目的とする遺伝子の発現を転写後に抑制する手法にはアンチセンス法、センス（コサプレッション）法、二本鎖RNAを転写させるRNAi法がある。花色の変化を指標にこれらの有用性を比較した。シアニジンを蓄積しているペチュニア（花色：赤）において、フラボノイド3’-水酸化酵素遺伝子(F3’H)の発現を抑制し、バラのジヒドロフラボノール4-還元酵素遺伝子を発現させるとペラルゴニジンが蓄積し、花色はオレンジになる。F3’Hの抑制にアンチセンス法、RNAi法を用いた場合、それぞれ27%、77%の組換え系統で表現型の変化が見られた。系統によってT-DNAのコピー数にはばらつきがあったが、形質が安定しているのはコピー数が1または2コピーの系統であった。またトレニア（花色：青）において、アントシアニジンシンターゼ遺伝子の発現を上記3種類の方法で抑制したところ、RNAi法では50%の系統で花色が白く変化したが、アンチセンス法、センス法で花色が白くなった系統は1％であった。以上により、RNAi法はアンチセンス法、センス法より効果的に遺伝子発現を抑制できることが明らかとなった。（本研究の一部はNEDOの委託により実施した。）

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バーベナ（Verbena hybrida）はクマツヅラ科の花卉園芸植物で、地面を這うように成長することからグラウンドカバーなどの用途に人気が高い。遺伝子組換え技術を適応することにより、花の色を改変したり、除草剤抵抗性を付与したり、土壌の汚染をモニタリング・浄化したりすることが可能であると期待されていたが、遺伝子導入が不可能であったので、形質転換系の開発を行った。
品種花手毬、タピアンの茎切片にアグロバクテリウムを感染させ、諸条件を最適化することにより形質転換が可能となった。特に、花手毬サクラにチョウマメフラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子を導入したところ、花色は薄ピンク色から藤色に変化し、花手毬サクラにはほとんど存在しないデルフィニジン型アントシアニンがアントシアニン全体の約50％に達した。また同時に、バーベナからF3'5'H、フラボノイド3'-水酸化酵素（F3'H）、ジヒドロフラボノール4-還元酵素（DFR）などの遺伝子を取得した。これらのアミノ酸配列は既に報告されている他種のホモログと合理的な相同性を示した。これらの分子生物学的、生化学的性質を検討したので、併せて報告したい。
(本研究の一部は生研機構からの受託により実施した。)

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我々は、ABAによるシグナル伝達機構を明らかにすることを目的に、シロイヌナズナのABA誘導性遺伝子rd29Bの発現解析ならびに発現に異常が見られる変異体の単離を行っている。シロイヌナズナを用いて、rd29Bと、その発現に関与することが示唆されている転写因子（AREB1, ABI5等）の遺伝子発現パターンを比較した結果、発芽初期には成植物体とは異なるABA応答性発現制御が働いていることが示唆された。また、rd29Bのプロモーターとルシフェラーゼ（LUC）の融合遺伝子を導入したシロイヌナズナを用いて、アクティベーションタギング用ベクターpPCVICEn4HPTあるいはpSKI015を利用したアクティベーションタギングまたはEMS処理を行い、変異体プールを作出した。得られた変異体プールの中から、発芽2日後の植物体、あるいは発芽10-12日後の植物体において非ストレス条件下でもLUCが発現する変異体、あるいは塩ストレス・ABA処理時にLUCの発現が異常になる変異体をスクリーニングした。これまでに行った変異体スクリーニングから、発芽2日後のABA応答が野生株と異なるライン、発芽10-12日後のABA応答が野生株と異なるライン、あるいは両者のABA応答が野生株と異なるラインが得られている。現在、スクリーニングを続けるとともに、得られた変異体の解析を行っている。

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　乾燥あるいは塩ストレスから遺伝子発現にいたるシグナル伝達機構を明らかにするために、シロイヌナズナの塩・乾燥応答性遺伝子rd29B遺伝子の転写調節機構について研究を行っている。塩・乾燥ストレス応答におけるrd29B遺伝子の発現は、主としてアブシジン酸(ABA)を介して制御されている。現在までにわれわれのグループは、i) rd29B遺伝子では、2つのABRE配列がABAによる遺伝子発現誘導のシス因子として働いていること、ii) ABRE配列を介してbZIP型タンパク質であるAREB1とAREB2が転写因子として関与していることを示してきた。本研究では、AREB1の転写活性化に関与する領域の同定を行うために、カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターにさまざまなAREB1の部分配列をつないだエフェクタープラスミド、およびABRE配列によって制御されるGUS遺伝子をもったレポータープラスミドを供試し、シロイヌナズナのT87培養細胞由来のプロトプラストを用いて一過的発現実験を行った。その結果、AREB1のN末端保存領域がレポーター遺伝子の転写活性化に関与していることが明らかになった。さらに、AREB1を過剰発現する形質転換体の遺伝子発現解析の結果とをあわせて、rd29B遺伝子の発現には、ABA誘導性の翻訳後修飾を介したAREB1のコンフォーメーション変化が必須であることを示唆するデータを得た。

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シロイヌナズナrd29B遺伝子の乾燥応答による発現は蛯描BAを介して制御されている。我々はrd29B遺伝子のプロモーター領域に存在する2個のABREがABA依存性のシス因子であり、これにbZIP型転写因子であるAREB1, AREB2が特異的に結合して下流の遺伝子発現を制御していることを明らかにしてきた。
AREB遺伝子は乾燥やABA処理などによって転写量が増大するが、ストレスのないコントロール状態においても発現が見られること、AREBの発現だけでは転写活性化が十分ではないことなどから、AREBがリン酸化などの修飾によって活性化すると考えられた。そこで、AREBタンパク質断片を基質として活性ゲル内リン酸化実験を行ったところ、T87培養細胞抽出液中にAREBの保存領域を含む断片をABA依存的にリン酸化する42kDaのキナーゼ活性が検出された。AREBの保存領域にはいくつかのタンパク質キナーゼのターゲットとなる配列が保存されているが、このうちCDPKのターゲットとなるSerあるいはThr残基をAla残基に置換したところ、リン酸化バンドが検出されなくなった。また、同じ置換によってtransativation実験におけるABA依存性の転写活性化も抑制された。一方、同じ場所をAsp残基に置換すると転写活性はABA非依存的に高くなった。この結果は、転写因子AREBの転写活性化がABA依存性のタンパク質キナーゼによるリン酸化で制御されていることを示している。

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EIN2は、エチレン情報伝達経路で重要な役割を担っていると考えられている植物特有の蛋白質で、その分子機能はまだ明らかになっていない。EIN2はN末端領域に膜十二回貫通ドメインを持ち、金属イオンのトランスポーターであるNrampと相同性があるが、EIN2におけるこの構造の機能は不明である。一方、C末端領域を過剰発現させた植物体は恒常的エチレン応答性を示すことが報告され、情報伝達経路において重要な働きを担っていると示唆されているが、この領域の機能も明らかとなっていない。また、既存のein2変異体のほとんどはヌルタイプの突然変異であり、機能ドメインの特定には至っていない。
そこで本研究では、EIN2の機能を解明する第一歩として、EIN2の機能ドメインの探索を試みた。この目的のために、EIN2cDNAに終止コドンの入らない15bpをランダムに挿入し、突然変異遺伝子を作製した。これらをein2-5変異株に導入し、ein2変異を相補できるかを調べることで、機能ドメインを明らかにできると考えた。現在、作製した変異遺伝子を導入した形質転換体を得ており、これらのエチレン応答の調査結果について報告する予定である。

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タバコERF2は、防御遺伝子のプロモーター領域に見いだされたエチレンおよびエリシターに応答する転写を制御するシスエレメント（GCC box）に結合する転写因子である。しかし，キチナーゼ遺伝子などプロモーター領域にGCC boxを持ちERF2の標的遺伝子であると考えられている遺伝子の発現をERF2がタバコ細胞内で制御するかどうかは不明であった。本研究ではERF2あるいはERF2とGRの融合遺伝子(ERF2:GR)を、CaMV35Sプロモーターで過剰発現させたタバコ植物体を作成し、標的遺伝子の発現変動について解析した。
　各形質転換タバコにおいて、プロモーター領域にGCC boxを持つ BCHN遺伝子およびGCC boxを持たないHsr203J遺伝子の発現量をノザン法で調べた。35S::ERF2植物では、BCHN遺伝子の発現量が増加していたが、Hsr203J遺伝子の発現量は増加していなかった。また、35S::ERF2:GR植物においてERF2:GRの核移行を誘導するためにDEXを処理すると、BCHN遺伝子の発現量が上昇したが、Hsr203J遺伝子の発現量は上昇しなかった。この時、DEX処理によるBCHN遺伝子の発現誘導に対するエチレンの影響を阻害剤STSの処理で検討したところ，エチレン非依存的にDEX処理によってBCHN遺伝子の発現誘導が起こることが示唆された。これらの結果から、ERF2は、タバコ細胞内においてGCC boxを介した防御遺伝子の転写活性化に働いていると考えられた。

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植物特異的な転写因子群Ethylene-responsive element binding factor(ERF)には、転写活性化因子と転写抑制因子が存在する。転写抑制因子は転写活性化因子による転写活性を抑制することから、その標的遺伝子の発現調節には転写抑制因子の活性制御が重要であると考えられる。
これまでに、タバコ転写抑制因子ERF3がユビキチン結合酵素NtUBC2と相互作用することを明らかにした。そこで、ERF3のタンパク質安定性を明らかにするために、大腸菌を用いて発現精製した組換えERF3と細胞抽出タンパク質とを試験管内で混合し、ERF3の蓄積量を解析したところ、ERF3は速やかに分解された。また、ERF3とGFPとの融合遺伝子を導入した形質転換タバコ培養細胞を用いて細胞内のERF3の蓄積量を解析したが、その蓄積を認めなかった。一方、試験管内、細胞内でERF3のDNA結合領域あるいは転写抑制領域は安定であった。これらの結果から、ERF3は不安定なタンパク質であるが、DNA結合領域ならびに転写抑制領域はその不安定性に関与しないと考えられ、NtUBC2とERF3の相互作用にDNA結合領域ならびに転写抑制領域が必要ないことと矛盾しなかった。

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アブシジン酸(ABA)は種子休眠、気孔の開閉、浸透圧ストレス耐性に関わる植物ホルモンであり、ABAシグナル伝達系の分子機構の解明は、植物科学の重要課題である。細胞膜は外界からのシグナルを受容する場と考えられ、それを構成しているリン脂質の1つホスファチジン酸(PA)は、外界からの種々のシグナルによって特異的に代謝されることが知られている。
我々はPAの生理機能を遺伝子レベルで理解する目的で発芽時のPA産生量を測定したところ、一過的に上昇することを見出した。したがって発芽時に機能するPAの代謝酵素が、ABAのシグナル伝達に重要な役割をしていると仮定し、PAの分解酵素であるホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、PAの産生酵素であるホスフォリパーゼD(PLD)に注目した。PAP、PLDともにいくつかの相同遺伝子がゲノムに存在するので、種子及び芽生えの発現解析から発芽時に機能しうるPAP、PLDを絞り込んだ。対応するノックアウト変異体(KO)を用い発芽時のABA感受性試験を行ったところ、PAP-KOはABA高感受性であること、PLD-KOは種子休眠が浅いことを見出した。以上の結果からPAは休眠、発芽という現象に関与し、ABAのシグナル伝達に機能することを遺伝子レベルで明らかにした。現在、それぞれの過剰発現型形質転換植物も加え、リン脂質代謝系のABAシグナル伝達における機能解析を行っている。

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RSGはジベレリン（GA）内生量調節に関与するタバコのbZIP型転写活性化因子であり、植物体においてその機能を阻害するとGA内生量が低下し矮化形質を示す。RSGの翻訳後制御機構を解析するためRSGと相互作用する蛋白質のcDNAを酵母Tow-hybrid法によりクローン化した。単離されたcDNAのグループの一つは真核生物に広く保存された制御因子14-3-3蛋白質であった。14-3-3蛋白質は主にリン酸化されたセリン残基を認識して結合し、標的蛋白質の機能を制御する事が知られている。これまでの解析により、14-3-3はRSGのリン酸化された114番目のセリン残基を認識してRSGと結合し、 RSGを細胞質に隔離する事により活性を負に制御する調節因子である事を明らかとした。さらに、核外輸送配列受容体Exportin1の特異的阻害剤レプトマイシンBを使った解析から、RSGは14-3-3により細胞質内に静的に拘束されているのではなく、核-細胞質間を高速にシャトルしていることが判明した。RSGの見かけ上の細胞質への局在は核外輸送速度が核移行速度を上回るためであった。14-3-3によるRSGの機能調節機構をさらに理解するため、RSGの細胞内局在に影響を与える因子を検索した。その結果、GA内生量調節に関与する転写調節因子RSGの細胞内局在はGA内生量により制御されていることを見出した。

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高等植物におけるアブシジン酸(ABA)のシグナル伝達は、多種多様な因子が関与することが報告されている。その中でも、タンパク質のリン酸化が大きく関わることが指摘されてきた。このことはABAに対する感受性を失ったシロイヌナズナabi1、abi2変異体の原因遺伝子が共にプロテインフォスファターゼであることからも明確である。しかしながら、ABAにより特異的に活性化されるプロテインキナーゼの同定は、シロイヌナズナにおいては明確化されていない。本研究では、シロイヌナズナT87培養細胞において、ABAにより活性化されるプロテインキナーゼp44、p42の存在をゲル内リン酸化法により確認し、生化学的およびバイオインフォマティクス的なアプローチの併用により、それらの遺伝子の探索を試みた。我々は、シロイヌナズナSnRK2プロテインキナーゼファミリーをその重要な候補として着目し、その一つであるSRK2Eが1）ABAにより活性化されること、2）ABAによる孔辺細胞の閉鎖やABA誘導性の遺伝子発現に強く関与することを、過剰発現体、T-DNA挿入変異体(srk2e)および特異的認識抗体を用いて明らかにした。また、SRK2Eは湿度低下でも活性化すること、srk2eが急激な湿度低下に適応できずwiltyな表現型を示すことから、このプロテインキナーゼがABAを介した水分ストレス応答に重要な機能を付与していることが強く示唆された。
Yoshida et al. (2002) Plant Cell Physiol. 43(12) in press

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我々は、イネのSnRK2プロテインキナーゼファミリーに分類されるキナーゼの機能解析を進めている。SnRK2ファミリーには、アブシジン酸 （ABA） による発現誘導をうけ、アリューロン層での GA 誘導遺伝子の ABA による発現抑制との関連が示唆されているコムギPKABA1や、孔辺細胞特異的でABAによる活性化を受けるソラマメAAPKなどが含まれる。イネゲノム上には同じサブファミリーに分類されるプロテインキナーゼをコードする遺伝子が少なくとも10個存在する。このうち、コムギPKABA1と最も高い相同性を示す2つの遺伝子についてノーザン解析を行ったところ、ともに高塩、乾燥およびABA処理によって発現誘導されることから、これらのファミリーをSAPK ( Stress and/or ABA regulated Protein Kinase ) と名付けた。今回は、SAPKファミリーメンバー10個 （SAPK1～10）すべてについての活性化制御を解析したので報告する。
SAPK1～10をそれぞれイネ培養細胞Oc株プロトプラスト内で一過的に過剰発現させたところ、すべてのプロテインキナーゼが高浸透圧処理によって速やかに活性化され、さらに、SAPK8, 9, 10についてはABAによる活性化も認められた。以上の結果から SAPKファミリーのプロテインキナーゼはABAおよび高浸透圧ストレスシグナリングカスケードの両方において機能していることが示唆された。

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青色光による気孔開口や、アブシジン酸による気孔閉鎖にプロテインキナ－ゼが関与する事が明らかになっており、孔辺細胞のシグナル伝達にキナーゼが重要な働きを持つと考えられているが、その実体は不明の点が多い。
　本研究では孔辺細胞のシグナル伝達に関与するプロテインキナーゼの特質を知る目的でキナ－ゼの遺伝子vfPK1をソラマメ孔辺細胞から単離し、以下の結果を得た。vfPK1は455アミノ酸残基からなる新規のタンパク質をコードする遺伝子であり、そのアミノ酸配列から植物SNF1関連プロテインキナーゼのSnRK3グループに属することがわかった。 vfPK1遺伝子発現の組織特異性をノーザンブロッティング法で調べた結果、孔辺細胞の他に根でも多く発現していた。しかし、葉肉細胞にはほとんど存在しなかった。さらにvfPK1を大腸菌内で発現、精製後、キナーゼ 活性を測定すると、自己リン酸化活性を持つ事が確認された。次に、vfPK1の全長をベイトに用いた酵母two-hybrid法を行った結果、カルシウム結合タンパク質（CBL）をコードする遺伝子（vfCBL1）が相互作用する蛋白質として同定された。vfCBL1はシロイヌナズナのAtCBL2と88.3％のアミノ酸同一性を示し、カルシウムを介した情報伝達に関与する可能性がある。vfPK1のキナーゼ活性にvfCBL1がどのような影響を与えるのか現在解析を進めている。

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　シロイヌナズナHis-Aspリン酸リレー系は、3種類の因子（HK, HP, RR）より構成され、サイトカイニンなどの植物ホルモンの応答情報伝達に関与している事が示唆されている。我々はサイトカイニン受容体（AHK2/3/4）を同定し、AHK→AHP→ARRリン酸リレー系とサイトカイニン応答情報伝達の関連を示唆してきた。これらHis-Aspリン酸リレー因子の中で、His-キナーゼ（AHKs）とレスポンスレギュレーター（ARRs）間の情報伝達を仲介するHPt因子として働くAHPは5種類存在する。これらの仲介因子はリン酸リレー情報伝達ネットワークにおける細胞内情報移行やクロスレギュレーション等に重要な働きをしていると予想される。今回は、これら全てのAHPs（AHP1～AHP5）を対象として、その遺伝子発現様式、Two-hybrid 法による相互作用因子の同定、プロモーター::GUS形質転換植物体を用いた発現部位の解析、欠損株や過剰発現体の取得解析などの網羅比較解析を行った。これらの結果を総合的にまとめながら、AHPの機能に関して、シロイヌナズナHis-Aspリン酸リレー情報伝達ネットワークの観点から考察する。

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His-Aspリン酸リレー系は、3種類の因子（HK, HP, RR）より構成され、サイトカイニンなどの植物ホルモンの応答情報伝達に関与している事が示唆されている。我々はサイトカイニン受容体（AHK2/3/4）を同定し、AHK→AHP→ARRリン酸リレー系とサイトカイニン応答情報伝達の関連を示唆してきた。このリン酸リレー系の最下流で働くと推定されるARRは、アミノ酸の1次構造上の違いから2つのグループに分類され、特にタイプB ARRはリン酸受容ドメイン以外にもB-モチーフと呼ばれるDNA結合ドメインを持つことから転写因子として機能していることが示唆されている。しかし11種類存在するタイプB ARRがシロイヌナズナにおいてそれぞれどのような機能を果たしているかはほとんど不明である。今回は、11種類全てのタイプB ARRのプロモーター::GUS形質転換植物を作成し、それぞれの発現時期及び組織特異性の違いを検討した。また、いくつかのARR（ARR11やARR14など）に関しては、過剰発現体や欠損株を作成・取得して解析を行った。これらの結果を基に、タイプB ARRの機能に関して、サイトカイニンに応答したHis-Aspリン酸リレー情報伝達機能の視点から考察する。

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最近、シロイヌナズナにおいて、His-Aspリン酸リレー情報伝達因子のヒスチジンキナーゼAHK4/CRE1/WOL1がサイトカイニンの受容体として機能することが示された。また、AHK4のホモログであるAHK2とAHK3もサイトカイニン受容体として機能する。His-Aspリン酸リレー情報伝達系はHis-キナーゼ、ヒスチジンホスホトランスミッター（HPt）とレスポンスレギュレーター（RR）から構成される。シロイヌナズナにはHPtをコードする遺伝子（AHP）が5種類、RRをコードする遺伝子（ARR）が22種類存在するが、ARRは一次構造の違いからタイプAとタイプBに分類される。このような状況から、サイトカイニンの情報伝達にAHK2/3/4→AHP→ARRという多段階のリン酸リレー系が関与することが考えられる。しかし、これらの因子がどのような組み合わせで情報伝達系を構成し、どのような高次機能制御に関わっているかについての知見は乏しい。
ここでは一群のタイプA ARRに焦点をあて、サイトカイニン情報伝達への関与とHis-Aspリン酸リレーネットワークの中での位置づけという観点から解析を行い、発現パターンの詳細な解析、細胞内局在性の同定、他のHis-Aspリン酸リレー情報伝達因子との相互作用解析に加え、過剰発現体及び遺伝子破壊株の解析結果を報告・考察する。

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　シロイヌナズナのトライコ－ムは、葉の表皮細胞が分化して生じる毛様の巨大細胞で、有糸分裂無しに染色体DNAの複製を繰り返すendoreduplicationによる巨大核を有している。このトライコームの発生過程において、CDKA(Cdc2a)の発現が確認されている。　
　CDKAのトライコームでの発現時期と細胞内局在を詳細に調べる為、CDKA-GFP融合タンパク質をCDKAプロモーターによりシロイヌナズナに発現させて、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、CDKA-GFPはトライコームの発生初期に発現し、主に核に局在していた。これにより得られた知見を基に、トライコームの発現過程においてCDKAと複合体を形成する可能性のあるサイクリンを予想した。CDKAプロモーターのmRNA転写開始点から-591/+4の領域(P')を用いるとCDKAのトライコームを除く発現がほぼ無くなることを利用し、P'でCDKA-GFPをシロイヌナズナにトライコーム限定で発現させ、GFP抗体で免疫沈降して共沈タンパクとして予想されるサイクリンが検出されるかどうかを調べた。その結果、トライコーム発現CDKA-GFPと複合体を形成するサイクリンの1つを特定することができたので、これについて報告する。また、トライコームにおけるendoreduplicationに、特定されたCDKA/サイクリン複合体がどう関与しているかについても検討を行った。

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*Endoreduplication is defined as nucleic DNA duplication without cell division. After some rounds of endoreduplicating cycle, cells contain multi-replicated DNA of a nucleus (polyploidy). Polyploid cells are often observed in various developed plant organs so that polyploidy is thought as a marker of differentiated cells. It is known that polyploidy occasionally correlate with cell enlargement. One mechanism is that plants control cell size through increasing polyploid level. However, little is known about molecular mechanisms of endoreduplication.
In order to identify genes involved in endoreduplication, we screened for mutants with enhanced polyploid level from activation-tagging lines using flow-cytometer. Until now, we identified 6 mutants as gain-of-function phenotypes from approximately 4500 lines. Here we report about precise screening method and phenotype of these mutants

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　Dタイプサイクリン（CYCD）は様々なシグナルに応答して発現し、G1/S期の進行を促す働きをすると考えられている。アラビドプシスにはCYCD遺伝子が10個存在するとされているが、我々はそのうちの一つCYCD4;1がG1/S期の進行だけでなくG2/M期の進行にも関わる可能性があることをすでに明らかにした。これはCYCD4;1がCYCDとしては今までに知られていない機能を持つことを示唆する。アラビドプシスにはこのCYCD4;1遺伝子と約55％の相同性を持つCYCD4;2遺伝子が存在する。
　我々はD4タイプサイクリン（CYCD4）の植物個体発生における機能を解明する目的で、まず両遺伝子の発現部位をin situ hybridization とプロモーターGUSアッセイにより解析した。これにより、両遺伝子共に維管束や葯などのかなり限られた組織で発現することが明らかになった。次にT-DNAタグラインの検索を行い、両遺伝子のT-DNA挿入変異体を単離した。この中で特にCYCD4;2のT-DNA挿入変異体は、花茎が抽台し始めると共に本葉が枯死し始め、最終的には花茎と花のみの植物体になり、捻性がかなり低下するという表現型を示した。現在、花粉形成におけるCYCD4 の役割に関して詳細な解析を進めている。

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　Cyclin-dependent kinase (CDK) は細胞周期の進行に伴い様々な調節因子により活性が制御される。これまでに動物を中心とした研究が進展し、CDK inhibitorがサイクリン/CDKの活性抑制に機能することが明らかとなった。シロイヌナズナのCDK inhibitor遺伝子(KRP)はゲノム情報から7種同定され、これらの遺伝子産物は動物のCDK inhibitorであるp27^Kip1のCDK阻害領域と相同的な一次配列を有するが、各遺伝子産物の詳細な特徴は不明であった。本研究では、KRPタンパク質の機能をサイクリン/CDKとの相互作用の観点から解析した。
　in vitro転写翻訳系を用いて合成したKRPタンパク質とサイクリンまたはCDKタンパク質との結合を解析した。その結果、結合の程度は異なるものの6種のKRPはサイクリン/CDK複合体と結合したが、KRP7は結合が検出できなかった。これまでの報告とは異なり、サイクリンやCDK単独のタンパク質に対しては、すべてのKRPで結合は認められなかった。ヒストンH1を基質としたリン酸化実験系を用いて、サイクリンD2/Cdc2aに対するKRPの阻害活性を評価したところ、KRPは量依存的に阻害作用を示したが、阻害活性の強さはKRPによって差異が認められ、KRPとサイクリン/CDK複合体の結合の強さと阻害活性が相関する可能性が示唆された。

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E2Fは動物の細胞周期のS期進入に必須な遺伝子群の転写を活性化する転写因子で、Rbタンパク質によって負に制御されることが知られている。植物でもE2FやRbといったG1/S期制御因子のホモログが単離されているが、Rbを介した制御機構の詳細について不明な点が多い。本研究では、E2Fによる植物G1/S期移行の分子機構の解明を目指して、タバコE2F(NtE2F)が、タバコRb（NtRb）やサイクリンD(NtcycD)といった他の細胞周期制御因子との相互作用の解析を行っている。これまでにタバコ培養細胞BY-2を用いた一過的な発現解析からNtE2FはヒトE2F-1と同程度の転写活性化能を有することを報告している。今回はNtRbによるNtE2F転写活性化能の抑制を解析するため、S期特異的に発現するPCNAプロモーターを用いた実験系を構築して解析を行った。その結果、NtE2Fの転写活性化能はNtRbによって抑制され、その抑制はサイクリンDによって解除されるが、サイクリンA, Bでは解除されないことを見出した。この結果はNtE2FがS期特異的遺伝子の発現を制御し、NtRbとサイクリンDによりNtE2Fの転写活性が制御されることを示しており、植物でもRbを介した制御機構がG1/S期移行に働くことを強く示唆している。

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　タバコ培養細胞BY-2の増殖にはS期に先行して，Aタイプのサイクリン依存性キナーゼ(CDKA)の活性化が必要である. CDKAは増殖期にあるBY-2細胞で優先的に発現しているものの，mRNAの蓄積量に明確な周期変化はない．また，同調培養系を用いた研究より，CDKAタンパク質の蓄積量が周期を通じて一定であるのに対して，ヒストンH1に対するキナーゼ活性はG1/S期とG2/M期に2つのピークをもつ周期変動を示す報告があり，サイクリン/CDKA複合体のタンパク質レベルでの制御が示唆される．
　本研究では培養7日目のBY-2細胞を新鮮な培地に植え継ぐことで，静止期あるいはG1期にある細胞集団を再び細胞周期に移行させる実験系を用いた．p13^Suc1カラムによりCDKA画分を調製してヒストンH1キナーゼ活性を解析した結果，G1期からS期へ移行する細胞がみえ始める6時間頃からキナーゼ活性が上昇し，10時間でピークになった．興味深いことに，p13^Suc1カラムに含まれるCDKAタンパク質量には変動がみられず，サイクリン/CDKA複合体の活性化にはタンパク質レベルの制御が示唆された．現在，BY-2細胞が増殖を再開する際のオーキシンやショ糖の影響，サイクリンDなどの細胞周期制御因子の挙動について解析しており，ゲルろ過によるサイクリン/CDKA複合体の解析と合わせて報告する．

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サイクリンDはCDK (Cyclin-dependent kinase)と複合体を形成してG1/S期移行にRb経路を介して関わる事が知られている。一方、植物にはG2-M期特異的に発現するサイクリンDが報告されており、それらはG2/M期移行に機能する事が推測されている。
当研究室でタバコ(Nicotiana tabacum)より単離した2種のサイクリンD　(NtcycD3-2a, NtcycD3-2b)はアミノ酸配列に高い相同性がみられ、主にG2-M期でmRNAの蓄積が観察された。N. tabacum の祖先種とされるN. tomentosiformis, N. sylvestris を用いたRT-PCRの結果、NtcycD3-2aは N. tomentosiformis 、NtcycD3-2b はN. sylvestris 由来のisoformであることが示唆された。さらにタバコ細胞周期制御因子CDK(Cdc2a, Cdc2b)、KRP (KIS1a)、Rbに対してGST pull-down assayを行った結果、両方のサイクリンDがCDK、KIS1a、Rbすべてに結合することが確認された。また昆虫細胞Sf-9株を用いてサイクリンDとCDKのin vitroキナーゼ活性の解析を行った結果、Cdc2aのみならずCdc2bとの複合体もHistoneH1蛋白質をリン酸化することが示された。

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植物病原菌Phytophthora cryptogea由来のタンパク質性エリシター（cryptogein）をタバコ培養細胞（BY-2）に処理すると、細胞質の凝集等の形態変化を伴う過敏感反応様のプログラム細胞死が誘導された。フローサイトメトリー法による解析から、エリシター処理によりG1期, G2期の細胞の割合が増加し、S期の細胞の割合が減少することが明らかとなり、細胞死誘導に先立って細胞周期が特定部位で停止すると考えられた。細胞死誘導に伴う細胞周期停止点を明らかにするため、3種類の方法で細胞周期の進行を同調化して、核の形態観察やフローサイトメトリー法による解析を行ったところ、M期、G1期にエリシター処理した細胞は、G1/S期で、S期にエリシター処理した細胞は、G2/M期でそれぞれ細胞周期が停止し、その後細胞死が誘導された。G2期後半からG1期にかけてのそれぞれの時期にエリシターを処理し、細胞死誘導を観察したところ、エリシターの処理時間の長さに関わらず、全ての細胞でほぼ同時刻から細胞死が観察され始めた。こうしたことから、プログラム細胞死の誘導には、それに先立つ細胞周期の停止が必要であり、それが細胞死の律速段階となり得ると考えられる。

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細胞周期中のG2期からM期にかけて、サイクリンBなどの一群の遺伝子が発現することが知られている。このようなG2/M期特異的転写はプロモーター中に存在するMSA (M-specific activator) エレメントとそこに結合する一群のc-Myb様転写因子の働きによって制御されている。タバコから単離したc-Myb様転写因子、NtmybA1、NtmybA2、NtmybBは同様にMSAエレメントに結合するが、プロトプラストを用いた一過的発現系においてはNtmybA1とA2は転写活性化因子として、NtmybBは競合的な転写抑制因子として働くことが示されている。これらタバコc-Myb様転写因子のin vivoにおける機能を探るため、CaMV35Sプロモーターを用いた過剰発現体やRNA干渉（RNAi）による発現抑制体を作出した。これまでにNtmybA2の発現を抑制したタバコ培養細胞BY2においてはカルス増殖速度の低下、4CレベルのDNAを持つ細胞頻度の増大がみられ、NtmybBの発現を抑止すると逆の効果が見られることを明らかにしている。この結果は、G2/M期進行をNtmybA2が促進的に制御し、NtmybBが抑制的に制御していると解釈でき、一過的発現系で見られるサイクリンBプロモーターに対する働きと合致する。同様の解析をタバコ毛状根、タバコ植物体において行っているので合わせて報告する。

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細胞が不等分裂し、それぞれが異なる運命をもつ娘細胞に分化していく過程は、細胞の多様性を生み出す根元的事象である。しかしながら、その分子メカニズムの多くは未解明である。コケ植物ヒメツリガネゴケは、形態が単純で細胞レベルでの研究に適しており、また、オーキシンやサイトカイニンにより細胞の分化を簡単に制御できる点で、不等分裂や細胞分化の分子機構解明に優れた研究材料である。更に、高効率の相同組換えが可能であり、正確な遺伝子機能解析が期待できる。ヒメツリガネゴケプロトプラストの再生過程は、増殖能を維持し続ける幹細胞と、より分化した娘細胞とに分かれる不等分裂を繰り返している。我々は、この点に着目し、ヒメツリガネゴケの配列決定済みの完全長cDNAをヒメツリガネゴケ単離プロトプラストに一過的に過剰発現させることで、再生過程に異常を引き起こす原因遺伝子のスクリーニングを行っている。これまでに2,000以上の遺伝子を過剰発現させた。その結果、不等分裂が等分裂になるもの、幹細胞が多数できるもの、不等分裂がおこらず細胞伸長のみが起こるもの、あるいは細胞形態が変わるものなどの異常が約5％の割合で見られた。これらの原因遺伝子として、転写因子、キナーゼ、タンパク質修飾に関係する情報伝達因子、機能未知のものやヒメツリガネゴケに特異的と思われるものなどが同定できた。

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真核生物のDNAに含まれる5-メチルシトシンは、自己ゲノムの発現調節や外来DNAの不活性化に機能する。シトシンのメチル化はS-アデノシルメチオニンをメチル基供与体として、DNAメチル化酵素により触媒される。植物のDNAメチル化酵素は、MET1、CMT、DRM の3ファミリーが存在する。本研究では、タバコより単離されたDRM（NtDRM1）について酵素解析を行った。
NtDRM1 cDNAは全長2540塩基で、シロイヌナズナ、トウモロコシで報告されていたDRMに高い相同性を示す、608アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。BY-2細胞で強制発現させたNtDRM1-GFP融合タンパク質は、核に局在した。昆虫培養細胞 (Sf9)を用いてGST-NtDRM1融合タンパク質を生産し、メチル化活性を検定した。GST-NtDRM1はpoly (dIdC)をメチル化した。合成DNAの場合、CpNpNに最も高い活性を示した。ついでCpNpG、そしてCpGに対する活性は低かった。NtDRM1は植物で初めて生化学的に酵素活性が示されたde novo型酵素であり、基質特異性を持つ新規な酵素であることが分かった。

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In a screen for morphological mutants from the T1 generation of approximately 50,000 activation tagging lines, we isolated four dominant mutants that showed hyponastic leaves. We designated them isoginchaku (iso). The iso-1D and iso-2D are allelic mutants caused by activation of the AS2 gene. Iso-3D and iso-4D are another allelic mutants caused by activation of the ASL1/LBD36 gene. These two genes belong to the AS2/Lateral organ boundaries gene family that is composed of 42 genes in Arabidopsis. The only recessive mutation isolated from this gene family was of AS2. Applying reverse genetics using a database of activation tagged T-DNA flanking sequences we found a dominant mutant that we designated peacock1-D (pck1-D) in which the ASL5/LBD12 gene was activated by a T-DNA. These results strongly suggest that activation tagging is a powerful mutant mining tool especially for genes that make up a gene family.

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優性突然変異を引き起こすアクチベーションタギングは、遺伝子ファミリーを形成する遺伝子群の機能解析など、遺伝子破壊型の突然変異では表現型が現れない遺伝子群の機能解析に欠かせないテクニックである。本研究では次世代型アクチベーションタギング法を構築するため新たに以下の2点の特徴を導入した新システムを作ることにした。1、1つのタグ（T-DNA）の導入に対して必ず1遺伝子が候補遺伝子として対応する。2、シロイヌナズナ以外の有用生物の遺伝子機能解析にも利用できる。この目的のもと、約1万種の独立シロイヌナズナ完全長cDNAからなる標準化cDNAライブラリーをアグロバクテリアのバイナリーベクター上で作成した後、アグロバクテリアに形質転換した。このバクテリアライブラリーをシロイヌナズナに花感染させ、約800ラインの独立した形質転換植物を作成した。形態形成や色素合成などの表現型が観察されたT1植物約80ラインのうち、約40ラインのT－DNAをPCR法をもちいて解析したところ、プロモータの下流に接続されているのはすべて別々の完全長cDNAであることが確認できた。我々はこのような完全長cDNAを用いた新たな遺伝子機能解析法をFox Hunting System(full-length cDNA over-expressor gene hunting system)と呼び、この手法をシロイヌナズナの遺伝子のみならず有用生物遺伝子のファンクショナルゲノミクスのための新技術として確立させるための整備を行っている。

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　我々は、イネでアクチベーションタギング法を利用した突然変異体の取得及び原因遺伝子の単離が可能かどうかを調べる目的で、現在までにアクチベーションタギングラインを約8000作製した。これらのラインでは4コピーの35Sエンハンサー及び35SプロモーターがT-DNAタギングにより導入されている。
　8000ラインのうち栄養成長期に顕著な変異形質を示すものとしてlesion mimic変異体が1ライン、stripe変異体が8ライン、針状の葉身を持つ変異体が1ライン得られている。このうちlesion mimic変異体について詳細に解析した。導入されたT-DNAは1コピーで、次世代25ラインを調べた結果変異形質は優性に遺伝しT-DNAとのリンクが認められた。更にTAIL-PCR法によりT-DNA隣接配列を増幅後、塩基配列決定、相同性検索を行ったところT-DNA挿入部位の500bp下流にORFが見いだされ、タバコの過敏感反応が起こる際に誘導されてくる遺伝子との相同性が認められた。上記の25ラインについて、この遺伝子の転写レベルをノーザン解析で調べた結果、転写レベルの強いものほど病徴の激しい傾向がみられた。現在この隣接遺伝子の転写活性化がlesion mimicの表現型をもたらしたことを証明するために再導入実験などを進行中である。
　本研究はイネ・ゲノムプロジェクトMP-1202により行った。

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We constructed more than 10,000 transposon-mutated lines in Arabidopsis so far. For every independent line, we sequenced the flanking region of Ds insertion, using a high throughput analytic method. Recently, we have started a "phenome project", in which we observe and screen in various phenotypes for each DS insertional line into coding regions in our resources. In a pilot experiment, we are selecting about 1,000 independent lines in which Ds element is located in coding regions of predicted Arabidopsis genes. We are planning to collect phenotypic data by two steps, morphological observation on plant growth and screening results under some environmental conditions. We report the present status of our phenome project and propose an international effort to develop a phenome analysis using gene knockout mutants for every functional gene in Arabidopsis.

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　我々はポストシーケンシング時代の遺伝子の機能解析において重要であるシロイヌナズナ完全長cDNAや挿入変異体といったリソースの整備とそれに関するデータベースの作製を進めてきた。完全長cDNA全長塩基配列決定に関しては、アメリカのSSPグループと共同し、2002年12月現在12,189クローンの全長塩基配列を決定した。また、単離した完全長cDNAクローンの5'末端塩基配列をゲノム塩基配列と比較することにより、プロモーター配列情報を獲得し、プロモーターデータベースも構築した。このプロモーターデータベースをシロイヌナズナ完全長cDNAマイクロアレイの解析結果と組み合わせ、網羅的な発現情報の基本データベースの作製を目指し進めている。さらに、Dsトランスポゾン挿入変異体データベースを作製しており、機能解析やフェノーム解析の基本となるべく進行中である。
　これらのデータは、理研ゲノム科学総合研究センター・植物ゲノム機能情報研究グループのウェブサイト(http://pfgweb.gsc.riken.go.jp/)から提供してきた。現在、データ提供だけでなく検索サービス等を拡張した新規データサイトの公開準備を進めている。本発表では、我々のグループが作製してきたデータベース、ウェブサイトについて述べる。

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　シロイヌナズナ全ゲノムの塩基配列が決定され、Tag-lineを用いた遺伝子破壊株の解析が、遺伝子機能を同定するうえで重要な手法の1つになっている。我々は、植物遺伝子の包括的な機能解析にむけてT-DNA Tag-lineの大規模な作製を行ってきた。導入するT-DNAの中にはレポーター遺伝子としてGUS遺伝子を挿入しており、ジーン・エンハンサートラップ法による遺伝子の発現解析が可能である。根端でGUS遺伝子の発現が見られるラインのスクリーニングから、根の伸長が野生株に比べて抑制されているラインを単離した。T-DNAはABCタンパク質遺伝子に挿入されており、このABCタンパク質遺伝子は酵母のGCN20という遺伝子と相同性が見られた。次に酵母でGCN20と結合することが知られているGCN1のシロイヌナズナオルソログを解析するため、Tag-lineから遺伝子破壊株の単離を行った。単離した8つの破壊株のうち、1つのラインでGUS遺伝子の発現が確認された。根での発現はABCタンパク質遺伝子と同様のパターンを示し、さらに地上部では若い葉・雌ずいで発現が見られた。N末端側にT-DNAが挿入されているラインでは、根の伸長が著しく抑制されており、さらに不稔であった。またABCタンパク質とシロイヌナズナGCN1は酵母Two-hybrid法により相互作用することが確かめられた。以上のことから2つの遺伝子は根の伸長を制御していることが明らかとなった。

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イネ完全長cDNA プロジェクトにより28,469個の完全長cDNAクローンが収集され、塩基配列の決定および機能解析が行なわれている。Blatプログラムを用いたjaponica BAC/PAC クローンへのマッピングの結果、94%カバーのゲノムデータに対して約19000のTU (Transcription Units)上にマップされた。さらに同一TU上にマップされる複数のクローン集団（開始・終始部位の変化、ドナー・アクセプター変化、エキソンスキップ）も検出された。オルタナティブスプライス遺伝子の発現調節機構を明らかにすることを目的とし、マッピング結果からエキソンスキップを示す候補遺伝子を選定した。これらのクローンの情報には膜タンパクや加水分解、転移酵素などが候補として含まれていた。インシリコでの情報を検証するため、候補遺伝子の生体内での発現をRT-PCRにより調査した。さらに、アミノ酸解析ツール（SOSUI:http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html, SWISSPORT: http://expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)を用いて立体構造モデルを作成したので、転写産物の機能変化について考察する。

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　SRタンパク質はN末側のRNA結合ドメインとC末側の長さの異なったアルギニン／セリン-リッチドメインに特徴づけられる構造を持っている。SRタンパク質はスプライシングに必須な因子であり、スプライソソームの構築などスプライシングの基本的な機能をもつと同時に、スプライシングエンハンサーなどに結合し、選択的スプライシングを行うことが知られている。
　我々はイネから、SRタンパク質をコードしていると考えられる19種のcDNAを単離している。この中には植物特異的な構造をもつSRタンパク質が7種ある。このうち、植物特異的なOsSR3はエキソン1内に2つの弱い5'スプライス部位を形成するWx^bのスプライシングを促進する効果があることが、イネの培養細胞を使った実験により明らかになった。さらに、全てのイネSRタンパク質についてSELEXにより結合配列を決定しようとしている。これまでのところ、OsSR3は新規な配列とともに、ASF/SF2結合配列とほぼ同じプリンリッチ配列に結合することがわかった。このことから、植物特異的な構造をもっているSRタンパク質においても、選択的スプライシングにおける機能は動物と一部重複している可能性が考えられる。また、SRタンパク質を過剰発現させる形質転換イネを作出中であり、選択的スプライシングを受けるmRNAのスプライス部位の選択への影響をみる予定である。

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モデル植物として汎用されている栽培品種タバコNicotiana tabacum（複二倍体，染色体数2n=24+24）の核ゲノムは2種類のサブゲノムから成り，それぞれは祖先種であるN. SylvestrisおよびN. tomentosiformis（共に二倍体，染色体数2n=24）由来である．一方，細胞質オルガネラである葉緑体は独自のゲノムをもっているが，核ゲノムとは異なりN. Sylvestris由来と考えられている．しかし，現在のところN. tabacum葉緑体ゲノムの由来を明確に実証した報告はない．そこで我々はショットガンシークエンス法を用いてN. SylvestrisおよびN. tomentosiformis葉緑体ゲノムの全塩基配列決定を行い，1986年にすでに決定されているN. tabacum葉緑体ゲノムの全塩基配列と比較してN.tabacum葉緑体ゲノムの由来をゲノムレベルで確認した．比較解析の結果，N.tabacum葉緑体ゲノムは確かにN. Sylvestris由来であることが明らかになった．

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The "Chloroplast Net" is a browser (.) based
on accumulating information on chloroplast genes and part of nuclear
genes encoding chloroplast components, like Lhc genes, in higher
plants. Chloroplasts in higher plants are estimated to consist of
2500 - 5000 proteins. Chloroplasts possess only about hundred
genes. Most chloroplast components are predicted to be encoded in
the nuclear genome. In October 2002, the draft genome sequencing of
Rice was achieved, therefore, the huge information about genomes in
Rice will be continued being supplied much more than now.
It is important to build up the relational data base linked
chloroplast genes with nuclear genes encoding chloroplast
components.
The systematical outline of a new relational data base named
"Navigator for Chloroplast/Photosynthesis-related Genes in Rice" is
discussed.
ChloroplastNet managed by NRPG (Nagoya Rice genome Project Group) is
supported by the MAFF of Japan.

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高等植物ミトコンドリアのゲノムは現在までにシロイヌナズナ、テンサイ、及び、イネで決定されている。ミトコンドリア内膜の呼吸鎖タンパク質、ATP合成酵素、リボソームタンパク質とcytC生合成酵素（いずれも一部のサブユニット）をコードする遺伝子、rRNAとtRNA遺伝子他、多数の未知ORFがある。植物種間で遺伝子構成は全く同じではなく、互いに欠落した遺伝子がある。このことは、高等植物ミトコンドリア遺伝子は現在核に移行途上であることを示唆しているのかも知れない。また、同一細胞内のプラスチドから遺伝子が移行している例も見られる。このように、ミトコンドリアのゲノム解析は植物細胞の3種類のゲノム（核、プラスチド、ミトコンドリア）間の遺伝子移動と進化を考察する上で欠かせないものである。さらに、転写後のRNA編集機構やグループIIイントロンの自己スプライシング機構のin vitroでの実験的解析が待たれる。
　我々はタバコミトコンドリアのゲノム塩基配列を決定した。その結果、タバコミトコンドリアのゲノムは3つの環状サブゲノムから成ること、それらはマスターサークルにもなりうること、ゲノム塩基数は400 kbであることが分かった。現在、上述の多くの未解明な課題を明らかにするため、そのゲノム・遺伝子解析（RNA編集部位の特異性を規定するトランス因子などの探索）を進めている。

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In order to monitor global gene expression changes during the nodulation process, we have initiated a SAGE analysis using the model legume, Lotus japonicus. In this study, comparison of gene expression profiles was made using 85,482 and 80,233 tags obtained from uninfected roots and nodule primordia. A statistical test has revealed 408 transcripts whose expression was induced in the nodulation process at the significance level of P <0.01, and 428 were identified as those which may be repressed. The gene identification of tags was done using the public as well as the in-house L. japonicus EST sequences. Extension of the SAGE tags into 3' cDNAs was performed for identification of tags with no matching EST by use of the reverse SAGE (rSAGE) technique. Genomic clones used in the genome sequencing project were PCR-screened to help annotate the novel 3' cDNA sequences.

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In the genome projects, protein coding genes are computationally predicted and annotated using many tools. On the other hand, annotation information of non-coding RNA (ncRNA) is not found in the most of published genome sequences. The reason is we don't have tools for gene prediction and analysis of ncRNA. tRNA is one of the ncRNAs and has significant function on translation. Their copy number is several hundreds and transcribed by Pol III. Since tRNA transcripts form rigid secondary (clover-leaf) structure and have highly conserved promoter motifs that we can easily find location of genes from genome sequences. However, we don't predict which tRNA gene is functional or pseudogene because of lacking gene characterization with experimental analysis. Therefore we have made genome-wide transcription assay from rice and Arabidopsis genes for increasing of information to build tRNA gene prediction algorithm. Furthermore, we have made comparison between rice and Arabidopsis tRNA gene organization.

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With the aim of understanding the whole genetic system of legume species, we initiated large-scale sequencing of the genome of a model legume, Lotus japonicus. Using the information on ESTs and cDNA markers of L. japonicus and other legumes, genomic clones corresponding to the multiple seed points of the genome have been chosen as initial targets. As the accumulation of the seed sequences has progressed, clone selection by walking has also been initiated. As of November 2002, a total of 1130 clones have been selected. Eighty-four of them are in the library phase, 6 are being sequenced, 570 are in the finishing phase, 68 are being annotated, and 237 have been annotated. Mapping of the seed clones has also been performed by generating PCR-based markers from sequence information, and 502 clones have been genetically localized. The detailed information on this project is available through the web site at http://www.kazusa.or.jp/lotus/.

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シロイヌナズナのtonsoku(tsk)突然変異株では、茎頂と根端の両メリステムの構造に異常が見られる。tsk変異株のメリステムではメリステム特異的に発現する種々の遺伝子の発現パターンに変化が見られ、異常な方向に分裂した細胞が観察されることから、tsk変異株では異常な方向への細胞分裂によって、メリステム構築に異常が起こっていると推定される。TSKタンパク質はタンパク質間相互作用に関わると考えられるLGNリピートとロイシンリッチリピートを持つ1311アミノ酸よりなる大きなタンパク質であり、タンパク質複合体のコアとして働いていると推定されるが、その細胞内機能は不明である。
今回我々は、TSKのGFPとの融合タンパク質を35Sプロモーターにつないだコンストラクトを作成した。これをアグロバクテリウムを介してタバコBY-2細胞に導入、発現させ、その細胞内局在性を解析した。その結果、GFPをTSKのN末、C末いずれにつないだ場合も核の核小体以外の領域に局在していることが分かった。またこの結果を検証するために細胞を分画し、TSKに対する抗体でウェスタンブロットを行った。この実験の結果は融合タンパク質の核局在を強く支持するものであった。TSKは細胞分裂における役割が示唆されていることから、細胞周期の各ステージにおけるGFP融合TSKタンパク質の局在性についても検討している。

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　シロイヌナズナのtonsoku突然変異株は根が短く花茎が帯化し、その表現型は根端と茎頂の両メリステムの構造異常と機能不全に由来する。TONSOKU (TSK) 遺伝子は主にメリステム領域で発現し、LGNリピートとロイシンリッチリピートを持つ新奇のタンパク質をコードしている。TSK が持つどちらのリピート配列もタンパク質間相互作用に関わっていると考えられていることから、TSK と相互作用するタンパク質を同定することがその細胞内における機能を明らかにする上で必須である。今回我々は、酵母 Two Hybrid 法を用いて幾つかの TSKと相互作用するタンパク質の候補を得た。その一つである POT3 は、アグロバクテリウムの T-DNA にコードされた 6b タンパク質と結合するタバコの NtSIP1 と相同性を持つタンパク質であった。TSK と POT3 の結合はそれぞれの特異的なドメインを介して起こる。6b タンパク質は転写活性化因子と考えられており、NtSIP1 は核に局在化することが報告されている。TSKと GFPの融合タンパク質も核に局在することを示すデータが得られている。これらのことは TSK が何らかの形で転写調節に関与することを示唆している。

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OsEMF1 gene shows relatively low similarity to Arabidopsis EMF1 which plays an important role in maintaining vegetative stage by suppressing the expression of MADS-box genes in juvenile stage. Rice osemf1 mutant shows up-regulation of several MADS-box genes, resulting in dwarfism, abnormal flower development, indicating OsEMF1 is also involved in transcriptional regulation. Interestingly, two out of four allelic mutant lines also show longitudinal white sector consisting of mesophyll cells lacking mature chloroplasts, resulting in stripe leaf. The reproducibility of the phenotype in two lines indicates that stripe leaf is allele-specific phenotype caused by osemf1 mutation. Overexpression of the mutant osemf1 gene in wild type leads to stripe-leaf phenotype, indicating that stripe-leaf is caused by a gain-of-function mutation of OsEMF1 gene. The comparison of the expression profile obtained by microarray analysis between the mutant and wild type is also presented.

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シロイヌナズナを用いた遺伝学的解析から花成制御機構の一端が明らかになりつつある。様々な経路からの花成シグナルはFT、SOC1/AGL20、LFY遺伝子（経路統合遺伝子）に統合され、花成の最終段階に伝えられる。花成統合因子の一つであるFT 蛋白質の生化学的機能については未だ不明な点が多く残されているが、我々はFTの下流でFD遺伝子が機能していることを遺伝学的手法を用いて明らかにした。fd-1は非常に弱い遅咲き表現型を示すが、35S::FTの早咲き表現型に対しては強い抑圧効果を示す。このことから、FD の活性は35S::FTの早咲き表現型に必要であると考えられる。また、早咲き表現型に対する抑圧効果は35S::FTに特異的であり、35S::SOC1/AGL20あるいは35S::LFY　(Nilsson et al., 1998) の早咲き表現型には影響を与えないことも判明した。ポジショナルクローニングによりFD遺伝子を同定したところ、 bZIP 転写因子をコードしていることがわかった。第4染色体上のFDを含む約 1Mb の領域は第2染色体上に重複した領域をもち、そこにはFDと高い相同性をもつ遺伝子FDP(FD PARALOG) が含まれる。FDの発現レベルは非常に低いものの、長日および短日条件で発現が確認された。また、yeast two-hybrid system を用いたタンパク質間相互作用の検討からFD はFT と相互作用することが判明した。このことからFT は FD とタンパク質間相互作用することで FD機能を調節する役割を果たしていると考えられる。

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　シロイヌナズナにおいては、花成遅延表現型を示す優性変異体fwaが知られている。fwa変異体では、プロモーター領域におけるDNAメチル化の低下により、GL2型ホメオボックス遺伝子FWAが異所発現している（Soope et al. 2000）。また、栄養成長期の野生型植物では、FWA遺伝子は発現しておらず、さらに、機能欠損変異体が花成時期に関して野生型と差がないことから、FWA遺伝子は花成制御には関わっていないと考えられる。一方、FWAと同じGL2型HD-ZIP蛋白質に属するANL2、PDF2を異所過剰発現させた場合、fwa変異体と同様に花成遅延表現型を示すことが報告されている（Weigel et al. 2000; Abe et al. in press）。これらの事実から、GL2型HD-ZIP蛋白質を異所発現させることにより、本来の制御機構が撹乱され、花成が阻害されるという仮説を考えている。これまでの遺伝学的解析から、FWAはFTの機能を阻害するか、あるいは、FTよりも下流の経路を何らかの機構で阻害すると推測される。そこで、FWAを用いることによりFTより下流の制御経路についての情報が得られると期待し、FWA蛋白質によって機能が阻害されるような蛋白質の探索を行っている。まず、FWAとFTの蛋白質間相互作用をyeast two-hybrid系を用いて検討した。また、FWAと相互作用する蛋白質についてもスクリーニングを進めている。これらについて報告する。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

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fzpはイネの穎花を形成しない突然変異体である。我々のグループにより単離されたFZP遺伝子は今までによく知られていた花芽分化決定遺伝子とは異なり、ストレスやホルモン応答で機能すると考えられていたERF ドメインを持つ遺伝子であった。In situ hybridizationによる発現解析から、FZP mRNAは栄養成長期、生殖成長期の枝梗（枝分かれ原基）分化期では発現せず、小穂分化期に発現し、穎花分化期には発現が消失することがわかった。
現在までに、ERF ドメインを持つタンパク質は転写調節因子であり、GCC boxと呼ばれるシス配列に結合することが分かっていた。そこで、GCC boxをプロモーターに持つレポーター遺伝子とFZPを植物の葉に導入したところ、レポーターの発現を上昇させた。これはFZPのERFドメインがGCC boxに結合し、レポーターの発現を上昇させたためと考えられる。また、GAL4ドメインとFZPの融合遺伝子とGAL4 boxをプロモーターに持つレポーター遺伝子を葉に導入した結果、レポーターの発現が上昇した。これはFZPの転写活性化ドメインがレポーターの発現を上昇させたためと考えられる。これらの結果から、FZPがGCC boxをプロモーターに持つ穎花形成遺伝子を転写活性化し、イネの花芽形成を決定している可能性が示唆された。

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　MADS-box タンパク質をコードする AGL24 は、これまでの解析から花成前後の茎頂で主に発現することがわかっている。AGL24 遺伝子の機能を明らかにするために、AGL24 過剰発現植物体を作出した結果、早咲き・ガクや花弁の葉様化・器官脱離の欠損といった多面的な表現型を示し、AGL24 が花の発生に関わる可能性が考えられた。表現型をさらに詳細に解析したところ、これらの植物体は、長日・短日条件いずれにおいても野生型と比較して早咲きになるが、長日の方が短日よりも依然として早咲きとなった。また、ガクや花弁の葉様化は ap1 に類似した表現型であるが、ノザン解析の結果、過剰発現植物体でAP1 の発現減少が認められた。AGL24 過剰発現が、様々な遺伝子の発現に影響を及ぼしていることが考えられたので、マイクロアレイ解析ならびにノザン解析により、AGL24 過剰発現植物体の遺伝子発現について調べた。その結果、AP1 に加えてputative auxin-regulated geneなどの発現減少が認められた。また、AGL24 過剰発現体と ap1, lfy, co などとの交配を行い、AGL24 過剰発現が花の発生のどの段階に影響を及ぼしているのかを調べている。本大会では、これらの結果をもとに、AGL24 の機能について考察する。

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近年、ジベレリン(GA)の生合成やシグナル伝達に関与する多数の遺伝子が単離されている。これにより、GA合成酵素遺伝子とシグナル伝達に関与する遺伝子の発現解析をとおして活性型ジベレリン(GA)の合成と受容についての知見を得ることが可能となった。我々は、イネGA合成酵素遺伝子OsGA20ox1, OsGA20ox2, OsGA3ox1,OsGA3ox2とシグナル伝達に関与する遺伝子D1 (G protein a-subunit), SLR1, GAMYBの器官特異的な発現を、プロモーター::GUS形質転換体を用いた解析やin situハイブリダイゼーションにより観察した。栄養成長期において、合成酵素遺伝子、シグナル伝達に関与する遺伝子ともに分化直後の若葉や幼根の根端付近などの活発に伸長や分裂が行われている組織や器官で発現していた。生殖成長期においてもGUS活性は伸長節間や花芽で観察された（昨年度本大会）。今回は、花芽形成時の茎頂においてこれらの遺伝子の発現解析を行ったので合わせて報告する。これらの遺伝子は、花芽形成直前の茎頂で発現し、その後、枝梗分化期では枝梗原基で、更に生育が進むと、雄蕊原基、タペート層でも発現することがわかった。以上の結果から、栄養成長から生殖生長への転換期におけるGAの果たす役割について考察したい。本研究の一部は、生研機構基礎推進事業の支援で行われた。

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　シソは短日処理で誘導された花成状態が長期間持続するのが特徴であり、これはバーナリゼーションにおける低温効果が長期間維持されることを連想させ、両者の間に共通の機構があることを想起させる。バーナリゼーションにはDNAメチル化・脱メチル化による遺伝子発現制御が関与することが報告されている。そこで、シソ、‘青ジソ’と‘赤ジソ’種子を250μMの5-アザシチジンで5日間処理後、培養土に移植して、25℃、長日条件（16時間明条件）で育てたところ、10週間後には2品種とも開花に至った。DNA脱メチル化剤による花成誘導は光周的に花成が制御される植物では初めての知見である。5-アザシチジン処理によって形成された花の形質は、短日処理で形成された花の形質と異なるところはなく、5-アザシチジンは花成を誘導するほかには、若干の生長抑制を引き起こすだけで、他の形質には影響しなかった。このことは、特定の少数の遺伝子だけが脱メチル化されて発現を制御されたことを示唆し、脱メチル化で発現を誘導される遺伝子（花成関連遺伝子）を特定できる可能性を考えうる。5-アザシチジン処理は茎頂に対しても有効で、このとき、下位の節にも花芽が形成された。この結果は、5-アザシチジン処理は輸送可能な花成誘導物質の生産を誘導したことを示唆する。

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