The chemoenzymatic method using glycosynthase is one of potent strategies for the synthesis of glycoproteins having a homogeneous glycan. In this method, the efficient preparation of the N-acetylglucosaminylated protein is of great importance. Thus, for producing this compound with a high efficiency, we developed the sequential thioester method and the fast preparation method of the N-acetylglucosaminyl peptide. These methods realized the efficient preparation of glycoproteins having GlcNAc. Finally, homogeneous glycoproteins, the Tim-3 Ig domain and emmprin were successfully synthesized by the transglycosylation using glycosynthase.

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The pathogenic fungus Cryptococcus neoformans causes cryptococcosis, an opportunistic infectious disease resulting in 600,000 deaths per year. The two major glycolipids in C. neoformans are glucosylceramide (GlcCer) with a fungus-specific ceramide (methyl d18 : 2/h18 : 0) and ergosteryl β-glucoside (EG); however, the catabolic pathway of these glycolipids has not yet been uncovered. We found two homologues of endoglycoceramidase (EGCase, EC 3.2.1.123) in C. neoformans, designated Endoglycoceramidase-related Protein 1 and 2 (EGCrP1 and EGCrP2). EGCase hydrolyzes the O-glycosidic linkage between oligosaccharides and ceramides in various glycosphingolipids. However, EGCrP1 and EGCrP2 show completely different specificities; that is, EGCrP1 is a neutral glucocerebrosidase specific to GlcCer, whereas EGCrP2 is an acid β-glucosidase capable of hydrolyzing not only GlcCer but also various β-glucosides, including pNP β-glucoside and EG. Using each disruption mutant of egcrp1 and egcrp2, we elucidated that EGCrP1 plays an integral role in quality control of the fungus-specific GlcCer by eliminating immature GlcCer, which are byproducts of the GlcCer synthesis pathway, whereas EGCrP2 is involved in the catabolism of EG in the vacuoles of C. neoformans. The analysis of egcrp1-disrupted mutants also revealed that the quality control of fungus-specific GlcCer is strongly linked to the formation of the polysaccharide capsule, an important virulence factor. On the other hand, the disruption of EG catabolism resulted in growth arrest, dysfunction in cell budding, and abnormal vacuole morphology. These results indicate that catabolism of two different glycolipids plays different physiological roles in C. neoformans and strongly suggest EGCrP1 and EGCrP2 as targets for anti-cryptococcal drugs with a new mechanism of action.

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グライコシンターゼ（Endo-M変異体）を用いた化学酵素法は、均一な糖タンパク質サンプルを円滑に得ることのできる強力な手法の1つである。この戦略では、糖鎖転移基質となるN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）付きタンパク質の効率的な調製が鍵となる。そこで我々は、鍵化合物の効率的合成を行うべく、One-Potペプチドライゲーション法と簡便なGlcNAc付きペプチドセグメント調製法を開発した。これら手法によって効率的にGlcNAc付きタンパク質を調製し、最後に、グライコシンターゼを用いた糖鎖転移反応で目的とする均一なN-結合型複合型糖鎖を有するTim-3 Igドメインとemmprinの合成に成功した。

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Cryptococcus neoformansは、免疫不全患者を中心に発症するクリプトコッカス症の原因菌である。私達は、C. neoformansにエンドグリコセラミダーゼ（EGCase）の2つのホモログ（Endoglycoceramidase related Protein 1, 2; EGCrP1, 2）　が存在することを見出した。この2つのホモログは、オリゴ糖鎖とセラミド間のβグリコシド結合を加水分解するEGCaseとは全く異なる基質特異性を示した。つまり、EGCrP1はグルコシルセラミド（GlcCer）に特異的な中性グルコセレブロシダーゼであり、EGCrP2はGlcCerのみならず種々のβ-グルコシドを加水分解するアグリコン特異性の広い酸性β-グルコシダーゼであった。これらの酵素遺伝子が欠損したC. neoformans変異株を作製、解析した結果、EGCrP1欠損株ではセラミドの合成過程で生成される未成熟型セラミドにグルコースが結合した、野生株にはない未成熟型GlcCerが蓄積した。一方、EGCrP2欠損株ではエルゴステリルβ-グルコシドが蓄積した。これらの結果は、EGCrP1はGlcCer合成系と共役してGlcCerの品質管理に、EGCrP2はエルゴステリルβ-グルコシド（EG）の分解に関与していることを示している。生理学的に重要なことは、EGCrP1欠損株では莢膜形成不全が、EGCrP2欠損株では液胞の肥大化と細胞分裂不全が観察されたことである。今回明らかにされたEGCrP1, 2が駆動する真菌特異的な糖脂質代謝経路は、新しい作用機序を備える抗深在性真菌薬の開発標的として有望と考えられる。

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