植物のFtsHプロテアーゼは葉緑体のチラコイド膜に局在し、異常タンパク質や代謝回転の速いタンパク質の分解を行っている。FtsHプロテアーゼが欠損した植物は、斑入りの表現型を示すことより、葉緑体の形成と維持に重要な働きをしていると考えられている。この過程を詳細に解明するためには、本酵素の基質特異性や他のタンパク質との親和性を解明する必要がある。私たちは、本酵素の発現系を構築して生化学的性質を解析することで、この問題の解明を目指している。大腸菌を宿主とした発現ベクターに本酵素を導入したところ、インクルージョンボディーが回収された。これを尿素で変性してリフォールドすることでATPase活性をもつ酵素が得られた。プロテアーゼ活性に関しては、想定できる条件のほぼ全てを検討してみたが、現段階では検出されていない。本研究では、ATPaseおよびプロテアーゼ以外の性質について解析を行った。本酵素は光化学系IIのD1タンパク質の分解を行っていることから、プロテアーゼドメインとD1タンパク質の一部が結合する時の熱力学的パラメーターをコンピューターシミュレーションにより算出した。またFtsHプロテアーゼは基質タンパク質の立体構造をエネルギー依存的にアンフォールドすることが知られていることより、本酵素のアンフォールダーゼ活性についてウシ血清アルブミンを用いて解析した。

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Skp1はCullin1，F-boxタンパク質，RBX1とSCF複合体を構成し，タンパク質のユビキチン化を触媒する．シロイヌナズナSkp1-like (ASK)は21個存在するが，ASK20は2つの翻訳産物ASK20A及びASK20Bをコードし， C末端側に機能未知の領域を持つ．本研究ではASK20の機能を知るための基礎となる解析を行った．ASK20A及びASK20BのmRNAはRT-PCRにより解析した全ての器官で検出され，ASK20 promoter:GUS植物でも根，茎，葉，花，種子でGUS活性が認められた．ASK20 promoter:ASK20B-GUS形質転換植物ではASK20 promoter:GUSと同様のGUS活性様式を示したが，ASK20 promoter:ASK20A-GUS形質転換植物ではASK20 promoter:GUSで認められた根の維管束，子葉，がく片，雄蕊でのGUS活性が消失していた．酵母2-hybrid法によりASK20A及びASK20Bは幾つかのF-boxタンパク質とは相互作用するが，CUL1とは相互作用しないことが示された．
本研究は独立行政法人，農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター（生研センター）による補助のもとに行われた．

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SUMOは、代表的なユビキチン様タンパク質であり、ユビキチンと類似した反応経路によって標的タンパク質に共有結合する。しかし、ユビキチン修飾の場合と異なり、SUMOによって翻訳後修飾された標的タンパク質は、分解されることなく安定化や、活性、局在の変換を受ける。シロイヌナズナにはゲノム上に8つのSUMO遺伝子が存在するが、ESTが報告されているのはAt SUMO1, 2, 3, 5の4つのみである。AtSUMO1, 2及びAtSUMO3については、ストレス応答性に違いがみられることから、それぞれのSUMO分子に機能的分担があることが示唆されている。本研究では、SUMO分子の機能分担についてより詳細な情報を得るために、各SUMO遺伝子の発現パターンを解析している。各組織においてRT-PCRを行った結果、AtSUMO1, 2については恒常的な発現が確認されたのに対し、AtSUMO3, 5においては組織特異性が観察された。また、根においてAtSUMO4の発現を確認できた。現在、GUSレポーター遺伝子を用いてより詳細な発現解析を進めている。さらに、SUMO化経路のE1酵素は、ユビキチン経路と異なりヘテロ二量体から構成されているが、シロイヌナズナにおいてはE1酵素に2つのアイソフォーム(AtSAE1a, b)が存在するため、これらについても発現解析を行い機能分担があるのかどうか検討している。

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シロイヌナズナの緑葉から単離した液胞のプロテオーム解析から，液胞にAt3g14210タンパク質が大量に蓄積していることがわかった．ここでは，At3g14210タンパク質をVML (Vacuolar Major Lipase)と呼ぶ． VMLはGDSL Lipaseモチーフを持っている．シロイヌナズナにはこのモチーフを持つタンパク質が100以上あるが，多くは機能が未知のままである．VMLの機能解明のためのツールとして，特異抗体を作製した．緑葉破砕物を遠心分画すると，VMLは液胞膜やマイクロソームと同じ画分に回収された．しかし，この画分をさらにショ糖密度勾配で遠心分画すると，VMLは，小胞体，ゴルジ体，液胞膜などに局在するマーカータンパク質とは異なる画分に濃縮された．架橋剤を用いた実験では，イムノブロットで高分子量へのバンドシフトがみられたことから，VMLは複合体として存在することが示唆された．免疫蛍光抗体法では液胞内部にドット状のシグナルが検出されたことから，VMLが液胞内腔で複合体を形成していることが明らかになった．VMLの生理学的な機能を明らかにする目的でT-DNA挿入による欠損変異体を確立した．VML欠損変異体の表現形の解析結果についても併せて報告する．

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COP9シグナロソーム（CSN）は、8つのサブユニットから成る核内タンパク質複合体である。CSNは生物の発生と分化に不可欠で、その機能不全個体は動植物で致死になる。また、CSNにはE3ユビキチンリガーゼ活性を調節する脱Rub活性があり、タンパク質の分解を調節する。
そこでCSNの分子機構を解析するため、CSN1サブユニットに着目して研究を進めた結果、そのN末端部位（CSN1N）がヒトのJNK1/SAPK情報伝達経路の信号を抑制することが判明した。この抑制がタンパク分解系を介さない新規の制御であることがわかったので、CSN1Nに直接結合する因子（NBP）群を動物培養細胞より単離した。NBPとして、SAP130、DDX15/hPrp43/mDEAH9、CFIm68など、それぞれRNAの転写、スプライシング、ポリA付加に関わる因子が同定され、CSNのmRNA代謝制御に関わる新規機能を強く示唆した。
次に遺伝学的・逆遺伝学的手法が確立しているシロイヌナズナに実験系を移し解析を進め、植物のNBP相同遺伝子を同定した。さらに、植物のNBPとCSNとが特異的に相互作用することが判明したので、その機能解析を個体レベルで行なっている。現在、植物に固有なNBPを同定し動植物におけるCSN機能の異同の解析を進めている。

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シグナルペプチドペプチダーゼ（SPP）は複数膜貫通型のアスパラギン酸プロテアーゼで、アルツハイマー病に関連するプレセニリンのホモログとして2002年に本体が単離された。SPPは膜内に2箇所の活性部位(YDおよびGXGD)を持ち、シグナルペプチダーゼにより切断された後のシグナルペプチドを基質とする。ヒトでは免疫応答に関与し、自己の細胞が健全であることを細胞外に提示するシグナル分子を生産する機能を担っている。植物にも推定一次構造からSPPの存在が確認されているがその発現や機能は全く解明されていなかった。
シロイヌナズナ・データベースを検索した結果、シロイヌナズナのSPP(AtSPP)に相同性を持つホモログが5種存在した。吸水種子における発現をin situハイブリダイゼーションにより検討すると、いずれの分子も幼根の表皮の一部と、シュートメリステムに発現していた。一方、花芽を持った茎頂においてはAtSPPが茎頂分裂組織(SAM)全体に発現していたのに対し、ホモログはSAMには発現しておらず、維管束を形成する髄状領域の下部で、細胞分裂の盛んな組織に発現していた。また、GFPとの融合タンパク質をシロイヌナズナ培養細胞(‘Deep’cells)に発現させたところ、AtSPPがヒトSPPと同様に小胞体膜であるのに対し、ホモログはエンドソームに局在していた。このような発現部位の特徴からAtSPPとそのホモログは生体内で異なる機能を有すると推定された。

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新種の緑藻，Chlamydomonas sp.W80株は耐塩性，カドミウム耐性を示すことから既存のChlamydomonas類とは大きく異なっている．これまで，抗酸化能やストレス耐性の機構について研究されてきたが，それ以外の性質については余り報告されていない．数種の蛍光ペプチドを用いてW80株とC. reinhardtiiのプロテアーゼ活性を比較したところ，基質によって活性量および至適pHに大きな違いが見られた．本研究ではpH 8に至適pHをもつトリプシン様活性の基質となるBoc-L-R-R-MCAを選択し，W80株のプロテアーゼ(以下W80CPと略)の精製と性質の決定を行ったので報告する．W80CPは細胞より疎水性，陰イオン交換，ゲルろ過クロマトグラフィーを用いた5段階の精製により，3,061倍精製され，収率は2.6%であった．この酵素はシステインプロテアーゼの阻害剤であるleupeptinなどにより阻害がみられたが，PMSFやEDTAで阻害が見られず，また，金属による活性上昇も見られなかった．これらの結果よりこの酵素はシステインプロテアーゼであると判定した．K_mは上記基質に対して44.4 μM，ゲルろ過法による分子量は102 kと求められた．また，SDS-電気泳動による結果から，この酵素は2量体であると考えられる．今後はアミノ酸配列の決定，遺伝子のクローニングを行う予定である．

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アロゲン酸デヒドラターゼ（ADT）は植物におけるフェニルアラニン（Phe）生合成の最終段階を触媒する酵素である。我々はイネ変異体、MTR1株の5-メチルトリプトファン抵抗性及びフェニルアラニン過剰蓄積表現の原因遺伝子として、バクテリアのプレフェン酸デヒドラターゼ相同遺伝子（OsPDTH）を見いだし、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系を用いた機能解析により、OsPDTHがADT活性を有することを明らかにした。これは植物のADTを同定した初めての例である。エンドウ単離葉緑体を用いた葉緑体移行試験から、OsPDTHは葉緑体移行し成熟型にプロセスされるタンパク質であることが示された。カイネティクス解析により、成熟OsPDTHはアロゲン酸に対しプレフェン酸と比較して10倍以上の基質親和性を示した。さらにOsPDTHはPheによるフィードバック制御を受けており、MTR1株由来の変異型酵素ではフィードバック阻害の感受性が約9倍低下していることが判明した。さらに様々なアミノ酸およびそのアナログに対する感受性試験から、同変異はフェニルアラニンおよびその類縁体に対する感受性に対し特異的に影響を及ぼしており、チロシンおよびメチオニンによる酵素活性の増大には影響がないことが明らかになった。以上の結果から、ADTは遊離Phe濃度を制御しており、変異株MTR1におけるPhe過剰蓄積は、Pheによるフィードバック調節が十分に機能していないことに起因するものと結論づけた。

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活性酸素は生成部位で速やかに消去されなければ細胞に障害をもたらすことから、3種の SOD 以外にも細胞内局在性の異なるいくつかのタンパク質がその消去に関与している可能性が考えられる。コケ植物 Pogonatum inflexum の抽出液を用い、7.5% Native-PAGE 後、SOD 活性染色をおこなったところ、通常の3種の SOD アイサザイムとは異なり、ゲルの先端部位に SOD の活性バンドを見いだした。新規な SOD 様タンパク質であることが示唆されたので本タンパク質の分子的性質について検討した。
ゲルから切り出し、部分精製したタンパク質(SOD-like A)はSDS-PAGE でほぼ均一であり、サブユニット質量は約15 KDaであった。また、P. inflexum は13% Native-PAGEで SOD-like A よりも移動度の大きいマイナーな SOD-like B も含むことが示された。SOD-like A および B はシアンと過酸化水素によって阻害されることから、CuZn-SOD と同様、銅原子を持つことが示唆されたが、一方、免疫ブロッティングにより両者は典型的な葉緑体型または細胞質型 CuZn-SOD とは異なっていた。ファーガソンプロット法により算出した SOD-like A および B の分子質量はそれぞれ40 KDa および10 KDa であった。したがって、SOD-like A はホモ二量体であることが示されたが、通常の植物 CuZn-SOD の分子質量 32 kDd よりは幾分大きかった。これらの結果から、P. inflexum は新しいタイプのSOD を含んでいると考えられる。

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デンプン枝切り酵素（SDBE）はアミロペクチン分子構築に重要な酵素であり、3種類のイソアミラーゼ（ISA）と1種類のプルラナーゼ（PUL）が存在する。イネ胚乳ではISA1-ISA2複合体とISA1ホモ複合体が共存することを昨年本学会で報告した。本研究ではSDBEのアミロペクチン合成寄与について報告する。研究方法としてイネ胚乳特異的プロモーターを用いたRNAi法によりISA発現を抑制した。ホストとして野生株（金南風）とPUL変異体（PUL遺伝子のエクソン10にトランスポゾンが挿入）を使用した。ISA1を抑制した結果、ISA活性がほぼ完全に失われ、sugary-1変異体（ISA1変異体）と同様、フィトグリコーゲンの蓄積を観察した。ISA2を抑制した結果ISA1-ISA2へテロ複合体が喪失、ISA1ホモ複合体活性のみが観察されたがそのデンプンは野生株のものと変化なかった。ISA1またはISA2の欠失によりフィトグリコーゲンを蓄積するアラビドプシスやジャガイモの結果とイネ胚乳とは異なることが分かった。イネ胚乳においてISA1ホモ複合体はISA1-ISA2ヘテロ複合体とプルラナーゼの機能の大部分を補うことができると考えられた。

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先に精製したトウモロコシアセチルコリンエステラーゼ(maize AChE)は42-44kDaのポリペプチドからなる88kDaの二量体であった．完全長cDNAは，1471bpからなり397残基のタンパク質をコードしていた．maize AChE遺伝子(maize AChE)と相同性を有する遺伝子は，植物界に広く発現しており，とくに単子葉植物において高い(92-64%)相同性が認められた．それに対し双子葉植物での相同性は相対的に低かった(57-53%)．このことから，双子葉植物におけるAChEの構造および特性が単子葉植物のAChEとは異なっていることが推測された．本報では，高いAChE活性を有するマメ科植物サイラトロから，AChEを精製し，そのcDNA配列を同定した．サイラトロAChE(siratro AChE)は，41-42kDaのポリペプチドからなる125kDaの三量体であった．完全長cDNAは，1441bpからなり384残基のタンパク質をコードしていた．また，ダイズにおいて90％の高い相同性遺伝子が認められたが，maize AChEとの相同性は45％と低かった．これらのことから，siratro AChEとmaize AChEでは，一次構造およびサブユニット構造に差異が認められた．一方，siratro AChEとmaize AChEにおける酵素特性の比較ではほとんど差異がなかった．

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大気中に放出される塩化メチル(CH₃Cl)の最大の発生源が植物であることが明らかにされている．最近，シロイヌナズナから塩化メチル合成酵素遺伝子(HARMLESS TO OZONE LAYER, HOL)が同定された．この酵素は，ハロゲン化物イオン(Cl^-, Br^-, I^-)や, それらに化学的性質の近いイオン(NCS^-, HS^-等)のメチル化を触媒していることが考えられるが，生理学的役割については未解明である．
HOL遺伝子の機能を明らかにするため，シロイヌナズナHOL遺伝子(AtHOL1)および相同遺伝子AtHOL2, AtHOL3について融合タンパク質を作成し，酵素化学的解析を行なった．その結果，各HOLタンパク質はS-adenosylmethionine依存的にCl^-, Br^-, I^-, NCS^-, HS^-をメチル化する活性を持ち， AtHOL1およびAtHOL2は，特にNCS^-に対する活性が高いことを明らかにした．さらに，シロイヌナズナのT-DNA挿入変異株（hol1, hol2, hol3）を用いて，これらの基質が生育に与える影響を解析した．その結果，培地に添加したKSCN (1 mM)に対してhol1変異体のみに生育阻害がみられた．また，NCS^-のメチル化産物であるCH₃SCNが，シロイヌナズナ野生株の傷処理により合成され，hol1変異体においてはその合成がほぼ消失したことを示した．NCS^-は傷害によるグルコシノレイト分解によって生成され，CH₃SCNは昆虫忌避作用や抗菌作用を有することが知られている．従って，AtHOL1がグルコシノレイト代謝や傷害応答に関与する可能性も示唆される．

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ジグリコシダーゼは二糖配糖体を二糖とアグリコンに加水分解する酵素である。ジグリコシダーゼはグリコシダーゼファミリー 1 に属しており、植物のモノグルコシダーゼである β-グルコシダーゼもこのファミリー1 に分類される。植物の β-グルコシダーゼは単糖配糖体を加水分解し、生体防御など様々な生理活性を持つアグリコンを放出する。グルコースの六位水酸基にさらに単糖が結合した二糖配糖体も多くの植物から報告されており、ジグリコシダーゼも植物界に広く分布していると考えられる。ジグリコシダーゼは β-グルコシダーゼと 50 % 以上の高い相同性を示すことから、β-グルコシダーゼから進化したと考えられる。その進化過程において、酵素のどのような構造変化が二糖特異性の獲得につながったのかを X 線結晶構造解析によって明らかにした。ジグリコシダーゼの一種である β-プリメベロシダーゼ (チャ樹由来) に基質アナログ阻害剤が結合した結晶を調整し 1.8 Å の分解能で構造解析した。その結果、活性残基とグルコース認識残基の構造は β-グルコシダーゼのものと完全に一致した。一方、 β-プリメベロシダーゼには二糖に水素結合するための特別な二つのアミノ酸 (Ser473、Gln477) が存在した。ジグリコシダーゼは基質結合部位の僅かな構造の変化によって二糖配糖体に対する加水分解活性を獲得したと考えられる。

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植物はリン酸欠乏時、生体膜中のリン脂質を糖脂質に転換し、貧栄養条件に適応する。当研究室の最近の結果から、この適応機構に植物ホルモンオーキシンが関与することが明らかとなった。オーキシンシグナルは、オーキシン応答性遺伝子の転写に関わる転写因子AUXIN RESPONSE FACTOR（ARF）に抑制的に働くIAAタンパク質がユビキチンプロテアソーム系により分解されることで活性化される。本研究では、IAAタンパク質のgain-of-functionの変異体であるslr/iaa14と、SLRとの相互作用が報告されているARF7、ARF19の二重変異体（arf7arf19）を用いて、リン酸欠乏時における糖脂質の蓄積に対する影響を調べ、これらの変異体においてdigalactosyldiacylglycerol（DGDG）蓄積が抑制されることがわかった。すなわち、野生型のシロイヌナズナのshootでは、充分なリン酸存在下では全脂質に占めるDGDGの割合は20%程度であるが、リン酸欠乏時には35%程度にまで増加する。このDGDGの含量がslrにおいては25%程度、arf7arf19においては30%程度に抑えられるという結果を得た。また、これらの変異体の根においても、同様にDGDG蓄積が抑制された。この結果は、これらのタンパク質がリン酸欠乏時の糖脂質の蓄積に関与することを示している。

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Phosphatidate (PA) phosphatase (PAP) はグリセロ脂質合成が共通してもつKennedy pathwayの最終生成物であるphosphatidic acid (PA) を脱リン酸化しdiacylglycerol (DAG) を生成する酵素であり、脂質の代謝において重要な役割を果たしている。シロイヌナズナに哺乳類の膜局在型PAPのホモログが存在することはすでに報告されているが、脂質代謝に関与し、葉緑体や細胞質などに局在すると考えられているPAPについてはまだ単離されていない。
そこで我々は哺乳類の膜局在型PAPとは異なった新しいタイプのPAPをラン藻でみつけ、そのホモログをシロイヌナズナで5つ同定した。解析の結果、これらのうちの3つが葉緑体に存在するPAPであることが明らかとなった。一方、最近Yeastで可溶性のPAPが単離され、そのホモログがシロイヌナズナに2つ存在することもわかった。従って、シロイヌナズナには、これまで知られていたPAPの他に少なくとも二種類の新規PAPファミリーが存在することが考えられる。本発表では、これら2つの新規PAPについて、単離と機能解析の結果を報告する。

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スフィンゴシン1－リン酸（SPH1P）は、動物細胞において細胞内および細胞間シグナル伝達物質として働くことが知られている。一方、植物においてもSPH1Pやフィトスフィンゴシン1－リン酸（PHS1P）が、気孔の閉鎖に関与するアブシジン酸シグナル伝達分子として働くことが最近明らかになりつつある。しかし、SPH1PやPHS1P、あるいはジヒドロスフィンゴシン1－リン酸（DHS1P）も含めたスフィンゴイド長鎖塩基1－リン酸（以下、長鎖塩基1－リン酸と略す）の合成、分解系に関与する代謝経路の分子基盤に関する研究はほとんどない。スフィンゴイド長鎖塩基1-リン酸リアーゼは、長鎖塩基1－リン酸をC16アルデヒドとホスホエタノールアミンに分解する。本発表では、シロイヌナズナのこの遺伝子AtSPL1が破壊された突然変異株(spl1)が、乾燥ストレスに対して耐性を示すことを報告する。また、Dspl1のグリセロ脂質組成を解析した結果、ホスファチジルエタノールアミンの含量が野生株と比較して有意に減少していた。この結果は、長鎖塩基1－リン酸の合成や分解の調節機構がグリセロリン脂質代謝系にも影響することを示唆する。さらに本発表では、シロイヌナズナのスフィンゴイド長鎖塩基1-リン酸ホスファターゼ遺伝子AtSPP1が破壊された突然変異株(spp1)についてもあわせて報告する予定である。

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細胞膜や液胞膜には、グルコシルセラミド（GlcCer）と呼ばれるスフィンゴ糖脂質が膜脂質の主成分として存在する。GlcCerはグルコシルセラミド合成酵素（GCS）によって合成されるが、植物においてこの遺伝子はワタから単離されたという報告しかなく、シロイヌナズナにおいてGlcCer合成に関する酵素遺伝子は確認されていない。そこで我々はまず、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeがGlcCerを有しないことを利用し、ワタのGCS遺伝子のオーソログと思われるシロイヌナズナのcDNAをS. cerevisiaeに導入し、この形質転換株がGlcCerを合成するか調べたがGlcCerを検出できなかった。この結果は、S. cerevisiaeがGlcCer 合成の代謝系を有していないことを反映することが考えられるので、次に、GlcCerを有する酵母Kluyveromyces lactis (ade2、his3、leu1)を用いて、K. lactis のGCS遺伝子非翻訳領域とS. cerevisiaeのHis3遺伝子による遺伝子倒置置換法によって、GlcCerが合成できないGCS遺伝子欠損株（GCS:: His3）を得た。本発表では、この欠損株を用いて、シロイヌナズナのGCSと思われる遺伝子のスクリーニングの結果を報告する予定である。

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花色の主成分であるアントシアニンのうち、アントシアニジン3-グルコシドにいたる生合成経路は殆どの高等植物で共通で、アントシアニジン3-糖転移酵素（A3GT）が糖転移を触媒する。その後、他の糖転移酵素により5位などに糖が付加することが多い。しかし、バラでは、1種類の糖転移酵素（アントシアニジン5,3-糖転移酵素）によってアントシアニジンの5位にグルコースが転移したあと3位にグルコースが転移すると報告された(Ogata et al. 2005)。我々はバラのゲノムライブラリーから、A3GTと同じ糖転移酵素ファミリーに属する酵素（RhA3GT）遺伝子を取得した（同一性46-57％）。RhA3GTは、in vitroにおいてアントシアニジンの3位への糖転移活性を有していた。本遺伝子のバラ花弁における発現レベルはノザンでの検出限界以下であった。一方、バラのcDNAライブラリーから、同じファミリーに属し他のA3GTと42-44％程度の同一性を示す蛋白質（RhF3GT）をコードする遺伝子を得た。RhF3GTは、in vitroにおいてアントシアニジンではなくフラボノールに対する糖転移活性を示した。RhF3GT遺伝子の発現をRNAi法により抑制したバラ形質転換体の花弁ではアントシアニン含量が減少し、花色が白色または淡色に変化した。バラにおけるアントシアニジン配糖化機構について議論する。

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アントシアニンメチル基転移酵素（AMT）は、Sアデノシルメチオニンをメチル基供与体として、アントシアニンの3’位あるいは5’位などの水酸基にメチル基を転移する反応を触媒する。アントシアニンのメチル化は、アントシアニンひいては花色の多彩さに寄与している。ペチュニアから得られたAMT遺伝子（WO2003-062428）を用いてトレニア（マルビジングルコシドを主要アントシアニンとする）からAMT遺伝子（ThAMT）を取得した。大腸菌で発現したThAMTはデルフィニジングルコシドをペチュニジン、マルビジングルコシドへとメチル化する反応を触媒した。バラなどの花弁にはデルフィニジンは存在せず、メチル化アントシアニンもあまり存在しないことが色彩の単調さの一因となっている。バラで、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド3’,5’-水酸化酵素遺伝子とThAMTを発現させたところ、花色が変化し、主要なアントシアニンとしてマルビジングルコシドが生成した。また、ペチュニジン、ペオニジングルコシドも蓄積された。AMTが花色を多彩にする上で有用なツールであることが示された。バラなどの花の色彩が将来はもっと豊かになることが期待される。

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我々はチョウマメの青色花弁においてテルナチンC5からテルナチンC3の生合成を触媒する、1-O-アシルグルコース：アントシアニン3'-O-グルコシド-6'''-O-アシル基転移酵素（3'AT; CtAT1）を同定した。31-及び24-kDaのサブユニットからなるこの酵素は、セリンカルボキシペプチダーゼ様アシル基転移酵素で、三つの推定N-グリコシル化サイトをもつ。この酵素遺伝子であるCtAT1をバキュロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞Sf9で組換えタンパク質を発現させた。様々なテルナチン類を基質に用い、組換えCtAT1で酵素反応を行って得られた反応産物をLC/MSで分析した結果、CtAT1には3'AT活性だけでなく、アントシアニン5'-O-グルコシド-アシル基転移酵素（5'AT）、及びアントシアニン3'-O-(4-O-グルコシル-(6-O-p-クマロイル))グルコシド-アシル基転移酵素（3'AT2）活性があることが示された。このCtAT1の細胞内局在性を解析するためにGFPとの融合タンパク質を発現させるベクターを構築し、タバコBY-2細胞に形質転換した。CtAT1-GFP融合タンパク質を発現したBY-2細胞では、CtAT1は液胞内腔に局在することが示された。この結果より、CtAT1は液胞でポリアシル化アントシアニン生合成におけるアシル化反応を触媒することが示唆された。

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シロイヌナズナにおいて、フラボノイド生合成および表皮細胞分化の制御には、MYB転写因子、bHLH転写因子、更にはWD40タンパクであるTTG1が複合体を形成し関与していることが知られている。シングルMYBドメイン転写因子であるCPC, TRY, ETC1, ETC2, ETC3およびAtMYBL2は表皮細胞分化を制御することが報告されている。ところが、フラボノイド生合成に関与するシングルMYBドメイン転写因子の報告はこれまでにない。そこで、フラボノイド生合成に関与するシングルMYB転写因子を遺伝子サイレンシング手法であるCRES-Tを用いて探索した。その結果、35S:AtMYBL2SRDX植物体のT2種子が高頻度で黄褐色であった。また、ロゼット葉のアントシアニン量の顕著な減少も認められた。一方、過剰発現体35S:AtMYBL2においても35S:AtMYBL2SRDX形質転換植物体と同様の表現型が見られたこと、およびトランジェントアッセイからAtMYBL2はリプレッサーであることが示された。更に、AtMYBL2の転写抑制ドメインがC末領域にあることが判った。このドメインを欠損させた形質転換植物、並びにAtMYBL2 T-DNA タグラインでは、野生型植物に比較してフラボノイド生合成酵素の1つであるDFRの発現が顕著に上昇し、且つロゼット葉のアントシアニン量は増加していた。これら知見からAtMYBL2は転写抑制活性を有し、フラボノイド生合成を負に制御すると推察される。

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ムラサキ(Lithospermum erythrorhizon)はその根部でナフトキノン系二次代謝産物のシコニン誘導体を生産・蓄積している。シコニン生合成はメバロン酸経路由来のゲラニルジリン酸(GPP)とシキミ酸経路由来のp-ハイドロキシ安息香酸との縮合を経て行われるが、このGPPはトレーサー実験によりメバロン酸経路に由来すること、さらに生化学的解析から、ムラサキのGPP合成酵素は現在知られる高等植物の中で唯一、細胞質局在であることが証明されている。このGPP合成酵素の実体を解明すべく、EST情報を基に細胞質局在という観点からFPP合成酵素と相同性を示すものを候補遺伝子とし、RT-PCRにより全長cDNA(LeFPPS）を得た。Hisタグを利用して精製したLeFPPSはGPPとIPPを基質としてFPPを合成する活性を示したが、DMAPPを基質としたGPP及びFPP合成活性は検出できなかった。しかし、ノザン解析によりシコニンの蓄積と一致する発現パターンを示すことが明らかになり、LeFPPSはムラサキ細胞内ではGPP合成能を示すと推察された。この仮説の下、ムラサキ無細胞抽出液と精製LeFPPSを混合したところ、FPP合成活性が検出されなくなる一方、強いGPP合成活性が検出された。これらのことからLeFPPSがGPP合成酵素の触媒サブユニットとして機能している可能性が示唆された。

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ソバ・ダッタンソバのアントシアニン生理機能解析の第一歩として、19品種系統の幼植物を材料にアントシアニンを同定し、蓄積含量の品種系統間差を調査した。ソバのアントシアニン含量の変異は0.67 - 1.17mg / g.d.w.で、構造はシアニジンをアグリコンとする単糖もしくは2糖配糖体であった。ダッタンソバのアントシアニン含量の変異は0.29 - 0.60 mg / g.d.w. で、構造は配糖体にガラクトースを含まないことを除きソバ同様であった。一方で、アントシアニン含量の変異を拡大するためダッタンソバに突然変異処理を行いアントシアニン高蓄積変異体を作出した。変異体のアントシアニン組成は通常品種系統と同様であったが、アントシアニン含量は50.5 mg / g.d.w.と高かった。また、暗所においては今回調査した品種系統はアントシアニンを蓄積しなかったのに対し、変異体は27.7 mg / g.d.w. のアントシアニンを蓄積した。続いて、アントシアニンの組織局在を調べるため子葉・胚軸の切片を調製し顕微鏡観察したところ、ソバ、ダッタンソバともに子葉や胚軸の表面部分に局在していた。このことから、ソバ幼植物のアントシアニンは他の植物の報告同様にUVスクリーン等の機能を持つ可能性が考えられる。今後は、今回見いだしたアントシアニン含量の異なる品種系統を用いてソバ・ダッタンソバのアントシアニン生理機能を解析する予定である。

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ニチニチソウ(Catharanthus roseus )の培養細胞の増殖は、リン酸飢餓により停止し、長期のリン酸飢餓の後にもリン酸添加により細胞分裂が再開する。リン酸添加後最初におこる代謝反応を知るために、リン酸飢餓細胞に、³³Piを与え、その行方を追ったところ、³³Pの放射能は、ヌクレオチドに多く取り込まれ、それに続いて糖リン酸に取り込まれた。ヌクレオチド、RNA、タンパク質含量は、リン酸飢餓時に徐々に低下したが、リン酸添加後、これらの物質は増加した。特にヌクレオチド量は急激に増加し、HPLCで分析した結果、ATPなどのヌクレオシドトリリン酸とUDP‐グルコース量の増加が顕著であった。リン酸添加により、リン酸トランスポーター遺伝子の転写物レベルや、酸性ホスファターゼ、5’-ヌクレオチダーゼ、3’-ヌクレオチダーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼなどの分解酵素活性は著しく低下したが、アデニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸ホスフォリボシルトランスフェラーゼ、ニコチンアミダーゼなどのプリンやピリジンヌクレオチド合成のサルベージ酵素の活性は増加した。ニチニチソウ細胞のリン酸飢餓からの回復の初期段階に急激なヌクレオチドの合成が含まれることが強く示唆された。

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チャ（Camellia sinensis）はツバキ（Camellia japonica）と同じツバキ科に属する植物である。チャ葉にはカフェインが存在するが、ツバキには存在しない。本研究ではチャと同じツバキ科植物であるツバキがカフェインを蓄積しない理由を明らかにすることを目的としている。
カフェインはキサントシンを出発物質とし、プリン環のN-7、N-3、N-1位の順にメチル化が起こることによって生成する。カフェイン生合成系はこのメチル化反応で制御されている。まず最初に、我々がチャから単離したN-3位とN-1位のメチル化を行うカフェインシンターゼ遺伝子（TCS1）の相同遺伝子がヤブツバキのゲノムに存在することを確認した。そのうえで、このTCS相同遺伝子の発現の有無について調べた。ノーザンブロット解析では転写産物の存在は確認できなかったが、RT-PCRによりTCS相同遺伝子の転写産物が存在することが明らかになった。RACE法によってTCS相同遺伝子の単離を試みたところ、2種類のTCS相同遺伝子が発現していることがわかった。これらのTCS相同遺伝子がコードするタンパク質は、チャのカフェインシンターゼと約90％の相同性を示した。

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イネはゲノムサイズが比較的小さく（約390Mbp）単子葉植物のモデル植物としてゲノムの解読が終了した。また、完全長cDNA数万クローンが 単離され、我々は植物で高発現させるためのFox Hunting Systemを用い てライブラリーを作成し、シロイヌナズナを検定植物として有用遺伝子の単離を目的として研究を進めている。
野生型のシロイヌナズナの種子の色は褐色であり、プロアントシアニジンが蓄積している。また、シロイヌナズナで単離されている種子の色に変異が見られる突然変異体は、淡褐色または黄色（白色）の種子を形成し、アントシアニンの合成酵素、その転写制御因子、細胞内での輸送等に関与する遺伝子の変異によることが示されている。
今回我々が作成したFoxラインの中で可視的変異を示す植物の中に種子の色に変異を示す個体が検出された。一つのラインは白色の種子を形成し、もう一つのラインの種子は淡褐色を示した。これらのラインは、葉または茎に蓄積するアントシアニン量が野生型に比べて減少しており、また、種子のプロアントシアニジンの蓄積も減少していた。しかしながら、アントシアニン合成酵素等のmRNA量の顕著な減少は認められなかった。導入された遺伝子の解析とそのアントシアニン合成との関係について現在解析を行っている。

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花卉園芸植物ではアントシアニンが葉で恒常的に発現した‘銅葉’は好まれており活用されている．それらは多くは枝変り（自然突然変異）として得られているが，代表的な花壇用の園芸花卉であるペチュニアでは銅葉は知られていない．今回，我々はアントシアニンの転写因子に着目して解析を行った．紫イネの原因遺伝子として単離されたOSB2遺伝子はbHLH型の転写因子をコードしている．これをCaMV 35Sプロモーターにつなぎペチュニア品種‘パープルウェーブ’に導入したところ，一部の個体の葉縁部にのみアントシアニンの蓄積と思われる着色が見られた．また別のmyb型転写因子の遺伝子を導入した個体と交配したところ，葉や花にアントシアニンを多く蓄積するものが得られた．これらの結果について考察する．

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高等植物において、赤色の多くはアントシアニンにより発色されている。それに対し、ナデシコ科、ザクロソウ科を除くナデシコ目植物ではアントシアニンは合成されず、その赤色はベタシアニンによって発色されている。我々はナデシコ目植物のベタレイン生合成系について解析を行っており、今回、ベタシアニンの生合成酵素であるDOPA dioxygenase (DOD) に注目し、その遺伝子の単離と解析を行った。
ナデシコ目植物であるヨウシュヤマゴボウ (Phytolacca americana) の培養細胞から、RACE法によりDODのORFを含むcDNAを単離した (PaDOD)。これと既知のcDNAとの構造をアミノ酸レベルで比較したところ、ビート (Beta vulgaris) とは71%、マツバボタン (Portulaca grandiflora) とは68%の相同性が見られ、ベタレイン合成植物のみに共通して見られる保存配列が確認された。また、PaDODの発現パターンを半定量的RT-PCRで解析したところ、赤色培養細胞ではベタシアニン蓄積前に多く発現することが分かった。植物体においては、ベタシアニン蓄積の見られる紅葉や茎の表皮、赤く色づいた実だけでなく、緑色の葉や茎、花芽でも発現が見られた。これらの結果をもとに、ヨウシュヤマゴボウにおけるDODの機能についてさらなる解析を進めている。

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The preprophase band (PPB) of plants is a band of microtubules that underlies the plasma membrane in prophase cells. The PPB plays an important role in the determination of the site of division site of plant cells. Clathrin-coated vesicles (CCV) as well as structurally related non-coated vesicles (NCV) were frequently observed at the PPB. To understand the role of the vesicles and actin in PPB development, we have quantitatively analyzed the effects of cytochalasin D on the distribution and the morphology of these vesicles and of cytoskeletal structure in high-pressure frozen onion epidermal cells by electron tomography. The average size of the NCVs decreased by treatment with cytochalasin D, suggesting a role of actin in vesicle fusion. Cytochalasin D also affected MT organization in the PPB. In particular, the PPBs become wider, due to greater lateral separation of the MTs, and simultaneously the length of the average MT decreases.

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液胞は植物、酵母、カビなどにおける様々な代謝物のコンパートメントとして知られている。我々は出芽酵母液胞で塩基性アミノ酸輸送に関わるVBA遺伝子ファミリーの存在を明らかにしている。本研究では分裂酵母における液胞アミノ酸輸送に関わる遺伝子を検討した。分裂酵母細胞による糖（2−デオキシグルコース）とアミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン）取り込みに対する液胞H⁺‐ATPase阻害剤コンカナマイシンの影響を調べた。糖取り込みは影響されず、アミノ酸取り込みが約60%阻害が見られ、細胞のアミノ酸取り込みには液胞が主要な働きをしていることがわかった。出芽酵母VBAに近縁の分裂酵母遺伝子、fnx1に加えてfnx2を新たに見出した。これらはいずれも14回の膜貫通部分を有するトランスポーター遺伝子と推定される。Fnx1pとFnx2pのGFP融合遺伝子産物はいずれも液胞膜に局在することを確認した。Δfnx1変異株では親株と比較してリジン、イソロイシン、アスパラギンの取り込み活性が低下し、Δfnx2変異株ではリジン、イソロイシンの取り込み活性が低下していた。以上の結果は、fnx1、fnx2が分裂酵母液胞において、比較的基質特異性の広いアミノ酸トランスポーターであることを示している。

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我々は、大腸菌で過剰生産したリコンビナント前駆体蛋白質を用いたin vitro葉緑体蛋白質輸送実験系を構築した。本実験系は、従来の同様の実験系に比較して輸送効率が優れており、輸送された蛋白質の化学量論的解析が可能であることに特色がある。現在は、この実験系を利用した様々な応用実験系を開発中である。例えば、葉緑体蛋白質の機能解析のために、野生型、あるいは変異型前駆体蛋白質を予め葉緑体に輸送させておき、その蛋白質と相互作用する因子検索を行う実験系、活性型蛋白質の獲得が困難な外来蛋白質を獲得するために、葉緑体移行シグナルであるトランジット配列(TP)を接続したキメラ蛋白質を作製し、in vitro輸送実験を行い、葉緑体の元来有するフォールディング活性を利用する実験系の構築などである。本大会においては、現在の進捗状況について発表する。

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真核生物の小胞輸送系では、COPII輸送小胞はER・ゴルジ体間の輸送のうち、ERからゴルジ体への順方向の輸送を行っている被覆小胞であり、低分子量GTP結合タンパク質のSar1p等や2種類の被覆タンパク質複合体(Sec23p/24p複合体、Sec13p/31p複合体)からなる。本研究では、COPIIコンポーネントのシロイヌナズナホモログについて、植物の発達における機能の解析を目的としている。
現在、COPIIコンポーネントのうち、sec31p、sec13p、sec23p、sec24pのホモログであるATSEC31、ATSEC13、ATSEC23、ATSEC24についての解析を行っている。ATSEC31、ATSEC13のホモログはそれぞれ2つ、ATSEC23のホモログは7つ、ATSEC24のホモログは3つ存在していることがデータベースでの検索より推測されている。これまでにこれらのホモログについてプロモーターGUSによる発現解析を行っており、ATSEC31, ATSEC13, ATSEC23については各ホモログが異なる組織や時期で発現し、ATSEC24では各ホモログが同じようなパターンで発現していた。また、ATSEC31, ATSEC13, ATSEC23についてはGFPを用いた細胞内局在を確認しており、今回はこれらの結果について報告する。ATSEC31とATSEC13については、その蛍光パターンからERに局在することが示唆されている。加えて、ATSEC31とATSEC13についてはBiFCを用いた相互作用解析も行っており、この解析からATSEC31とATSEC13がERにおいて相互作用していることが示唆されている。

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ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）は小胞輸送や細胞増殖など様々な生理機能を担っている。我々は、酵母でPI3K（Vps34）と複合体を構成するAtg6/Vps30に着目し、これまでにシロイヌナズナAtg6ホモログがオートファジーや加水分解酵素CPYの液胞輸送に関わること、及びAtg6 とVps34が細胞内の点状の構造体で共局在することを確認している。この構造体は酵母細胞のオートファゴソーム前駆体(PAS)に類似しており、現在、PI3Kとオートファジーの関係に関心を持って研究を進めている。
ここでは、PI3Kによって合成されるホスファチジルイノシトール3リン酸(PI3P)の可視化について紹介する。PI3Pに結合するFYVEモチーフとGFPの融合蛋白は、シロイヌナズナ培養細胞内の点状の構造体でAtg6、さらにPASのマーカータンパクAtg8と共局在していた。この結果は、PI3K複合体によるPASへのPI3Pの供給が、オートファゴソームの膜形成に必須であるという我々の考えを支持する。
さらに、植物体におけるPI3K複合体の機能解明を目的に、RNAiによるATG6やVPS34の発現抑制を試みている。なお、ATG6のT-DNA挿入株では花粉が発芽しないが、電子顕微鏡観察を行っても成熟花粉の内部に構造の異常は認められなかった。

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シロイヌナズナ花茎重力屈性の研究過程で単離された変異体zig zag(zig)は重力屈性に加え形態にも異常を示し、その原因遺伝子は小胞輸送関連因子Qb-SNARE VTI11をコードする。高等植物において重力感受等の高次機能に関わる小胞輸送の分子基盤を明らかにするため、zig-1の表現型を抑圧するサプレッサーの単離解析を行っている。zig suppressor 3 (zip3)は、zig-1の示す花茎の重力屈性及び形態異常を部分的に抑圧する劣性変異体である。また、zig-1において、重力感受細胞である内皮細胞のアミロプラストは液胞膜に包まれずに細胞上下に偏在したのに対し、zip3 zig-1では野生型と同様にアミロプラストが液胞膜に包まれて移動する細胞とzig-1様の細胞とが観察された。以上の結果からzip3変異はzigの表現型を細胞レベルにおいても部分的に抑圧すると考えられる。マッピングの結果、出芽酵母Vps35pのシロイヌナズナホモログをコードするAtVPS35bに変異が見つかった。Vps35pは液胞前区画(PVC)とゴルジ体の間の逆行輸送に関わるretromer複合体の構成タンパク質であることが知られており、相補性試験によりAtVPS35bがzip3の原因遺伝子と同定された。本発表ではzip3のzig抑圧の分子メカニズムについて議論したい。

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花粉は、雄原細胞と精細胞からなる複雑な構造を持ち、その形成過程では、細胞の膜構造の大規模な再編が行われていることが知られている。また、花粉管の伸長過程では、花粉管の伸長に伴い、小胞輸送によって花粉管の先端部分に選択的に大量の細胞膜および細胞壁を構成する成分が送り込まれている。我々は、花粉の発達及び伸長過程において特定の小胞輸送に関わるSNARE（soluble N-ethyl-maleimide sensitive factor attachment protein receptors）分子を探索するために、シロイヌナズナの細胞膜上に局在すると考えられているQa-SNARE9種類およびVAMP5種類について、自身のプロモーターでGFP融合型のSNAREを発現するトランスジェニックシロイヌナズナを作成し、そのなかで花粉の発達過程および花粉管の伸長時に特異的に発現しているSNARE分子の探索を共焦点レーザー顕微鏡を用いておこなった。その結果、SYP112,124,125,131では、花粉において特異的な発現が観察された。花粉において発現しているSNARE分子の細胞内局在についてもあわせて発表をおこなう。

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小胞体で合成されるタンパク質は正しい高次構造をとった後、小胞輸送により目的の場所へ運ばれる。この過程に異常が生じBiPなどの小胞体シャペロンの遺伝子が誘導される現象は小胞体ストレス応答と呼ばれ、哺乳動物では正常な発達に必要であること等、重要な細胞応答であることが明らかにされている。私達は植物での分子機構、生理機能を明らかにするためにシロイヌナズナを用いて研究をおこなっている。その過程で糖鎖合成阻害剤ツニカマイシンにより転写誘導されるbZIP型転写因子AtbZIP60を同定した。AtbZIP60はbZIPドメインに続いて膜貫通領域と予想されるドメインを有することから、非ストレス条件下では膜に局在し、ストレス依存的にタンパク質レベルで切断を受けて核に移行して転写因子として機能することが予想された。そこで、抗AtbZIP60抗体を作製しウエスタン解析を行った。その結果、ツニカマイシンやDTTなどの小胞体ストレス誘導剤によって、全長のAtbZIP60に加えて切断型のAtbZIP60が検出された。細胞分画により局在解析を行ったところ、全長のAtbZIP60は小胞体に、切断型AtbZIP60は核に局在することを示した。また、通常の生理条件下においては葯において切断型AtbZIP60が検出されたことから、小胞体ストレスが起こっていると考えられた。現在、遺伝子破壊株における表現型の解析を行っている。

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貯蔵タンパク質は種子の登熟期に小胞体で前駆体として合成され，小胞輸送によりタンパク質蓄積型液胞に運ばれる．貯蔵タンパク質の液胞選別輸送機構を明らかにする目的で，私達は貯蔵タンパク質の前駆体を種子に異常蓄積するシロイヌナズナ変異体を単離・解析してきた．選別輸送レセプターAtVSR1の欠損変異体種子は，貯蔵タンパク質前駆体を細胞外に分泌する1）．MAG2欠損変異体種子は貯蔵タンパク質前駆体を細胞内の小胞体由来の新規構造体に異常蓄積する2）．これらの結果は，AtVSR1とMAG2が貯蔵タンパク質輸送の異なる過程で機能していることを示している．これまでにこの両方の表現型を示す変異体は得られていない．この2つの過程を阻害する目的で，AtVSR1とMAG2の二重変異体を作製した．この二重変異体は正常に発芽・成長した．免疫電子顕微鏡観察の結果，この二重変異体は細胞内と細胞外の両方に貯蔵タンパク質前駆体が蓄積していることが明らかになった．貯蔵タンパク質の液胞選別輸送機構について議論する．
1）Shimada et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 16095（2003）
2）Li et al. Plant Cell,（2006）in press

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Positron Emitting Tracer Imaging System （PETIS）は、植物に投与したポジトロン放出トレーサーの動態を動画像として撮像できる装置である。さらに短半減期核種のトレーサーを投与することで同一個体を用いた撮像を繰り返すことも可能となり、同一植物体における環境変化に応じた元素動態の変化を捉えることができる。
本研究ではPETISおよびポジトロン放出トレーサー¹¹CO₂（半減期20.39分）を用い、カドミウムが植物の炭素転流に及ぼす影響について解析した。実験には播種後4週間目のイネを用い、最大展開葉に¹¹CO₂を投与した後の¹¹C-同化産物の動態を撮像した。得られた動画像データに対して、¹¹C-同化産物が同化葉から葉鞘基部へと到達する時間を決定するプログラムを開発し、転流速度を解析した。本手法を用いて、カドミウムを経根吸収させたイネの¹¹C-同化産物の転流速度を計測したところ、通常条件下におけるイネの転流速度と比較して有意に低下する結果が得られた。

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必須元素や汚染物質等の植物中動態を経時的にイメージングする手法は植物研究に新たな知見を与え、生物学の分野での多大な貢献があった。その代表的手法には、放射性同位元素をトレーサーとして用い、その濃度分布をイメージングすることで植物体内の必須元素や汚染物質の分布を画像化する、オートラジオグラフィ、ポジトロンイメージング法などがある。しかしこれらの方法で画像化できる測定対象の元素は1種類に限られるため、複数核種を同時に捉え、競合する元素の同一環境下・同一個体内の植物生理反応をイメージングすることは不可能である。そこで原子力機構・JAXA・群馬大学の三者によってCdTe半導体ガンマカメラを開発した。これは従来のイメージング装置と異なり、高いエネルギー分解能（1％以下）を実現することでガンマ線を放出する複数の元素を同時にイメージングできる検出システムである。試作機によりタバコ1個体内の異なる元素分布の取得に成功し、本システムによって複数元素の同時イメージングが可能である事が示された。
このように我々は植物分子イメージング技術を開発することで、植物個体レベルでの代謝全体の流れを見るという研究手法の確立を目指している。植物分子イメージングにおける新規方法論として、本手法の可能性・展開について本会で討論したい。

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世界全体で、約10億人が鉄欠乏性貧血症であると言われており、特にイネを主食とするアジアで深刻な問題となっている。そこで、種子における鉄含有量を高めたイネ（高鉄含有米）を創製すれば、鉄欠乏性貧血症の改善に大きく貢献すると考えられる。すでに我々は、イネの胚乳に鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンを高発現させ、種子における鉄含有量を最大で約3倍に増加させることに成功した。しかし、フェリチンの発現をさらに強化させても種子の鉄含有量はあまり増加しなかった。そこで本研究では、イネ科植物の鉄獲得機構において重要なムギネ酸類の生合成に関わるオオムギの遺伝子HvNAS1、HvNAAT-A,-BおよびIDS3をイネに導入することにより、イネの鉄吸収・転流能力を向上させ、より鉄含有量の高い高鉄含有米を創製することを試みた。 まず、HvNAS1のみ、HvNAS1とHvNAAT-A,-Bのみ、IDS3のみをそれぞれ導入し、ムギネ酸類生合成系のみを強化した3種類の形質転換体における種子中の金属含有量について報告する。また、3つのムギネ酸類生合成系遺伝子とダイズフェリチン遺伝子SoyferH2をイネの胚乳特異的発現プロモーターを用いて発現させる形質転換体を作製した。ベクターには、選抜マーカーを外すことが可能な大容量マーカーフリーベクターを用いた。この形質転換体のT₂種子中のフェリチンの発現と鉄含有量について報告する。

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粗放型薄層屋上緑化には乾燥に強いCAM植物であるマンネングサ属の植物が多く利用されている．なかでも帰化種であるメキシコマンネングサ・オウシュウマンネングサが最も広く用いられている．本研究では在来マンネングサ属の植物3種の蒸散速度を帰化種4種と比較した．
在来種のセトウチマンネングサおよびマルバマンネングサは帰化種であるメキシコマンネングサ・オウシュウマンネングサ・オノマンネングサおよびツルマンネングサと同程度の低い蒸散速度を持ち，乾燥に強いことが示された．一方，コモチマンネングサは約10倍の蒸散速度を示し，比較的乾燥に弱いことが示された．このことは逆にコモチマンネングサは水が十分にある環境ではその他のマンネングサ属の種に比べて，建物冷却効果が高いことを示している．これらマンネングサ属の蒸散速度は地上部の重量で標準化した場合に最もばらつきが少なく，根の水分吸収は蒸散の律速要因ではないことが示唆された．
セトウチマンネングサおよびマルバマンネングサは少なくとも水利用／乾燥耐性については現在屋上緑化に利用されている帰化マンネングサと同様の能力を備えており，粗放型薄層緑化をより生態学的に負荷が小さいと思われる在来種に変更することができる可能性が示唆された．また，より冷却効果を期待する場合には新たにコモチマンネングサを用いて屋上緑化を行うと良い結果が得られるかもしれないことが示唆された．

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植物による土壌修復（ファイトレメディエーション）により、有害重金属であるカドミウム（Cd）を土壌中から効率的に回収するためには植物体の地上部に、より多くのCdを移行させる必要がある。植物体内のCdの長距離輸送には維管束組織である導管・篩管内に存在するタンパク質の関与が考えられる。我々は維管束組織に存在するCdに応答するタンパク質に注目し、これらの生理的機能を解析することにより植物におけるCdの長距離輸送機構の解明を目指している。本発表では特に篩管内に存在するCd応答性タンパク質について報告する。
供試植物としてはアブラナを用いた。約3ヶ月水耕栽培した植物に、48時間、30μMの濃度でCd処理を行った後、切断法により篩管液を採取した。この篩管液に含まれるタンパク質の濃度は約0.25 mg mL^-1で、Cd処理区／無処理区の間で違いは見られなかった。これらの篩管液タンパク質を二次元電気泳動法により分離し、銀染色法による検出を行った。篩管液タンパク質の組成をCd処理区／無処理区の間で比較すると、Cd処理により存在量が変化する複数のタンパク質の存在が確認できた。これらのタンパク質についてPMF (Peptide mass fingerprinting)解析を行い、その同定を試みた。また、これらのタンパク質のCd結合性についても現在、検討を行っている。

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アクアポリンに代表されるMajor Intirinsic Proteins(MIP)は、水だけでなくケイ酸やホウ酸など無電荷の低分子を透過するチャネルとして機能していることが明らかにされている。我々はイネにおけるホウ素輸送機構を明らかにするため、シロイヌナズナホウ酸チャネルAtNIP5;1と相同な遺伝子であるOsNIP3遺伝子群について解析を行っている。
AtNIP5;1と最も高い相同性を示すOsNIP3;1はホウ素欠除培地にさらすことより、根におけるmRNA蓄積量が約5倍上昇した。一方、ホウ素欠乏により、OsNIP3;1の発現が誘導された植物体をホウ素を含む培地に戻すと、発現量が通常条件と同レベルまで低下した。続いて、GFP-OsNIP3融合タンパク質をタバコ培養細胞において一過的に発現させたところ、細胞膜への局在を示した。さらに、OsNIP3;1プロモーター制御下でGUSを発現する形質転換体を観察したところ、根においては中心柱と外側の皮層とにGUSの染色が観察された。一方、地上部では維管束周縁部にGUSの染色が観察された。
これらの結果から、OsNIP3;1はホウ素欠乏誘導性のイネにおけるホウ酸チャネルとして、外部からのホウ素吸収および地上部での維管束からのホウ素移行に関与していることが推測された。

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アクアポリンは水やその他の小分子を輸送する膜タンパク質で、生物界に広く存在している。シロイヌナズナのアクアポリンは35種類存在し、4つのグループ（PIP、TIP、NIP、SIP）に分けられる。本研究ではこの中で機能未知な部分の多いNIPグループ9分子種のうち4分子種（NIP1-1、NIP1-2、NIP5-1、NIP6-1）にスポットをあて、水透過能の測定、細胞内局在、組織特異的発現等を解析した。
各NIPを発現させた酵母膜小胞を用い、ストップトフロー光散乱法により水透過能を測定した結果、4分子種共に水透過能は非常に小さいことが示された。また、GFPとNIPの融合遺伝子をシロイヌナズナ培養細胞で発現させたところ、NIP1-1、NIP1-2、NIP6-1において、細胞膜や液胞膜ではなく小胞体への局在を示唆する結果が得られた。また、アグロバクテリウムを用いてpromoter-GUS導入植物体を調製し解析したので、組織特異的発現についても報告する。

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ホウ素は高等植物の必須元素の一つであり、細胞壁の構造維持に働く。ホウ素はまた、過剰に存在すると植物に害を及ぼす。シロイヌナズナBOR1はホウ素の導管への積み込みを担う排出型ホウ酸トランスポーターである（Takano et al. 2002）。私たちは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター制御下でBOR1-GFP融合タンパク質を発現する形質転換植物の根端の細胞において、BOR1-GFPは低ホウ素条件下に細胞膜に局在するが、高濃度のホウ酸添加によってすみやかにエンドソームへ移行し、液胞において分解されることを明らかにした (Takeno et al. 2005)。
本発表では、BOR1プロモーターの制御下で発現したBOR1-GFP融合タンパク質の細胞内局在とそのホウ素条件による制御について報告する。BOR1-GFPは低ホウ素条件下に、根の成熟した領域においては中心柱の細胞に局在し、根端の領域においては表皮と皮層を含む様々な細胞に局在した。特に表皮細胞においては根の基部側（内側）の細胞膜に偏在していた。これらの結果から、BOR1は根の成熟した領域では導管へホウ酸を積み込み地上部へホウ素を送る役割を、根端の領域ではより内側の細胞層へホウ酸を輸送し伸長中の細胞壁にホウ素を供給する役割を担うものと考えられる。

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植物の機械刺激受容の分子機構を明らかにするため、我々は出芽酵母のCa²⁺透過性機械受容チャネル候補の変異株(mid1)の致死性を相補する、シロイヌナズナの2つの遺伝子MCA1 とMCA2 (旧名AtMID1AとAtMID1B)を単離した(第45回年会)。Mca1とMca2はアミノ酸配列上72 %の同一性をもつが、Mid1とは10 %の同一性しかもたない。我々が開発した二層寒天法により、Mca1は根が寒天の硬さを感知することに関与していることを報告した(第47回年会)。本研究ではMca1とMca2の機能を酵母において解析した。まず膜分画法により、Mca1は酵母の細胞膜に局在することを明らかにした。次に酵母のmid1 cch1二重変異株の致死性に対する相補能を調べた。すなわち、酵母のMid1とCch1は協調して高親和性Ca²⁺チャネルとして機能しているので、単独ではmid1 cch1二重変異株を相補できない。しかし、Mca1とMca2はそれぞれ単独でこの二重変異株を部分相補し、Ca²⁺蓄積を増加させた。この知見は、Mca1とMca2がMid1とは異なるメカニズムでCa²⁺透過タンパク質として機能することを示す。

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高塩濃度環境は、作物の生育に大きな影響を及ぼす環境要因である。イネは耐塩性が低い作物として知られている。しかし、イネのNaイオン含量は、田面水の1/100程度で常にNa⁺を排除し、細胞内の濃度を低く保っている。また環境中の塩濃度が上昇しても細胞内のイオン濃度は低く保たれている。この塩ストレス回避を担う遺伝子群をイネFull-length cDNA over-expressor gene (FOX) hunting system (羽方ら、H18本大会) および44Kイネマイクロアレイシステムを用いて探索した。イネFOX系統種子を吸水後12日間水耕栽培し、NaCl存在下3日間生育後葉および根を採取し重量を測定した。マイクロアレイはアジレント社イネゲノム情報を基にしたオリゴヌクレオチド44K個がはり付けられたアレイを用い、塩処理により発現変動する遺伝子を調べた。FOX systemにより約2500系統を試験し、塩ストレスを軽減した遺伝子としてZn finger型転写調節因子をはじめ糖輸送体遺伝子などを見いだした。塩処理後18時間目のイネのRNAを鋳型にしたプローブでは脂質代謝、Zn finger型転写調節因子、輸送体などの遺伝子が検出された。FOX systemにより選抜された遺伝子とマイクロアレイにより見いだされた遺伝子とは全く異なっているが、機能的な分類では類似性が高い。いずれの手法においても選抜されたK^＋チャンネル遺伝子は、酵母変異株を用いたイネ完全長cDNAの機能解析では耐塩性に大きく関わることが明らかにされている。

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植物は浸透圧ストレスを受けると、ストレス耐性の獲得に関わる遺伝子群を働かせることで柔軟に適応している。これまでに浸透圧ストレス下において代謝と膜輸送に関与する遺伝子の発現が変化し、糖やアミノ酸などが蓄積することが示されている。本研究では乾燥ストレスで発現が誘導され、単糖トランスポーターと相同性が高い遺伝子であるERD6とその相同性遺伝子を解析した。糖トランスポーターの特徴としては、疎水性アミノ酸から構成される12ヶ所の膜貫通領域が存在することが挙げられる。疎水性アミノ酸の分布から推定した結果、ERD6およびその相同性遺伝子にも膜貫通領域が12ヶ所存在し、アミノ酸配列においても既知の単糖トランスポーターと高い相同性を示した。まず、northern解析による発現解析を行ったところERD6とその相同遺伝子は乾燥、低温、高塩ストレスによるmRNAの増加が確認された。次に、GUSリポーター遺伝子を用いて、植物体での組織的局在を調べたところ、ERD6は小葉脈、相同遺伝子では主葉脈においてGUS活性が検出され、発現する組織の違いも確認された。また、高塩処理下では地上部だけでなく地下部を含む植物全体にGUS活性が検出された。現在、T-DNAタグラインを用いたERD6欠失変異体を用いた表現型解析を行っている。

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CO₂は濃度依存的に気孔の開閉を誘導する環境因子であり、低CO₂条件下では気孔は開口し、蒸散量が上昇し、葉面温度が低下する。このような植物のCO₂感知のメカニズムを調べるために、現在、CO₂濃度依存的な葉温変化に異常をきたすシロイヌナズナ突然変異体のスクリーニングを行っている。ht 1((high leaf temperature 1) は、低CO₂条件下で高温を示す変異株として単離され、CO₂濃度変化に伴う気孔の応答性が低下していることが確認された。このHT1原因遺伝子はタンパクキナーゼをコードしており、葉において孔辺細胞特異的な発現をしていた。ht 1には2つのアリルが存在するが、変異体の表現型の強さと変異型タンパクにおけるキナーゼ活性の強さには相関がみられた。また、キナーゼ活性の欠損を引き起こす改変HT1遺伝子を過剰発現させた形質転換植物は、ht 1と同様CO₂応答性が低下していた。さらに、HT1キナーゼは阻害剤を用いた解析より、Rafキナーゼに似た性質を持つことが示唆された。つまりHT1キナーゼがRafのようにシグナル伝達系の上流の因子として働いている可能性が考えられる。

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高等植物では増殖制御、病害応答等にMAPK情報伝達系の関与が示唆されているが、動物、菌類とは異なる進化・関与が示唆されている。シロイヌナズナでは約20種のMAPK相同遺伝子の存在が知られているが、機能未知の遺伝子も多く、植物型MAPK情報伝達系解明にはより単純なモデル植物が必要とされている。
単細胞性緑藻クラミドモナスはEST・ゲノム解析が進んでいることから、MAPK情報伝達系の研究に最適のモデル生物である。我々の研究室ではクラミドモナスからMAPK相同遺伝子CrMPK1,2を分離し、その機能解析を進めてきた。一方、近年になりドラフトゲノム情報(Chlre3)が公開されたことから、MAPK相同遺伝子を検索したところ、CrMPK1,2及びLf4を含むTEY型4種、TDY型4種の存在が明らかとなった。それら塩基配列及び推定アミノ酸配列を元に相同性検索を行った結果、植物特有TDY型MAPKと病原性鞭毛虫類MAPK類似MAPKの存在が示唆された。植物特有TDY型MAPKは病害感染等による発現誘導が知られているものの、その機能は不明のままである。また、クラミドモナスに病原性鞭毛虫類MAPK類似MAPKが存在することは進化的、機能的に大変興味深い。
現在、クラミドモナスの全MAPK相同遺伝子の機能を推定するために、RT-PCRによる発現時期の解析を行っている。

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