マイクロボディ（MB）と葉緑体を細胞当り1個ずつ持つクレブソルミディウムのMBの分裂と分配過程を，連続切片の電顕観察によって3次元的に解析した．間期には，棒状のMBが筒型の細胞の短軸方向（将来の紡錘体軸に対して垂直）に配向し，その一端に中心小体対が近接していた．前期では，MBが伸長し，かつ分岐するだけでなく，細胞の長軸方向に向きを変えた．複製された中心小体対はMBの両端のごく近傍に位置していた．中期には，伸長したMBは開放型紡錘体の側面に沿うように位置し，その両端は紡錘体極の中心小体対にそれぞれ近接していた．終期では，2個の娘核は，中心小体に先導されるかのように細胞の両端にそれぞれ移動し， MBはさらに伸張した．MBの両端は，この時期においても中心小体対に近接していた．MBの分裂は少なくとも細胞質分裂の初期には開始していなかった．従って，MBの分裂は細胞質分裂の完了と同時かその直前に行われると考えられる．細胞分裂後，核が細胞の端から中心小体対を伴って中央にもどる際に，MBもその一端が中心小体対に近接した状態で中央に戻るとともに，細胞の短軸方向に向きを変えた．細胞周期全体においてMBは中心小体対と常に近接しており，また分裂期においては多数の微小管がMBに沿うように配置していた．以上の観察結果は，MBの配向の変化と分裂および分配に中心小体と微小管が関与していることを示唆している．

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シロイヌナズナのcrumpled leaf (crl)変異体ではプラスチドの分裂が阻害されると共に、胚を含み植物全体の形態に異常が観察される。crl変異体の胚がクロロフィルをもたないプラスチドを含む細胞を多数含むこと等から、我々はcrlの胚の形態が異常となるのは、クロロフィルをもたないプラスチドが多数胚に存在するためではないかと考えている。今回、我々はプラスチド局在YFPタンパク質を発現しているcrl変異体を用いて、crlの葉にクロロフィルをもたないプラスチドを含む細胞が存在するのかどうかを検討した。その結果、crlの葉にはクロロフィルを持たないプラスチドと葉緑体とが共存する葉肉細胞が約27％存在したが、クロロフィルを持たないプラスチドのみを含む葉肉細胞は検出されなかった。一方、crlの葉にはクロロフィルを持たないプラスチドのみを含む孔辺細胞が約30％、プラスチドを検出できない孔辺細胞が約14％存在した。また、プラスチドが検出できない表皮細胞が約18％存在した。以上の結果から、crlの葉の形態が異常を示すのはクロロフィルを持たないプラスチドを含む葉肉細胞が存在するためではなく、プラスチドが検出できない表皮細胞が存在するためか、あるいは、葉の発生に必要な何らかの葉緑体機能がcrlの葉緑体では低下しているためではないかと考えられた。

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我々は、小胞輸送、特にエンドサイトーシスが植物の高次現象において果たす役割を明らかにすることを目的とし、エンドソームと液胞で機能するSNAREとRabに注目し研究を行っている。AtVamp727は、シロイヌナズナに存在するR-SNAREの中で唯一エンドソームに特異的に局在しており、GNOM依存的なエンドサイトーシス経路に関与する可能性が示唆されている（Ueda et al., 2004；Uemura et al., 2004）。そこで、さらにその機能の詳細を明らかにするため、小胞の融合において協調的に機能していると考えられるRab5グループや、PVCと液胞に局在するAtVam3/Syp22（Qa-SNARE）との相互作用について解析を試みた。AtVAMP727のT-DNA挿入変異体の解析を行ったところ、目立った表現型は見られず、RAB5（RHA1、ARA7、ARA6）のいずれかとの二重変異体についても同様であった。一方、atvamp727 atvam3二重変異体は胚致死の表現型を示した。そこで、これら2つのSNAREの細胞内局在を比較した結果、これらが部分的に共局在することが明らかとなった。さらに、この二重変異体の未成熟胚の細胞においては、貯蔵型液胞の断片化が観察された。これらのことから、AtVamp727とAtVam3が協調的に機能する可能性が示された。

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動物ミトコンドリアゲノムの複製はDNAポリメラーゼγ（Polγ）が行っているが、Polγは塩基配列が決定されたシロイヌナズナやC. merolae（シゾン）には存在していない。現在、植物や藻類のオルガネラゲノムの複製は、大腸菌のDNAポリメラーゼIとある程度の相同性を持つ酵素が行っていると考えられているが、まだ完全に証明されていない。シゾンの核ゲノムには、このような酵素をコードする遺伝子が2個存在する（PolA、PolB）。PolAとPolBの局在を、免疫ブロット分析およびGFP（タマネギにおいて観察）を用いて調べた結果、PolAはプラスチド、PolBはプラスチドとミトコンドリアの両方に局在することがわかった。PolA、PolB組換えタンパク質のDNA合成活性を測定した結果、PolAはddTTP、PolBはホスホノ酢酸に感受性があることがわかった。シゾン同調培養系において転写産物とタンパク質の蓄積量を調べた。その結果、PolAはほとんど変化しなかったが、PoBは周期に合わせ発現量が変化したことから、PolBがオルガネラゲノムの複製に関わることが示唆された。ホスホノ酢酸によるin vivoでの影響を調べた結果、予想とは異なり、濃度が高いほど核ゲノムに対しオルガネラゲノムの割合が増加した。これはさまざまな可能性が考えられ、更に検討が必要である。

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私達は葉緑体の発達に必要な核コードの遺伝子の機能を解析するために、シロイヌナズナのトランスポゾンAc/Dsのタグラインを用いてアルビノ変異体albino or pale green mutantの解析を行っている。その変異体の中の一つであるapg4は子葉がアルビノ表現型を示し、本葉は黄色と緑色の斑入りの表現型を示した。透過型電子顕微鏡によるプラスチドの形態の解析では、子葉のプラスチドは野生型に比べ内部構造の発達が全く見られず、空胞が多く見られる異常なプラスチドが観察され、本葉のプラスチドは野生型と同じようにラメラ構造が形成されている葉緑体とチラコイド膜の発達中の段階の葉緑体を似ている異常な葉緑体が観察された。apg4は大腸菌のRBFA（Ribosomal binding factor A）と相同性がある遺伝子のプロモーター領域に、Dsが挿入している変異体であり、RT-PCRによりRBFAの転写の有無を調べたがRNAは検出されなかった。高等植物のおいてRBFAの機能はまだ解明されていない。大腸菌のrbfA変異体は低温ストレス下で16S rRNAの成熟を抑制する事が報告されているが、apg4では、大腸菌とは異なり23S rRNAと4.5S rRNAの間のプロセッシングに異常が観察された。また、低温ストレスによって、RBFAの発現が誘導されるか報告する。

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プラスチドは内膜構造の未発達なプロプラスチドから色素や機能の違いによりクロロプラストやエチオプラストに分化し、光合成・デンプン蓄積・カロテノイド蓄積など様々な機能を持ち非常に重要な役割を果たしている。そこで私達はプラスチド間の分化機構に関与するタンパク質の機能を解明することを目的として、シロイヌナズナの各プラスチドとトマト（マイクロトム）のクロモプラストの単離からタンパク質の同定までの方法を確立したので報告する。本研究の特徴は連続密度勾配遠心分離にNycodenzを用いたことである。Nycodenzは容易に連続密度勾配が作成でき、他のオルガネラの混入していない純粋で無傷プラスチドを単離できるという利点がある。これまで内膜構造がしっかり構築されていない葉緑体以外のプラスチドや変異体を単離することは困難とされていたがNycodenzを用いることで単離することに成功した。密度勾配遠心分離による各種のプラスチドを単離、プラスチドの可溶性タンパク質の抽出、二次元電気泳動によるタンパク質の分離、MALDI/TOFMSによりペプチド断片の質量を測定し、MASCOT Softwareでタンパク質を推定した。
クロロプラスト・エチオプラスト・クロモプラスト・apg3（albino or pale green mutant 3）・apg2のプラスチドに含まれるプラスチドタンパク質について報告する。

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植物の亜硫酸還元酵素（SiR）は色素体内でフェレドキシンを電子供与体としてSO₃^2-をS^2-に還元する酵素である。近年、SiRは単離葉緑体核様体の構成成分として見つかった。本研究では、酵素活性をもつホロ型酵素を用いてエンドウ（PsSiR）またはトウモロコシSiR（ZmSiR）のDNA結合特性を調べた。PsSiRとZmSiRは二本鎖および一本鎖DNAに配列非特異的に結合した。PsSiRのDNA結合は酵素活性には影響しなかった。これは核様体内でフェレドキシンおよびSO₃^2-がSiRと相互作用できることを示唆している。In vitro DNA凝縮アッセイの結果、DNA凝縮能はPsSiRの方がZmSiRよりも高いことが示され、in vitro転写系ではPsSiRによる強固なDNA凝縮によってZmSiRよりも強力な転写抑制が見られた。免疫蛍光観察では、単離エンドウ葉緑体では核様体に大部分のSiRの局在が見られたが、トウモロコシでは明確な核様体への局在は見られなかった。以上の結果は、SiRが核様体凝縮に重要な役割を果たしているが、核様体への結合の程度は植物種により異なることを示唆している。

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オルガネラ（色素体及びミトコンドリア）ゲノムDNAにコードされる遺伝子は80-200種類と非常に少ない。オルガネラで機能する多数のタンパク質遺伝子は核にコードされ、翻訳後、オルガネラへの移行シグナル配列によってオルガネラに輸送される。これらの核コード遺伝子の多くは、オルガネラの起源である細胞内共生バクテリアに由来すると考えられている。共生バクテリアの遺伝子が核に移り、産物がオルガネラで機能するためのハードルの一つはオルガネラへの移行シグナル配列の獲得であるが、その獲得機構の全体像はいまだ明らかではない。
本研究では、ゲノム中にはオルガネラへの移行シグナル配列となりうる可能性を持つ配列が潜在的に存在するのではないかと考え、7生物種の全ゲノム配列に対し、オルガネラへの移行シグナル配列の探索を行った。その結果、ゲノム中の非コード領域やコード領域の逆鎖において多数の移行シグナル配列候補が予測された。これらの配列のうちいくつかを、GFP遺伝子の上流につなぎ植物体において発現を行った結果、実際にこれらがオルガネラへの移行シグナル配列として働くことが示された。この結果は生物ゲノムは潜在的にオルガネラへの移行シグナルとなりうる配列を潜在的にコードしており、オルガネラ遺伝子は核へ転移した際に偶発的に移行シグナル配列を獲得した可能性を示唆する。

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Cyanidium caldarium RK-1株はCyanidioschyzon merolae 10D株と同じく原始紅藻類に属し、高温酸性の温泉に生育している。このたびC. caldarium RK-1株の色素体ゲノムの塩基配列がほぼ決定したことを報告する。C. caldarium RK-1の色素体ゲノムの予想されるサイズはおよそ150 kbpで、AT-richな環状ゲノムである。この塩基配列を基にOpen Reading Frameを検索し、存在する遺伝子を確認した。同定された遺伝子は、psaAやrbcLなど光合成関連の遺伝子が多く存在した。また緑色植物と異なり、アミノ酸合成、脂肪酸合成、ビタミン合成に関与する多くの遺伝子が見られた。多くの遺伝子はC. meloraeと高い相同性を示し、遺伝子の配列も近い部分が多く見られた。その一方で遺伝子の並びが異なる部分も見つかったので、このこともあわせて報告する。

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色素体は、120～160kbpの環状DNAからなる独自のゲノムを持つ。色素体ゲノムには，約40種の光合成関連遺伝子，約60種の遺伝子発現関連遺伝子，及び数種のその他の遺伝子がコードされている。色素体の重要な特徴は，組織に応じて様々な形態や機能をもつ色素体を分化させる能力を持つ点である。色素体の分化に伴い，その遺伝子発現は大きく変化すると考えられるが，葉緑体以外の色素体に関する研究例は限られている。本研究では，色素体DNAのTilingマクロアレイを利用し，シロイヌナズナ色素体遺伝子の組織・器官別発現パターンを網羅的に解析し，各組織で発現する遺伝子のカタログ化を行った。その結果，以下の事実が明らかになった。（1）発芽8日目の実生，ロゼッタ葉，茎生葉，茎などにおける色素体遺伝子発現パターンはほぼ同一であった。（2）実生の色素体遺伝子の発現は，発芽初期にダイナミックに変化する事が分かった。（3）根における色素体遺伝子の発現は，葉に比べ大きく減少しているが，accD遺伝子の発現のみが根でも一定のレベルを維持していた。（4）種子の登熟過程でも色素体遺伝子の発現は大きく減少していくが，trnEや5SrRNAなど一部の遺伝子の発現がむしろ強まることが分かった。以上の結果から，組織別の色素体遺伝子発現の制御において，転写及び転写後制御が重要な役割を果たしている事が明らかになった。

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色素体RNAポリメラーゼの一つ，原核型のPEPは主に光合成遺伝子の転写に関わり，ファージ型の NEPはハウスキーピング遺伝子を転写する。PEPは活性部分のコア酵素とプロモーター認識に必須のシグマ因子とから構成され、シグマ因子の交換によって転写する遺伝子群を一括して変換すると考えられている。シロイヌナズナの場合、6個のシグマ因子遺伝子（AtSIG1-AtSIG6）が存在し，その全てが核ゲノムにコードされている。しかし，それらの機能分担の詳細はまだ明らかになっていない。我々は， AtSIG6がσ70型の葉緑体プロモーターを広く認識するシグマ因子で，葉緑体分化の初期過程で重要な働きをしていることを明らかにしている。本研究では，sig6-1変異体に各シグマ因子を発現させることで，それぞれのシグマ因子がAtSIG6の機能を相補できるかを検討した。その結果，AtSIG1，AtSIG3，ATSIG4の場合，sig6-1変異体で発現が減少する多くのPEP依存遺伝子の発現を回復させる傾向が見られた。一方， AtSIG2，AtSIG5は，それぞれtRNA遺伝子，およびpsbA，psbD，psaAの光化学反応中心遺伝子など，比較的限定された遺伝子の発現を回復させた。本研究により，植物シグマ因子のプロモーター認識特性に偏りがあり，それが色素体の遺伝子発現制御に重要な役割を果たしている可能性が示唆される。

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シロイヌナズナの chlorina5 (ch5)は葉緑体プロテアーゼ（CH5）をコードする遺伝子に塩基置換が入った変異体である。この葉緑体プロテアーゼはチラコイド膜局在の膜貫通域を持つ亜鉛プロテアーゼである。近年様々な葉緑体プロテアーゼが報告され、それぞれの変異体について解析が進められている。しかしCH5の機能や基質は明らかではない。ch5変異体は成長の初期において野生型に近い緑色をしているが、成長するにつれてクロロフィルやカロテノイドが減少していく。我々はこの表現型に注目してch5変異体の退色機構とプロテアーゼの機能の解明を試みた。RT-PCRによりCH5の遺伝子発現を解析したところ、成長の後期になるほどより発現が高くなることが明らかになった。変異体の形質が後期でより明確になるのはCH5の活性が後期になるほど高くなるためであると予想される。また多くの変異体でクロロフィル量が減少するとLHCが分解するため、葉緑体内でチラコイドのスタックが減少することが報告されているが、ch5変異体においても同様の結果が認められた。さらにタンパク質組成はLHC以外に大きな差はないことから、CH5はチラコイド膜に存在する微量のタンパク質を基質にしていることが予想される。以上の結果からCH5の機能と他の葉緑体プロテアーゼとの関連について議論する。

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葯のタペータム内には、タペトソームとエライオプラストという二種類の特徴的な脂質系オルガネラが存在する。花粉は、花粉管を伸長する前に、柱頭上で吸水・接着・認識といった幾つかのプロセスを経るが、その際ポーレンコートとよばれる花粉表面に存在する脂質に富んだ成分が重要な役目を果たす。このポーレンコートが形成されるためには、タペータムからの脂質成分の放出と花粉壁への沈着という特異のプロセスが必要である。私達は、タペータム内の脂質系オルガネラの形成及びその内包成分のタペータムからの放出と花粉壁への沈着のメカニズムを明らかにすることを目的に研究を行った。
加圧凍結技法を用いて野生型の葯を電子顕微鏡観察したところ、エライオプラスト内の脂質成分は白い顆粒状物質として観察されたが、同じ物が化学固定法では黒い物質として観察された。一方、タペトソーム内物質は、凍結固定でも化学固定でも黒く観察された。すなわち、固定法の違いによって脂質成分を識別することができた。この手法を用いて詳細に観察を行い、タペトソーム内の脂質とエライオプラスト内の脂質が、タペータムから異なるプロセスで放出され、花粉壁に沈着することを明らかにした。

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高等植物のイソプレノイド類は、細胞質に存在するMVA経路と色素体に存在するMEP経路の2つによって生合成され、この2つの経路間にはクロストークが存在する。MVA経路の鍵酵素HMGRの欠損変異体(hmg1)では、タペータム特異的なオルガネラである、色素体の一形態であるエライオプラストと小胞体由来であるリピットボディーのタペトソームに形態異常が見られ雄性不稔形質を示す。そこで本研究では、これら脂質を多く含んだオルガネラ内の脂質が、どの代謝産物によるものかを調べることを目的とした。まず、MEP経路のDXP合成酵素の欠損によるアルビノ変異体(cla1)の形態を観察したところ、エライオプラストは正常な形態を示した。このことから、エライオプラストは色素体であるにもかかわらず、その脂質成分はMEP経路由来ではないことが明らかとなった。次に、MVA経路の下流にあるステロール生合成経路のメチル化酵素SMTs遺伝子に着目し、SMT1の欠損変異体(smt1)とSMT2の過剰発現体(hs)と発現抑制体(hc)の形態を観察した。その結果、smt1ではエライオプラスト、タペトソームの形態に若干の異常が見られ、また、hsは野生型と差がなく、hcではタペトソーム形態の若干の異常が観察された。ゆえに、エライオプラストとタペトソームの脂質成分はHMGR下流でステロール生合成経路の中間に位置する産物と予想された。

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遠心過重力による茎の伸長成長阻害と肥大成長促進(成長方向の変化)のメカニズムを明らかにするため、過重力環境下で生育させたアズキ上胚軸の表層微小管の配向およびγ-チューブリン遺伝子の発現を解析した。過重力処理により細胞長軸に直交する微小管(横向きの微小管)を持つ細胞の割合は減少し、一方、細胞長軸と平行する微小管(縦向きの微小管)を持つ細胞は増加した。過重力環境で生育させた芽生えを1 g環境に移すと、微小管の配向は縦向きから横向きに変化した。このような微小管の配向変化は成長方向の変化に先行し、30分以内に観察された。次に、微小管の形成に関与すると考えられているγ-チューブリンの遺伝子発現を解析したところ、過重力処理後15分以内に発現量の増加が始まり、30分後には最大に達した。その後、発現量は低下し、120分後には1 g対照と同レベルになった。また、過重力環境から1 g環境に移した際も発現量は一過的に増加した。メカノレセプターの阻害剤であるランタンおよびガドリニウムで処理をした上胚軸では、過重力による成長方向、微小管配向ならびにγ-チューブリン遺伝子の発現の変化は見られなかった。以上の結果から、アズキ上胚軸は、重力刺激を原形質膜上のメカノレセプターで受容し、その情報によりγ-チューブリンのレベルを一過的に変化させることにより、表層微小管の配向を調節して、成長方向を変化させていると思われる。

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植物細胞の極性伸長の制御には表層微小管が大きく関与している。これまで我々は細胞の伸長方向が異常になりねじれ形質を示すアラビドプシス変異株を42系統単離、解析し、チューブリン遺伝子の変異が原因であることを報告した。これらは全て微小管が変異型チューブリンを取り込み性質が変化してしまうドミナント型の変異であった。変異株では伸長領域において表層微小管が伸長軸と同じ方向に傾いており、表層微小管束の配向とねじれ形質との相関関係が強く示唆されている。
微小管構造は全ての真核生物でほぼ共通であり、αチューブリンとβチューブリンが安定なヘテロ二量体を形成し、これが縦につながった微小管原繊維が通常13本横に束ねられて中空の微小管となるとされる。しかし、in vitro重合系では12から17本の原繊維からなる微小管のバリエーションが生じると報告されている。原繊維が13本の時以外では微小管の軸に対してわずかにねじれた形態をとり、このねじれが最終的な配向に影響を与える可能性が示唆されている。本会では、透過式電子顕微鏡によってアラビドプシス植物体の微小管の原繊維構造を観察する技術を確立し、野生株・変異株における観察を行ったのでこれを報告する。
また、微小管を蛍光標識した観察系を用いて、変異型微小管の動態変化を観察し報告しているが今回新たに複数の変異株で異常な動態を観察したのでこれも併せて報告を行う予定である。

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タバコ培養細胞BY-2より単離されたTMBP200はアフリカツメガエのXMAP215やシロイヌナズのMOR1/GEM1をメンバーとする真核生物に高度に保存されたMAPsファミリーのメンバーである。シロイヌナズナの変異体の解析から、植物におけるこのMAPsファミリーは、細胞周期を通じて微小管配列の構築に関与することが明らかになってきたが、その詳細は十分には明らかにされていない。我々は、誘導転写系を用いてTMBP200に特異的な二本鎖RNAの転写誘導のためのコンストラクトを構築し、これをBY-2細胞に導入してTMBP200の発現抑制が可能な形質転換株を得ている。これらの株では、紡錘体やフラグモプラスト微小管の配列が大きく乱れ、有糸分裂、細胞質分裂が正常に行われなかった。一方、間期の細胞では、TMBP200の発現抑制により表層微小管の消失や断片化などの大きな異常は認められず、またTMBP200の欠乏下においても、表層微小管はプロピザミド処理による破壊から、その除去後に回復した。ところが、サイトカイニン処理によるプロトプラスト由来細胞の伸長系を用いて、細胞伸長に対するTMBP200の発現抑制の効果を調べたところ、TMBP200の欠乏は、伸長する細胞の割合を大きく低下させることが判った。この結果は、TMBP200が細胞伸長過程における表層微小管の配列変化に重要な役割を持つ可能性を示している。

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コムギの発芽初期過程に特徴的なタンパク質として単離されたgerminは、シュウ酸酸化酵素であり、細胞壁中に分泌されることが示されている。シュウ酸酸化酵素はシュウ酸を分解して過酸化水素を生成することから、細胞壁中のペルオキシダーゼの活性に影響し、細胞壁のフェノール化合物の代謝調節に関与する可能性が考えられている。本研究ではコムギ芽生えを用いて、この可能性について検討した。先ず、染色法により芽生えのシュウ酸酸化酵素活性を調べたところ、細胞壁が強く染色され、また、シュートでも根と同様の強い活性が見られた。次に、播種後3日目のシュートから活性細胞壁標品を調製し、シュウ酸あるいは過酸化水素を含んだ溶液中で処理した後、弱アルカリ溶液で細胞壁から抽出されるエステル結合性のフェノール化合物量を調べた。その結果、この抽出画分に含まれるフェノール化合物の大半は、フェルラ酸とその重合体であるジフェルラ酸であり、シュウ酸または過酸化水素処理により同程度にジフェルラ酸量が増加した。従って、細胞壁のシュウ酸酸化酵素は、過酸化水素を生成・供給することでペルオキシダーゼの活性を増加させて、細胞壁内でのフェルラ酸のカップリング反応を促進すると考えられる。

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全ての植物細胞が持つ一次細胞壁に対して二次壁（＝木質）は、茎や胚軸、葯、鞘などの限られた組織にのみ形成される。本研究では植物特異的転写因子NACファミリーであるNST1, NST2およびNST3が二次壁の形成を制御することを明らかにしたので報告する。NST1プロモーターは、花茎や胚軸の木部、葯、鞘のバルブ内被層で、NST2プロモーターは主に葯で、NST3プロモーターは花茎や胚軸の木部、鞘のバルブ内被層で活性が認められた。そこでNST1, NST2の二重変異体を作成すると葯内被細胞層の二次壁肥厚が抑制され葯の開裂が完全に抑制された。一方NST1, NST3の二重変異体は、花茎や胚軸において二次壁形成がほとんど見られなくなり植物体は直立できなくなった。さらに果実鞘を詳細に調べると、NST1の変異体では、バルブマージンの二次壁形成が抑制され、NST1, NST3二重変異体ではさらにバルブ内被層の二次壁形成が抑制されることがわかり、いずれも変異体においても果実鞘の自然開裂が著しく抑制された。一方NST遺伝子のいずれかを異所的に過剰発現させると、地上部の様々な部位で異所的な二次壁肥厚が観察された。これらのことから3つのNST転写因子は、機能重複して、道管以外で起きる二次壁形成の大部分を制御する木質形成のマスター転写因子であることが明らかになった。

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陸上植物がより大きく成長するためには、自重を支持する構造、あるいは水や無機塩類等を体の末端まで輸送する特殊な構造が必要である。このような構造を有する支持組織そして輸送組織においては、各細胞が固有の細胞壁を分化させることが知られている。植物の支持組織や輸送組織の形成に関与する細胞壁構築メカニズムを明らかにするために、マイクロアレイ法を用いて、シロイヌナズナの上部組織を支える花茎の基部組織で高発現している細胞壁関連遺伝子群を同定した。この中には、細胞壁の肥厚や硬化に関与する細胞壁関連遺伝子が多数存在したが、興味深いことに、上部組織の荷重を軽減することによって、これらの細胞壁関連遺伝子の発現は減少した。この結果は、上部組織の荷重が、これらの遺伝子産物を通して、花茎の基部における細胞壁の肥厚や硬化を促進しているという可能性を示すものであった。そこで我々は、これら全ての遺伝子について、プロモーター::GUS遺伝子を導入した形質転換体を作成して、組織レベルでの各遺伝子の発現パターンを解析して、花茎基部における細胞壁の肥厚や硬化とこれらの遺伝子との関連性を詳細に解析した。これまで中心的に解析してきた花茎基部の輸送組織の細胞壁で働くグリシンリッチタンパク質についての最新の研究結果とともに、花茎基部における細胞壁の肥厚や硬化に関与する遺伝子群の全体像について報告する。

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我々は、Thermosynechococcus vulcanus RKNにおける低温培養時の菌体の凝集現象と、セルラーゼ添加による凝集解消を報告しており、これらの関係性に着目している。また、セルロース合成酵素遺伝子ホモログの破壊株における、低温培養時の時間依存的な凝集度の測定の結果、凝集はTvtll0007破壊株では起こらず、Tvtlr1795破壊株では素早く、Tvtlr1930-33破壊株では野生株同様に起こることも分かっている。
今回は、この低温凝集が上記遺伝子の発現レベルに起因するのかを探るため、定量的RT-PCRによるmRNA発現解析を行った。なお、低温凝集は約48h後には完了した。低温培養0hを基準として、Tvtlr1795、Tvtlr1930-33の発現は1時間後には大きく上昇し、その後やや低下するものの高いレベルを保った。一方、Tvtll0007の本来の発現レベルはTvtlr1795、Tvtlr1930-33に対して高かった。また、6時間以降では通常温度に比べ低温での発現が有意に高かったものの、誘導の程度は大きくなかった。このことから、低温凝集の主な要因としては、これらの遺伝子発現の誘導だけではなく、凝集に必須のTvTll0007の酵素活性の上昇なども示唆される。よって、現在セルロース合成活性のin vitro、in vivoにおける測定を試みている。

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シロイヌナズナ温度感受性突然変異体lignescens（lig）は、制限温度下で成長阻害やリグニン異常蓄積を示す点に特徴がある。本研究では、リグニン合成に関する新規メカニズム解明のため、lig変異体の解析を行った。lig変異体は許容温度の18℃では正常に生育するが、制限温度の28℃条件下では根の成長が著しく抑制された。リグニン定量の結果、28℃処理後2日目からリグニン含有量の増加が示されるとともに、フロログルシノール塩酸染色により根端付近でリグニンの異常蓄積が見られた。また、エバンスブルー染色の結果、根端付近の根毛で細胞死が起きていた。一方、リグニン合成阻害剤AIP処理を行うことにより、リグニンの異常蓄積は抑制されたが、成長回復は見られなかった。さらに、リグニン合成関連およびその他の遺伝子としてAtPAL1、AtCAD-D、AtCCR1、AtCCR2、またVSP1、PDF1.2、CESA1、CESA3の発現解析を行ったところ、28℃条件下に置いたlig変異体ではAtPAL1、AtCAD-D、AtCCR2、PDF1.2の発現が増加した。これらの結果を踏まえ、lig変異体におけるリグニンの異常蓄積と根の成長阻害機構について考察する。

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私たちはこれまでヒャクニチソウ管状要素分化実験系を用い分化過程の管状要素特異的に発現する新規ペルオキシダーゼ遺伝子ZPO-Cを単離し、ZPO-Cが管状要素のリグニン化に密接に関連している事を示した。また、シロイヌナズナでもZPO-Cと高い相同性を示すホモログが見つかり、リグニン化への関与が示唆されているが、十分な解析はなされていない。
本研究ではシロイヌナズナのZPO-CホモログであるAtPrx66、またAtPrx66に最も相同性が高いAtPrx47及びAtPrx64について、リグニン生成における役割を明らかにするためシロイヌナズナ植物体での解析を試みた。各ペルオキシダーゼのプロモーター領域とレポーター遺伝子GUSを結合したコンストラクトを作成・導入することで各ペルオキシダーゼの発現部位を解析した。芽生えを用いた組織化学的なGUS活性の解析の結果、いずれの形質転換系統でも根で強い発現を示したが、AtPrx66は分化過程の導管でのみ、AtPrx47は導管及び導管周辺の柔組織、AtPrx64はAtPrx47で活性が見られた領域を取り囲む領域で発現が見られ、これらの発現は同心円的に配置されていることが分かった。またAtPrx66とAtPrx47は葉の維管束でも発現が見られた。これらの結果に加え、発達した植物体の各器官におけるGUS活性解析の結果についても報告し、これらのペルオキシダーゼの機能について考察する。

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リグニンはモノリグノールが複雑に重合し形成される高分子物質である。リグニンは植物体内で維管束組織の二次細胞壁に蓄積し、細胞壁の強化をする。またリグニンは病傷害によっても蓄積し、生体防御に関与する。モノリグノールの重合は、細胞外において主にペルオキシターゼによって触媒されている。モノリグノールを重合する際に、ペルオキシターゼは過酸化水素を基質として利用している。
本研究では過酸化水素の量を低下させることで、モノリグノールの重合を抑え、リグニン合成を抑制した植物体を作製することを目的にしている。過酸化水素の量を低下させるため方法として、2種類の細胞外に輸送されるカタラーゼを用いた。1つはBotrytis cinereaのもつ細胞外カタラーゼBcCAT2を用い、もう1つは本来ペルオキシソームに局在するシロイヌナズナのカタラーゼAtCAT2にヒャクニチソウペルオキシターゼZPO-Cの細胞外輸送シグナルを付加させた。これら2種類のカタラーゼ遺伝子のC末端に解析用としてGFPもしくは6×Hisを付加させた。アグロバクテリア法にてタバコ培養細胞BY-2とシロイヌナズナに導入し、形質転換体を得た。現在、BY-2を用いた酵素学的解析やシロイヌナズナを用いた植物体の成長やリグニン生成への影響の解析を進めている。

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本研究グループでは、TFIIA型ZnフィンガーファミリーやERFファミリーに属する一部の転写因子が強い転写抑制活性を持ち、これらの転写因子による下流の遺伝子の発現抑制が植物の生理機能に重要であることを明らかにした。これらの転写抑制因子のC末にはEARモチーフと呼ばれる配列が保存されており、この保存領域が転写抑制ドメインとして機能することが分かった。驚くべきことに、このEARモチーフ中に含まれる“XLxLXL”という6残基からなる短い配列が強力な転写抑制能を持つことが示された。これまでにXLxLXLのように数残基のみで強力に機能する転写抑制ドメインが同定されたという報告は無い。またEARモチーフは植物にしか保存されていないため、植物が他の生物にはない独自の転写調節機構を発達させたものと思われる。しかし、本転写抑制ドメインが、なぜこのように強力な転写抑制能を発揮するのか、そのメカニズムは不明である。
EARモチーフは、6残基のみで強力な転写抑制機能を発揮するが、この6残基のみの短いペプチド鎖が、酵素活性等を有し直接転写抑制に作用している可能性は低い。したがって、転写を抑制するためには他の因子、例えばコリプレッサーが必要であるものと推測する。そこで本研究では、酵母two-hybridシステムを用いてこのEARモチーフと相互作用する因子を同定し、それらの因子がEARモチーフを介した転写抑制機構にどのように関わっているのかについて議論する。

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これまでに我々は、強光および酸化ストレス応答性の熱ショック転写因子（HsfA2）を同定した。HsfA2は強光だけでなく種々のストレスに応答することから、種々のストレス応答のシグナル伝達経路で機能することが示唆された。さらに、HsfA2過剰発現植物（35S::HsfA2）を用いてHsfA2標的遺伝子を同定したところ、いくつかのHSPやストレス防御遺伝子などがHsfA2により制御されていることが明らかとなった(Plant J, 2006)。そこで、強光および酸化ストレス条件下におけるHsfA2による下流遺伝子の発現制御機構を詳細に解析することを試みた。
HsfA2標的遺伝子について強光およびH2O2処理に対する応答を解析したところ、全ての遺伝子がHsfA2と同様に応答することが明らかとなった。また、これらの遺伝子のHsfA2ノックアウト株における強光応答性を解析した結果、野生株に比べ応答が抑制されることから、HsfA2に直接制御されることが示された。そこで、35S::HsfA2で最も誘導されていたHSP18.1-CIのプロモーター領域を用いたDual-luciferase assayによってHsfA2の認識配列を同定したところ、HsfA2はHSEを認識していることが明らかとなった。さらに、3つのHSEエレメントの必要性を検討したところ、HsfA2はいずれか1つのHSEのみで下流遺伝子の発現を制御できることを示した。現在、HsfA2による他の下流遺伝子の制御機構、さらには他のHSFのHSE認識機構についても検討中である。

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イネ・カタラーゼ遺伝子CatBは根特異的発現を示すことがわかっている。地上部の光条件の変化によるCatBの根での発現について調べたところ、mRNAは暗黒条件下で減少し、代わりにスプライシングされていないセンス及びアンチセンス RNAが蓄積することがわかった。このセンス－アンチセンス CatB RNAは、地上部を取り除くと蓄積がみられなかった。また、イネを暗黒条件から明期と暗期が周期的に変わる明暗条件に移すと、センス－アンチセンス CatB RNAが減少し、CatB mRNAが増加することがわかった。これまでの結果から、地上部からのシグナルが根でのセンス－アンチセンス CatB RNAの蓄積に関与しているものと予想され、暗黒条件のような生育に適さない光環境下において、アンチセンスCatB RNAがセンスCatB RNAと2本鎖RNAを形成することにより、センスCatB RNAのプロセシングやその後に続くタンパク質合成が抑えられているものと推測される。地上部から根に伝達されるシグナルとして、オーキシンが候補の1つであることが示されたので報告する。
Iwamoto and Higo (2006) Gene 377: 186-194.

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種々の植物遺伝子が糖栄養源の変動に応答した発現制御を受けている。マイクロアレイを用いた解析は、シロイヌナズナ全遺伝子の約5％が糖に応答したmRNAの誘導を受け、またその80％以上は糖によるmRNA誘導がタンパク質合成の阻害でブロックされる二次応答性のものであることを示している。我々は、糖によって短時間にmRNAが誘導され、その誘導がシクロヘキシミドで阻害されない推定転写因子を選抜した。SPRF3(AtSCL4)とSPRF4(AtSCL15)は異なるサブファミリーに属するGRAS因子である。AtSCL4^p:GUSやATSCL15^p:GUSの形質転換植物を用いた解析から、AtSCL4とAtSCL15の発現はいずれも糖に応答して転写レベルで制御されているが、互いに発現部位が異なることが明らかになった。AtSCL4あるいはAtSCL15の過剰発現によって発現が増加する遺伝子には，糖誘導性遺伝子に加え、ジャスモン酸（JA）生合成に関わるAOS、JA応答性のVSP、PDF1.2など多くのJA関連遺伝子が共通に含まれていた。AtSCL4とAtSCL15の発現はMeJAで誘導されず、またAtSCL15とAOSの発現部位は類似している。糖によるAtSCL4、AtSCL15の発現は、JA合成活性の調節を通して一群のJA応答性遺伝子の発現を制御している可能性について、更なる検証を進めている。

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種子で働く物質蓄積システムは、植物発生における遺伝子発現制御の理解のためのモデル系として、主にシロイヌナズナやナタネでの解析が進んでいる。本研究では、それらの種子とは異なるタイプに属するゴマ種子での物質蓄積機構を解明するために、種子に貯蔵される油脂およびタンパク質の蓄積に関わる遺伝子群の登熟過程における発現様式を解析した。(1) 油脂生合成酵素 (α-CT, BC, BCCP, KAS1, ACP, FAD2) とオレオシンの各遺伝子は、すべて開花後2～3週目にかけて一斉に高発現を示した。この時期には急激な油脂含量の増加が認められた。種子での油脂蓄積を制御する転写因子、WRI1の遺伝子発現の時期は、オレオシン遺伝子の発現時期と一致していた。このことは、WRI1がオレオシン発現の調節に密接に関係していることを暗示している。(2) 種子貯蔵タンパク質 (SSP) 遺伝子のうち、11S globulin遺伝子は2～3週目に発現レベルが上昇した後、徐々に減少したのに対し、7S globulin遺伝子は2～6週目にかけてほぼ一定の発現レベルを示した。一方、2S albumin遺伝子の発現レベルは1～3週目に発現レベルの上昇がみられ、以後、次第に低下した。SSPの蓄積を制御する転写因子 (ABI3, ABI5, L1L, bZIP12) の各遺伝子の発現様式をSSP遺伝子の場合と比較した結果、11Sおよび7S globulinの遺伝子発現制御にはABI5とABI3が関わり、2S albumin遺伝子の制御にはL1LとbZIP12が関わっている可能性が示唆された。

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シロイヌナズナ ASML1 は、モデル糖誘導性プロモーターの活性化を指標にしたエンハンサータギング法で同定された AP2 型転写因子をコードする遺伝子で、種子の油脂蓄積量の低下した wrinkled1 変異株の原因遺伝子と同一である。ASML1/WRI1 の発現は糖処理で上昇し、その過剰発現は種々の糖誘導性遺伝子の発現を亢進することから、種子におけるショ糖炭素源の油脂への分配を正に制御すると推定された。今回、ASML1/WRI1 の油脂合成における役割を明らかにする目的で、過剰発現株を用いたマイクロアレイ解析を行った。その結果、ショ糖代謝酵素や葉緑体内での脂肪酸合成系などの遺伝子の発現が、野生型に比較して過剰発現株において増加しており、またこれら遺伝子の発現は遺伝子破壊株では低下していた。しかし、トリアシルグリセロールの合成に関わる TAG1 やオレオシン遺伝子の発現には顕著な変化は見られなかった。種々の遺伝子について、プロトプラストにおけるプロモーターと LUC レポーター遺伝子の一過性発現に及ぼす効果を調べたところ、ASML1/WRI1は脂肪酸合成系遺伝子のプロモーターを顕著にtrans-activationしたが、TAG1 やオレオシン遺伝子のプロモーターの活性化は低かった。これらの結果から、ASML1/WRI1 はショ糖の取込から葉緑体内での脂肪酸合成に至る過程の遺伝子の活性化に関わると推定される。

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シロイヌナズナ ASML1/WRI1 は油脂貯蔵に欠損を示す wrinkled1 変異株、糖誘導性プロモーターの活性化を示す asml1 変異株から同定された AP2 型転写因子である。変異株を用いたマイクロアレイ解析の結果などから、ASML1/WRI1 はショ糖代謝や脂肪酸合成系の遺伝子の発現を活性化してショ糖の油脂への転換の促進に働くと推定されている。実際に、プロトプラストを用いた一過性発現系において、ASML1/WRI1 は種々のショ糖代謝や脂肪酸合成系の遺伝子プロモーターからの転写を trans-activation することが示された。今回、ASML1/WRI1 の配列特異的 DNA 結合活性を明らかにする目的で、一過性発現系で特に強く活性化を受ける SUS2、Pl-PK、KAS1、BCCP2 の種々の欠失プロモーターを用いた ASML1/WRI1 による trans-activation assay を行ったところ、いずれも翻訳開始点上流 300 bp の領域が trans-activation に必要であることが明らかになった。組換え GST 融合 ASML1/WRI1 はこれら活性化に必要な領域の DNA 断片に結合し、ASML1/WRI1 はこれら遺伝子のプロモーターに直接結合して転写を活性化すると考えられる。現在、ASML1/WRI1 の結合配列を決定するための解析を進めている。

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VOZ（Vascular plant One Zinc-finger protein）は、シロイヌナズナ液胞局在型プロトン輸送性ピロフォスファターゼであるAVP1のプロモータ領域に結合するone-finger型のzinc-finger motifを持つタンパク質としてone-hybrid法により単離され、それぞれAtVOZ1 (At1g28520)とAtVOZ2（At2g42400）と名づけられた。また、VOZ遺伝子はシロイヌナズナなどの双子葉類だけでなく、単子葉類やシダ、コケ植物であるセン類まで高度に保存されていることから、陸上高等植物の進化を考える上で非常に興味深い遺伝子である。AtVOZは、in vitroの結合実験でDNAの特定の塩基配列を認識して結合することから、新規の転写因子であると考えている。更にAtVOZ1, AtVOZ2の二重変異株は、長日条件での花成遅延が観察される。この事実から、AtVOZ遺伝子のシロイヌナズナにおける花成への何らかの関与が考えられる。そこでまず私たちは、AtVOZ遺伝子産物がどのような遺伝子の発現調節に関わっているか調べるためにマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、AtVOZ1, AtVOZ2二重変異株では花成関連遺伝子FT並びにTSFの発現が顕著に低下していることが明らかとなった。その他の遺伝子発現の変化についても発表する。

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植物の様々な光応答は光受容体フィトクロムを介して制御されている。この光応答のシグナル経路を明らかにするために、フィトクロム相互作用タンパク質をY2Hでスクリーニングし、シロイヌナズナVOZ (Vascular plant One-Zinc finger) を単離した。VOZは、シロイヌナズナの液胞局在型プロトン輸送性ピロフォスファターゼであるAVP1の発現を調節するZinc fingerモチーフを有するタンパク質としても知られている。VOZは陸上植物に広く保存されており、シロイヌナズナではAtVOZ1, AtVOZ2の2分子種存在している。シロイヌナズナのタグラインを探索したところVOZ1,VOZ2各々二つずつ同定された。voz1/voz2二重変体は、長日条件において花成遅延が観察された。フィトクロムは光周性開花制御に関与しており、その下流で機能する因子としてCO、FTが知られている。しかしながら、光受容体からFTの発現制御に至る機構はまだ明らかになっていない。そこで、二重変異体においてこれらの遺伝子の発現をReal time PCRにより調べた。その結果、FT遺伝子の概日リズムに依存した発現上昇が観察されなかった。VOZがフィトクロムを介し、光周期に依存した花成経路において果たす役割について議論する。

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硫黄欠乏に応じてGFPが発現する形質転換シロイヌナズナを変異原処理し、硫黄栄養条件に応じた転写制御に異常の見られる変異株の単離、解析を行ってきた。今回は硫黄欠乏応答とクロロフィルの合成が共に減少した3つの新たな変異株について報告する。定量的RT-PCRの結果、これらの変異株では硫黄同化経路において重要な硫黄欠乏応答性遺伝子であるAPS還元酵素（APR1）、硫酸トランスポーター（Sultr4;2）、セリンアセチル転移酵素（Serat3;2）の発現が硫黄欠乏条件でどれも野生型株に比べて減少していた。原因遺伝子をマッピングした結果、フェレドキシン依存型グルタミン酸合成酵素（GLU1）、プラスチドRNA ポリメラーゼのシグマ因子（SIG2）、Mg-キレーターゼIサブユニット（CHLI1）の3つの遺伝子にそれぞれ変異が見つかった。これらの遺伝子については、欠損によりクロロフィル前躯体の合成が阻害されクロロシスになることが既に知られていたが、今回の解析により、硫黄欠乏応答にもこれらの遺伝子が関与することが新たに示唆された。クロロフィル合成経路は、光合成関連遺伝子の発現制御に関わることが既に報告されているが、硫黄代謝や硫黄欠乏応答性遺伝子の発現制御においても重要な働きを担っている可能性がある。

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細胞内で特定のRNAが過剰に蓄積するとRNAサイレンシングが誘発されるというRNA閾値説は、コサプレッションの誘発原因説として考えられている。本研究において、α-リノレン酸の合成を触媒するタバコ小胞体局在型ω-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(NtFAD3)のコサプレッション株に、さらにNtFAD3遺伝子を含むコンストラクトを多重導入したところ、α-リノレン酸含量が増加した株が得られた。NtFAD3コサプレッション株は本来NtFAD3遺伝子を過剰発現を目的として導入したところ導入遺伝子と内在性遺伝子ともに発現が抑制されてしまった株であるので、上記のα-リノレン酸含量が増加した株はrevertant株と呼ぶ事ができる。revertant株では、導入遺伝子のコピー数が増える事で過剰発現の表現型に戻ったことになる。この現象の原因を調べるため、NtFAD3コサプレッション株にプロモーター配列のヘアピンコンストラクトを導入したところ、一部にα-リノレン酸含量が増加し過剰発現した系統が得られた。つまり、プロモーター配列に対するヘアピンRNAのを転写によって、標的プロモーター配列がメチル化され、導入遺伝子の転写活性が低下すると、コサプレッションを誘発する細胞内のNtFAD3転写産物濃度が閾値を下回ったため、残存するNtFAD3 mRNAによる過剰発現が成立したと考えられる。

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シスタチオニン γ-シンターゼ（CGS）は植物のメチオニン生合成の鍵段階を触媒する酵素である．シロイヌナズナのAtCGS1発現はmRNAの分解段階でメチオニンの代謝産物のS-アデノシルメチオニン（SAM）によって負のフィードバック制御を受けている．これまでにSAMによりAtCGS1第1エキソン内で翻訳停止が誘導され，それに引き続いてmRNA分解が起こることがわかっている．この制御にはAtCGS1第1エキソンが必要十分な領域であり，特にAtCGS1第1エキソン中の14アミノ酸から成るMTO1領域が重要であることが示されている．しかし，これまでこの領域は植物において広く保存されているものの，SAMによる転写後制御が他植物でも起こるかどうかは不明であった．
そこでシロイヌナズナ以外のモデル植物のAtCGS1第1エキソンに相当するcDNA領域を単離して，シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過的発現系とコムギ胚芽抽出液由来の試験管内翻訳系を用いて解析を行った．その結果，モデル植物のAtCGS1第1エキソン相当領域の下流にレポーター遺伝子を繋ぐと，AtCGS1第1エキソン同様にSAM添加時にレポーター活性が低下した．また試験管内翻訳系での解析により翻訳停止が起こっていることもわかった．これらの結果より，CGSのSAMによる転写後制御は植物間で保存された機構であることが示唆された．

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シスタチオニン γ-シンターゼ（CGS）はメチオニン生合成の鍵段階を触媒する．シロイヌナズナAtCGS1遺伝子の発現は，メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニンに応答してmRNA分解の段階で負に制御される．この制御にはAtCGS1第1エキソン内の植物間で高度に保存された十数アミノ酸の領域（MTO1領域）が関わっている.小麦胚芽抽出液の試験管内翻訳系でこの制御は再現され，この系における解析から，mRNA分解に先立ってMTO1領域の直後Ser-94で翻訳の一時停止が起こることが明らかになった．また，翻訳停止にはTrp-93，Ser-94が重要であることが示された．このTrp-93，Ser-94は被子植物間では保存されているが，ヒメツリガネゴケPpCGSでは異なっている．そこで本研究では，ヒメツリガネゴケとシロイヌナズナの一過的発現系，小麦胚芽抽出液の試験管内翻訳系において，このPpCGSの転写後制御の強さを解析した．その結果，シロイヌナズナの系と小麦胚芽抽出液の系では，翻訳停止部位にTrp-SerをもたないPpCGSではAtCGS1よりも弱い制御が観察された．しかし，ヒメツリガネゴケの系では結果は逆転し，つまりPpCGSではAtCGS1よりも強い制御が観察された．これらの結果は，cis因子である配列以外に，transに働く因子がこの転写後制御に関与することを示唆している．

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シロイヌナズナのシスタチオニンγ‐シンターゼ (CGS) をコードするCGS1 mRNAでは，メチオニンの代謝産物であるS-アデノシル-L-メチオニン (SAM) に応答して第1エキソンのコード領域内で翻訳中のリボソームが停止し，それと共役してmRNA分解が起こる．この制御はコムギ胚芽抽出液試験管内翻訳系において再現され，5’領域を欠いた複数種のmRNA分解中間体が蓄積する．分解中間体の5’末端の解析から，SAMに応答して停止したものを先頭に複数個のリボソームが連なって停止し，各リボソームの5’側内部でmRNA分解が起こることが示唆された．さらに先頭のリボソームでは転座の段階で翻訳の停止が起こり，部分翻訳産物であるペプチジル-tRNAはリボソームのAサイトを占める.
ピューロマイシンはリボソームのAサイトに作用する翻訳伸長阻害剤である．先頭のリボソームと後続のものを，部分翻訳産物の解析により区別して，ピューロマイシンに対する感受性を調べた．その結果，後続のリボソームはピューロマイシンに対する感受性が高かったのに対し，先頭のものでは低かった．本阻害剤の作用機構から，先頭のリボソームのAサイトはペプチジル-tRNAで埋まり，後続のものでは空であることが示唆された．

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Non-coding RNA (以下ncRNA)はさまざまな遺伝子発現調節を行っている。大腸菌では網羅的解析により81のncRNAが同定されているが、光合成を行う原核生物ではあまり解析が進んでいない。当研究室では、淡水性ラン藻Synechococcus elongatus PCC 6301(以下PCC 6301)ゲノムの全塩基配列を決定し、タンパク質遺伝子2525個、RNA遺伝子55個を予測した。さらに、遺伝子間領域に未知のncRNA遺伝子が存在するかどうかを明らかにするため、ゲノム間の相同性検索とPCC 6301のアレイ解析の2つの方法で検討した。PCC 6301とSynechocystis sp. PCC 6803、Nostoc sp. PCC 7120、Thermosynechococcus elongatus BP-1ゲノムの遺伝子間領域の相同性検索を行った結果、3カ所の相同性の高い領域を見い出した。1つはguaBとtrxA遺伝子間領域で、この中に60 ntの新規RNA遺伝子を同定した。さらに2カ所の領域について解析を進めている。また、対数増殖期のPCC 6301細胞より抽出したRNAを用いて遺伝子間領域を含むオリゴアレイ解析を5回行った結果、隣接遺伝子よりも発現量の多い遺伝子間領域が31カ所検出された。計33カ所の領域をノーザン解析した結果、7カ所に隣接遺伝子より著しくサイズが小さい転写物が検出された。これらの転写物の5’末端を決定し、二次構造を予測したので報告する。

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植物は、葉窒素量の約4割を占める光合成律速因子RuBisCOの合成と活性化を厳密に制御し、光合成速度や窒素バランスを高度に調節している。RuBisCOの量的制御機構は、生合成と分解に関わる多様な因子群により達成されると想定されるが、その分子機構の全貌は明らかでない。本研究では、植物体地上部におけるRuBisCOの蓄積量が15～60%に低下した4系統のシロイヌナズナqrr (Quantitative regulation of RuBisCO) 変異体を解析し、原因遺伝子とRuBisCO量的制御の関連を考察した。暗黒下で4日間生育したqrr変異体に0, 30, 60時間の光を照射し、緑化過程におけるRuBisCO蓄積量と遺伝子発現量の推移を調べたところ、RuBisCOの転写段階に異常は無いが、RuBisCO蓄積量が常時低下している株(1)、光照射後期に低下した株(2)、低下していない株(3)に分類された。グループ1の原因遺伝子は、葉緑体スプライシング因子(CRS1)及び葉緑体移行シグナルを有する未知機能遺伝子であり、RuBisCO合成に関わると考えられた。グループ2と3の変異部位は、光呼吸酵素AGT1及び葉緑体移行シグナルを有する未知機能遺伝子上に有り、特に後者は下位葉におけるRuBisCO量の分解に関わるものと予想された。現在、qrr変異体の表現型と原因遺伝子の機能との連関について、より詳細に解析している。

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高等植物のオルガネラでは、RNA編集によってRNA鎖上の特定のCがUに変換される。個々の編集部位はPPR (pentatricopeptide repeat)タンパク質によって特異的に認識されることが示唆されている。PPRタンパク質は、オルガネラでの様々なRNAプロセシングに関わっており、シロイヌナズナのゲノムには450ほどがコードされている。しかし、シロイヌナズナでは469のRNA編集部位がみいだされており、ひとつのPPRタンパク質が一つの編集部位だけを認識しているとは考えにくい。また葉緑体形質転換植物の解析からも、いくつかのRNA編集部位の反応に共通のトランス因子が関与している可能性が示唆されてきた。しかし、これまで単一のトランス因子が複数のRNA編集部位を認識することを示す直接の証拠は得られていなかった。そこで本研究では、タバコ葉緑体in vitro RNA編集系を用いたUVクロスリンク実験によって、そのような共通因子の探索を行った。その結果、タバコのndhF-1、ndhB-9、rpoB-3の3つの編集部位には分子量95kDaの同一因子(p95)が結合していることが明らかになった。このp95は、上流近傍のシス配列と標的C塩基の両方に結合していた。従って、p95は、psbE-1部位を認識するp56やpetB-1部位に結合するp70などと同様な性質をもった部位認識因子であると予想される。

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植物では、RNA silencingは遺伝子発現制御機構やウイルス防御機構として働いている。これに対し、多くの植物ウイルスはRNA silencingに抵抗する手段であるsilencingサプレッサーをコードしていることが分かっている。このウイルスのsilencingサプレッサー効果の検出方法としては、Nicotiana benthamianaにおけるagroinfiltration法が広く用いられている。この系で、Arabidopsis thaliana においてsilencingに関わるとされている2本鎖RNA（dsRNA）結合タンパク質（DRB4）を調べてみると、ウイルスサプレッサー（HC-Pro）と同様な結果が得られた。A. thalianaには、DRB4を含めて5つのDRBタンパク質が存在しているが、その多くは機能がよく分かっていない。そこで、これらのタンパク質についてもこの系で実験を行い、silencingへの影響の有無を調査している。また、DRBファミリーと同様にdsRNA結合モチーフを持つが、機能が未知であるRNase III様タンパク質、RTL2についても調査している。

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RNA editingとは、塩基の挿入、欠失もしくは置換によって機能的な成熟RNAが生じる現象である。陸上植物の葉緑体では、これまでに、転写産物の特定部位のCがUへ変換するeditingが見出されており、葉緑体遺伝子の発現制御に重要な役割を担っていることが明らかになっている。葉緑体でのeditingは、組織ごとに異なる効率で起き、発生ステージの違いによる制御の可能性も示唆されている。一方、環境条件によりeditingの起きる効率が変動する可能性に関しては、限られた報告例しかなく、いまだに網羅的な検討は行われていない。本研究では、RNA editingを受ける全部位が特定できるタバコ葉緑体において、光条件の違いが各部位でのediting効率に影響を与えるか否かを調べた。明所で育てた緑葉と暗所での黄化芽生えからRNAを抽出し、それぞれ全38部位におけるediting効率を測定し比較した。その結果、明条件下と暗条件下とで、34か所の部位での効率には差がほとんど検出できなかったものの、残りの4部位では顕著な効率の変化が認められた。rpoA遺伝子とndhD遺伝子に存在する計3か所の部位では、明条件下で効率が30-80％上昇していたが、逆に、ndhA遺伝子中の部位では、明条件下で30％の効率低下が観察された。本研究の結果は、葉緑体遺伝子のうち少なくとも一部は、その発現レベルの光制御にRNA editingが強く関与していることを示している。

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トランスポゾンはゲノム寄生因子とも呼ばれ、多くの生物においてゲノムの主要な構成因子になっている。宿主ゲノムの安定化には寄生因子を不活性化する宿主側の機構が必要となる。遺伝子サイレンシングは寄生因子に対し宿主が獲得した防御機構であるということもできる。MicroRNA (miRNA)は転写後遺伝子サイレンシングのトリガーとして働く低分子RNAの一種である。低分子RNAはしばしばPTGSの誘導に重要な役割を果たしており、特に、寄生因子由来の低分子RNAは宿主側の防御機構による寄生因子の不活性化に関与することが明らかにされている。イネの低分子RNAのライブラリーから見いだされたmiRNAの一種であるmiRJはトランスポゾン様の構造から産出される。miRJはDNAメチル基転移酵素を標的とすることが配列上予想された。DNAメチル基転移酵素は一般に遺伝子サイレンシングの確立と維持に機能することから、このmiRNAはトランスポゾン中から産出されるにもかかわらずこれまでのケースとは逆に遺伝子サイレンシングを抑制すると予想される。このことはトランスポゾンが低分子RNAを利用して宿主の遺伝子サイレンシング機構を回避する経路の存在を示唆している。本研究ではこの経路の存在を明らかにするために、miRJがDNAメチル基転移酵素の発現を制御しているか否を解析した結果を報告する。

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シロイヌナズナのMOM1はゲノム中の一部の反復配列や外来性遺伝子の転写型サイレンシングに必須の因子だが、既知の標的遺伝子のすべてが多コピーで存在していたため、詳細な機構解析は困難だった。今回、内在性シングルコピー領域の転写抑制にもMOM1が関与していることが明らかになり、詳細な解析が可能になった。マイクロアレイ解析により、mom1変異体でRNA蓄積量が上昇している遺伝子としてとしてcyclophilin40（CyP40）遺伝子が検出されたが、RNAブロット解析の結果から、mom1変異体では野生型には見られないサイズのCyP40 RNAが多量に蓄積していることが示された。解析の結果、（1）変異体で特異的に蓄積している転写産物は、CyP40遺伝子上流のトランスポゾン様配列内のシングルコピー領域に転写開始点をもつが、転写の向きはトランスポゾンの向きとは逆であること、（2）転写開始点付近およびCyP40遺伝子領域内のヒストンH3K4/K9/K27メチル化がmom1変異体における活性化に伴って変化しないこと、（3）蓄積している転写産物がCyP40遺伝子領域内でトランススプライシングを受けていることなどが明らかになった。トランススプライシングを受けたRNAは野生型においてもごく僅かに蓄積しており、変異体では幾つかのスプライシングパターンが検出された。

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近年RNAiで知られるsiRNAが、DNAメチル化やヒストン修飾を誘導しクロマチンの不活化を引き起こすことが示唆されている。また、シロイヌナズナやイネにおいて内在性siRNAのクローニングが行なわれ、内在性siRNAの種類の豊富さが浮き彫りとなった。そのため、siRNAのシグナルがゲノムの幅広い領域に届き得ることが考えられるが、全てのsiRNAがそれぞれターゲットとなるクロマチンに対して機能するのかは分からない。そこで本研究では、任意のゲノム配列と相同性を持つsiRNAをイネに高蓄積させ、そのsiRNAがクロマチンの不活化を引き起こすことができるのかどうかを解析した。任意のゲノム配列にはプロモーター配列を選択した。これまでに、8つの遺伝子をそれぞれターゲットにした形質転換イネを作出し、ターゲットプロモーター領域のDNAメチル化とヒストン修飾の変動を解析した。また、クロマチンの不活化の指標として、ターゲット遺伝子の発現抑制の程度を解析した。それらの結果から、下記の3つを示唆および考察したので、本年会で議論したい。1) siRNAが引き起こすクロマチンの不活化には、DNAメチル化およびヒストン修飾が重要である。2) siRNAはどのようなゲノムに対してもヒストン修飾を誘導するわけではない。3) siRNAはどのようなゲノムに対してもクロマチンの不活化を引き起こすわけではない。その要因のひとつに、ヒストン修飾を誘導できるかどうかという点が考えられる。

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近年のゲノム研究から、トランスポゾンは植物ゲノムの多くを占めることが明らかになってきている。多くのトランスポゾンは不活性化状態にあり、その不活性化はエピジェネティックな制御を受けていることが示唆されている。マイクロアレイ解析によって、シロイヌナズナのDDM1がトランスポゾンや縦列反復配列のメチル化に関与することが示されている。
本研究では、Brassica rapaにおいてddm1-RNAi低メチル化形質転換体を用いてMSAP (methylation-sensitive amplification polymorphism)解析を行い、BrDDM1によるDNAメチル化制御を受ける配列を探索した。その結果、制御を受ける配列の多くはトランスポゾン様配列や反復配列であることが分かった。また、器官の違いによるDNAメチル化の差を調べるために、葉、雄蕊、雌蕊から抽出したDNAを用いて同様にMSAPを行ったところ、いくつかの遺伝子領域においてDNAメチル化に器官による差が見られたが、この配列について野生型とddm1-RNAi低メチル化形質転換体でMSAPのバンドに差は見られなかった。
以上の結果から、BrDDM1はトランスポゾンや反復配列のメチル化を制御し、器官の違いによるメチル化の変化への関与は小さいことが示唆された。

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DNAのメチル化は、クロマチン構造を制御し、遺伝子の発現を調節することが知られている。このことはDNAのメチル化状態が変化すると、遺伝子発現が変化し、最終的には生物の形質が変化することを示唆する。私たちは、イネ種子(ヤマダニシキ)を脱メチル化剤5-アザデオキシシチジンで処理し、矮性かつ早生の変異株を得た。この形質は、少なくとも9代目まで安定に遺伝した。DNAメチル化レベルの低下も安定に遺伝していることが明らかになった。そこで、MSAP法によって、変異株ゲノムの脱メチル化領域を探索したところ、十数個の遺伝子領域が同定された。それらのうちXanthomonas oryzaeに対する抵抗性遺伝子であるXa21-likeについて詳しく検討した。この遺伝子は変異株では恒常的に発現しており、病原菌抵抗性も各世代にわたって向上していた。そこで、発現とメチル化との関連を調べるため、プロモーター領域のメチレーションマッピングを行った。その結果、野生株では高度にメチル化されていること、しかし変異株では大幅に脱メチル化されていることが明らかになった。以上の結果から、病原菌抵抗性は、塩基配列の変化をともなわない変異であり、安定に遺伝することから、エピジェネティック遺伝と考えられた。つまり、ある個体が獲得した形質は場合によっては遺伝することが示唆された。

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植物の光形態形成はCOP/DET/FUS (Constituitive/De-etiolated/Fusca)タンパク質によって負に制御されている。近年、COP/DET/FUSタンパク質が光形態形成を正に制御する転写因子の分解を促進することが明らかになった。そこで、本研究ではCOP/DET/FUSタンパク質の一つであるCOP10を介したタンパク質分解制御機構の解明を目指している。COP10はUV-damaged DNA binding protein 1 (DDB1)とDe-etiolated 1 (DET1)とCDD複合体を形成している。昨年、CDD複合体はさらにCullin4とRbx1と相互作用することが明らかとなった。我々はCDDコア複合体にさらに相互作用する新規因子を探索することで、光形態形成におけるタンパク質分解制御機構解明を目指している。
COP10の相互作用因子の探索のために、我々はFlag-tagged COP10 Arabidopsis (Flag-COP10)を作出した。このFlag-COP10を材料としてCDD複合体とその相互作用因子の精製を行ったところ、新規な相互作用因子と思われるバンドが検出できた。現在これらの因子の同定を行っている。

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ユビキチン化は真核生物に普遍的に存在するタンパク質修飾機構の一つであり、多くのタンパク質がユビキチンによって修飾を受けている。ユビキチン化はタンパク質分解におけるシグナルとなり、ユビキチン化されたタンパク質は分解装置であるプロテアソームによって分解される。さらに、ユビキチン化タンパク質はエンドサイトーシスや細胞内輸送、シグナル伝達、DNA修復といった多様な現象にも関わっていることが知られている。このことから、ユビキチン化の標的となるタンパク質を明らかにすることは生命現象を研究する上で重要である。しかしながら、高等植物での知見は動物や酵母と比べて極めて少ない。そこで、我々の研究チームではユビキチン化タンパク質の網羅的探索を試みた。
材料にはシロイヌナズナの芽生えを用いた。ユビキチン抗体カラムでユビキチン化タンパク質の精製を行ったところ、ユビキチン化を受けていると予測されるタンパク質が精製された。本学会ではこの精製サンプルをLC-MS/MS解析によって同定した結果を報告する。

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