Ferritin is a class of iron storage proteins. In the present study, two full-length cDNA clone, NtFer1 and NtFer2, encoding ferritin from cDNA library of 3-old tobacco seeding, constructed in the lambda TriplEx2 vector have been isolated and characterized. NtFer1 and NtFer2, were 1214 and 1125 nucleotides long encoding 251 and 259 amino acid residues, respectively. The mature subunit encoded by NtFer1 shares 78.3% and 70.6% homology with two soybean ferritin subunits, while NtFer2 shares 71.7% and 68.4%. Southern blot indicated that NtFer1 was encoded by a two-copy gene and NtFer2 was encoded by a single-copy gene in the tobacco genome. Northern blot analysis showed that NtFer1 and NtFer2 were expressed in leaves as well as in roots, and NtFer1 was well responsive to excess iron then NtFer2. The abundance of NtFer1 mRNA was increased in leaves by exogenous ferritin gene everexpressing, while the abundance of NtFer2 mRNA was stably.

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フェリチンは24量体を形成する鉄貯蔵タンパク質として知られており、高等植物、動物、微生物など幅広い生物種において見出されている。演者らは、ダイズ種子に存在するフェリチンが二種類の異なるサブユニットからなるヘテロ24量体を形成し、両サブユニットはは機能的にも異なっていることを明らかとした。即ち、従来型サブユニット(H-1)はC-末端領域が成熟過程で切断され単独では24量体を保持できないのに対し、新規に見出したサブユニット（H-2）は切断を受けず24量体の安定に寄与するということがin vitroの系において示唆された(*)。各サブユニットの植物体内での安定性、鉄貯蔵機能を検討するため、各々の遺伝子を導入した形質転換タバコを用い解析を行った。
　植物体の鉄含有量については通常鉄濃度のMS培地で生育させた場合には両者の間で大きな差は見られなかったが、鉄濃度を数倍に増やした培地においては新規サブユニットを発現する形質転換体が有意に高い値を示した。また、両サブユニットを共通に認識する抗体を用いたイムノブロッティングによる解析の結果、H-2サブユニットはH-1サブユニットよりも形質転換植物中での安定性に優れていることが明らかとなった。このことから、植物体内においても新規フェリチンサブユニットは安定に保持され、鉄貯蔵に寄与していると考えられる。
(*) Masuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19575-19579

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ニコチアナミン(NA)は鉄キレーターであるムギネ酸類生合成の中間体としてイネ科植物の鉄吸収において重要な役割を果たす．一方，NA自体が鉄やそのほかの金属のキレーターであり、ムギネ酸類を合成しない双子葉植物にも存在することから植物体内の金属イオンの輸送や分配に関与していると考えられている．しかしその生理的機能の詳細については明らかでない．演者らは，3分子のS－アデノシルメチオニンからNAを合成するニコチアナミン合成酵素（NAS）の遺伝子群を，オオムギ、イネ、トウモロコシから単離しており，シロイヌナズナからも3種類の遺伝子（AtNAS1,2,3）を単離した．
イネ科以外の植物におけるNAの機能を明らかにするために，本研究では，シロイヌナズナの3種類のNAS遺伝子のそれぞれについて，金属元素に対する応答をプロモーターGUSアッセイ，定量的RT-PCRにより解析した．
その結果，3種類の遺伝子は鉄によってそれぞれ異なる制御を受けていること，またそれぞれの発現部位が異なることが明らかになった．AtNAS1,2は鉄欠乏によって転写レベルでの発現が誘導された．これは双子葉植物ではムギネ酸が合成されないので，NAS遺伝子の発現は鉄欠乏により誘導されないと想定されていたことを否定する結果である．一方，AtNAS3は鉄欠乏によって発現が抑制され，AtNAS1,2とは異なる生理機能を持つことが示唆された．

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Serine acetyltransferase (SATase) catalyzes the formation of O-acetylserine (OAS) from L-serine and acetyl-CoA, connecting serine metabolism to cysteine biosynthesis. SATase and OAS are proposed to be regulatory factors in the biosynthesis of cysteine in plants. In the genome of Arabidopsis thaliana, there are five predicted SATase-like genes. To elucidate the temporal and spatial expression patterns of the different putative SATase isoforms (SAT-p, -c, -m, -#5, and -106) during the development of wild type A. thaliana, real-time quantitative PCR was performed. The results show that SATases mRNAs have distinct expression levels between aerial and root regions during plant development.
A. thaliana plants carrying fusions of SATase promoter region and green fluorescent protein (GFP) were produced to verify SAT-m, -c, and -p tissue-specific expressions. The result showed similar tissue-specific expressions of SAT-p and SAT-c, differing with SAT-m that is expressed ubiquitously.

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セリンアセチル転移酵素 (SATase) は、システイン生合成の重要な中間体であるO-アセチルセリン (OAS) を生成する酵素である。シロイヌナズナゲノムには5つのSATaseアイソザイム遺伝子が存在しているが、細胞質局在性のSAT-cはその活性がシステインによりフィードバック阻害を受けることからOASを介した硫黄同化系の制御に重要な役割を果たしていると考えられる。そこでSAT-cの硫黄同化系における機能を明らかにするために、T-DNA挿入変異体のスクリーニングを行い、SAT-c遺伝子にT-DNAが挿入された植物を1系統（KOC）単離し、解析を行った。
　OAS、システイン、グルタチオン含量を測定した結果、野生型シロイヌナズナと比較してKOCではシステイン含量が約50%に減少していたが、OAS、グルタチオン含量は変化しなかった。現在DNAアレイ実験、およびFT-MSによる代謝物の包括的解析を行いSAT-c遺伝子が破壊されたことによる影響を解析中である。

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　アシルアミノ酸遊離酵素（Acylamino acid releasing enzyme,AARE) はN末端がアシル化されたペプチドからアシル化アミノ酸を遊離するエキソペプチダーゼであるが、最近、AARE が酸化や還元糖による化学修飾を受けたタンパク質を分解する機能を持つエンドペプチダーゼでもあることが動物で明らかにされた。今回、植物における AARE の生理機能を明らかにすることを目的に、遺伝子の単離と生化学的性質の解析を行った。アラビドプシスのゲノムに見い出された動物 AARE とホモロジーの高い遺伝子をRT-PCR によりクローニングした。コードされた694個のアミノ酸からなるタンパク質は動物 AARE と28％の相同性があり、大腸菌で発現させた組換え AARE は、アラビドプシスとキュウリから精製したネイティブな AARE とほぼ同じエキソペプチダーゼとしての酵素学的性質を示した。さらに、精製キュウリ AARE はネイティブ ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) は分解せず、グルコースによりグリケーション修飾された Rubisco のみを分解した。これらの結果から、植物に存在する AARE も、N末端がアシル化されたペプチドからアシル化アミノ酸を遊離する機能だけではなく、化学修飾を受けたタンパク質の除去にも機能していることが考えられた。

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ホウレンソウの葉緑体ストロマからClpプロテアーゼの精製する過程で，我々はClpの基質である蛍光ペプチド，Suc-Leu-Tyr-MCAの分解活性を持つ別の酵素の存在を発見した．本講演ではその酵素の精製と性質について報告する．この蛍光ペプチドを分解する酵素は，通常のカラムクロマトグラフィーにより精製され，SDS-PAGEより求められた分子量は35,000であった．このタンパクのN末端配列をペプチドシーケンサーで解析したところ，ホウレンソウ由来のO-アセチルセリン(チオール)リアーゼ(OASリアーゼ)のN末端配列（AVSLSPP）と完全に一致していた．OASリアーゼは，システイン生合成の最終段階で，O-アセチルセリンと硫化水素からシステインと酢酸の生成反応を触媒する酵素である．この酵素にはいくつかのアイソザイムが存在し，それらは葉緑体，細胞質，ミトコンドリアに分布していること，また，OASリアーゼは補酵素としてピリドキサールリン酸を持つため，407 nm付近に吸収があることが知られている．我々の精製したタンパクにも407 nmに吸収が見られた．これらのことから，Suc-Leu-Tyr-MCAを基質として精製されたタンパクは，OASリアーゼである可能性が極めて高い．現在，反応速度論的に本酵素の反応機構について解析を進めている．

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　クラミドモナスには2種類のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、Mmp1とMmp2が知られている。Mmp1はガミートライシン（Matsuda 1998）として接合時の配偶子細胞壁溶解に機能し、Mmp2はその遺伝子発現時期からみて接合子形成後に機能すると推定される（Kuboら2001）。本研究では、クラミドモナスESTライブラリーの検索によって見出された第3のMMP、Mmp3の遺伝子構造とその転写発現を解析し、さらに特異抗体を用いた蛋白質レベルでの発現解析を行った。
　Mmp3 cDNAのORFは646アミノ酸をコードし、Mmp1、Mmp2との相同性は70%と59%であった。そのアミノ酸配列は、プレプロ領域をもち、先の2つのMMPsと同様に、メトジンシングループに属する亜鉛結合モチーフをもっていた。サザン解析からMmp3遺伝子は、1コピーで、タンデムに配列しているMmp1-Mmp2とは別の遺伝子座に位置することが分かった。ノザン解析からMmp3は、栄養細胞において特異発現し、細胞周期のG₁期に転写が増大した。
　Mmp3の推定マチュアポリペプチド領域のN末およびC末付近のペプチド配列をもとに2種類の抗体を作製した。両者は65 kDa蛋白質を共通認識した。この蛋白質は、細胞周期のG₁中、後期において顕著に発現した。以上の結果より、Mmp3は細胞の伸長成長時の細胞壁溶解に関与している可能性が示唆された。

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UDP-D-グルクロン酸4-エピメラーゼはUDP-D-グルクロン酸からUDP-D-ガラクツロン酸を合成する酵素である。生成物UDP-D-ガラクツロン酸はペクチン質多糖生合成におけるガラクツロン酸供与体として機能する。本酵素はこれまでにエンドウ、ダイコンで部分精製され膜結合型であることが知られている。Streptococcus pneumoniaeで同定された本酵素遺伝子の推定アミノ酸配列を用いてBLAST検索した結果、シロイヌナズナには少なくとも6つのアイソザイムが存在し、それらは全て膜結合型酵素と予測された。そのうちの1つ At4g30440のcDNAをライブラリから単離し、細胞質ドメインに相当する領域を大腸菌で発現させた。組換蛋白質はUDP-D-グルクロン酸4-エピメラーゼ活性を示した。現在、組換蛋白質を抗原として作成した抗体を用い、免疫組織化学的手法により細胞内局在部位を検討中である。

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Synechocystis sp. PCC6803 extracellularly produced a hemolysin homolog (gene product of sll1951) by culturing in BG-11 medium supplemented with 3 μM CuSO₄. No hemolytic activity was found in the culture medium. The protein was purified by DEAE-cellulose and Superose 6 chromatography. On the latter, the protein was eluted at the position of 560 kDa. When this value is compared with the molecular weight of the monomer, deduced from the DNA sequence, 178 kDa, the protein is likely to form a trimer. The mobility of the protein upon SDS-PAGE largely and reversibly changed by heat: 84-98 kDa when not heated and 224 kDa when heated. This mobility change suggests that the hemolysin homolog underwent a reversible structural change by heat, and is likely to be due to the Ca-binding β-roll motifs in the protein molecule. The Ca content in the protein is now being measured.

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植物の主要リン脂質であるホスファチジルコリン（PC）はCDP-コリンを経由するヌクレオチド経路で合成される．シロイヌナズナには，AtCCT1およびAtCCT2と命名した2つのCDP-コリン合成酵素の遺伝子が存在するが，我々は低温においてPC含量の増加とAtCCT2の発現増大とが相関することを報告した（Inatsugi et al. (2002) Plant Cell Physiol. 43:1342-1350）．今回，PC合成におけるCCTイソ遺伝子の役割をさらに明らかにすべく，シロイヌナズナT-DNAタギングラインよりAtCCT1およびAtCCT2のT-DNA挿入遺伝子破壊株，cct1およびcct2，を単離した．cct2の脂質組成は23℃でも2℃・1週間の低温馴化処理後でも野生株のそれと変わりがなかった．この結果は，シロイヌナズナのPC生合成とその調節にはAtCCT1だけで充分であることを示している．さらに，かけあわせで作出したcct1 cct2二重遺伝子破壊株では，CCT活性が野生株の2％以下まで低下したものの， 23℃での成長と脂質組成は野生株とほとんど変わりがなかった．以上の結果は，シロイヌナズナのPC生合成は通常の2％程度のCCT活性で充分であるか，あるいは，ヌクレオチド経路にかわる未知のPC合成経路により補償される可能性を示唆している．

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低温馴化する植物では，環境温度の低下に伴いリン脂質の含量とジ不飽和分子種およびポリエン脂肪酸の割合が上昇する．我々は，この現象の生理的意義を明らかにするため，低温におけるリン脂質の生合成活性化機構の解析を目指している．今回，主要なリン脂質であるホスファチジルコリン(PC)とホスファチジルエタノールアミン(PE)の含量と脂肪酸組成を，低温に移したシロイヌナズナのロゼット葉で比較し，PEの含量と不飽和度の上昇がPCより遅れることを見出した．PCの生合成律速酵素であるCTP:ホスホリルコリンシチジリルトランスフェラーゼ(CCT)およびPEの生合成律速酵素であるCTP:ホスホリルエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ(ECT)について調べたところ，ECT活性の上昇はCCT活性の上昇より数日遅く，この活性上昇の遅れがPE蓄積の遅れの原因であると考えられた．さらに，ECT遺伝子はCCT遺伝子に較べ，低温における転写産物の蓄積が遅れることを明らかにした．以上の結果は，シロイヌナズナの低温に応答したリン脂質生合成活性化機構において，PCとPEでは異なる遺伝子発現の調節が起こっていることを示している．

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　フルクタンは寒地型イネ科植物など、温帯起源の植物の組織にデンプンに代わって貯蔵されるフルクトースのポリマーである。フルクタンの主な役割の一つとして細胞内浸透圧調整に関与していることが知られており、乾燥や凍結のような環境ストレスに応答する点で重要な物質である。ペレニアルライグラスは牧草としての評価は高いが、他の寒地型イネ科牧草に比べて環境ストレスに弱い。本研究ではペレニアルライグラスの耐凍性を向上させる目的で、コムギ由来のフルクタン合成酵素6-SFT (sucrose-fructan 6-fructosyltransferase)および1-SST (sucrose-sucrose 1-fructosyltransferase)をコードする遺伝子wft1およびwft2^1）を導入したペレニアルライグラスを作出した。
　導入遺伝子が確認された16個体を供試し、糖類を抽出してHPLC分析を行った結果、wft1が検出された2個体およびwft2が検出された3個体で、対照個体との比較において、有意な差を示すフルクタンの蓄積が見られた。導入個体に関して電気伝導度法で耐凍性の評価を行った結果、フルクタン含有量が高い導入個体では比較的耐凍性が高かった。このことからコムギ由来のフルクタン合成遺伝子の導入によってペレニアルライグラスの耐凍性が向上することが確認された。
^1）Kawakami and Yoshida, Biosci, Biotechnol. Biochem. 66, 2297-2305 (2002)

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植物は低温馴化過程において、細胞内に適合溶質を蓄積し、耐凍性を獲得・向上させる。本研究では耐凍性の獲得と、適合溶質の量的効果（浸透圧調節能）および質的効果（直接保護作用）との関連を検討する事を目的として、低温馴化過程における適合溶質の細胞内局在性を決定し、その量的変化を測定した。材料は、冬コムギであるNorstar を用い、3℃、0～21日間低温馴化処理を行った。適合溶質は、糖・アミノ酸・グリシンベタイン含量をそれぞれ測定した。適合溶質の細胞内局在性は、Nonaqueous Fractionation法（Stitt et al., 1989）を本実験用に改変し、4つの細胞内画分（細胞質・液胞・葉緑体・ミトコンドリア）について決定した。その結果、低温馴化後、1）適合溶質中、全ての細胞内画分において糖の蓄積量が最も多い；2）適合溶質の蓄積は細胞質で最も多い；3）糖は液胞に最も蓄積しているが、単・二糖類は細胞質に最も多い；4)プロリンの蓄積は細胞質 > 液胞 > ミトコンドリアの順に多い；5)ベタインの蓄積は細胞質 > 液胞 > 葉緑体の順に多い、という点がわかった。以上の結果について、電顕観察により得られた細胞内画分の体積推定値を用い、適合溶質のオルガネラにおける濃度を求め、耐凍性との関連について考察する。（本研究の一部は、生研機構からの研究費により行われた。）

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A cDNA microarray was utilized to screen for clones that are induced by chilling stress in rice roots. Two cDNAs clones induced at 12oC and involved in trehalose biosynthesis, TPS and TPP, were identified. Full-length cDNA clones were isolated through library screening. Southern analysis indicates, OsTPP1 is a single copy gene while OsTPS1 may have similar genes. Northern blotting showed that both clones were rapidly and transiently induced within 1-4h and the signals disappeared after 6-10h of chilling stress. Fructose and glucose levels in cold-treated rice roots consistently increased after a lag of 5h. Sucrose levels consistently increased during the 24h of chilling treatment. Concurrent increase of trehalose levels was apparently faster and earlier than the other sugars, and followed the patterns of OsTPP and OsTPS mRNAs accumulation. It appears that trehalose biosynthesis is transiently induced and maybe involve in the regulation of sugar metabolism in chilling-stressed roots in rice.

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低温ストレス耐性をもつ植物の多くは、低温ストレスに曝されるとポリアミンが増加する(Guy et al. 1986)。しかし、植物の低温ストレス耐性獲得におけるポリアミンの役割は未解明の部分が多い。我々は低温ストレスに応答するディファレンシャルクローンの中に、ポリアミン生合成のキー酵素のひとつ、S-アデノシルメチオニンデカルボキシラ-ゼ(SAMDC)の部分cDNAを発見した。このSAMDCの部分cDNAをプローブに用い、イネ実生のcDNAライブラリーから2種類の全長SAMDC遺伝子を単離した(Pillai & Akiyama, Information Sciences, 2002, in press)。今回は、単離したOsSAMDC1 (GenBank, YO7766と一致)及びOsSAMDC2 (GenBank, AJ251899と一致)の3'-UTRを遺伝子特異的プローブとして用いて発現解析を行った。その結果、OsSAMDC1 が低温ストレスにのみ応答するのに対し、OsSAMDC2 は低温ストレスの他、塩ストレスや乾燥ストレスに対しても応答することが明らかになった。また、これらの遺伝子特異的プローブを用いたサザンブロット解析によって、イネ「ゆきひかり」のゲノム中には、OsSAMDC1 及びOsSAMDC2 遺伝子がそれぞれ1コピーだけ存在することが判明した。OsSAMDC1 遺伝子を再導入したイネ遺伝子組換え系統のポリアミン量を比較した結果についても合わせて報告する。

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　クロダネカボチャから単離したスペルミジン（Spd）合成酵素遺伝子で形質転換したシロイヌナズナは，野生株に比べ，種々の環境ストレスに対して高い耐性を示す（春日部ら，2001）．植物のストレス障害の多くには活性酸素が関与していると考えられるので，低温遭遇葉の抗酸化酵素活性を形質転換体と野生株とで比較した．
　播種後55日目の土耕苗を低温条件（5/5℃，12時間日長，200 um^-2 s^-1）に4日間移した．低温遭遇により葉の遊離ポリアミン濃度が高まったが，常に形質転換体のほうが野生株より高濃度であった．また，低温遭遇により葉のFv/Fmが低下しH₂0₂濃度が高まったが，形質転換体はそれらの程度が小さかった．低温遭遇により葉のSOD活性が酵素タンパクの増加を伴って増大し，形質転換体はその程度が極めて大きかった．APX活性においても，SODほどではないものの類似の傾向が認められた．形質転換体ではSpd合成酵素阻害剤処理によりSOD活性増大程度が小さくなり，野生株ではSpd処理によりSOD活性増大が僅かながら促進された．なお，MDHARとGRは低温による増大程度が小さかった．これらの結果は，Spdには抗酸化酵素の低温誘導を促進する機能のあることを示唆する．

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穂ばらみ期、とりわけ小胞子初期の冷温による花粉の発育障害は、産業的にも非常に深刻なイネの冷害をもたらす。冷温障害発生メカニズムに強くリンクする遺伝子を特定し、その機能を解明することを目的として、花粉母細胞期から小胞子中期までの葯発育過程で発現し、冷温ストレスによって変動する遺伝子群の発現パターンをマイクロアレイ技術により網羅的に解析した。その結果、最高冷温感受性期である小胞子初期から冷温耐性を獲得していく小胞子中期にかけて、冷温に応答して多様な遺伝子群の発現増加・減少が起こっていることが明らかとなった。それらの中で、ジャスモン酸合成酵素遺伝子が小胞子初期の冷温によって顕著に発現レベルを低下させること、逆に、ポリアミン合成酵素遺伝子が小胞子初期の冷温によって顕著に発現レベルを上昇させることを見いだし、遺伝子全長の構造解析および発現様式の解明をおこなった。これらのイネ葯冷温ストレス応答遺伝子及び、ジャスモン酸、ポリアミンが冷温下の花粉形成機能の維持あるいは花粉発育障害発生機構において重要な役割を果たしている可能性が考えられる。

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　寒冷地域に分布する落葉広葉樹のシラカンバ(Betula platyphylla L.)は、秋から冬にかけて季節的な低温馴化過程を経て耐寒性が著しく上昇する。シラカンバの木部放射柔細胞は深過冷却によって凍結抵抗性を高めるが、この抵抗性の誘導には細胞内部だけでなく細胞外部の要因も関連する可能性が考えられる。そこで本研究では、木部組織の凍結抵抗性と関連性のある細胞外因子を見い出すため、低温馴化過程で生じる木部組織での細胞外蛋白質の組成変化を調べ、冬季誘導性蛋白質の同定を試みた。
　野外で採集したシラカンバの枝から皮相組織を取り除いて得られた木部組織を材料に用い、短時間の酸性溶液処理により細胞外蛋白質を抽出した。夏と冬に採集した組織からそれぞれ調製した細胞外蛋白質画分の組成をSDS-PAGEにより比較したところ、季節的な低温馴化によって30 kDa付近の複数の蛋白質バンドが顕著に増加していることが明らかになった。これらの冬季誘導性の細胞外蛋白質(WCWPs)を単離して、N末端アミノ酸配列の分析をおこなったところ、互いにアミノ酸配列が類似しており、生体防御に関連するPR蛋白質と相同性を示すことが判明した。また、WCWPsに対する抗体を用いてイムノブロット解析をおこなった結果、これらは互いに冬季誘導性のアイソフォーム蛋白質であることが示唆された。

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冬季に-80℃以下の高い凍結耐性を獲得するクワ(Morus bombycis Koidz.)皮層柔細胞では、秋から冬にかけての季節的低温馴化に伴い、可溶性画分に18kDの分子サイズを有するタンパク質（WAP18）の蓄積が見出される。精製したWAP18は、in vitroに於いて凍結・融解による乳酸脱水素酵素活性低下を防止したことから、WAP18はクワ皮層柔細胞が獲得する冬季の凍結耐性獲得に、何らかの形で貢献するものと推測される。cDNAクローニングにより、WAP18はPR-10/Bet v 1ファミリーと高い相同性を有することが示された。ノーザン解析を行ったところ、WAP18遺伝子は、4℃の低温処理のみならず、wounding、エテフォン、およびサリチル酸による誘導が見られた。
一方、PR-10/Bet v 1ファミリーはその推定されるアミノ酸配列から、細胞質に局在すると推測されているが、正確な細胞内局在は示されていない。そこで、WAP18のクワ皮層柔細胞における細胞内局在を、免疫電子顕微鏡法を用いて観察したところ、細胞質と核に金コロイド標識が見いだされた。このことから、PR-10/Bet v 1ファミリーは細胞質と核に局在することが示唆された。

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イネは初期生長期に、比較的低温による障害を受けやすい事が知られている。幼苗の低温障害は、主に吸水阻害による萎凋と葉緑体内での活性酸素発生による葉の脱色の2つに分類できる。我々は、クラミドモナス由来葉緑体型Ascorbate peroxidaseのアスコルビン酸欠乏時の失活に対する安定性が、高等植物のそれに比べて高いことを明らかにした。この酵素をイネの葉緑体で発現させることで、イネのH2O2消去能を飛躍的に向上させ、幼苗期耐冷性を強化できる可能性がある。そこで、クラミドモナス由来Ascorbate peroxidase（APX）の遺伝子をイネに導入し、イネ幼苗の低温下での脱色耐性が強化されるか調べる事にした。遺伝子導入にあたっては、葉緑体移行配列部分を除去したクラミドモナスAPXcDNAの、N末側にイネGlutamine synthaseの葉緑体移行配列部分、C末側にほうれん草APX由来チラコイド膜Stucking配列を付加した合成APX遺伝子を発現させることで、特に葉緑体チラコイド膜近傍でのH2O2消去能を強化することを狙った。遺伝子発現が確認できた形質転換体では、当代植物体および次世代植物体でパラコート耐性が強化されており、当代植物体の葉切片を用いた耐冷性検定では低温脱色耐性が強化されていた。今回は導入したT2分離世代の幼苗を用いた低温耐性検定の結果を報告する。

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Cold deacclimation (DA) is a phenomenon that is genetically controlled to lose the degree of freezing resistance acquired during cold acclimation (CA) and is triggered by spring warmth. DA is also accompanied by a restart of plant growth arrested during CA. We hence set out to establish an experimental system of Arabidopsis for studying DA at molecular level, which may enhance our understanding of the regulation of freezing resistance and growth. We demonstrated that an application of the protein synthesis inhibitor cycloheximide at the onset of DA treatment prevented significantly the subsequent loss of freezing resistance, suggesting that novel gene expression is required for the development of DA. We therefore conducted macroarray and differential display analyses to list up genes that showed altered transcript levels during DA. These results provide us with a future guideline for studying DA at molecular level. (Supported in part by a grant from PROBRAIN.)

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Rice is a typical chilling sensitive plant. Cell suspension cultures of rice also suffer injuries at chilling temperatures. However, we found out that exogenous application of ABA induces freezing tolerance in rice cell cultures in a similar manner as in other cell cultures of Gramineae plants that have genetically cold hardiness. We analyzed physiological factors involved and cytosolic proteins expressed during ABA induced freezing tolerance by 2D electrophoresis.
At the optimum conditions, the rice cells tolerated -12C and some cells even -20C after 7 days of incubation in the presence of 75 μM ABA at 25C. More than 80 CBB-stainable protein spots were either increased or induced by ABA treatment. Some of the major ABA responsive spots were detected as early as 6h of incubation with ABA containing medium while after one day incubation most ABA responsive spots were detected when the rice cells tolerated moderate freezing.

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　ブロムグラス培養細胞（Bromus inermis Leyss）は、低温処理やアブシジン酸（ABA）処理により耐凍性を獲得する。我々はブロムグラスの耐凍性機構を解明するために、低温処理やABA処理による遺伝子群の発現変化をイネのマイクロアレイを用いて解析した。
　低温やABA処理により発現が上昇する遺伝子群の中から10遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。その1つは不凍タンパク質として報告されているキチナーゼと相同性がある。ブロムグラスは低温処理により培地中の不凍活性が上昇することが明かとなっており、その関連を調べている。
　現在、単離した遺伝子を導入した形質転換ブロムグラスを作製している。

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　プラスチド内のタンパク質の9割以上が核ゲノムにコードされているため，プラスチドがその機能を発揮するためには，これらが細胞質で翻訳後，プラスチド包膜を透過する必要がある．プラスチド包膜に存在しタンパク質の輸送に関与する因子は，Toc（外包膜），Tic（内包膜）と命名され，これまで主にエンドウを材料とした生化学的手法により解析されてきた．Tic40因子に相当するシロイヌナズナ遺伝子はハプロイドゲノムあたり1コピーで存在し，GFPを用いた局在解析の結果，プラスチド包膜上に局在することが明らかになった． atTic40遺伝子にT-DNAの挿入を持つ変異体では，葉緑体を含む組織すべてにおいて緑化が抑制されていた．そこで変異体における葉緑体色素含量を測定した結果，予想通り調べた全ての色素が野生型のものと比較して減少していた．そこでそれらの存在比を検討した結果，野生型の存在比を保持したまま減少していることが明らかになった．さらに形態学的ならびに生化学的解析を行った結果，変異体での淡緑色の表現型は，葉緑体分化というよりはむしろ葉の細胞数の減少に起因することを示唆する結果が得られた．

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　葉緑体は植物の特徴である光合成機能を有し、これは葉や茎など限られた器官においてのみ、発達する。この器官特異的な葉緑体構築機構を解明するために、アクティベーションタギング法を適用し、シロイヌナズナのカルスにおいて光合成遺伝子 RBCS が発現するようになった突然変異系統 ces (callus expression of RBCS ) を選抜した。ces101 系統カルスは緑色を呈し，野生系統カルスに対して RBCS の発現が約700倍増加していた。さらに，葉緑体光合成遺伝子の転写を司るσ因子の遺伝子 SIG1 の発現も増大していた。すなわち、 CES101 は、核光合成遺伝子の発現に加えて、葉緑体光合成遺伝子発現までをもその制御下に置くことが示唆される。ces101 系統においては，ゲノム当たり1コピーの T-DNA が，第3染色体上部 P1 クローン MSL1 部位に挿入されていた。その近傍に存在していたreceptor-like kinase 遺伝子とエンハンサー配列とを連結したバイナリーベクターを作製し，親系統カルスに導入した。その結果、ces101 系統カルスと同様に緑化する表現型が現れ、CES101 はreceptor-like kinase 遺伝子と同定された。また、ces102 系統カルスにおいても、活性化された遺伝子の解析を行っているので合わせて報告する。

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GrpE は蛋白質のフォールディングや膜透過に関与する分子シャペロンHsp70と協同的に働く補因子（コシャペロン）で、原核生物や真核生物のミトコンドリアにおいて広く見いだされている。原核生物やミトコンドリアのGrpE の機能は、Hsp70に結合したATP/ADP の交換反応の促進であり、Hsp70 のシャペロン機能において必須な役割を果たしていることが明らかになっている。高等植物葉緑体内にもHsp70が存在しているが、協同的に働くと予想されるコシャペロンに関しては、その存在様式やHsp70との機能の協同性などは不明である。本研究ではシロイヌナズナ葉緑体に存在する2種類のGrpE蛋白質に関して解析をおこなった。
　シロイヌナズナゲノムデータベースおよびESTデータベースには、アミノ末端に葉緑体行きのトランジット配列様の配列を有し、さらに成熟体部分が葉緑体の進化的起源と考えられるらん藻のGrpE に高い相同性を示す蛋白質をコードすると予想される遺伝子が2つ（AtcpgrpE1, AtcpgrpE2）存在している。これらの遺伝子がコードする蛋白質cpGrpE1, cpGrpE2が、実際に葉緑体ストロマに局在することを確認した。さらに2つのcpGrpEは葉緑体ストロマにおいてほぼ等量存在しており、いずれも葉緑体Hsp70と複合体を形成していることが分かった。現在、これら2つのcpGrpEのノックアウト株の解析や、Hsp70との相互作用や複合体形成様式について解析を進めている。

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高等植物ルビスコは核ゲノムにコードされる小サブユニット(SSU)と葉緑体ゲノムにコードされる大サブユニット(LSU)が8つずつ会合したL₈S₈構造を採っている。ルビスコは植物の緑化中に盛んに生合成されるが、その過程で、シャペロニンのようなタンパク質の介助を受け、フォールディングや会合が起こっている。また、ルビスコは老化やストレスにより分解される。これらルビスコの生合成や分解の詳細なメカニズムについては解明されていない。ルビスコの各サブユニットは生合成過程や分解過程においては、L₈S₈構造をとらない状態で細胞内に存在している可能性が考えられる。これらの存在状態を明らかにすることはルビスコの生合成メカニズムや分解メカニズムを解明する上で重要である。本研究では、植物内でL₈S₈構造を採っていないルビスコサブユニットについて解析した。
暗所で発芽させたダイコンに光を照射すると、経時的にルビスコホロ酵素の蓄積量が増加した。このときの葉の不溶性画分には、SSUのみが蓄積していることを、ウェスタンブロティングならびに質量分析により明らかにした。また、完全展開した成葉の不溶性画分におけるSSUの蓄積量は大きく減少していた。これらの結果から、SSUはルビスコの生合成が盛んな植物では一部が不溶化していることが考えられる。現在、緑化過程に不溶性画分に蓄積するSSUの特性について解析中である。本研究の一部はMETI/RABの委託によるものである。

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我々はトウモロコシのトランスポゾンAc/Dsを用いてシロイヌナズナの遺伝子破壊系統を多数作製して、葉緑体の形成や光合成機能に関与する遺伝子に注目し、F3世代について幼苗期の表現型を調べ、アルビノ又は葉の色素が薄くなるpale green変異体の探索を行った。染色体5番の3カ所のドナー部位と染色体1番の4カ所のドナー部位から転移させた9425ラインの遺伝子破壊系統よりアルビノ変異体87ラインを単離した。その内、トランスポゾンの挿入が原因で、アルビノの表現型を示したラインは42ラインであり、約50％のタグ効率あった。得られたアルビノ表現型には様々なタイプがあり、単純なアルビノ変異体が21ライン、pale green変異体が15ライン、双葉のみが白い変異体が4ライン、斑入りやまだらになっている変異体が3ライン単離された。データーベース上のゲノム情報により遺伝子を破壊していると考えられる変異体が40ライン、その内既知の遺伝子を破壊しているのが22ライン、残りの2ラインは広い遺伝子間領域にDsの挿入が確認され、その領域に新規のアルビノ原因遺伝子が存在することが示唆された。また、各原因遺伝子のうち、葉緑体移行シグナルをもつ遺伝子は25、ミトコンドリア移行シグナルをもつ遺伝子は6、その他が6あり、必ずしも葉緑体蛋白質が破壊されたことによりアルビノなどの表現型質を示すわけではなく、いくつかのミトコンドリア蛋白質もアルビノ原因遺伝子であることを示している。

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　細胞質雄性不稔(CMS)は、広く高等植物に見られる現象で、多くの場合、ミトコンドリアゲノムの組み換えよって生じたミトコンドリア遺伝子の発現が原因であることが明らかになっている。また、稔性回復(Rf)については、CMSに特異的な核遺伝子の存在が知られている。このように、CMSとRfはミトコンドリア遺伝子と核遺伝子の相互作用を明らかにする上で、良いモデル系となると考えられる。
　我々はこれまで、コセナダイコンのCMS 及び Rfについて研究を進めてきた。コセナCMS個体では、コセナダイコン細胞質に特有なミトコンドリア遺伝子orf125が存在し、その翻訳産物の蓄積が見られる。これに対し、稔性回復個体では、この蛋白質の蓄積量がそのmRNA量の減少を伴わす、著しく低下することが明らかになっている。この回復遺伝子の単離を目的に、ポジショナルクローニングを行い、候補の遺伝子を形質転換することにより同定した。この遺伝子は、687アミノ酸をコードできるORFをもち、オルガネラ遺伝子発現を調節することが提唱されているpentatricopeptide repeat motifを16個持つものであった。現在、この遺伝子の発現様式を種々の組織で解析している。また、稔性不稔個体において、orf687遺伝子に非常にホモロジーの高い遺伝子が存在・発現していた。これらの結果をもとに稔性回復遺伝子の機能について考察する。

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シロイヌナズナ葉緑体変異体 arc シリーズは、肉眼観察では野生型との違いは検出されないが、葉緑体の大きさと数が変化した変異体であり、Pykeらによって1991年に単離・報告された。しかし、原因遺伝子の同定はいずれの変異体でもなされていない。葉緑体の分裂制御機構については未だ未解明な部分も多く、本変異体の原因遺伝子の同定は制御機構の解明につながると考えられる。そこで我々はarc3の原因遺伝子の同定を行い、マッピングの結果、 ARC3遺伝子は第一染色体上に存在する事が示され、相補実験から同定した遺伝子がARC3遺伝子であることを示した。ARC3遺伝子は742アミノ酸をコードしており、N末領域がバクテリアの分裂制御因子であるFtsZとのホモロジーがあり、C末領域は真核生物でよく知られているシグナル伝達因子のphosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinaseの一部とホモロジーがあった。ARC3遺伝子は、真核生物が原核細胞由来の葉緑体の分裂を制御するために、真核型の遺伝子と原核型の遺伝子が融合して生じたと考えられる。現在ARC3タンパク質のそれぞれのホモロジー部分の機能を調べており、その結果も併せて報告する。

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FtsZタンパク質は原核生物の細胞質分裂面で機能する分裂リングの主要構成分子である。高等植物ではFtsZには2つのタイプが存在し、それぞれが葉緑体分裂に関与している。我々は苔類ゼニゴケから葉緑体型のftsZ遺伝子の単離を試み、MpftsZ1、MpftsZ2の2つを得た。ノーザン解析は両遺伝子が転写されていることを示した。CaMV35SプロモーターにMpftsZ2遺伝子を繋いだプラスミドを構築しゼニゴケに遺伝子導入した結果、巨大葉緑体を持つ形質転換体が1個体得られた。野生株の表皮の細胞は38．2 ± 21．4個の葉緑体を持つ一方、形質転換体では7．4 ± 4．4個にまで減少していた。サザン解析は、導入したMpftsZ2遺伝子が最低3コピー導入されていることを示した。ノーザン解析は、この形質転換体ではMpftsZ2遺伝子が過剰発現していることを示した。野生株と形質転換体ではクロロフィル量に有意な違いは見られず、また通常光下でのクロロフィル蛍光分析においても有意な違いは見られなかった。しかしながら、形質転換体は野生株に比べて約1/5に成育が抑制されており、このことは巨大葉緑体を持つ細胞には何らかの障害があることを示唆している。

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私たちはこれまでにシロイヌナズナにおいて、ミトコンドリア分裂過程に関わる遺伝子として、ADL2b (Arabidopsis Dynamin-Like protein 2b) を同定した。シロイヌナズナゲノム中にはこれと相同性の高い遺伝子ADL2aが存在しているが、この遺伝子産物は葉緑体に局在することが報告されていた。そこで今回、私たちはADL2aに関して細胞内局在を再実験した。すると、私たちの結果では、N末端もしくは全長にGFPをつないだ融合たんぱく質は、どちらも葉緑体には局在しなかった。一方、ADL2aの全長のN末端もしくはC末端にGFPを融合したたんぱく質は、主にミトコンドリアの端部や狭窄部に存在することが確認された。このパターンはADL2bの局在と非常に似たものであった。そこで、ADL2aとADL2bそれぞれにGFPとRFPをつなげて観察したところ、これらの局在パターンが実際に同じであることが確認された。さらに、ADL2aのGTPase領域に点変異を導入したドミナントネガティブたんぱく質をタバコ培養細胞BY-2で発現させたところ、変異たんぱく質を入れた細胞において特異的にミトコンドリアの分裂阻害によると思われる伸長化が引き起こされた。以上の結果から、ADL2aもADL2bと同じようにミトコンドリア分裂に関与していると考えられる。

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真核生物に広く存在するペルオキシソームは、高等植物では脂肪酸代謝、光呼吸など種々の機能を担っている。我々は、ペルオキシソーム形成の分子機構を明らかにするために、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の局在を指標として、シロイヌナズナにおいてペルオキシソーム形成が異常になった apm (aberrant peroxisome morphology) 突然変異体を選抜し、解析を進めている。
apm1は、ペルオキシソームの形が長くなり、細胞内の数も減少するという表現型を示すことから、ペルオキシソームの分裂が抑制された変異体と考えられる。マッピングの結果、APM1 遺伝子は、ダイナミンファミリーの1つである ADL2A タンパク質をコードしていることが明らかとなった。apm1では、ペルオキシソームのみならず、ミトコンドリアの分裂も抑制されていることから、ADL2A タンパク質はペルオキシソームとミトコンドリアという2種類のオルガネラの分裂に関与していることが明らかとなった。apm1植物体は、野生型に比べ矮性を示し、また、ショ糖非存在下における発芽時には根の生長が抑えられる。この結果は、ペルオキシソームとミトコンドリアの協調した機能が必要とされる光呼吸系と脂肪酸代謝系の活性が低下していることを示している。根と葉における器官特異的なペルオキシソームの分裂についてもあわせて報告する。

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高等植物のペルオキシソームは、個体の生長に合わせてその機能を転換させるユニークなオルガネラである。近年、酵母や哺乳類など他の生物種のペルオキシソーム研究から、ペルオキシソームの形成維持に関わる因子群（ペルオキシン）が26種同定されているが、その生理機能のほとんどは未だ不明である。これまでに我々は、シロイヌナズナペルオキシン5、7、14がペルオキシソームへのタンパク質輸送に関わることを明らかにしてきた。そして現在、他生物種には観察されない植物ペルオキシソームの機能転換のメカニズムを統合的に理解することを最終目的として、シロイヌナズナペルオキシンを全て網羅し解析を行っている。まず、他生物種のペルオキシンの配列を用いた相同性検索を行ったところ、シロイヌナズナゲノムには15種のペルオキシン遺伝子が存在していることがわかった。本発表ではこれらのシロイヌナズナペルオキシンのうち、他生物種の解析からペルオキシン5、7、14と同様にタンパク質輸送に関わることが示唆されているペルオキシン10、12について、さらに詳細な結合解析を行ったので報告する。また、酵母two-hybrid screeningによりペルオキシン14と相互作用する植物ペルオキシンの検索をしたところ、ペルオキシン14、5と相互作用する新規RING-fingerタンパク質を同定したので、この解析結果についても併せて報告したい。

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脂肪性種子植物のペルオキシソームは、その成長過程において可逆的に機能転換することが知られているオルガネラである。暗所で生育させた黄化子葉にはグリオキシソームが存在し、光を受けて緑化した子葉では緑葉ペルオキシソームへと機能転換する。前回本大会において、シロイヌナズナ子葉より緑葉ペルオキシソームを高純度に精製する系を確立し、MALDI/TOF-MSを用いたプロテオーム解析による緑葉ペルオキシソームタンパク質の網羅的解析について報告した。
今回は、5日間暗所で生育したシロイヌナズナ黄化子葉よりグリオキシソームを単離し、プロテオーム解析を行った結果について報告する。本解析では、既知のグリオキシソームタンパク質に加え、kinase proteinを含めた新規タンパク質の同定に成功した。オルガネラを用いたプロテオーム解析において、新規に同定されたタンパク質が実際にそのオルガネラに局在することを確認することは、調整したオルガネラの純度を検定する上でも重要である。そこで我々はこのkinase proteinをperoxisomal protein kinase 1 (PPK1)と名付け、その詳細な解析を行った。PPK1 cDNAをRT-PCRによりクローニングし、発現産物の特異抗体を作製した。この特異抗体を用いた局在解析から、PPK1がグリオキシソームに局在すること、さらにグリオキシソーム内膜に局在し、予想されるkinase領域はグリオキシソーム内に存在していることが明らかとなった。

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　生物は生理的温度より5～10℃高い温度にさらされると、通常の生育温度で機能して いるタンパク質の合成が停止し、熱ショックタンパク質（Heat shock protein ; HSP）を合成する。HSPのうち15～30kDaのものは低分子量HSP（sHSP）と呼ばれ、C末端側に保存領域（αク リスタリンドメイン）を持ち、分子シャペロンとして機能することが報告されている。sHSPは植物における主要なHSPであり、細胞質、葉緑体、ミ トコンドリア、ERに、それぞれ異なる分子種が局在することが知られている。
　我々はシロイヌナズナから、αクリスタリンドメインを持ち、さらにペルオキシソーム輸送シグナル（PTS）を有する2種類のsHSP様タンパク質を発見した。ペルオキシソームに局在するsHSPはこれまで報告例が無く、その機能は全く未知である。このうちの一つであるAtMP27は、N末端側にPTSを有し、緑葉ペルオキシソームに局在する膜タンパク質であった。しかしその遺伝子発現は熱ショックではなく、光によって誘導されるという特徴を示した（2000年度本大会報告）。本研究では、もう一つのsHSP様タンパク質であるAtHSP15.7に注目した。AtHSP15.7はC末端にPTS配列を持ち、熱ショックによって遺伝子発現が誘導される。現在、 AtHSP15.7の細胞内局在性及び遺伝子発現について検討中である。

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　ペルオキシソームは、脂肪酸β酸化、グリオキシル酸回路およびグリコール酸代謝などの代謝系を持ち、脂肪酸分解や光呼吸などの生理機能を担っている。我々は、ペルオキシソームの脂肪酸β酸化能を欠損する突然変異体の単離に成功した。そのうちped1、ped2、ped3の3系統の突然変異体については原因遺伝子の同定を完了している。PED1およびPED3遺伝子は、脂肪酸β酸化に関わる3-ketoacyl CoA thiolaseおよびペルオキシソーム膜ABCトランスポーターを、PED2遺伝子はペルオキシソームタンパク質の細胞内輸送を担うAtPex14pをコードしていることから、上記突然変異体は脂肪酸β酸化が異なる段階で停止していると考えられる。
　ペルオキシソームによる種子貯蔵脂肪の分解は、発芽過程における重要なプロセスであり、脂肪酸β酸化の欠損は発芽初期の遺伝子発現に何らかの影響を及ぼすと考えられる。我々は、発芽初期の遺伝子発現調節機構の解明をめざしてこれら3つの突然変異体における遺伝子発現を比較検討している。DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析の結果、それぞれの突然変異体は異なる遺伝子発現パターンを示すことが明かとなった。この結果をもとに、発芽初期過程における遺伝子発現の調節機構について考察する。

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　維管束分化の空間的制御機構を解明するため，我々はシロイヌナズナから葉脈パターンに異常のある変異体(van1～van7)を単離し解析している．今回，細脈が著しく断片化した状態で形成されるvan3変異体について，オーキシン分布およびオーキシンに関わる遺伝子との相互作用を検討したので報告する．
　まずDR5::GUS遺伝子(オーキシン誘導性のプロモーターとGUSの融合遺伝子)を用い，オーキシン分布と葉脈形成について調査した．野生型においてDR5は，細脈が形成される場で，まずスポット状（断片的）に何ヶ所かで発現し，その後スポットから，発現した細胞が前形成層に分化しつつ発現部位が広がっていき，最後にそれぞれのスポット由来の発現がつながった．van3においてもDR5は，まずスポット状に発現していたが，その数は少なかった．そこで細脈の前形成層は，オーキシンの蓄積とともに断片的に形成されること，またvan3ではその形成能が低下しているため，前形成層がつながらず，断片化してしまうと考えられた．
　またvan3とオーキシン極性輸送に異常をもつpin1変異体と二重変異体を作成したところ，additiveな表現型となった．したがってVAN3とPIN1は遺伝的に独立であり，VAN3の機能はオーキシンの極性輸送と直接は関連しない可能性が示唆された．現在gnや mp変異体との二重変異体も作成しており，これらの結果についても合わせて考察したい．

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高等植物の器官形成に伴う維管束形成機構は組織分化やパターン形成における分子メカニズムの解析においてよいモデル系となっている。我々は維管束形成機構に関する新たな知見を得ることを目的として、シロイヌナズナのジーントラップラインを用いたスクリーニングを行っている。ジーントラップラインを用いることで維管束形成に関する遺伝子が推定できると同時に、その候補遺伝子内に挿入されたレポーター遺伝子により突然変異体としての形質を現し生理的機能の解析も容易になると考えている。約47800ラインのジーントラップライン中の染色が確認された2100ラインから維管束でのGUS染色が確認された93ラインを選抜し、ライン化を行った。その中でも特に維管束特異的にGUS染色されるラインや、表現型等から維管束形成時の特定のステージで働くか、あるいは維管束のパターン形成に関わっていると予測されるラインに注目してTAIL-PCR法、および5`-RACE法によりGUS遺伝子の挿入位置を探っている。今回は、維管束特異的に染色されると同時にvan変異体様の維管束の断片化を示すKG09040ライン等における組織学的および分子遺伝学的解析について報告する。

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管状要素分化では、二次壁形成、プログラム細胞死等の一連の事象が時間的空間的に秩序だって起こる。しかし、それらを制御する機構についての知見は現在のところ乏しい。そこで、今回は活性酸素に着目し、ヒャクニチソウ管状要素分化系を用いて、管状要素内での活性酸素の局在と管状要素分化における役割について調べた。葉肉細胞から管状要素へと分化する過程で、二次壁形成が起こり始める頃をピークに、細胞先端にO₂^-が発生することをnitroblue tetrazoliuim (NBT) 染色により見出した。この領域は、FITC-WGAで認識される二次壁沈着開始部位と一致していた。NADPH oxidase 阻害剤であるDPI を添加するとNBT での染色が見られなくなることからNADPH oxidase がこのO₂^-の生産に関わっていると考えられた。DPIは二次壁形成直前に加えると二次壁形成を抑制したが、二次壁形成開始直後の添加では二次壁形成は抑制されなかった。以上のことから、NADPH oxidase によって生産される細胞先端でのO₂^-が二次壁沈着の引き金となっている可能性が示唆された。

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　高等植物の葉身は扁平であるため、根や茎には見られない特異的な成長制御機構が存在すると考えられる。これまでに我々は、葉の二次元的な成長には、縦・横独立の細胞極性伸長が関与することを明らかにしてきた。一方、細胞分裂の方向性が葉身の形態形成に果たす役割は不明である。そこで、この点について知見を得るため、シロイヌナズナの新たな細葉変異株、angustifolia3 (an3) を単離し解析を行った。an3 変異株は、葉の長さは野生株と同様であるが、葉身の幅は約25％減少する。一方、葉肉細胞の縦横比は野生株とan3 変異株で差が認められない。これらの結果は、葉身における細胞分裂の方向性はランダムに決定されるわけではなく、縦と横それぞれの方向に極性を持つように制御されていることを示唆する。また、葉の細胞の幅が減少することで細葉の表現型を示すan と、an3 との2重変異株は、相加的な表現型を示すため、葉の幅方向の細胞伸長と細胞分裂とは独立に制御されていると考えられる。現在、an3 の原因遺伝子をクローニング中であり、その経過についても報告する。

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ANgene of Arabidopsis encodes the homolog of the human CtBP which regulates polar elongation of the leaf cells. AN homologs from Marchantia polymorpha(MAN) and Ipomoea nil(MAN) rescued the an-1 mutation in terms of leaf morphology. MAN does not conserve the LXCXE domain which were contained in the AN and IAN. Moreover, although LXCXE domain is known to have ability to interact with Rb, AN does not interact with Rb in Yeast two-hybrid system. Taken together, we concluded the LXCXE domain of AN is not necessary to regulate the leaf width. Another yeast two-hybrid analysis indicated that AN can not interact with Ela, unlike mammalian CtBP. RT-PCR suggested that the transcriptional expression level of AN is important to regulate the leaf width. We analyzed relationship between translational level of AN and the an phenotype. Based on these results, possible role of AN will be discussed.

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　植物の葉には縦横や表裏の極性が存在する。我々の研究室ではこれまでにそれら極性伸長のメカニズムを明らかにしてきた。が、葉の扁平な構造を構築する分子機構や、サイズの制御機構には、まだは不明な点が多い。今回、葉の扁平性に異常を示すシロイヌナズナのアクティベーションT-DNA挿入株K346を単離して、解析を進めた。K346の植物体は矮性を示し、その葉はくぼみ、長さ方向の伸長がより抑制され、丸みを帯びた形態異常を示す。K346のヘミ接合体はホモ接合体より弱い表現型であった。従って、T-DNA挿入に伴う近傍遺伝子の過剰発現が形態異常の原因であると考えられた。原因遺伝子同定のため、T-DNAの挿入部位を決定したところ、それはAt2g36980とAt2g36990の間であることが分かった。しかし、これらの遺伝子の発現量は、野生型と同様であった。そこで、さらに詳しくこのゲノム領域の塩基配列を検討したところ、アミノ酸53残基をコードし得るORFを発見し、At2g3698xと名付けた。K346においてAt2g3698xは野生型よりも強く発現していたため、現在、At2g3698xを野生株で過剰発現させ、表現型の追試実験を行っている。

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The Arabidopsis SPIRAL1 (SPR1) gene encodes a novel plant-specific protein. spr1 mutants show right-handed twisting in the epidermis of roots and etiolated hypocotyls presumably due to impaired organization of cortical microtubules (cMTs). Both SPR1::GFP and SPR1::His fusion proteins were able to compliment spr1 mutants, and the GFP fluorescence co-localized with cMTs. Bacterially expressed SPR1::His, however, failed to bind taxol-stabilized tubulin polymers, suggesting indirect interaction between SPR1 and cMTs. The Arabidopsis genome contains five SPIRAL1-LIKE (SP1L) genes. While double mutants of spr1 and some sp1ls showed novel twisting phenotype in the inflorescence, CaMV35S::SP1L fusion genes were able to rescue the spr1 defects. SPR1 and SP1Ls share high identity in both N- and C-terminal regions. GFP fusion experiments indicated that these regions alone are sufficient for targeting SPR1 to cMTs. These results suggest that the conserved N- and C-regions of SPR1 and SP1Ls indirectly act on cMTs through as yet unidentified molecule(s).

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Recessive mutations in Arabidopsis thaliana SPIRAL1 locus, SPR1, reduce anisotropic growth of endodermal and cortical cells in roots and etiolated hypocotyls, and induce a right handed helical growth in epidermal cells of these organs. It was proposed that a microtubule dependent process and SPR1 act antagonistically to control directional cell elongation. SPR1 encodes a novel protein of low molecular weight. We identified two genes, SPI1 and SPI2, encoding proteins that interact specifically with SPR1 in the yeast two-hybrid system assay. SPI1 and SPI2 define a new family of putative type Ib membrane proteins. We have isolated plants harboring T-DNA insertions in SPI1 and SPI2 genes. Characterization of spr1/spi mutants, together with the SPR1 and Myc-SPI tagged proteins association to the Arabidopsis microsomal protein fraction, strongly suggest that the putative SPR1/SPI membrane bound protein complex is involved in a cell expansion process that might be related with cortical microtubule arrays.

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　分裂により新たに生じた植物細胞は体軸方向に急速に伸長する。植物細胞の伸長方向は細胞壁の主成分であるセルロース繊維が伸長方向と直角に沈着し、いわゆる「たが」として働くことで規定される。また、セルロース繊維は細胞質表層部に存在する表層微小管と平行して沈着することから、表層微小管がセルロース繊維の配向を通じて細胞伸長の方向性を決めているとされている。
　アラビドプシス変異体spiral2(spr2)は、根、茎、葉柄などが右巻き方向にねじれる細胞伸長変異体である。原因遺伝子SPR2はマップポジションを基にクローニングされ、タンパク質間相互作用に機能すると推定されるHEAT repeatを有する新規タンパク質をコードすることが分かった。SPR2のC末端にGFPを融合させたSPR2-GFPタンパク質は細胞質表層部に存在する表層微小管に局在した。又、SPR2組換えタンパク質はタバコBY-2培養細胞由来チューブリンから調製した微小管とin vitroで直接結合した。SPR2は表層微小管の配向化に機能する植物特有の微小管付随タンパク質であることが示唆された。

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　シロイヌナズナのZIMは、ジンクフィンガーモチーフやCCTモチーフを持ち、転写因子として働くことが予測されている。ZIMは栄養生長期から発現し、茎頂での発現量が高い。ZIMの生物学的な機能を明らかにするため、ZIM過剰発現体を作出した。その結果、胚軸や葉柄が伸長するという表現型が見られた。伸長は細胞伸長によるものであった。胚軸伸長は暗所では野生型と変わらないことから、明所での伸長抑制がきいていないと考えられる。さらに、赤色、遠赤色、青色のいずれの波長の光でも胚軸伸長が見られたことから、ZIMはフィトクロムやクリプトクロムなど光受容体からのシグナルが統合された後のシグナル伝達経路で、伸長抑制に対する負の制御因子として働くことが示唆された。胚軸や葉柄の細胞伸長には、ジベレリンやブラシノステロイドといった植物ホルモンが関与していると考えられている。ZIM過剰発現体における胚軸および葉柄の伸長は、ブラシノステロイド生合成阻害剤であるブラシナゾールにより阻害されたため、伸長にはブラシノステロイドが必要であることが示された。以上のことから、ZIMはブラシノステロイドを介した光形態形成の制御に働くと考えられる。現在、ZIM過剰発現体による表現型がどのような遺伝子の発現によるものかを、マイクロアレイを用いて調べている。

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シロイヌナズナにおいて花茎伸長欠損変異体として単離されたacaulis5 (acl5)は、その原因遺伝子がスペルミン合成酵素をコードすることが明らかになっている。しかし、スペルミンをはじめとするポリアミンが植物の形態形成にどのような機構で作用しているか明らかになっていない部分が多い。そこで我々は、スペルミンと花茎伸長とをつなぐ因子の探索を目的とし、acl5のサプレッサー変異体を単離してその解析を行った。EMS処理によって得られた5個体のサプレッサー変異体suppressor of acl5 (sac) 51~55の花茎伸長の回復度合いは様々であったが、いずれも優性変異であった。アミノ酸置換のacl5-1変異株では、ACL5遺伝子自身の発現レベルが上昇し、負のフィードバック制御が示唆されていたが、それぞれのsac変異体では、芽生えの時期で既に、ACL5の遺伝子発現がそれぞれその後の花茎伸長の回復度合いに応じて野生型のレベルに回復していることが分かった。ポジショナルクローニングにより、Sac51変異がMSJ1.18遺伝子内の約900塩基対からなる長い5'側非翻訳領域にあることを明らかにした。推定bHLH転写因子をコードすると考えられるこの遺伝子がこの非翻訳領域によってどのように制御されているのかを検討した結果も報告する予定である。

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植物の細胞壁は、多数の遺伝子ファミリーにコードされる多様なタンパク質群の働きを通して構築される。シロイヌナズナでは細胞壁構築に関与する遺伝子ファミリーが多数同定されているが、これらの遺伝子ファミリーに属する遺伝子の発現様式の全体像と調節機構を明らかにした例はほとんどない。そこで我々はDNAマイクロアレイ法とリアルタイムRT-PCR法を用いて、シロイヌナズナの細胞壁関連遺伝子群の網羅的な発現解析を行った。解析の結果、同一遺伝子ファミリー内においても、独自の発現様式を示す遺伝子と、類似の発現様式を示す一群の遺伝子とが混在することが明らかになった。系統学的解析から、類似の発現様式を示す遺伝子群の多くはゲノム重複等により派生した遺伝子であることが示唆された。また類似の発現様式を示す遺伝子群のプロモーター領域には共通の塩基配列が保存されていることも明らかになった。これらの遺伝子群のうち、根特異的発現を示すエンド型キシログルカン転移／加水分解酵素遺伝子群に焦点を当て、その詳細な解析を基に、遺伝子の発現様式の多様性と共通性の進化の意味について議論する。

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