我々は硫黄栄養欠乏条件下でシロイヌナズナのトランスクリプトームとメタボロームの経時的変化を調べ、一括学習自己組織化マッピングにより共発現・共蓄積する遺伝子群・代謝物群を明らかにした。既知のグルコシノレート（GSL）生合成酵素遺伝子群が硫黄栄養欠乏条件下で共発現していることがわかり、これらと共発現している機能未知遺伝子は同様にGSL生合成に関与すると推察した。この考えに基づき、GSL生合成遺伝子群を正に制御する転写因子の候補遺伝子を見出した。AtGenExpressプロジェクトで取得された1388アレイデータを用いた共発現解析により、この遺伝子はメチオニン由来GSL（MET-GSL）生合成に関与する酵素遺伝子群とのみ共発現していることがわかり、これらの遺伝子群を特異的に制御すると推定された。当該遺伝子ノックアウト変異株、および過剰発現T87培養細胞のトランスクリプトームとGSL蓄積パターンを解析した結果、実際にこの転写因子はMET-GSLの生合成を正に制御し、トリプトファン由来GSLの生合成には関与しないことが示された。本発表ではMET-GSL生合成の制御メカニズムについても考察する。

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硫黄欠乏条件のシロイヌナズナの代謝物と転写物の経時的変化をinfusion FT-MSとDNAアレイで非ターゲットに検出し，一括学習自己組織化マッピング (BL-SOM) を用いてクラスタリングした結果，同調的な経時的変化を示したメチオニン (Met) 由来のグルコシノレート (MET-GSL) と既知の遺伝子を含む MET-GSL 生合成遺伝子候補がそれぞれ同一区画にマッピングされた．シロイヌナズナには Met 側鎖の炭素が2～6個伸長した MET-GSL が同定されている．この Met の側鎖伸長反応は，ロイシン (Leu) 生合成反応に類似しており，Met の側鎖伸長遺伝子 (MET-ELONG) は Leu 生合成遺伝子のホモログであると推定される．そこで，BL-SOM で推定された MET-ELONG 候補遺伝子群の T-DNA 挿入遺伝子破壊シロイヌナズナの成分変化を調べた結果，側鎖伸長が進んだ MET-GSL が野生型と比較して顕著に減少した．この結果から，トランスクリプトミクスとメタボロミクスの統合解析で推定された遺伝子ホモログが側鎖伸長された MET-GSL 生合成に必須な生合成遺伝子であることが明らかになった．

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【目的】イネSekiguchi-lesion (sl) 変異体は過敏感細胞死に類似したrun away型の細胞死を自発的に起こし、イネいもち病に対して抵抗性を示す。最近Map based cloningが行われ、sl変異の原因遺伝子としてシトクロムP450遺伝子 (CYP71P1) が単離された。本研究ではsl変異体の代謝プロファイル分析を行い、CYP71P1の触媒する反応およびその基質を同定することを目的とした。
【方法と結果】野生株（cv. Kinmaze, WT)、sl変異体 (SL)、sl変異体に野生株由来のCYP71P1を過剰発現させた株(OX)の懸濁培養細胞から代謝物を80%MeOH水溶液で抽出し、LC-ESI-MS（島津LCMS-2010）を用いたノンターゲット型代謝プロファイリング分析に供した。データ解析の結果、SLで強度が弱く、WT, OXで強いm/z 177のピーク、および、SLで強度が強く、WT, OXでは弱くなるm/z 161のピークを見出した。精密質量数測定およびMS/MS分析から、これらをserotonineおよびtryptamineと同定した。同じ表現型は変異体の葉でも見られた。以上の結果からCYP71P1はtryptamineをserotonineに変換するtryptamine 5-hydroxylaseであると推測された。

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昨年の本大会では、LC/FT-ICR-MSによるトマト果実の網羅的な分析について報告し、多くの未知代謝物の存在を示唆した。本研究は植物の代謝物データベース作成を目標としているが、未知代謝物に対してより多くの化学構造的情報（組成式、MS/MSイオン、文献検索による推定構造など）をアノテーションとして付することは成分同定への手がかりになるだけでなく、大量データの一斉解析に用いることを可能にし、代謝流動の解明に役立つことが期待できる。今回は、このような未知代謝物についてLC/FT-ICR-MSを用いた我々のアノテーション手法について紹介し、解析データから得られる知見について報告する。成熟段階の異なるトマト（Micro-Tom）果実を組織別（果皮と果肉）に抽出し、LC/FT-ICR-MS分析を行った。検出された各MS値については内部標準補正法により精密質量を求めた。また、ノイズ除去を行い、精密質量値と13C同位体強度比から組成式候補を導きだす方法を確立した。この手法により、全体で330以上成分に対するアノテーションを可能にした。さらに、これらのデータを活用することにより、フラボノイド類などでトマト特有の未知代謝経路の推定に応用できることが示唆された。

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FT-ICR-MSは、高分解能、高質量精度などの特徴を持つことから、植物のメタボローム解析において主要な分析機器の一つである。また、LCと組み合わせることにより、同一質量を持つ物質を分離することができ、さらに精密な分析結果が得られる。しかしLCを用いると、スキャンポイントごとに分析を行うので、データ構成がより複雑になる。よって、試料を分析器に直接導入するフローインジェクション法に比べ、解析もより困難になる。現状では、ユーザがデータを1つずつ確認し、有益なピークの拾い出しを行っているが、数千のスキャンにおいておのおの千ほども検出される分析データを全て把握するには多大な時間と労力を要する。そこで我々は、各スキャンにおける検出m/z値のずれを内部標準物質データにより補正し、スキャンごとのm/zデータを対応付け、さらにピーク検出を一斉に行うコンピュータシステムを、Javaを用いて開発した。確実にピークを特定できれば、マススペクトルにおける同位体パターンも推定でき、そのピーク物質の絞込みを効率的に行うことができる。本発表では、トマトを例とし、解析手法について紹介する。本システムを用いて解析・蓄積されたデータは、代謝物アノテーション作成や、そのデータベース化に役立ち、LC/FT-ICR-MSを用いたメタボローム解析におけるスタンダードとなることが期待される。

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DNAアレイ解析や、各種クロマトグラフィーと質量分析による代謝産物解析の進歩により、大量のトランスクリプトームデータとメタボロームデータが得られるようになった。我々は、両オームデータを代謝経路マップ上で同時に比較解析できるインターネットツール、KaPPA-View（http://kpv.kazusa.or.jp/kappa-view/)を公開している。KaPPA-Viewでは、利用者がアップロードしたデータを用い、2実験間でのトランスクリプトームおよびメタボロームのプロファイル変化を、代謝経路上の遺伝子・化合物を示すシンボルの色変化として表示可能である。ここでは、新バージョンであるKaPPA-View2について報告する。近年、様々な実験条件におけるDNAアレイデータを元にピアソン相関係数等を計算し、遺伝子発現の協調性を解析可能となってきた。KaPPA-View2では、遺伝子間および代謝産物間の関係を、代謝経路マップ上に重ね描く機能を実装した。ATTED-II（http://www.atted.bio.titech.ac.jp/）の遺伝子相関データの他、利用者が準備した相関データも利用でき、代謝経路の機能分担や、パラログ遺伝子間での機能分担を推定することが可能である。さらにKaPPA-View2では、比較を行う2実験のデータセットを複数設定できる機能、登録されている遺伝子・代謝産物・酵素反応・マップ情報へ外部から直接アクセスできる機能を追加した。

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植物は光合成産物のうちかなりの部分を根からRhizodepositionとして放出することが知られており、個々の化合物については研究例があるもののその全体像については未だ知られていない。本研究室ではイネを用いて植物根分泌物の回収のための無菌水耕系を開発し、播種後16日目(移植後12 日目)まで無菌状態を維持することに成功した。それらの植物から回収された根分泌物について、ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)を活用したメタボロミクス的手法により包括的な解析を行ったので報告する。
イネ(Oryza sativa cv. Nipponbare)を+P、-P条件下で水耕栽培し、培養液から根分泌物を回収した。1/10強度のSCD培地により無菌状態を確認した。凍結乾燥サンプルからメタノールにより根分泌物を溶出し、GC-MSにより分析した。重複や不純物を除くとおよそ90のピークが検出され、約半数のピークを同定した。12種類の糖の誘導体が検出されたほか、有機酸やアミノ酸、脂肪酸、アミン類の分泌も確認された。GCのピーク面積に基づいてPCA解析を行ったところ、低リン条件下では糖の分泌が減少し、アミン類、脂肪酸の放出が増加する傾向を示した。現在UPLC-MSを使用し、対象をより多くの物質、特に二次代謝産物にまで広げた分析を進行中である。

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桂皮酸モノリグノール経路は、リグニンなど多様なフェニルプロパノイドの生合成に関与する、植物の主要な代謝経路の一つである。本経路は、碁盤の目状に経路を形成しており、各段階に関与する生合成酵素には複数のアイソザイムが存在し、その基質化合物も単一ではない。このように複雑な経路において、推定基質を用いた個々の酵素活性の個別解析は生理的代謝フラックスの評価を誤った方向に導く可能性もある．
FT-ICR MS (フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置) は高い感度と分解能を有する質量分離装置であり，混合物溶液を直接分析装置に導入することにより同時に多数の化合物が分離・分析できる。さらに、検出されるそれぞれのイオンの精密質量から、組成式を推測することができる。これらの特性から、FT-ICR MS を用いて複数の酵素と酵素基質を用いた一連の生合成反応の網羅的高速解析が可能であると考えられる。
本研究では、桂皮酸モノリグノール経路の 4CL (4-coumarate:CoA ligase) および HCT (hydroxycinnamoyl CoA:shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase) の組み換え酵素を調製し、複数の桂皮酸類を基質に用いて連続した酵素反応を同時に行い、FT-ICR MS 一斉分析によって HCT の生成物を検出した。本発表では、複数の酵素反応解析における FT-ICR MS を用いたメタボロミクスの有用性を議論する。

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フラボノイドは、フェニルプロパノイド－酢酸複合経路から生合成されC6-C3-C6骨格を持つ、植物の主要な二次代謝産物のグループである。現在、6000種以上のフラボノイドが様々な植物種から報告されている。フラボノイドは植物の主要な色素成分であり、抗酸化活性、抗アレルギー活性やその他の生物学的な機能を持つことが知られている。構造の分類により、物理化学的な性質、置換パターン、生合成経路、植物の代謝経路の進化について明らかにしうるので、構造の分析は解析の鍵である。そこで、我々は代謝パスウェイおよび植物種とリンクしたフラボノイド階層分類データベースを構築した。データベースには約6000種のフラボノイドが登録されており、12桁のIDシステムを用いて、骨格、水酸基の導入パターン、置換基のパターンで分類している。また、我々は代謝経路と関連づけて代謝産物－植物種の関係を閲覧できるビューアーも開発した。本ビューアーでは、植物の系統樹、フラボノイドの階層分類、代謝パスウェイをリンクさせて見ることができる。これらのソフトウェアシステムはhttp://www.metabolome.jp/ で公開している。今回、フラボノイドの階層分類システム、およびソフトウェアシステムの詳細について報告する。今後、他のフェニルプロパノイドや二次代謝産物についても分類を行い、データベースを構築する計画である。

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植物の生理的な機能を基盤とした工業原料等の有用物質の生産を可能とする為に、植物の物質生産プロセスを解明することが必要とされている。セルロースを主成分とする細胞壁は、工業原料としての利用価値が高い反面、非常に多くの酵素が関与する複雑なプロセスで形成されており未知の部分が多い。それを解明する為の手法として、公開されているシロイヌナズナのマイクロアレイデータを基にした遺伝子共発現相関解析を用い、細胞壁形成に関わると推測される遺伝子の選抜を行ったことを前回の年会において報告した。今回は、それらの遺伝子が実際に細胞壁の形成に関与しているのかどうかを実験的に証明することを試みた。
候補とした遺伝子に関して、シロイヌナズナ培養細胞T87を使い過剰発現体を作製した。それらの中で二次壁をターゲットとした転写因子において、フーリエ変換赤外分光光度計で糖成分と考えられるスペクトルで変化が見られた。また、一次壁をターゲットとした別の転写因子のRNAiを、一次壁ということから致死になる可能性を考慮しグルココルチコイド誘導型ベクターを用いて行ったところ、デキサメタゾン処理により致死になる表現型が観察された。これらの転写因子を中心に、マイクロアレイ解析やガスクロマトグラフィー-質量分析機などを利用したメタボロミクス解析に関しても併せて報告する。

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我々は工業原材料となる植物由来有用物質への応用をゴールとし、シロイヌナズナ培養細胞T87を主に用いた遺伝子発現及び代謝産物の網羅的な測定・解析を行っている。演者らはその一環として、天然ゴム等の多様な有用二次代謝産物を生み出すイソプレノイド合成経路に着目して解析を進めている。昨年度（第47回）年会において演者らは、AtGenExpressのアレイデータ（771セット）を元に算出された遺伝子間の共発現相関を用いたネットワーク解析を行い、イソプレン単位の細胞質／葉緑体における合成経路であるMVA／MEP両経路を始めとするイソプレノイド合成経路の酵素遺伝子と共発現する、すなわちそれらの発現制御への関与が考えられる候補因子を見いだした。
今回の発表では、これらの候補のうち12遺伝子に対して、完全長cDNAの過剰発現を確認したT87における、マイクロアレイによる網羅的な転写産物解析、及びGC/MS、FT-ICR/MS、UPLC-Q-TOF/MSを用いた代謝産物のnon-target分析の解析経過について報告する。現在得られている一部の候補因子の結果からは、共発現相関で見られた関係とは完全には一致しないもののMEPやMVA経路の酵素遺伝子の発現量への影響が見られており、またGC/MSの結果からも対照群との差異を与えるような未同定ピークが見つかってきている。

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サイトカイニンを介した根から地上部への窒素栄養情報伝達機構の存在は種々の植物において指摘されてきた。以前の研究で我々は、シロイヌナズナの根における窒素に応答したサイトカイニン含量の増加が、サイトカイニン合成酵素isopentenyltransferase (IPT) 遺伝子の1つAtIPT3の硝酸イオンによる遺伝子発現誘導に起因することを明らかにした。窒素栄養情報伝達機構は有用作物の生長制御、収穫量増大などの点で重要である。よって現在シロイヌナズナの結果をもとに有用作物であるイネにおける窒素誘導性IPT遺伝子の探索、解析を進めており、その結果を報告する。
イネにはサイトカイニン合成活性をもつIPTの遺伝子が7つ（OsIPT1-5, 7-8）存在している。その遺伝子産物の細胞内局在を調べたところ、葉緑体、ミトコンドリア、サイトゾルに分かれて局在していた。これらのOsIPT遺伝子について、イネの根と地上部における硝酸イオンまたはアンモニウムイオンへの応答性を検討した。その結果、根、地上部でそれぞれ複数のOsIPT遺伝子が、いずれも硝酸イオン、アンモニウムイオンでともに発現誘導されていた。この結果はシロイヌナズナのAtIPT3が硝酸イオンのみに応答するという報告と異なり、イネとシロイヌナズナの窒素に応答したIPT遺伝子発現誘導が異なる機構で行われていることを示唆するものである。

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植物は硝酸イオンとアンモニウムイオンを窒素源として吸収し同化して、アミノ酸、タンパク質や核酸といった種々の窒素元素を含む生体物質の生合成を行っている。無機窒素の供給は窒素シグナルに直接的に応答した遺伝子発現に加え、同化物含量の上昇とそれに基づく二次的制御を引き起こすと考えられる。本研究では、イネにおける窒素の供給によって引き起こされる代謝変化と遺伝子発現パターンを包括的に明らかにするために、滅菌水により発芽後1週間培養した後に10 mM硝酸アンモニウムにより1時間、3時間、24時間の窒素処理を行ったイネを用いて、アミノ酸や有機酸といった代謝物の変動の解析とマイクロアレイを用いた発現解析を行った。シュートと根に分けて時系列で評価することにより、代謝物と遺伝子発現の変動がシュートと根では異なることが明らかとなった。また、短時間の間に発現が誘導される転写因子に加え、グルタミンの含有量と正の相関を持って発現が誘導される転写因子を同定した。そのような転写因子には、AP2-EREBP family、MYB family、NAC family、WRKY family、zinc-finger familyに属する転写制御因子が含まれていた。現在、これら転写因子の標的遺伝子の探索も進めている。

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窒素同化に必要な炭素骨格の生合成経路の酵素の発現に関わるトウモロコシ転写因子Dof1を発現しているシロイヌナズナ形質転換体では、遊離アミノ酸総量の増加と窒素同化能力の向上が見られることを既に報告している。今回、我々はDof1による窒素同化能力の強化はアンモニウムイオンの存在に依存することを報告する。アンモニウムイオン非存在下で生育させた場合には地上部と根のいずれにおいてもDof1形質転換体とコントロール植物体の遊離アミノ酸含量の間に有意な相違は確認されなかったが、10 mMアンモニウムイオン存在下で生育させた場合には地上部でのみコントロール植物体に比べてDof1形質転換体のほうが高い遊離アミノ酸含量を持つことが判明した。アンモニウムイオン存在下で生育させた形質転換体の地上部でのみ、遊離アミノ酸の含量の増加ともに窒素同化に必要な炭素骨格の供給に関わるクエン酸回路の代謝中間体であるリンゴ酸およびフマル酸の減少も観察され、また、Dof1転写制御因子のターゲットであると推定されるAtPEPC1やAtPK1などの発現の上昇も確認された。これらのことからDof1機能は組織特異的に、またアンモニウムイオン依存的に発現されることが示唆された。現在、Dof1形質転換シロイヌナズナを用いたDNAマイクロアレイ解析を行っており、その結果についても報告する予定である。

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砂漠環境に自生する野生スイカは、乾燥強光に伴い生体内の窒素化合物を大規模に分解・再利用し、ヒドロキシルラジカル消去能に優れたシトルリンを蓄積する。これまでに、シトルリン代謝を担う全11種の酵素のうち4酵素が、乾燥に伴い活性変動し、シトルリン蓄積の鍵となっていることを明らかにしている。本研究では、乾燥強光に伴い活性を増加させる鍵酵素の一つであるAcetylglutamate kinase (AGK)に注目し、その活性制御機構を解析した。
まずアルギニンによるAGKのフィードバック阻害を解析したところ、乾燥後の野生スイカ葉粗抽出液におけるAGK活性は、乾燥前の粗抽出液における活性と比較し、フィードバック阻害が緩和されることを見出した。このようなAGKの応答から、炭素・窒素比を制御するセンサータンパク質PII proteinの関与が示唆された。そこで野生スイカPII protein量を抗体反応により解析したところ、シトルリンの蓄積と相関して発現量が増加していた。次にストレス未処理の野生スイカのタンパク質粗抽出液に組換えPII proteinを加えAGK活性を測定したところ、アルギニンによるAGKのフィードバック阻害が緩和されることを見出した。これらの結果は、野生スイカにおいてPII proteinがシトルリン蓄積を制御していることを示唆している。

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光合成の炭酸固定反応を触媒する酵素Rubiscoの葉における量は、窒素栄養の供給量の増加に伴い特異的に増加することが知られている。Rubiscoの小サブユニットをコードする遺伝子rbcSは核ゲノムにgene familyを形成することが知られ、イネ(Oryza sativa L)においても5分子種(OsRBCS1-5 )の座乗が確認されている。本研究ではイネ葉を材料とし、Rubisco量の窒素栄養への応答に関する基礎的な知見として、rbcS gene familyの窒素栄養に対する応答をmRNAレベルから明らかにすることを目的とした。窒素栄養を0.5 mM(低窒素区)、2 mM(標準区)、8 mM(高窒素区)の濃度で含む水耕液で栽培したイネ第10葉における各mRNAを、リアルタイムRT-PCR法により定量した。その結果、窒素供給量に関わらずOsRBCS2-5のmRNAの蓄積量が高く、高窒素区においては、これらのmRNA量の最大値が標準区と比べ増加していた。その一方で、低窒素区においては、mRNA量の最大値がOsRBCS2およびOsRBCS4では標準区と比べ低下していたのに対し、OsRBCS3およびOsRBCS5では増加していた。以上から、イネにおけるrbcS gene familyの窒素供給量に対するmRNAレベルでの応答は、分子種によって異なっていることが明らかとなった。

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リブロース 1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（RuBisCO）はカルビンサイクルの鍵酵素で、カルボキシラーゼ反応とオキシゲナーゼ反応を同一活性部位で触媒する。オキシゲナーゼ反応に対するカルボキシラーゼ反応の比特異性は S_rel ( S_rel = Vmax(CO₂) Km(O₂) / Vmax(O₂) Km(CO₂) ) で示される。高 S_rel を示す RuBisCO の創成は植物の光合成効率改良につながると考えられ、期待されている。
好熱性原始紅藻 Galdieria partita の RuBisCO は地球上で最も高い S_rel を示し、高等植物の約3倍の 238 である。構造解析から、我々は Galdieria RuBisCO に高い S_rel に関与すると予想される構造を見出し、ラッチ構造と呼んでいる。ラッチ構造は RuBisCO の触媒 loop 上の Val332 の主鎖の酸素原子と Gln386 のアミノ基間に形成される水素結合で、植物やラン藻 RuBisCO には見られない。
本研究では S_rel とラッチ構造の関係を明らかにするため、変異導入により S_rel が非常に低い Synechococcus sp. PCC 7002 RuBisCO に Galdieria RuBisCO のラッチ構造を導入し、酵素学的解析を行った。その結果ラッチ導入 RuBisCO は野生型より高い S_rel を示す傾向が見られた。現在、変異 RuBisCO の詳細な解析を行っている。

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海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumの葉緑体内、ガードルラメラ上に顆粒を形成し、葉緑体内の溶存無機炭素バランスを調節していると考えられるカーボニックアンヒドラーゼ、PtCA1は、培養液中のCO₂が上昇すると発現抑制される典型的なCO₂応答性タンパク質である。本研究では、この遺伝子ptca1のプロモーター配列Pptca1をモデルとして、海洋性珪藻が海洋表層でCO₂濃度を感知する機構を探った。すでにCO₂応答に必要なコア領域であることが示されているPptca1の-70bpより下流領域に存在する3つの推定シスエレメント（CRE1、p300結合配列、及びCRE2）を削除或いはアンチセンス置換したコンストラクトを作成し、これをGUSレポーター遺伝子uidAに繋いだ。P. tricornutum細胞をホストとしてこれら改変Pptca1のloss of function実験を行った結果、CRE1およびp300結合配列が高CO₂環境下でPptca1を抑制するために必要であることが分った。さらに、cAMPアナログ及びcAMP分解酵素阻害剤を用いて、細胞質のcAMP濃度を高める処理により内在ptca1の発現が低CO₂環境下でも抑制され、また、この抑制効果はCRE1の削除によって消失することが分った。CO₂センシング機構のセカンドメッセンジャーとしてのcAMP代謝について議論する。

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海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutum の細胞内carbonic anhydrase(PtCA1)は、CO₂の濃縮(CCM)及び固定に重要な鍵酵素の一つであると考えられている。PtCA1はガードルラメラ上に顆粒状に局在することが明らかにされているが、顆粒を形成する仕組み、及び顆粒を形成することの生理的意義は明らかにされていない。本研究では、PtCA1の顆粒の形成機構を明らかにすることを目的としている。成熟PtCA1のN末端あるいはC末端をそれぞれ部分的にトランケートした改変PtCA1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換体を作製し、GFP蛍光の細胞内局在を観察した結果、PtCA1のC末端側から数えて1 ~20アミノ酸の領域に顆粒形成に関わる配列があることが示唆された。また、この領域を含む疎水性クラスター分析を行った結果、この領域内に3 残基毎に繰り返し存在する疎水性アミノ酸 M, L, I, L, L がC末端のαヘリックス上に一列に並ぶことで、疎水性クラスターが形成されると推定された。そこで、これら疎水性アミノ酸をそれぞれ側鎖のサイズが似かよった親水性アミノ酸に置換した改変PtCA1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換体を作製し、GFP蛍光の観察を行った。その結果、この疎水性クラスターが、PtCA1の顆粒形成に必須であることが示された。

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多くの水生光合成生物は、光合成に必要な無機炭素が不足すると、能動的に無機炭素を細胞内に取り込む無機炭素濃縮機構（CCM）を誘導する。緑藻クラミドモナスにおけるCCMの発現誘導には、制御因子CCM1が必須であるがその生化学的実体は未解明である。今回、CCM1タンパク質のN末端側に存在する亜鉛結合ドメインについて、亜鉛結合性とその重要性を解析し、さらにCCM1の細胞内存在様式について検討したので報告する。
亜鉛結合部位を1カ所含むCCM1のアミノ末端側71アミノ酸残基の領域、2カ所含む101アミノ酸残基の領域をそれぞれGST融合タンパク質として大腸菌で発現させた。精製したタンパク質の結合亜鉛を原子吸光法で定量した。N末端側71アミノ酸残基の領域には亜鉛が1原子、101アミノ酸残基の領域には2原子結合していた。さらに、この領域中のHis-54残基をTyrに置換したところ、亜鉛結合性が失われた。His-54がTyrに変異した株cia5ではCCMが誘導されないので、細胞のCO₂応答性には、CCM1に亜鉛が結合する必要があると考えられた。また、ゲル濾過クロマトグラフィー、抗体免疫染色法によりCCM1の存在様式を解析した。CCM1は細胞内で核に局在し、複合体を形成すると考えられる。

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緑藻クラミドモナスはCO₂が欠乏するとCO₂濃縮機構を誘導し、細胞内に能動的にCO₂を輸送する。この機構はCO₂の濃度変化の感知とシグナル伝達を介した、CO₂輸送体を含む遺伝子群の発現誘導によるとされている。我々は遺伝子発現プロファイルからCO₂欠乏誘導性遺伝子を同定し、その機能解析を進めている。
細胞を5%のCO₂過剰条件から0.04%のCO₂欠乏条件に移し6時間までの発現プロファイルを取得し、277個のCO₂欠乏誘導性遺伝子を見出した。この中に含まれるLciBは、ピレノイド構造を持つ緑藻にオルソログが見いだされ、48-kDaの親水性タンパク質をコードする。LciBの発現はCO₂シグナル伝達のマスター因子CCM1に制御され1)、CO₂輸送能を欠損した変異株を相補することから2)、LciBがCO₂欠乏条件においてCO₂輸送に積極的に関わると考えられるが、その機能は解析されていない。そこで我々はLciBタンパク質に対する抗体を作製し、低CO₂条件においてピレノイド周囲に蓄積することを明らかにした。またLciBのRNAi株を作出したところ、CO₂輸送活性が野生株に比べて70%程度低下していた。CO₂欠乏条件におけるLciBの機能について議論したい。1) Miura et al., Plant Physiol., 2004 2) Wang and Spalding, PNAS, 2006

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円石藻はハプト植物門に属する単細胞石灰藻である．代表種であるEmiliania huxleyiは，広範な海洋での大増殖（ブルーム）を引き起こし，中生代白亜紀以降の地球規模の炭素循環に影響を与えてきた．E. huxleyiの増殖制御機構の解明には，生育の基礎となる光合成炭素代謝系の解析が不可欠である．そこで，本研究では，¹⁴CO₂を基質としたトレーサー実験による光合成初期産物の解析と，鍵酵素の特性解析を試みた．
光合成初期産物を解析した結果，カルビン-ベンソン回路の中間体と考えられる糖リン酸化合物に加え, C₄アミノ酸であるAspなどが多く生じることを見出した．これは，C₃化合物にCO₂（HCO₃^-）を付加してC₄化合物を生じるβ-カルボキシレーション活性が高いためと考えられた．そこで，β-カルボキシレーション酵素のcDNA配列をESTライブラリから検索した結果，ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）とピルビン酸カルボキシラーゼ（PYC）の相同配列を見出した．明暗条件下で両酵素のmRNAの発現量を比較した結果， 光照射下でPEPCKの発現は抑制され，PYCの発現は顕著に増加した．さらに，PYCの全長cDNAの配列解析の結果，予測されるアミノ酸配列のN末端部に葉緑体移行シグナルが存在することが明らかになった．以上の結果より，E. huxleyiでは，葉緑体局在のPYCによるβ-カルボキシレーションが，光合成炭素固定に大きく寄与していると結論した．

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イネの栽培品種の一つであるOryza glaberrima Steud.は、不良環境抵抗性を示すと一般的には言われている。しかしながらOryza glaberrimaの水ストレスに関する反応性やその生理的メカニズムは明らかではない。本研究は、豪雨や河川の氾濫による急激な水位上昇をともなう冠水(Flash floods)に対するOryza glaberrimaの生理的反応の特性を検証した。
材料および方法
本研究は、ギニア共和国で2006年5月から6月にかけて行った。ギニア在来品種Saligbeli (Oryza glaberrima)、Ballawe (Oryza sativa)とFlash Flooding 耐性品種IR49830-7-1-2-2 (Oryza sativa)の3品種を供試した。播種後12日目の幼苗を水深1mで7日間完全冠水した。
結果および考察
SaligbeliとBallaweは冠水初期に冠水時に成長する葉鞘(第5・6葉)を伸長させることにより、草丈が急激に伸長した。一方、同時期のIR49830-7-1-2-2の葉鞘伸長はほとんど見られなかった。冠水前のSaligbeliは地上部に対する地下部の乾物重比が他の品種に比べて大きいが、冠水処理により地下部の乾物重比は減少し、冠水後半には他の品種と同程度となった。Saligbeliは乾物分配パターンを変化させることにより、地上部の成長を維持していることが示唆された。

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Carotenoids (Cars) are group of pigments complementary to bacteriochlorophyll (BChl), which play important functions of light-harvesting, which include capturing light energy by Car followed by transferring its singlet energy to bacteriochloropyll. In this paper, subpicosecond time resolved absorption spectra of carotenoids having 9-11 conjugated double bonds were recorded in the visible region, upon excitation at different vibronic excited states, 1B_u⁺(v = 0,1,2). The spectral data matrices were analyzed by singular-value decomposition (SVD) followed by global fitting by the use of a sequential model. SVD was used to extract all significant components and the decay time constants determined by global fitting. The lifetimes (τ) of the 1B_u⁺, 1B_u^- and 2A_g^- states shortened with the number of conjugated double bonds (n) among neurosporene (9), spheroidene (10) and lycopene (11). The linear dependence of lnτ as a function of 1/(2n+1) was explained in term of the Englman-Jortner energy-gap law.

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古典的なカロテノイドであるβ-カロテンは植物の光合成において一重項励起状態を介してクロロフィルへそのエネルギーを伝達している。またカロテノイドの励起と緩和の過程を振動分光学的に調べるには重水素置換体の利用が有用となり得る。
NAの全トランスβ-カロテンの精製と6種類の重水素置換体 (12-d, 12,12'-d₂, 14-d, 14,14'-d₂, 15-d, 15,15'-d₂) の合成、精製を行い、重ベンゼン溶液中で¹H-¹Hシフト相関スペクトル (COSY) と¹H-¹H NOESYを用いて共役結合部位のシグナルを帰属した。重水素に隣接した水素のシグナルは高磁場シフトした。重水素二置換体はシグナルが単純化され、重水素一置換体では異なる分裂パターンのシグナルが複雑に重なり合う傾向が見られた。これにより重水素置換が完全に行われていることが確認できた。
基底状態のラマンスペクトルでは、C-H面内変角振動がC-C伸縮振動やC=C伸縮振動とカップリングしているので、重水素化によりそれぞれの振動が低波数シフト、高波数シフトすると期待される。重水素付近でのカップリングに変化が見られてシグナルが分裂する可能性も考えられる。
現在基底状態のラマンスペクトルを測定しており、将来サブピコ秒時間分解誘導ラマン分光法を用いて重水素化β-カロテンの複数の励起状態の寿命と振動の固有スペクトルを解明するための足がかりとしたい。

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溶液中とLH1, LH2, RC, RC-LH1複合体に結合した共役二重結合数n = 9–13の範囲のカロテノイド(Car)の三重項状態の吸収スペクトルを測定して、三重項寿命(τ)のn依存性を調べた。Englman・Jortnerのエネルギー・ギャップ則から導かれるln τと1/(2n + 1)との直線関係の変化を次のように説明した。(1) 溶液 → LH2に伴う直線関係の短寿命方向へのシフトは、カロテノイド共役鎖の捩れに由来する。(2) LH1 → RC-LH1に伴う直線関係の傾きの減少は、微小成分として混在する長鎖カロテノイドが、三重項エネルギー散逸のチャンネルを形成するためである。(3) RC → RC-LH1に伴う水平な直線関係への変化(共役鎖長依存性の消滅)は、RCのバクテリオクロロフィルが、三重項エネルギー貯蔵庫(triplet reservoir)としての機能を発揮するためと考えられる。

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Rhodovulum sufidophilumは海洋性の紅色光合成細菌であり、光化学反応中心複合体に結合している通常4ヘム型のチトクロムサブユニットが3ヘム型であるという特徴を持つ。この反応中心への電子供与体として他の紅色光合成細菌にも広く見られる水溶性のチトクロムc₂が確認されているが、これまでの研究でチトクロムc₂だけでなく膜結合性のチトクロムcもまた電子供与体として働くことを示唆してきた。本研究ではこの膜結合性チトクロムcをコードする遺伝子のクローニングと破壊を通じてその生理的役割を明らかにすることを目標とした。クローン化された遺伝子の配列解析から、このチトクロムはN末端に膜貫通領域を持つ分子量50,528のモノヘムチトクロムcであることが解った。また、ヘムの結合部位がC末端領域にありチトクロムc₂とアミノ酸レベルで54%の高い相同性を示したことから比較的最近起こった遺伝子重複に起源を持つ可能性が示された。我々は以前の研究でチトクロムc₂遺伝子を破壊しても光合成による生育は野生型と変わらないことを示している。本研究で膜結合性チトクロムc遺伝子を破壊した株を作製したところ、やはり生育は野生型とほぼ同様であった。しかしこれらチトクロムの2重破壊株を作製したところ、光合成による生育は不可となった。このことからR. sulfidophilumにおいては両者とも反応中心への生理的電子供与体として等価に働くことが示された。

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繊維状非酸素発生型光合成細菌(Filamentous anoxygenic phototroph: FAP)は、16S rRNAに基づく系統樹では光合成微生物の中で最も分岐の古い生物であり、光合成の進化を研究する上で有用である。温泉噴出口付近で緑色や赤橙色の微生物マットを形成して棲息し、キノン型の光化学反応中心を持つ。同様にキノン型反応中心を持つ紅色細菌では、反応中心はチトクロムbc複合体・可溶性チトクロムと共に循環的電子伝達系を形成している。一方FAPではチトクロムbc複合体や可溶性チトクロムは、ゲノムからも生化学的にも同定されておらず、FAPの光合成電子伝達系については不明な点が多い。今回我々はR. castenholzii由来の銅蛋白質オーラシアニンの大腸菌を用いた大量精製に成功したのでその性質について報告する。さらに我々は、R. castenholziiの生細胞および膜標品を用いた研究によりキノンアナログが反応中心の再還元を阻害することから、FAPにおいても循環的電子伝達系が存在すると考えている。今後はオーラシアニンの解析とともに、FAPの電子伝達系におけるキノール酸化還元酵素の同定も進めていきたい。

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全トランス－カロテノイドには、種々の対称性を持つ一重項励起エネルギー準位がある。光合成系でのエネルギー伝達は、これらのエネルギー準位での内部転換と振動緩和により制御されているが、本研究では光学活性1B_u⁺状態での振動緩和を対象とした。1B_u⁺状態は、短鎖、長鎖、いずれのカロテノイドのエネルギー伝達にも携わる、重要なエネルギー準位である。本実験では共役二重結合数がn = 13の1B_u⁺状態の寿命が最も短いスピリロキサンチンを対象にして、約40 fsのパルス幅を持つフェムト秒レーザーを用いて時間分解吸収スペクトルを測定した。その結果、ごく初期の時間領域において、2種類の異なる時間変化をする誘導発光ピークが存在し、高エネルギー側のものが先に消えることを観測したが、これは1B_u⁺(1)から1B_u⁺(0)への振動緩和に由来するものと考えられる。1B_u⁺(1)から1B_u⁺(0)への振動緩和は、過去に研究された2A_g^-状態の振動緩和と比較すると非常に早く、高エネルギー側の1B_u⁺ (1)成分が200 fs以内にほぼ消えることが観測された。しかし、この振動緩和は、内部転換の速さ(～10 fs)と比較すると非常に遅いので、数種類の振動準位から、内部転換とバクテリオクロロフィルへのエネルギー伝達が、競争して起こっていることが予測される。

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In order to understand the important functions of carotenoids in photosynthesis systems, their excited-state energies and lifetimes should be determined correctly. Because the time-resolved fluorescence up-conversion spectroscopy is free from stimulated emission and transient absorption, it is very suitable to achieve that. For the sake of obtaining the up-conversion signal of the 1B_u⁺(0)→1A_g^-(0) transition and minimize the effect of vibrational relaxation, spheroidene was excited upon the 1B_u⁺(1)←1A_g^-(0) transition. We have recently succeeded in obtaining time-resolved fluorescence data by the use of 1 KHz, 100 fs pulses. SVD followed by global fitting was used to analysis the time-resolved fluorescence up-conversion spectra, we found that two dynamic processes were present in the spectra. We assigned the faster and slower processes to the relaxation dynamics of 1B_u⁺ and 1B_u^- states, respectively. The lifetimes of 1B_u⁺ and 1B_u^- states were determined to be 0.04 ps and 0.30 ps, respectively.

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The possible mechanism of dissipation of triplet energy in reaction center (RC) bound carotenoid has been established by a pair of investigations which proposed that the series of configurational changes of carotenoid could facilitate the triplet-energy dissipation. The sub-microsecond time-resolved Raman spectra of spheroidene bound to the reduced RC of Rb. sphaeroides 2.4.1 were recorded at room temperature. The OD800 nm=100 cm^-1 sample with 100 mM ascorbate acid were pumped at 590 nm and probed at 532 nm respectively. After spectral analysis we observed a series of time-dependent spectral changes which could be attributed to the triplet-state configurational changes of the RC bound carotenoid. As strengthened by our preliminary study of time-resolved EPR spectroscopy (Yoshinori Kakitani, et. al., Biochemistry 2006, 45, 2053-2062), this investigation provided us the definitive evidence of the triplet-state configurational changes of the RC bound carotenoid functioned as the dissipation of triplet-energy under physiological temperature.

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シアノバクテリアSynecocystis PCC6803のフォスファチヂルグリセロール合成酵素pgsA欠失株における反応中心構造、励起エネルギー移動を検討した。1)PG除去により、CP43,CP47を欠失したPSIIが増加した。2)PSIは減少した。3)PSI, PSIIタンパク質の新規合成は続くがRCへのくみこみが抑えられた。4)77K蛍光スペクトルとピコ秒寿命を測定すると、PSIIのCP47の694nm蛍光はへっていた。一方683nm蛍光は大きく増大した。減衰過程の検討からこの成分はクロロフィルでなくアロフィコシアニンによると結論された。フィコシアニンの蛍光寿命は大きく変化しなかいので、ほぼ完全なフィコビリゾームが膜系上にあり、PSII減少とともにアロフィコしアニンの蛍光寿命が増大したと結論され、電顕でも確認された。この効果はPG再添加により速やかに解消された。

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光化学系II反応中心に局在する二量体クロロフィルP₆₈₀は、水の酸化の駆動力となるために、その酸化還元電位は+1.2 Vと推定されており、生物界で最も高い。しかし、その高い電位を保持するための鍵となる分子構造については不明である。本研究では、P₆₈₀のリガンドとなるアミノ酸が酸化還元電位に及ぼす影響を調べることを目的とし、D1側のP₆₈₀のクロロフィル(P_D1)のリガンドであるHis198をGlnおよびAlaに置換した好熱性シアノバクテリアT. elongatusの部位特異的変異株を作製し、構造変化に伴う機能の変化を調べた。
どちらの組換え体も光独立栄養条件で生育したが、アンテナ色素であるフィコシアニンからアロフィコシアニンを通って光化学系IIへのエネルギー移動の効率は、野生株に比べて悪かった。単離した光化学系IIコア複合体は野生株のそれと同じ高い酸素発生活性を示した。FTIRによるP₆₈₀/P₆₈₀⁺差スペクトルにおいて、特にD1-H198Qでは、そのPD1の一部の構造に変化が認められた。この株のS₂Q_A^-およびS₂Q_B^-の熱発光温度は野生株よりも高く、また、閃光照射吸収スペクトルは長波長側にシフトしていた。これらの結果から、P_D1のリガンドは、P₆₈₀の酸化還元電位に関与していることが明らかとなった。

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光化学系II(PSII)におけるチロシンY_D(D2-Tyr160)は、P680の副次的電子供与体として働く。P680⁺によって酸化されたY_Dは、プロトンを解離して中性ラジカル(Y_D^·)となる。光化学系IIのX線結晶解析によると、Y_DはD2-His189及びD2-Gln164と隣接しており、これらのアミノ酸側鎖を含む水素結合ネットワークが、Y_Dのプロトン共役した電子移動反応に重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、この水素結合ネットワークの構造、及びY_Dの酸化反応の分子機構の詳細は、未だ明らかにされていない。本研究では、フーリエ変換赤外 (FTIR) 分光法を用いて、Y_Dと近傍アミノ酸側鎖との水素結合構造を調べた。
シアノバクテリアThermosynechococcus elongatusのPSIIコア蛋白質を用いて、光誘起Y_D^·/Y_DFTIR差スペクトルを測定した。チロシン側鎖を[4-¹³C]Tyrで置換した試料についてスペクトルを測定し、Y_Dの水酸基に由来するバンドを抽出した。D₂O中でY_Dを重水素置換した試料のスペクトルと比較から、Y_Dの1252 cm^-1のバンドが、CO伸縮振動とCOH変角振動がカップルした振動に由来することが示された。このCO/COHバンドに関して量子化学計算による解析を行った結果、Y_DはD2-His189及びD2-Gln164の両方と水素結合を形成していることが明らかとなった。

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光化学系IIにおいて、炭酸水素イオンがQ_A、Q_B間に位置する非ヘム鉄に結合していることは既に知られている。一方、炭酸水素イオンがMnクラスターの配位子として、酸素発生反応に関与している可能性が報告されているが、その詳細は未だ不明である。本研究では、赤外分光法を用いて、炭酸水素イオンとマンガンクラスターとの相互作用を調べた。通常の炭酸水素イオン、または¹³Cで同位体置換した炭酸水素イオンを光化学系II試料に加え、酸素発生系の各S状態遷移（S₁→S₂、S₂→S₃、S₃→S₄、S₀→S₁）の閃光誘起フーリエ変換赤外差スペクトルを測定した。(H¹²CO₃^-―H¹³CO₃^-)二重差スペクトルを計算すると、1閃光目のスペクトルのみに炭酸水素イオンのバンドが観測され、2～4閃光目のスペクトルには、同位体効果は全く見られなかった。Mnを除去した光化学系II試料を用いて非ヘム鉄の差スペクトル（Fe²⁺/Fe³⁺）を測定し、¹³C置換によって非ヘム鉄に結合する炭酸水素イオンのバンドを検出した。その結果、このスペクトルはS状態測定の1閃光目の二重差スペクトルと一致し、そこで観測されたバンドは非ヘム鉄由来であることが明らかとなった。これらの結果から、酸素発生系の各S状態遷移において構造変化する炭酸水素イオンは存在しないことが示された。このことは、炭酸水素イオンがMnクラスターの配位子ではないことを強く示唆している。

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イネの「分げつ」は側枝に相当する器官で、強勢の分げつは茎の先端に穂をつけることから、その多寡は収量に影響する重要な農業形質である。イネを密植した場合、この分げつの出現は抑制されることが知られているが、この応答制御に関わる分子機構については知見が乏しい。一方、他の植物の研究からは、植物の密植応答は葉陰で高まる遠赤色光／赤色光の比が主にフィトクロムB（phyB）によって検知されて誘導されることが示されている。そこで、イネにおいて分げつ出現の抑制という形で現れる密植応答がフィトクロム制御下にあるかを、疎植・密植両条件で各種フィトクロム変異株を栽培することで解析した。コントロールとして栽培した日本晴は、密植により分げつの数を有意に減らした。加えて、今回調査したフィトクロム変異株（phyA, phyB, phyC, phyAphyC, phyBphyC）では、全てにおいて正常な分げつ出現の抑制が密植時にのみ観察された。ここで注目すべきことは、phyBを欠損しても分げつの数については正常な密植応答が見られることで、このことは、イネではphyB が密植検知に必須でないことを示している。これまでの結果から、現段階では二つの可能性が残された。（1）イネではphyAがphyB同様に密植検知に関わる。（2）イネの密植検知にはフィトクロムが関与しない。現在、その二つの可能性について検討を加えている。

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葉緑体は効率よく光を吸収するために弱い光には集まり（集合反応）、光損傷を避けるために強い光からは逃げる（逃避反応）。種子植物シロイヌナズナでは、集合反応は2つの青色光受容体フォトトロピン（phot1、phot2）によって制御され、逃避反応はphot2 のみによって制御されている。我々は最近、葉緑体光定位運動に異常を示す変異体 kac1 を単離した。マッピングにより KAC1 遺伝子が植物に特有なタンパク質をコードすることが明らかになった。KAC1 遺伝子は葉、茎、花および根でその発現が確認された。KAC1タンパク質は主に可溶性画分で検出されるが、膜画分でも検出される。KAC1タンパク質の発現量と細胞内局在パターンはphot1phot2、jac1、chup1のどの葉緑体光定位運動の変異体でも変化がなかった。

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光受容体フィトクロムは、植物の様々な光応答を制御している。松下ら(2003)、岡ら(2003)は、シロイヌナズナのフィトクロムB(phyB)のN末端側651アミノ酸(AtPhyBN651)、さらに短い450アミノ酸(AtPhyBN450)とGFP-GUSとの融合タンパク質がphyBの生理機能を相補出来る事を示し、phyBのシグナル伝達には N末端側450アミノ酸が重要であることを明らかにした。短日植物であるイネのphyB機能欠損変異体(phyB-2)は、赤色光下での幼葉鞘等の伸長生長の促進および第1葉の緑化の抑制、青色光下での第2葉のラミナジョイントの屈曲が報告されている（高野ら、2005）。そこで、シロイヌナズナおよびのイネのPHYBのN末端部位(AtPhyB-N450,-N651, OsPhyB-N450,-N651)をGFP-GUS融合タンパク質としてphyB-2に発現させた。その結果、赤色光下での光形態形成および第1葉の緑化においては、OsPhyB-N651はphyB欠損を部分的に相補したが、OsPhyB-N450はほとんど相補しなかった。青色光下でのラミナジョイント反応は、AtPhyB-N450, -N651は相補せず、OsPhyBN450は野生型レベルまで相補、OsPhyB-N651は野生型よりも強い形質(スーパーフィトクロム様活性)を示した。以上の結果は、イネphyB分子のシグナル伝達機構はシロイヌナズナphyB分子と異なっており、さらに、その必須な機能ドメインも、生理反応によって分化している事が示唆された。

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The bending of a plant toward the direction of intense light is called phototropism. This directional growth response is caused by the plant growth regulating substances. In this aspect, Bruinsma-Hasegawa hypothesis (1990) stated that the gradient of growth-inhibiting substances (phototropism-regulating substances) in the illuminated side is a key factor of bending during phototropic curvature. Although some phototropism-regulating substances were isolated from several plant species, the molecular mechanism underlying this phenomenon is still largely remained. The symbolic phototropism-regulating substances, cis- and trans-raphanusanins were isolated from radish hypocotyls. To understand the role of raphanusanins in phototropism and the responsible genes of growth inhibition, differential display was performed between the raphanusanin applied and control hypocotyls. We could isolate some candidate genes. Almost all positive clones were related to biotic and abiotic stress. The detailed roles and functional impacts of these genes in the growth inhibition will be presented.

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イネの環境ストレス応答機構は、未解明の部分が多く残されている。我々は、マイクロアレイ解析によりイネの環境ストレス応答性遺伝子を数多く見出した。本研究ではそれらの内、乾燥ストレスによって発現量が著しく減少し、シロイヌナズナのPhytochrome Interacting Factor (PIF)と高い相同性を示すbHLH型転写因子であるOsPIF1の機能解析をおこなっている。これまでに、OsPIF1遺伝子の非ストレス条件下での明期における発現上昇が乾燥ストレス処理によって消失すること、OsPIF1過剰発現イネでは節間伸長が促進されること、逆にリプレッションドメインを利用したOsPIF1機能欠損イネでは節間伸長が抑制されることなどを示した。これらの結果はOsPIF1が乾燥ストレス応答においてイネの節間伸長を制御している重要な因子である可能性を示唆している。最近、トランジェント発現実験によりOsPIF1は転写活性因子であること、GFP融合タンパク質を用いた解析により核に局在することを示した。さらに、GUS遺伝子を用いた発現解析の結果、OsPIF1の節における強い発現が認められた。形質転換イネを用いたマイクロアレイ解析とトランジェント発現実験により、OsPIF1の標的遺伝子の候補の一つとしてエチレン生合成系の遺伝子が見出された。この遺伝子の節における発現は乾燥ストレスによって著しく減少した。現在、OsPIF1の標的遺伝子の同定を試みている。

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植物ホルモンであるアブシジン酸（ABA）は、青色光による気孔開口を阻害することにより気孔閉鎖を促進し、植物体からの水分の損失を防ぐ。しかしながら、ABAが気孔開口を阻害する分子機構についてはよくわかっていない。本発表では、ABAのセカンドメッセンジャーとして知られる一酸化窒素（NO）による気孔開口阻害について報告する。ソラマメ表皮および孔辺細胞プロトプラストをNO発生剤であるニトロプルシドナトリウム（SNP）で処理すると、青色光に依存した気孔開口が阻害され、気孔開口の駆動力を形成するH⁺放出も阻害された。これらSNPによる青色光反応の阻害は、NOスカベンジャーであるCarboxy-PTIO（c-PTIO）により回復された。また、c-PTIOはABAによる青色光に依存した気孔開口およびH⁺放出の阻害も部分的に回復させた。さらに、SNPは細胞膜H⁺-ATPaseの活性化に必要なこの酵素のリン酸化および14-3-3タンパク質の結合を阻害した。しかしながら、SNPは青色光受容体であるフォトトロピンの自己リン酸化にはほとんど影響を与えなかった。以上の結果から、ABAはNOを介し、フォトトロピンからH⁺-ATPaseに至るシグナル伝達系を阻害することで気孔開口を阻害することが示唆される。

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我々は水耕栽培レッドリーフレタスの品質を向上するため，夜間補光に用いる光質が葉のフラボノイド類の含量および生合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響を調べている。フラボノイド類に所属するアントシアニン類とフラボノール類は同じ基質から生合成されることが知られている。レッドリーフレタスを栽培する際に夜間補光（青色光+UV-B）を行うと，未成熟葉におけるアントシアニン類のシアニジン含量とフラボノール類のケルセチン含量が増加することをすでに明らかにしている。そこで，フラボノール生合成酵素（FLS）の遺伝子発現解析のため，対照を夜間無補光として， UV-B，青色，赤色を夜間に照射した。FLSの発現量は赤色光下で減少し，UV-Bと青色光下で増加した。さらに，UV-Bと青色光を併用照射すると，単独照射と比べてFLSの発現量は増加することが明らかとなった。以上より，未成熟葉のフラボノールの生合成はUV-Bと青色光によって促進され，赤色光によって抑制されることが示された。本研究は平成18年度井上円了記念研究助成を得て行った。

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明期中の総光量の1 %以下の微弱な赤色光を暗期開始直後に，または微弱な青色光を暗期終了直前にホウレンソウに照射すると，バイオマスが20 %以上増加した（羽生・庄子，2000）。これは少ない消費電力で植物生産を向上させる画期的な光制御技術であるが，その機構は不明である。我々は，このバイオマス増加は葉の展開促進によるものと推測し，光刺激が葉の展開に及ぼす影響について調査した。栽培期間を通じた暗期開始直後の赤色光刺激または暗期終了直前の青色光刺激によって,バイオマスの増加とともに，葉面積の拡大が観察された。光学顕微鏡で葉の断面を観察すると，暗期開始直後の赤色光刺激によって細胞サイズが増加した。他方，暗期終了直前の青色光刺激では細胞のサイズは変化しなかった。以上から，暗期開始直後の赤色光刺激は葉の細胞サイズを増加させること，また暗期終了直前の青色光刺激は細胞数を増加させることによって，葉の展開を促進することが示唆された。また，暗期終了直前の青色光刺激によって葉厚が増加した。現在，光刺激が柵状組織および海綿状組織の厚さおよび層数に及ぼす影響について解析を行うとともに，シロイヌナズナの光受容体欠損株を用いた解析も行っている。

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植物は、過剰な光エネルギーを吸収した際、チラコイド膜内外に形成されるΔpHにより誘導される熱放散機構によって光化学系を保護している。この機構はクロロフィル蛍光の非光化学的消光(NPQ)の最も速い成分であり、qEクエンチングと呼ばれる。従来詳しく研究されてきた高等植物では、この反応にはビオラキサンチンの脱エポキシ化によってできるゼアキサンチン(キサントフィルサイクル)の関与が知られている。しかし、そもそも緑藻クラミドモナスではqEクエンチングが小さいほか、高等植物でqEクエンチングに必須なPsbSがほとんど発現していないため、qEクエンチング生成機構は種によって異なる可能性が考えられる。そこで本研究では、クラミドモナスにおけるゼアキサンチンが蓄積しないVDE(violaxanthin de-epoxidase)欠損株npq1 lor1を用いて、PAM蛍光測定とHPLCによる解析を行った。その結果、npq1 lor1においても、明暗サイクル条件下野生型と同程度のqEクエンチングが見られた。更に、強光条件下野生型で見られるqEクエンチング成分増大も観察された。これらのことから、クラミドモナスで見られる小さなqEクエンチングは、高等植物と異なりキサントフィルサイクル非依存的であることが示唆される。

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以前の研究で、アズキ懸濁細胞は培地中マンノース（Man）を炭素源として利用できないが、順応したカルス細胞はManをショ糖（Suc）に変換しMan培地で生育することを報告した（Kato and Inouhe 2005）。本研究では、明暗条件下で育成したアズキ芽生えの細胞成長と細胞内糖組成に対するManの影響を調べた。
MS塩類を含む寒天培地（対照）とそれに90mMの Suc又はManを添加した寒天培地へ滅菌した種子を蒔いた。明暗所で7日間植物体を生育させ、地上部、根、子葉の重量と長さを測定し、各器官の細胞壁量と細胞内可溶性糖の分析を行った。その結果、明所と暗所の両方で、Manは根を阻害することがわかった。摩砕した組織の細胞壁分析により、Manは根の細胞壁増加を強く阻害していた。Manは対照に較べ、根の可溶性画分のSucと単糖（Glc,Fru）濃度を2.5～4.5倍増加させたが、Suc処理による各糖の増加（4.1～22倍）には及ばなかった。地上部も根と同様、Manによる細胞壁合成と成長の阻害が見られた。子葉の可溶性糖の分析から76.6～91.3%がSucであり転流糖としての働きが示唆された。
以上の結果から、Manは植物体の細胞壁合成と成長を阻害することがわかった。また、培養細胞と植物体の細胞ではMan代謝の様式が違うことも示された。

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細胞壁パープルホスファターゼ(purple acid phosphatase)は、プロティンホスファターゼを含むメタロホスフォエステラーゼファミリーのメンバーであり、その機能はまだ明らかにされていない。パープルホスファターゼを構成発現する形質転換タバコ細胞は、細胞分裂速度が速まり、倍化時間が半減した。また、細胞は凝集した形態を示した。形質転換体と野生株を比較したホスホプロテーム解析により、糖鎖分解酵素であるα-キシロシダーゼおよびβ-キシロシダーゼ（β-グルコシダーゼ）がパープルホスファターゼの基質と推察された。形質転換体と野生株を比較したところ、グリカナーゼ活性に大差は無いにもかかわらず、グリコシダーゼ活性は形質転換体の方が野生型より低かった。従って、形質転換体ではα-キシロシダーゼとβ-キシロシダーゼ（β-グルコシダーゼ）に対する基質が多く蓄積し、それが形質転換体の特質を示す可能性が考えられた。そこで、細胞にキシログルカンオリゴ糖あるいはキシロビオースを与えたところ、前者の場合、細胞の表現型が形質転換体と一致した。一方、後者の場合は細胞の形に変化は見られず、逆に増殖速度は抑制された。以上の結果から、パープルホスファターゼの基質はα-キシロシダーゼであると結論した。

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前演題では細胞壁パープルホスファターゼの基質α-キシロシダーゼが脱リン酸化されることにより、キシロシダーゼ活性が抑制されるとともに、細胞分裂速度が速まることが示された。α-キシロシダーゼが不活性化されると、キシログルカンオリゴ糖量が増加することが推察される。本演題ではキシログルカンオリゴ糖による細胞の増殖促進効果について検討したので報告する。
蛍光標識されたキシログルカンオリゴ糖(XXXG)をMS培地に添加し、それらが取り込まれる部位と細胞の肥大効果を観察した。細胞分裂初期においてXXXGは細胞の中央部（細胞板が形成される位置）の細胞壁にバンド状に取り込まれた。細胞分裂後期から終期においてXXXGは細胞板に特異的に取り込まれた。間期では細胞の伸長方向と垂直な方向に繊維状に壁に取り込まれた。一方、キシログルカンは、細胞周期に関わらず常に細胞壁全体に均一に取り込まれた。また、XXXGによる細胞の肥大効果については、細胞板が形成される分裂後期から終期、また、間期において、長軸方向と垂直な方向、長軸方向ともに約3倍の肥大促進効果が観察された。
従って、パープルホスファターゼは、キシログカンオリゴ糖を蓄積させて、細胞の増殖速度をコントロールしていることが推察された。

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パープルホスファターゼ(NtPAP12)を構成発現するタバコ細胞の研究から、パープルホスファターゼは細胞の増殖速度を促進すると考えられた。本研究はタバコ培養細胞で示されたホスファターゼの機能をシロイヌナズナで検証することを目的に行った。
NtPAP12を構成発現するシロイヌナズナ、NtPAP12と最も相同性の高いAtPAP10 にTタグが挿入された遺伝子破壊株を用いて、これらの表現型を野生型と比較した。AtPAP10 のプロモーターGUS発現株の結果から、AtPAP10は分裂組織で発現し、葉や根では主として維管束で発現した。ロゼット葉表皮細胞のサイズが形質転換体は野生型に比べて約0.3倍に小さくなったが、遺伝子破壊株では差が認められなかった。表皮細胞の数について、形質転換体では約1.5倍に増加したのに対し、遺伝子破壊株では約0.7倍に減少した。これらのことから、ホスファターゼの構成発現は、シロイヌナズナにおいても細胞の増殖速度を促進し、その結果、葉の細胞サイズが小さくなると推察した。

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キシランは二次細胞壁の主要なヘミセルロースで、キシロースがβ-1,4で直鎖状に結合した主鎖をもつ。このキシラン主鎖を分解する大麦エンドβ-1,4-キシラナーゼ（HvXYLI）を構成的に発現させる形質転換体ポプラを作出した。木部ヘミセルロース画分のメチル化分析の結果から、4-結合由来のキシロース残基が野性型の5分の1程度にまで減少しており、キシランの量が減っていることが示された。概観した表現型の変化としては葉面積が若干大きくなり、成長も僅かながら大きかった。あて材を誘導させるために水平にして育成したところ、最終的には野性型と同様な角度にまで起きあがったが、屈曲初期に茎のより低い部分から立ち上がるので、木部形成初期の組織が野性型よりも柔軟であることが示された。木部におけるリグニンの量が野性型に比べて減少しており、また二次木部形成初期における維管束間の木化が野性型よりも遅れることが蛍光顕微鏡の観察で示された。リグニンはキシランをターゲットに堆積が開始すると考えられており、キシランの減少によってリグニンの堆積がスムーズに行われないことが野性型よりも柔軟な屈曲を示した原因であると考えられる。

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キシログルカンを特異的に分解するキシログルカナーゼをポプラで構成発現させることにより、ポプラの成長が活性化された。すなわち、節間の伸長が促進され、バイオマス量が野生株に比べて2～3倍増加した。細胞壁のゆるみに伴うシンク機能の活性化は、バイオマス量の増加をもたらした。このことは、樹幹の成長が、根を通じた無機養分、および葉を通じた炭素の吸収をともに活性化することを示したものである。特に形質転換体では、葉の形態が変化した。すなわち、暗い光の下で培養しているにもかかわらず、陽葉様の形態を示した。本研究では、ソース機能に及ぼすシンク機能の作用について報告する。
形質転換体の葉は、野生株に比べて気孔の閉鎖速度が遅く、また光合成能が高いことが示された。しかしながら、葉を除いた形質転換体に野生株を接ぎ木しても、バイオマス量の増加が認められた。従って、葉の形態変化に伴う炭素固定能増大効果よりも、樹幹における壁のゆるみが成長を促進していることが示された。

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