幼植物体(T2)を用い、それぞれCd暴露下において育成した後、生育量、あるいは地上部と根部のCd含有量を指標として選抜を行った。選抜基準は実験プール毎に5%の有意水準を逸脱する値とし、これらの値を示したカルス、あるいは植物体から遺伝子を抽出・同定してCd耐性・蓄積能関連遺伝子の候補とした。なお、カルスの選抜ではCd存在下において通常より生育の悪いカルスは通常のカルスと差がつきにくいことなどから、生育の良いカルス（すなわち遺伝子導入により耐性を獲得したと考えられるカルス）のみを選抜した。これまでに、カルス約10000株、T1種子500系統を供試し、他よりCd耐性が強いカルス約100株、Cdあるいは他の金属元素の含有量に変化が認められたT1種子約130系統を得た。これらの中には、ファイトキレーチン合成酵素、各種カイネース、活性酸素除去酵素、トランスポーターなど既知のCdストレス応答関連遺伝子の他、機能が未解明の遺伝子が多く含まれている。

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広範囲の土壌における低濃度の重金属汚染を解消する場合、低濃度であるために緊急性が低く、かつ広範囲を対象とするので、高いコストをかけた浄化法は適用しづらく、低コストの浄化法が求められる。その1つとして植物を用いた浄化法（ファイトリメディエーション）は、有力な手段としてあげられるが、単位時間当たりおよび単位面積当たりの浄化率が低いために浄化終了までに長時間を要する。このような問題点を持つファイトリメディエーションを一般化するためには、高い重金属の吸収・蓄積能力を持つ植物が求められる。一方、代表的な重金属であるカドミウム（Cd）によって植物の生長が抑制され、クロロシスが誘導されることが知られている。しかし、その現象に関与する因子はほとんど分かっていない。そこで我々はCdによって引き起こされる生理現象を遺伝子レベルで明らかにすることを目的としてCd感受性変異体のスクリーニングを行った。T-DNAタギング法により得られた約200万粒のアラビドプシス種子をビアラホスで選抜し、約13000系統のタグラインを得た。それらの実生を50 μM Cdを含む培地で選抜し、野生型より根が短い個体を約40得た。現在、各変異体のDNA解析を進めるとともに、生理的特長を把握するために種々のCd濃度に対する応答について解析中である。あわせて報告する。

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